KR100466254B1 - Conjugates Comprising Oligonucleotide And Hydrophilic Polymers for Gene Transfer, Hybrid Polyion Complex Micelles Self-assembled from Said Conjugates and Their Manufacturing Method - Google Patents
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Abstract
본 발명은 난치성 질환의 치료용으로 사용가능한 유전자 전달용 접합체로서,The present invention is a gene delivery conjugate that can be used for the treatment of refractory diseases,
세포내로 전달하고자 하는 올리고뉴클레오티드와, 친수성 고분자를 포함하며 상기 올리고뉴클레오티드의 말단기가 친수성 고분자와 공유결합으로 연결된 유전자 전달용 접합체와,An oligonucleotide to be delivered into a cell, a gene delivery conjugate comprising a hydrophilic polymer and a terminal group of the oligonucleotide covalently linked to a hydrophilic polymer,
상기 유전자 전달용 접합체와 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 고분자간의 이온 상호작용에 의해 형성되는 고분자 전해질 복합미셀을 개시한다.Disclosed is a polymer electrolyte composite micelle formed by ionic interaction between the gene delivery conjugate and a cationic peptide or cationic polymer.
상기 구성에 의한 고분자 전해질 복합미셀에 의하면 세포내로 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 전달할 수 있으며, 비교적 낮은 농도에서도 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성을 나타낼 수 있어 생명공학을 위한 기초연구 및 의학분야에서 매우 유용하다.According to the polymer electrolyte composite micelle according to the above configuration, the oligonucleotide can be efficiently delivered into the cell, and the antisense oligonucleotide can be exhibited at a relatively low concentration, which is very useful in basic research and medical field for biotechnology.
Description
본 발명은 난치성 질환의 치료용으로 사용 가능한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자로 구성되는 접합체와 상기 접합체와, 다가 양이온 고분자 또는 양이온 펩타이드의 이온 결합에 의한 고분자전해질 복합 미셀 입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a conjugate composed of oligonucleotides and hydrophilic polymers usable for the treatment of intractable diseases, and a polymer electrolyte composite micelle particle by ion bonding of the conjugate, a polyvalent cationic polymer or a cationic peptide, and a method for producing the conjugate.
유전자치료에 있어서 안전하고 효율적인 유전자전달기술은 오랫동안 연구되어왔으며 다양한 유전자 전달체와 전달기술이 개발되어 왔다. 특히 아데노바이러스, 레트로바이러스 등 바이러스를 이용하는 유전자전달기술과 리포좀과 양이온성 지질, 그리고 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 벡터(nonviral vector)를 이용한 유전자전달기술 들이 개발되어 왔다. 그러나 바이러스를 유전자의 전달체로이용하는 방법의 문제점은 아직까지의 기술로는 전달된 유전자가 숙주의 염색체에 이입되어 숙주의 유전자의 정상기능에 이상을 유도하거나 발암 유전자를 활성화시키지 않고 존재할 수 있다는 확증이 없다는 점이다. 또한 바이러스의 유전자가 적은 양이라도 계속 발현되고 있을 경우 자가면역증을 유발할 수 있거나, 이 바이러스 전달체의 변형된 형태의 바이러스 감염이 유발될 경우 효율적인 방어면역을 일으키지 못할 수 있다는 점이 배제되지 못하고 있다. 따라서 바이러스성 벡터를 사용하는 방법 이외에 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등이 그들 각각의 단점을 개량하는 방향으로 연구되고 있다. 이들 비바이러스성 벡터들은 바이러스성 벡터보다는 그 효율성에 있어 많이 뒤떨어지지만 생체 내 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 부작용이 적고 생산 가격이 저렴해 질 수 있다는 장점을 기반으로 개량기술의 수립이 가능하다.Safe and efficient gene delivery techniques for gene therapy have been studied for a long time and various gene carriers and delivery techniques have been developed. In particular, gene transfer techniques using viruses such as adenoviruses and retroviruses and gene transfer techniques using nonviral vectors using liposomes, cationic lipids, and cationic polymers have been developed. However, the problem with the method of using a virus as a gene carrier is that the technique to date has been confirmed that the transferred gene may enter the host chromosome and exist without causing abnormality in the normal function of the host gene or activating a carcinogenic gene. It is not. In addition, it is not excluded that even if a small amount of the gene of the virus is continuously expressed, it may cause autoimmunity, or if a viral infection of a modified form of the virus carrier is induced, it may not cause effective defense immunity. Therefore, in addition to the use of viral vectors, methods for fusing genes into liposomes, methods using lipids or polymers with cations, and the like have been studied to improve their respective disadvantages. These non-viral vectors are much lower in efficiency than viral vectors, but considering the safety and economic efficiency in vivo, it is possible to establish an improvement technique based on the advantage that the side effects are low and the production price can be low.
미셀(micelle) 이란, 친수성과 소수성의 성질을 가진 물질 중 친수성과 소수성이 특정 비율로 결합되었을 때 수용액상에서 열역학적 안정성으로 인해 자연적으로 자기조립 구조가 이루어진 구조체를 의미한다. 수용액상에서 자가조립하여 미셀을 형성할 수 있는 블록 공중합체들의 내부는 소수성의 성질을 가지고 있어 난용성 약물을 손쉽게 포획할 수 있고, 표면은 친수성의 성질을 가지므로 난용성 제제의 가용화, 약물 전달 운반체 등에 사용된다. 이러한 소수성의 내부와 이를 둘러싼 친수성 표면에 의한 수용액 상에서의 미셀의 안정화에 대한 개념은 소수성 상호작용 외에 서로 다른 전하를 띄는 고분자전해질 간의 상호작용까지 넓혀서 적용할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜을 접합시킨 서로 다른 전하를 지닌 고분자전해질들은 서로간의 상호작용으로 인해 자발적으로 형성되는 micelle 구조를 지닌 복합체를 형성하는데, 이를 고분자전해질 복합 미셀(polyion complex micelles) 이라 한다 (Kataoka, K., Togawa, H., Harada, A., Yasugi, K., Matsumoto, T., Katayoshe, S., Macromolecules. 29, 8556-8557, 1996 참조). 이들 고분자전해질 복합 미셀들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템, 즉 마이크로스피어, 나노입자 등에 비해, 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 이루는 구조이므로 제제의 quality control 및 재현성의 확보가 용이하다.Micelle refers to a structure in which a self-assembled structure is naturally formed due to thermodynamic stability in an aqueous solution when hydrophilicity and hydrophobicity are combined in a specific ratio among hydrophilic and hydrophobic materials. Block copolymers that can form micelles by self-assembly in aqueous solution have hydrophobic properties to easily capture poorly soluble drugs, and the surface has hydrophilic properties, solubilizing poorly soluble agents and drug delivery carriers. Used for The concept of stabilization of micelles in an aqueous solution by the hydrophobic interior and the hydrophilic surface surrounding the hydrophobic interior can be applied by extending the interaction between polymer electrolytes having different charges in addition to hydrophobic interactions. Polyelectrolytes with different charges conjugated with polyethylene glycol form complexes with micelle structures that spontaneously form due to interactions with each other. These are called polyion complex micelles (Kataoka, K., Togawa, H., Harada, A., Yasugi, K., Matsumoto, T., Katayoshe, S., Macromolecules. 29, 8556-8557, 1996). These polyelectrolyte complex micelles are extremely small in size and highly uniform in spontaneous structure compared to other systems used as drug delivery carriers, such as microspheres and nanoparticles, and thus facilitate quality control and reproducibility of the preparation. Do.
생체내로 약물을 전달하기 위한 전달체에 사용되는 고분자의 요건은 생체적합성의 성질을 가지고 있어야 하며, 이러한 조건을 만족시키는 대표적인 고분자로는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이 있다. 폴리에틸렌글리콜은 미국 식품의약품안전청(FDA)의 승인을 받아 오랫동안 단백질의 특성 개선, 고분자의 표면개질 또는 유전자 전달에 광범위하게 사용되고 있다. 폴리에틸렌글리콜은 친수성이며 자체의 독성이 거의 나타나지 않고, 생체 내에서 면역반응을 거의 일으키지 않는 생체 적합성 폴리머이다. 또한 폴리에틸렌글리콜로 표면의 성질을 개질 함으로써 단백질의 흡착을 크게 줄일 수 있다.The requirement of the polymer used in the carrier for delivery of the drug in vivo should be biocompatible, and representative polymers satisfying these conditions include polyethylene glycol (PEG). Polyethyleneglycol has been used by the US Food and Drug Administration (FDA) for a long time and has been widely used for improving protein properties, polymer surface modification or gene transfer. Polyethyleneglycol is a biocompatible polymer that is hydrophilic and shows little toxicity in itself and rarely generates an immune response in vivo. In addition, the adsorption of protein can be greatly reduced by modifying the surface properties with polyethylene glycol.
올리고뉴클레오티드는 동물 및 사람의 질병을 치료하는 데에 있어 치료의 일부분으로 사용되어왔다. 예를 들면, 바이러스성, 균류성, 대사성 질병과 관련된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 안티센스(antisense) 등이 있다. 올리고뉴클레오티드와 그가 혼성화하는 상보적인 표적 핵산간의 관계를 일반적으로 안티센스 (antisense)라 일컫는다. 일단 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표적 유전자를 동정하게 되면, 그 표적과 충분히 상보적인 즉, 충분히 특이적으로 혼성화하는 염기서열을 선택하여 바람직한 억제가 이루어지도록 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 치료에 사용하는데 있어서 주된 문제점은 세포로의 전달과정과 세포 내에서의 올리고뉴클레오티드의 안정성과 올리고뉴클레오티드를 세포막을 통해 효율적으로 세포내로 전달하는 데에 있다. 올리고뉴클레오티드의 주 사슬은 에스테르 본드로 이루어져 있기 때문에 대부분의 세포 내에서 빠르게 분해되며 그 반감기가 20여분 정도 되기 때문에 계속적으로 올리고뉴클레오티드가 세포 내로 전달되어 일정 농도에 이르지 않으면, 안티센스 효과는 나타나기 어렵게 된다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 뉴클라아제(nuclease)에 대한 민감성을 개량하기 위해 포스포치오에이트 결합이나 (Milligan, J. F., Mateucci, M. D., Martin, J. C., J. Med. Chem. 36, 1923-1937, 1993 참조) 2-O-allyl기 같은 작용기를 도입하여 (Fisher, T. L., Terhorst, T., Cao, X., Wagner, R. W., Nucleic. Acid Res. 21, 3857-3865, 1993 참조) 안정성을 높인 시도가 행해졌다. 그러나 현재까지 올리고뉴클레오티드가 세포막을 효율적으로 투과할 수 있게 하는 기술은 개발 단계에 있다고 할 수 있다.Oligonucleotides have been used as part of treatment in treating diseases in animals and humans. Examples include antisense, which can regulate the expression of genes associated with viral, fungal, and metabolic diseases. The relationship between an oligonucleotide and the complementary target nucleic acid to which it hybridizes is generally referred to as antisense. Once the target gene of the antisense oligonucleotide is identified, a sequence that is sufficiently complementary to the target, i.e., specifically hybridizes, is selected to achieve the desired inhibition. The main problems in the use of antisense oligonucleotides in therapy are the delivery process to cells, the stability of the oligonucleotides in the cells, and the efficient delivery of the oligonucleotides into the cells through the cell membrane. Since the main chain of the oligonucleotide is composed of ester bonds, it is rapidly degraded in most cells and has a half-life of about 20 minutes. Therefore, if the oligonucleotide is continuously delivered to the cell and reaches a certain concentration, the antisense effect is difficult to appear. To improve the sensitivity of these oligonucleotides to nucleases, see phosphothioate linkages (Milligan, JF, Mateucci, MD, Martin, JC, J. Med. Chem. 36, 1923-1937, 1993). Attempts to improve stability by introducing functional groups such as 2-O-allyl groups (see Fisher, TL, Terhorst, T., Cao, X., Wagner, RW, Nucleic. Acid Res. 21, 3857-3865, 1993) Was done. However, until now, the technology that enables oligonucleotides to penetrate the cell membrane efficiently is in development stage.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 내로의 전달을 위해 마이크로인젝션 또는 양이온성 고분자 또는 지질을 이용하거나 배양액에 올리고뉴클레오티드를 직접 분산시키는 방법을 이용하고 있으나 직접 주입하는 마이크로인젝션을 제외하고는 그다지 높은 효과를 보지 못하고 있다.In order to deliver antisense oligonucleotides into cells, microinjection or cationic polymers or lipids are used, or oligonucleotides are directly dispersed in a culture medium. However, except for the direct injection of microinjection, the effect is not so high. .
본 발명의 목적은 세포내로의 유전자 전달을 위해 말단에 기능기를 도입한 올리고뉴클레오티드와 생체적합성이 우수한 친수성 고분자와의 사이에 분해성 또는 비 분해성 결합으로 제조되는 유전자 전달용 접합체 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.Disclosure of Invention An object of the present invention is to provide a gene delivery conjugate prepared by degradable or non-degradable linkage between an oligonucleotide having a functional group introduced at its terminal for delivery into a cell and a hydrophilic polymer having excellent biocompatibility, and a method for producing the same. There is.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달용 접합체와 양이온을 띈 다가 양이온성 고분자 또는 펩타이드와의 상호작용에 의해 자발적으로 생성되는 고분자전해질 복합 미셀을 제공함에 있다.Still another object of the present invention is to provide a polyelectrolyte complex micelle spontaneously generated by interaction with the gene delivery conjugate and a cationic multivalent cationic polymer or peptide.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 고분자 전해질 복합 미셀을 이용하여 유전자 치료용으로 제공되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포내 전달 효율성을 향상시키고자 함에 있다.Another object of the present invention is to improve the intracellular delivery efficiency of antisense oligonucleotides provided for gene therapy using the polymer electrolyte composite micelles.
도 1은 본 발명의 고분자전해질 복합 미셀의 개념을 간략하게 나타낸 모식도이다.1 is a schematic diagram briefly showing the concept of a polymer electrolyte composite micelle of the present invention.
도 2는 본 발명의 산 분해성 결합을 포함한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜간의 접합과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.Figure 2 is a schematic diagram showing the conjugation process between the oligonucleotide containing the acid-degradable bond of the present invention and polyethylene glycol as a hydrophilic polymer.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 산 분해성 결합을 포함한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자간의 접합과정에서 단계별 생성물을 역상 HPLC를 사용해 분석한 크로마토그램이다.Figure 3 is a chromatogram analysis of the step-by-step product using reversed phase HPLC in the conjugation process between the oligonucleotide and the hydrophilic polymer containing an acid-degradable bond according to an embodiment of the present invention.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 산 분해성 결합을 포함한 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자간의 접합체의 산성환경 하에서의 시간에 따른 올리고뉴클레오티드의 분리정도를 나타내는 그래프이다.Figure 4 is a graph showing the degree of separation of oligonucleotides over time in the acidic environment of the conjugate between the oligonucleotide and the hydrophilic polymer including the acid-degradable bonds according to an embodiment of the present invention.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 산 분해성 결합을 포함한 올리고뉴클레오티드-폴리에틸렌글리콜 접합체와 양이온성 펩타이드인 KALA 사이의 상호작용에 의해 생성된 고분자전해질 복합 미셀의 세포 내 전달현상을 공유초점현미경으로 관찰한 사진이다.5 is an intrafocal microscopic observation of intracellular delivery of the polymer electrolyte composite micelles produced by the interaction between an oligonucleotide-polyethylene glycol conjugate including an acid-degradable bond and a cationic peptide, KALA, according to an embodiment of the present invention. One picture.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 산 분해성 결합을 포함한 안티센스 c-myc 올리고뉴클레오티드-폴리에틸렌글리콜 접합체와 양이온성 펩타이드인 KALA 사이의 상호작용에 의해 생성된 고분자전해질 복합 미셀의 평활근 세포주의 증식 저해 정도를 나타내는 그래프이다.Figure 6 is a degree of inhibition of the proliferation of smooth muscle cell lines of the polyelectrolyte complex micelles produced by the interaction between the antisense c-myc oligonucleotide-polyethylene glycol conjugate containing the acid-degradable bonds and the cationic peptide KALA according to an embodiment of the present invention A graph representing.
본 발명은 유전자를 목적하는 세포내로 전달하는 유전자가 결합된 접합체로서, 세포내로 전달하고자 하는 올리고뉴클레오티드와, 생분해적인 친수성 고분자를 포함하며 상기 올리고뉴클레오티드의 말단기가 친수성 고분자와 공유결합으로 연결된 유전자 전달용 접합체를 포함한다.The present invention is a conjugate to which a gene for delivering a gene into a desired cell is conjugated, and includes an oligonucleotide to be delivered into a cell and a biodegradable hydrophilic polymer, and a terminal group of the oligonucleotide is covalently linked to a hydrophilic polymer. Conjugates.
본 발명은 시험연구용으로나 의약산업적으로 매우 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함하는 유전자를 효율적으로 세포내로 전달할 수 있는 미셀형태의 유전자 전달 시스템을 제공한다.The present invention provides a micelle-type gene delivery system capable of efficiently delivering genes including antisense oligonucleotides and the like which are very useful for test research and pharmaceutical industry.
상기 올리고뉴클레오티드는 유전자 치료 등에 유용한 일체의 유전자를 포함하며 이에는 의학적으로 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩타이드 헥산(PNA) 등이 포함된다. 또한 상기 본 발명에 적용가능한 올리고뉴클레오티드 내의 주사슬의 결합형태는 포스포디에스터 결합, 포스포로티오에이트 결합, 포스포로아미데이트 결합, 또는 아미드 결합 등이 포함된다.The oligonucleotide includes any gene useful for gene therapy and the like, and includes medically useful antisense oligonucleotide, peptide hexane (PNA), and the like. In addition, the binding form of the main chain in the oligonucleotide applicable to the present invention includes a phosphodiester bond, a phosphorothioate bond, a phosphoroamidate bond, an amide bond and the like.
바람직하기로 상기 올리고뉴클레오티드는 세포내의 DNA나 RNA에 특이적으로 결합할 수 있는 분자량인 1,000∼50,000의 범위내의 것으로부터 선택됨이 좋다. 위와 같은 조건을 만족하는 올리고뉴클레오티드의 예를 들면 c-myc, c-myb, c-fos, 또는 c-jun 등의 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 있으며 이들 유전자의 전부 또는 일부 절편이 여기에 포함될 수 있다.Preferably, the oligonucleotide is preferably selected from the range of 1,000 to 50,000 which is the molecular weight that can specifically bind to DNA or RNA in the cell. Examples of oligonucleotides that satisfy the above conditions include antisense oligonucleotides such as c-myc, c-myb, c-fos, or c-jun, and all or some fragments of these genes may be included therein.
친수성 고분자는 상기 올리고뉴클레오티드와 공유결합을 통해 접합체를 형성한다. 상기와 같이 형성된 접합체는 이후 상반되는 전하 즉 양이온을 띠는 고분자 전해질과의 소수성 및 이온상호작용 등을 통해 자발적으로 형성되는 미셀 구조의 복합체를 형성한다. 상기 친수성 고분자는 세포내로 이행되어질 유전자 전달체를 구성하므로 그 자체 독성이 없어야 하며, 생체내에서 면역반응을 일으키지 않는 생체적합성 고분자 중에서 선택되어야 한다. 바람직하기로 상기 친수성 고분자는 비이온성이고 분자량이 500 이상인 것에서 선택된다. 이들 친수성 고분자의 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등이 있다. 바람직하기로는 상기 친수성 고분자 중에서도 폴리에틸렌글리콜은 안전성은 물론 단백질의 특성개선, 고분자의 표면개질 등에 있어 그 특성이 매우 우수하다.Hydrophilic polymers form conjugates through covalent bonds with the oligonucleotides. The conjugate formed as described above forms a complex of micelle structure spontaneously formed through hydrophobicity and ion interaction with the opposite charge, that is, the cation-containing polymer electrolyte. Since the hydrophilic polymer constitutes a gene carrier to be transferred into a cell, it should not be toxic in itself and should be selected from biocompatible polymers which do not cause an immune response in vivo. Preferably the hydrophilic polymer is selected from nonionic and molecular weight of 500 or more. Examples of these hydrophilic polymers include polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone, polyoxazoline, and the like. Preferably, among the hydrophilic polymers, polyethylene glycol is very excellent in safety, protein properties, polymer surface modification, and the like.
접합체를 구성하는 상기 친수성 고분자와 올리고뉴클레오티드 사이의 결합은아미드 결합, 카바메이트 결합 등을 포함하는 비분해성 결합과, 하이드라존 결합, 포스포로아미데이트 결합, 아세탈 결합 등을 포함하는 산분해성 결합과, 디설파이드 결합, 에스터 결합, 안하이드라이드 분해성 및 효소 분해성 결합의 군에서 선택되는 1종의 형태일 수 있다.The bond between the hydrophilic polymer and the oligonucleotide constituting the conjugate includes non-degradable bonds including amide bonds, carbamate bonds, and the like, and acid-degradable bonds including hydrazone bonds, phosphoramidate bonds, acetal bonds, and the like. , Disulfide bonds, ester bonds, anhydride degradable and enzymatic degradable bonds.
상기 유전자 전달용 접합체의 합성은 다음과 같은 단계를 포함하여 수행가능하다.Synthesis of the conjugate for gene delivery can be performed including the following steps.
(1) 올리고뉴클레오티드의 말단기(예를 들면 3' 또는 5'말단)를 활성화하는 단계와,(1) activating the end group (eg, 3 'or 5' end) of the oligonucleotide,
(2) 생분해성인 친수성 고분자를 상기 올리고뉴클레오티드의 말단기에 공유결합시키는 단계.(2) covalently attaching a biodegradable hydrophilic polymer to the terminal group of the oligonucleotide.
상기에서 올리고뉴클레오티드의 말단기를 활성화하기 위한 물질은 예를 들면 1-에틸-3,3-디에틸아미노프로필 카보디이미드(EDAC), 이미다졸, N-하이드로식숙신이미드(NHS)와 디클로로헥실카보디이미드(DCC), HOBT, p-나이트로페닐클로로포르메이트, 카보닐디이미다졸, N,N'-디숙신이미딜카보네이트(DSC) 등이 있다.The substance for activating the end group of the oligonucleotide is, for example, 1-ethyl-3,3-diethylaminopropyl carbodiimide (EDAC), imidazole, N-hydrosuccinimide (NHS) and dichloro Hexylcarbodiimide (DCC), HOBT, p-nitrophenylchloroformate, carbonyldiimidazole, N, N'-disuccinimidylcarbonate (DSC), and the like.
본 발명은 상기한 유전자 전달용 접합체와 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 고분자간의 이온 상호작용에 의해 형성되는 고분자 전해질 복합미셀을 포함한다. 도 1은 상기 고분자 전해질 복합미셀의 형성과정을 개략적으로 도시한 예로서 산 분해성 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드(ODN)-PEG 접합체와 양이온성 펩타이드(KALA)간의 상호작용에 의해 복합미셀이 형성되는 과정을 보여주고 있다.The present invention includes a polymer electrolyte composite micelle formed by the ionic interaction between the aforementioned gene delivery conjugate and a cationic peptide or cationic polymer. 1 illustrates a process of forming a composite micelle by an interaction between an oligonucleotide (ODN) -PEG conjugate having an acid-degradable bond and a cationic peptide (KALA) as an example schematically illustrating the formation of the polymer electrolyte composite micelle. Is showing.
상기에서 양이온성 펩타이드에 속하는 물질의 예를 들면 KALA 또는 프로타민 등이 있으며, 양이온성 고분자에 속하는 물질의 예를 들면 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민, 폴리라이신, 디에틸아미노에틸덱스트란, 폴리디메틸아미노에틸메틸아크릴레이트 또는 이들의 유도체 등이 이에 해당된다.Examples of the substance belonging to the cationic peptide include KALA or protamine, and examples of the substance belonging to the cationic polymer include polyethyleneimine, polyamidoamine, polylysine, diethylaminoethyldextran, and polydimethylaminoethyl. Methyl acrylate or derivatives thereof, and the like.
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are only presented to understand the contents of the present invention, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to these examples.
<실시예 1> 산 분해성 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체의 합성 (도 2 참조)Example 1 Synthesis of Oligonucleotide-PEG Conjugates Having Acid Degradable Binding (see FIG. 2)
본 실시예에서는 올리고뉴클레오티드로서 안티센스c-myb을 사용하였다. 5' 말단에 인산기를 도입한 올리고뉴클레오티드를 1-에틸-3,3-디에틸아미노프로필 카보디이미드(EDAC)와 이미다졸로 활성화하여 올리고뉴클레오티드-포스포이미다졸리드 중간체를 형성하였다. 먼저 40 l의 5 mM 인산완충액(pH 6.8)에 녹인 올리고뉴클레오티드 1 mg (179 nmol)를 40 mg EDAC (209 umol)에 가해 녹인 용액에 100 ㎕의 1 M 이미다졸을 가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 세파덱스 G-50 스펀-칼럼 크로마토그래피를 통해 분리하여 100 ㎕의 칼럼 완충액 (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM 인산완충액, pH 7.5)에 모은다. 상기 합성된 올리고뉴클레오티드-포스포이미다졸리드 중간체에 에틸렌디아민을 최종농도로 250 mM 되게 첨가하고 50 ℃에서 한 시간 동안 반응시켜 포스포로아미데이트 결합을 형성한 후, 세파덱스 G-50 스펀-칼럼 크로마토그래피를 통해 반응물을 분리하였다. 상기의 포스포로아미데이트 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드에 N-하이드록실숙신이미드로 활성화된 메톡시 폴리에틸렌그리콜(Methoxy-PEG-N-hyroxyl succinimide (NHS) derivative, Mw 2,000)을 첨가하여 상온에서 3 시간 반응시켜 산 분해성 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드-PEG를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드와 PEG의 반응 몰비는 1:3 이었다. 상기 합성된 올리고뉴클레오티드-PEG는 역상 HPLC (C-4)를 통해 분리하였다. 올리고뉴클레오티드-PEG는 100 mM 암모니움 아세테이트와 50 % 아세토니트릴(acetonitrile in 100 mM ammonium acetate)의 농도구배법을 이용하여 분리하였다. 상기 올리고뉴클레오티드와 친수성 고분자간의 접합과정에서 형성되는 단계별 생성물은 도 3의 크로마토그램으로부터 확인할 수 있다.In this example, antisense c-myb was used as the oligonucleotide. Oligonucleotides having a phosphate group introduced at the 5 'end were activated with 1-ethyl-3,3-diethylaminopropyl carbodiimide (EDAC) and imidazole to form an oligonucleotide-phosphimidazolide intermediate. First, 1 mg (179 nmol) of oligonucleotide dissolved in 40 l of 5 mM phosphate buffer (pH 6.8) was added to 40 mg EDAC (209 umol), and 100 µl of 1 M imidazole was added to the dissolved solution, followed by reaction at room temperature for 1 hour. I was. The reaction is separated via Sephadex G-50 spun-column chromatography and collected in 100 μl of column buffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM phosphate buffer, pH 7.5). Ethylenediamine was added to the synthesized oligonucleotide-phosphoimidazolide intermediate at a final concentration of 250 mM and reacted at 50 ° C. for one hour to form phosphoramidide bonds, followed by Sephadex G-50 spun-column. The reaction was separated by chromatography. N-hydroxysuccinimide-activated methoxy polyethylene glycol (Methoxy-PEG- N- hyroxyl succinimide (NHS) derivative, Mw 2,000) was added to the oligonucleotide having the phosphoramidate linkage at room temperature. Time reacted to synthesize oligonucleotide-PEG with acid degradable bonds. The reaction molar ratio of oligonucleotide and PEG was 1: 3. The synthesized oligonucleotide-PEG was isolated via reverse phase HPLC (C-4). Oligonucleotide-PEG was isolated using a concentration gradient method of 100 mM ammonium acetate and 50% acetonitrile (acetonitrile in 100 mM ammonium acetate). Step products formed during the conjugation process between the oligonucleotide and the hydrophilic polymer can be identified from the chromatogram of FIG. 3.
도 4는 상기 합성된 산분해성 결합을 포함한 접합체의 산성환경 하에서의 시간에 따른 올리고뉴클레오티드의 분리정도를 보여주고 있다. 산도 7.4 (▼)에서는 올리고뉴클레오티드가 거의 가수분해가 이루어지지 않으나 산도 4.0(●)에서는 매우 빠르게 올리고뉴클레어티드가 분해되어 분리되는 것을 보여준다.Figure 4 shows the degree of separation of oligonucleotides over time in the acidic environment of the conjugate including the acid-degradable bonds synthesized. In acidity 7.4 (▼), the oligonucleotide is hardly hydrolyzed, but in acidity 4.0 (●), the oligonucleotide is rapidly degraded and separated.
<실시예 2> 비 분해성 결합을 지닌 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체의 합성Example 2 Synthesis of Oligonucleotide-PEG Conjugates with Non-Degradable Binding
비 분해성 결합을 통한 올리고뉴클레오티드와 폴리에틸렌글리콜의 접합을 위해, 5' 말단에 아민기(-NH2)를 도입한 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 먼저, 5'말단에 아민기(-NH2)를 도입한 올리고뉴클레오티드 1 mg (179 nmol)을 400 ㎕의 5 mM 인산완충액 (pH 7.4)에 녹인 후, 이 용액을 100 ㎕의 N-하이드로실숙신이미드로 활성화되어 있는 메톡시-폴리에틸렌그리콜 (methoxy-PEG-NHS, Mw 2000)이 녹아있는 용액 (5 mM 인산완충액 (pH 7.4))에 천천히 첨가하고 교반하여 3시간 동안 반응시켜 비 분해성결합인 아미드결합으로 연결된 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체를 합성하였다.For conjugation of the oligonucleotide with polyethylene glycol through non-degradable bond, an oligonucleotide having an amine group (-NH 2 ) introduced at the 5 'end was used. First, 1 mg (179 nmol) of oligonucleotide having an amine group (-NH 2 ) introduced at the 5 'end was dissolved in 400 µl of 5 mM phosphate buffer (pH 7.4), and then 100 µl of N-hydrosil solution was added. It is slowly added to a solution (5 mM phosphate buffer (pH 7.4)) in which methoxy-PEG-NHS (Mw 2000), activated with succinimide, is dissolved. Oligonucleotide-PEG conjugates linked by amide bonds as bonds were synthesized.
<실시예 3> 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀(polyion complex micelles)의 형성과 특성화Example 3 Formation and Characterization of Oligonucleotide-PEG / KALA Polyelectrolyte Complex Mouselles
상기 실시예 1의 방법으로 합성, 분리한 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체를 세포 전달을 위한 형태인 고분자전해질 복합 미셀을 형성하기 위해, 양이온 펩타이드인 KALA 또는 프로타민, 양이온 고분자인 폴리에틸렌이민 등을 사용하였다. KALA를 이용했을 경우의 예를 들어 자세히 설명하면, 먼저 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체를 2x PBS에 1:1로 희석한 후, 역시 PBS에 녹인 KALA를 첨가하여 수용액 상에서 고분자전해질 복합 미셀을 형성하고 미셀의 안정화를 위해 30 분간 상온에 방치하였다. 이때 KALA 펩타이드의 양전하와 올리고뉴클레오티드의 음전하의 전하 비는 1:1 (+/- = 1/1) 이었다.In order to form the polyelectrolyte complex micelle synthesized and separated in the method of Example 1 by the oligonucleotide-PEG conjugate for cell delivery, a cationic peptide, KALA or protamine, a cationic polymer, polyethyleneimine, or the like was used. For example, in the case of using KALA, first, the oligonucleotide-PEG conjugate is diluted 1: 1 in 2x PBS, and then KALA dissolved in PBS is added to form a polymer electrolyte composite micelle in an aqueous solution, It was left at room temperature for 30 minutes for stabilization. At this time, the ratio of the positive charge of the KALA peptide and the negative charge of the oligonucleotide was 1: 1 (+/- = 1/1).
상기의 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합체 미셀의 수용액 상의 크기를 측정하기 위해 동적 광 산란법(dynamic light scattering (DLS) method)를 사용하였다. DLS를 통한 측정결과, 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고이온 접합체 미셀은 70 nm 정도의 크기에 매우 좁은 분산도를 지녔음을 알 수 있었다.Dynamic light scattering (DLS) method was used to measure the size of the oligonucleotide-PEG / KALA polyelectrolyte complex micelle in the aqueous phase. As a result of the measurement by DLS, the oligonucleotide-PEG / KALA high ion conjugate micelles were found to have a very narrow dispersion degree on the order of 70 nm.
<실시예 4> 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀의 세포 내로의 전달효율 검색Example 4 Screening for Delivery Efficiency of Oligonucleotide-PEG / KALA Polyelectrolyte Complex Micelles into Cells
안티센스c-myb과 상보적인 염기서열을 지닌 센스c-myb(sensec-myb) 올리고뉴클레오티드를 형광염료와 접합하고 안티센스c-myb을 포함한 올리고뉴클레오티드-PEG 접합체를 혼성화하였다. 그런 다음 양이온성 펩타이드인 KALA를 첨가하여 고분자전해질 복합 미셀(polyion complex micelles)을 형성하여 세포에 처리하여 세포 내로 미셀이 전달됨을 확인하였다. C-myb antisense oligonucleotide and the complementary nucleotide sequence with the sense c-myb (sense c-myb) joined to nucleotides and fluorescent dyes and oligonucleotide containing the antisense c-myb was hybridizing nucleotide -PEG conjugate. Then, the addition of the cationic peptide KALA to form a polyelectrolyte complex micelles (polyion complex micelles) was treated to the cells to confirm that the micelles are delivered into the cells.
5' 말단에 형광염료(fluorescene isothiocyanate, FITC)를 접합시킨 센스 c-myc 올리고뉴클레오티드를 상기 실시예 1에서 제조한 올리고뉴클레오티드-PEG 용액에 첨가하여 섞은 후, 65℃에서 5분간 가열하고 얼음에서 급랭시킴으로써 혼성화 시켰다. 이렇게 혼성화 되어 형광 염색된 접합체를 2xPBS에 1:1로 희석하고 PBS에 녹아있는 KALA 용액과 섞어 고분자전해질 복합 미셀을 형성하였다. 이때 KALA 펩타이드의 양전하와 올리고뉴클레오티드의 음전하의 전하 비는 1:1 (+/- = 1:1) 이었다. 이렇게 형성된 고분자전해질 복합 미셀을 상온에서 30분 방치한 후, 커버글라스 위에서 배양한 A7R5 평활근세포주 (smooth muscle cell line)에 첨가하고 3시간 동안 배양하여 공유초점현미경 (confocal microscope)으로 미셀의 세포 내 전달을 확인하였다(도 5 A: 본 발명, B: 대조군). 이를 자세히 설명하면, 미리 세포를 한well 당 5 x 104개가 되도록 콜라젠이 코팅된 커버글라스가 들어있는 6-well plate에 분주하고 10 % fetral bovine serum (FBS) 가 포함된 DMEM 혈청 배지에서 24 시간 배양하였다. 형광 염색된 미셀을 첨가하기 전에 세포가 자라고 있던 배지를 버리고, 무혈청 DMEM 배지로 교환해준 후, 형광 염색된 미셀을 20 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그런 다음 PBS로 4회 씻어주고 0.2% 글루타르알데히드와 0.5% 포름알데히드를 함유하는 PBS로 15분간 4℃에서 고정시킨 후 PBS로 씻어내고 세포가 있는 커버글라스를 슬라이드글라스에 놓고 공유초점현미경을 이용하여 세포 내로 전달된 올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 미셀이 세포내로 전달됨을 확인하였다. 대조군으로는 PEG가 접합되지 않고 형광염료 만이 접합된 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.Sense c-myc oligonucleotide conjugated with a fluorescent dye (fluorescene isothiocyanate, FITC) at the 5 'end was added to the oligonucleotide-PEG solution prepared in Example 1, mixed, heated at 65 ° C. for 5 minutes and quenched on ice. By hybridization. The hybridized fluorescently stained conjugate was diluted 1: 1 in 2 × PBS and mixed with the KALA solution dissolved in PBS to form a polymer electrolyte composite micelle. At this time, the ratio of the positive charge of the KALA peptide and the negative charge of the oligonucleotide was 1: 1 (+/- = 1: 1). The polymer electrolyte complex micelle thus formed was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, then added to an A7R5 smooth muscle cell line cultured on a cover glass, incubated for 3 hours, and then transferred into the cell of a micelle using a confocal microscope. (Fig. 5 A: present invention, B: control). To explain this in detail, pre-dispense the cells in 6-well plates containing collagen-coated cover glass to 5 x 10 4 cells per well and 24 hours in DMEM serum medium containing 10% fetral bovine serum (FBS). Incubated. Before adding the fluorescent stained micelles, the medium in which the cells were grown was discarded and replaced with serum-free DMEM medium, and the fluorescent stained micelles were added at a concentration of 20 µg / ml and incubated at 37 ° C. for 3 hours. Then, wash 4 times with PBS, fix with PBS containing 0.2% glutaraldehyde and 0.5% formaldehyde at 4 ℃ for 15 minutes, wash with PBS, cover glass with cells on slide glass and use shared focus microscope It was confirmed that the oligonucleotide-PEG / KALA micelles delivered into the cells were delivered intracellularly. As a control, oligonucleotides in which only fluorescent dyes were conjugated without PEG conjugated were used.
<실시예 5> 안티센스c-myb올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀의 평활근세포주의 증식 저해에 대한 관찰.Example 5 Observation of Proliferation Inhibition of Smooth Muscle Cell Line of Antisense c-myb Oligonucleotide - PEG / KALA Polyelectrolyte Complex Micelle.
안티센스c-myb올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀의 평활근 세포에 대한 증식저해 활성도를 알아보기 위해 세포 수 측정법, 티미딘 섭취량 정량법, 그리고 MTT assay를 이용한 세포 수 측정법을 사용하였다. 본 실시 예에서는 세포 수 측정법에 대해 자세히 설명하겠다. 먼저 평활근 세포주인 A7R5 세포를 6-well plate에 한 well 당 1 x 104개가 되도록 분주하고 10% FBS가 포함된 DMEM에서 24 시간 동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 0.25 FBS가 포함된 DMEM에서 다시 48 시간 동안 배양하였다. 48 시간 후 기존의 배지를 제거한 후, 다시 배지를 10% FBS가 포함된 DMEM으로 교환해 주고 적정농도(20 ug/ml)의 안티센스c-myb올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀을 처리하였다(Day 0). 대조군으로는 미스매치(mismatched) 올리고뉴클레오티드가 포함된 고분자전해질 복합 미셀을 처리한 세포와 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 일정 기간마다 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 떼어내고 heamocytometer를 이용하여 세포의 수를 측정하였다. 이때 생 세포의 숫자를 측정하기 위해 trypan blue exclusion assay를 사용하였다. 도 6은 상기 실험결과 얻어진 평활근 세포주 증식저해 결과 그래프로서 안티센스 뉴클레오티드를 이용한 고분자 전해질 복합 미셀의 경우, 무처리 세포 대조군이나 미스매치 올리고 뉴클레오티드 복합 미셀에 비하여, 평활근의 세포 성장을 억제하는 것을 보여주고 있다.(▼안티센스c-myb올리고뉴클레오티드-PEG/KALA 고분자전해질 복합 미셀, ○: mismatched 올리고뉴클레오티드가 포함된 고분자전해질 복합 미셀, ●: 무처리 세포).Anti - sense c-myb oligonucleotide - PEG / KALA polyelectrolyte complex micelles were used for cell proliferation inhibitory activity against smooth muscle cells. Cell counting, thymidine uptake, and MTT assay were used. In this embodiment, the cell number measurement method will be described in detail. First back in and incubated for 24 hours in DMEM containing the the smooth muscle cell line A7R5 cells 6-well plate the well 1 x 10 frequency divider, and 10% FBS to four sugar to, DMEM was removed the medium and contains a 0.25 FBS Incubate for 48 hours. After 48 hours, the medium was removed and the medium was again exchanged with DMEM containing 10% FBS and the antisense c-myb oligonucleotide - PEG / KALA polyelectrolyte complex micelle was treated at an appropriate concentration (20 ug / ml). (Day 0). As a control group, cells treated with a polyelectrolyte complex micelle containing mismatched oligonucleotides and cells without any treatment were used. The cells were removed by treatment with trypsin-EDTA at regular intervals and the number of cells was measured using a heamocytometer. At this time, trypan blue exclusion assay was used to measure the number of living cells. FIG. 6 shows that the smooth muscle cell line proliferation inhibition result obtained as a result of the experiment showed that the polymer electrolyte conjugated micelles using antisense nucleotides suppressed smooth muscle cell growth as compared to the untreated cell control or mismatched oligonucleotide conjugated micelles. (▼ Antisense c-myb oligonucleotide - PEG / KALA polyelectrolyte complex micelle, ○: polyelectrolyte complex micelle containing mismatched oligonucleotide, ●: untreated cell).
본 발명에 의한 접합체는 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 고분자와의 상호작용을 통해 고분자 전해질 미셀을 형성하여 미셀의 형태로 세포내로 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 전달할 수 있으며, 비교적 낮은 농도에서도 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성을 나타낼 수 있어 생명공학을 위한 기초연구 및 의학분야에서 매우 유용하다.The conjugate according to the present invention forms a polymer electrolyte micelle through interaction with a cationic peptide or a cationic polymer to efficiently deliver oligonucleotides into cells in the form of micelles. It is very useful in basic research and medical field for biotechnology.
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