KR100460442B1 - 남조류 아나배나 사일린드리카를 분해하는 신균주스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스 - Google Patents

남조류 아나배나 사일린드리카를 분해하는 신균주스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남조류 아나배나 사일린드리카를 분해하는 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 부영양화 수계에서 대량으로 발생하는 남조류 아나배나 사일린드리카(Anabaena cylindrica)를 분해, 제거할 수 있는 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)는 기존의 남조류 분해세균과는 달리 특이적으로 아나배나 사일린드리카에 대한 효과적인 생물학적 조절인자로서 남조류 발생을 조절할 수 있다.

Description

남조류 아나배나 사일린드리카를 분해하는 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스{Stenotrophomonas minatitlanensis Lysing Cyanobacterium Anabaena cylindrica}
본 발명은 남조류 아나배나 사일린드리카를 분해하는 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 부영양화 수계에서 대량으로 발생하는 남조류 아나배나 사일린드리카(Anabaena cylindrica)를 분해, 제거할 수 있는 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)는 기존의 남조류 분해세균과는 달리 특이적으로 아나배나 사일린드리카에 대한 효과적인 생물학적 조절인자로서 남조류 발생을 조절할 수 있다.
근대에 이르러 공업화, 도시화, 인구증가, 농경활동 등이 급격히 발달되면서 수질의 부영양화가 가속화되고 있다. 부영양화 수계에서는 조류에 의한 1차 생산력이 증가하는데, 특히 수온이 상승하는 하계에는 남조류(cyanobacteia)의 대발생에 의한 수화(water-bloom)가 발생함으로써 다음과 같은 수생태계의 변화를 초래한다[Freshwater Ecology, Jeffries, M. and D. Mills, 1990; A Eutrophic Lake-Lake Mendota, Brock, T.D. 1985; Microbiology Aspects of Pollution Control, Dart, R.K. and R.J. Stretton, 1980].
1) 빛의 차단에 의해 수중생물의 광합성이 저하됨으로써 먹이 사슬이 파괴된다.
2) 수표면에 대량 증식한 조류가 일시에 소멸하면서 각종 미생물에 의해 분해되는 과정에서 용존 산소가 결핍된다.
3) 대발생을 거친 남조류가 먹이사슬의 상층에 속하는 다른 수생물들에 의해 이용되고 미생물에 의해 분해되는 과정에서 각종 유기물과 질소, 인 등의 무기 염류가 용출되어 수계의 부영양화 현상을 반복 심화시킨다.
4) 이온화되지 않은 암모니아가 어패류 등에 축적되면 심한 독성을 띠면서 수 생태계 및 양식업에 치명적인 피해를 초래하게 된다.
5) 다량의 암모니아가 질산화과정을 통해 질산염으로 바뀌어 상수원에 존재함으로써 공중위생을 위협한다. 아민(amine)과 질산염(nitrate)의 화합물로부터 합성되는 니트로스아민(nitrosamine)은 성인에게 발암물질로 작용하며, 어린아이에게 나타나는 메타에모글로비네미아(methaemoglobinarmia)(일명 '블루 베이비 신드롬'(blue baby syndrome))는 음용수를 통해 흡수한 질소혼합물이 헤모글로빈의 산소를 치환함으로써 발병하는 것으로 알려져 있다[Freshwater Ecology, Jeffries, M. and D. Mills, 1990].
6) 설파이드(sulfide)의 생성 등으로 인해 심한 악취를 유발함으로써 불쾌감을 준다[J. Plankton Res., Galat, D.L. and J. P. Verdin, 1989. 10:771-778].
7) 수표면에 거품(scum)을 형성함으로써 각종 수상생활을 방해하고 정수장의 침전사를 막아 경제적 손실을 초래할 뿐만 아니라 상수원의 정수과정에서 염소처리에 의하여 발암물질인 트리할로메탄(trihalomethane)의 발생 잠재력을 증가시킨다.
8) 독소를 분비함으로써 가축과 야생동물, 사람에게 치명적 피해를 초래한다.
남조류 독소에 의한 야생동물과 가축의 집단폐사 사례는 널리 알려져 있으며, 이들 독소들은 인간에게도 유사한 질병을 유발할 수 있고 발암원으로서 작용할 수 있는 것으로 추정되고 있다[Microalgae, Becker, E.W. 1994; Water Res., Himberg, K., A.M. Keijola, L. Hiisvira, H. Pyysalo and K.Sivonen, 1989, 23:979-984; The Society for Applied Bacteriology Symposium Series No.1, Steel, J.a., 1989]. 우리 나라에서는 삽교호의 경우 이미 1982년 6월에서 9월에 걸쳐 마이크로사이스티스(Microcystis)에 의한 수화 현상이 보고된 이후 신갈호, 대청호, 소양화 등 거의 모든 호수에서 아파니조메논(Aphanizomenon), 아나배나(Anabaena), 마이크로사이스티스 등과 같은 남조류에 의한 수화현상이 관찰되고 있으며[한국육수학회지, 조규송, 김범철, 허우명, 조성주, 1989, 22:179-189], 유속이 있는 낙동강에서도 막대한 지장을 초래하였다. 따라서, 부영양화의 조절 및 남조류의 생장조절에 대한 연구는 공중위생 및 수자원의 원활한 이용을 위하여 시급한 과제이다.
이러한 부영양화에 의한 수화 현상을 방지하기 위해서는 다음 표 1에서 나타낸 방법들이 이용될 수 있으나[Freshwater Ecology, Jeffries, M. and D. Mills, 1990], 이러한 방법들은 기술적, 경제적 측면에서 제한이 있으며[Microbiology Aspects of Pollution Control, Dart, R.K. and R.J. Stretton, 1980], 특히 우리 나라의 경우에는 호소 및 저수지를 중심으로 생활의 터전을 마련하고 있는 사람들의 생존권과 좁은 국토를 고려할 때 그 제어가 현실적으로 힘들다. 따라서 이미 부영양화되어 있는 수역에서의 수화조절을 위하여 적극적인 제어책이 요구되어황산구리(copper sulfate)나 클로린(chlorine)등과 같은 화학물질들을 부분적으로 사용하고 있기도 하지만[Cyanophage ecology, Cannon, R.E. 1987], 이러한 화학물질들은 수화현상 원인 조류에 특이(specific)하지 않을 뿐만 아니라, 이 화학물질들에 의해 영향을 받은 조류들은 독소 화합물(toxic compound)을 내어 먹이 사슬(food chain)을 구성하는 구성원들로서의 역할이 부진해지는 등 생태계의 구성 생물들의 생존에 영향을 미치게 되는 단점을 지닌다. 뿐만 아니라 조류의 수화 현상시 수반되는 환경의 높은 염기적 조건하에서 불안정하므로 많은 양의 처리가 불가피하여 경제적인 측면 및 독성과 부식의 문제가 더욱 심각해진다 할 수 있다[Introduction to Environment Microbiology, Mitchell, 1974].
따라서, 근래에 이르러 수질의 부영양화를 억제하기 위하여 여러 분야에서 생물학적 처리기법의 개발이 활발히 진행되고 있으며, 파지(phage)나 균류(fungi), 동물 플랑크톤(zooplankton), 원생동물(protozoa) 등을 이용한 남조류의 생장을 억제함으로써 부영양화를 조절하고자 하는 연구가 진행된 바 있다[J. Appl. Bacteriol., Barnet, Y.M., M.J. Dart and W.D.P. Steward, 1981, 51:541-552; Cyanophage, Desjardins, 1983]. 시아노파지(Cyanophage)는 남조류에 대해 특이하게 작용한다는 장점이 있지만, 각각의 남조류에 대한 시아노파지를 분리하여 이용하여 하며, 시아노파지 저항성 돌연변이주의 출현에 인하여 대규모 생태계에의 적용에 많은 제약이 있는 것으로 알려졌다[J. Bactreiol., Shilo, M., 1970,104:453-461]. 그리고 세균을 이용한 제어방법의 개발에 대한 연구도 이루어진 바 있지만[New Phytol., Daft and Steward, 1971; Microbial pathogens ofcyanophycean bloom, Steward, W.D.P. and M.J. Dart, 1977, p.177-218; Biological regulation of bloom-causing blue-green algae, Martin, E.l., J.E. Leach and K.J. Kuo, 1978], 대부분이 남조류 세포에 부착된 상태에서 작용하거나 노쇄한 세포에만 작용하는 효율상의 문제점이 있다.
호수 회복(restoration) 테크닉과 그의 작동
테크닉 작동방법
영양분 유입(inflow) 감소
폐수처리 변성된 영양분 주입(input)
폐수/스톰워터(stormwater)전환 (diversion) 영양분 주입(input) 감소
농지의 처리 변성된 영양분 주입
유입(inflow)의 처리 영양분 주입 감소
생성물 변형(예를 들어, 포스페이트 없는 세정제) 영양분 주입 감소
내부 영양분 사이클의 분열
드레징(dredging) 영양분 제거, 불충한 내부 공급
층형성 방지(destratification)/정화(aeration) 혼합이 증가됨에 따라 조류(algae) 생성 감소
하이폴림네틱(hypolimnetic) 정화(aeration) 산소 부족의 보충
영양분 억제(inactivation) 알룸을 첨가하여 침전시키고 인과착화시킴
바닥 밀봉(bollom sealing) 감소된 영양분 방출
호수-수준 조정(lake-level manipulation) 정화(aeration)/노출된 침전물의 고형화
더 높은 열대 수준에 대한 생물학적 사이클링 어류 포획자(predator)/증가된 동물플랑크톤 그레이징(grazing)을 조절하여 조류(algae) 조절
영양분 방출의 증가
생물 수확(biotic harvesting) 매크로피트(macrophytes)의 제거
선택적 (하이폴림네틱(hypolimnetic))방출(dischrage) 영양분이 풍부한 심해의 제거
희석/씻음(flushing) 영양분과 조류(algae) 생체량(biomass) 제거
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 연구한 결과, 부영양화를 일으키는 남조류 아나배나 사일린드리카을 제거하는 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스를 부영양화가 일어나는 수계에서 분리하여 투명대 형성 여부 및 남조류 분해능을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 부영양화를 일으키는 남조류 아나배나 사일린드리카를 분해할 수 있는 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(Stenotrophomonas minatitlanensis)[KFCC - 11299]를 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)를 남조류 론(Cyanobacterial lawn)에서 분리한 사진이다.
도 2는 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)의 남조류 분해능을 측정하기 위하여 남조류 론(Cyanobacterial lawn)에 여과지를 놓고 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)를 접종하여 주변의 투명대 형성 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 남조류에 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)를 첨가한 혼합배양액과 남조류만을 배양한 단일 배양액을 비교한 사진이다.
도 5는 남조류와 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)를 혼합 배양 후, 남조류의 클로로필 에이(Chlorophyll a) 값과 분리세균의 세포 수 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 남조류 아나배나 사일린드리카(Anabaena cylindrica)를 분해할 수 있는 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(Stenotrophomonas minatitlanensis) [KFCC - 11299]를 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 남조류 아나배나 사일린드리카를 분해하는 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 부영양화 수계에서 대량으로 발생하는 남조류 아나배나 사일린드리카를 분해, 제거할 수 있는 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스는 아나배나 사일린드리카에 대한 효과적인 생물학적 조절인자로서 남조류 발생을 조절할 수 있다.
우선 부영양화가 일어나는 수계에서 수질시료와 토양을 채취하여 균주 분리용 시료로 사용하여 미생물을 순수 분리한 후 활성이 우수한 미생물을 최종 선별한다.
최종적으로 선별된 균주 중 남조류 아나배나 사일린드리카 분해능이 가장 우수한 미생물을 동정한 결과, 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스와 유사한 성질을 갖는 근연균으로 동정되었으며, 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(Stenotrophomonas minatitlanensis)로 명명하였다. 한국미생물보존센터에 2002년 2월 28일에 기탁하였으며, 수탁번호는 KFCC - 11299이다.
상기 균주의 남조류 분해능을 알아보기 위하여 투명대 형성 여부를 확인하였고, 남조류와 혼합배양시켜 남조류가 분해, 제거되는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)는 해로운 효과를 가지는 남조류 아나배나 사일린드리카에 대한 효과적인 생물학적 조절인자로서 남조류 발생을 조절함으로써 환경친화적으로 생태계를 복원할 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미생물의 분리
부영양화가 일어나는 수계에서 수질시료를 채취하고, 저층의 토양시료는 적당량의 증류수에 현탁하여 접종시료를 준비하였다. BG-11 배지에서 5 ∼ 7일간 배양한 남조류 아나배나 사일린드리카를 원심분리하여 4 ×107∼ 5 ×107cell/㎖이 되게 BG-11 배지(2×)에 현탁하고, 현탁액 3 ㎖와 1 ㎖의 상기 접종시료, 3 ㎖의 1.0% 용융 한천(agar)을 45 ℃에서 잘 섞어(상부 한천 층)에 미리 준비된 1.0% 한천이 첨가된 고체 선택배지(BG-11, 하부 한천 층)에 부어 균일하게 퍼지게 하였다. 상부 한천 층 형성을 효과적으로 하기 위하여 4시간 가량 실온에서 방치한 후 28 ℃, 40 μMm-2s-1의 조건에서 배양하였다. 배양도중 수시로 배지상에 나타나는 투명대(hollow zone)의 형성 여부를 도 1과 같이 관찰하고, 투명대를 형성하는 콜로니(colony)는 루프(loop)를 이용하여 분리하여 박테리아의 생장을 위한 LB 배지(Trypton 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g/1ℓD.W)에 도말(streaking)하여 배양하였다. 형성되는 콜로니를 3 ∼ 5회 연속 계대배양하여 순수한 균주를 얻었다.
실시예 2: 미생물의 동정
몇 년 전까지만 하더라도 미생물 동정시에 배양학적, 형태학적, 생리 생화학적 특징을 조사하여 Bergy's Manual을 비교하고 참조하여 동정을 하였고, 그 이후에는 Biolog test를 하여 동정을 하였으나, 요즘에는 16S rRNA의 염기서열을 가지고 GeneBank와 같은 웹 검색 프로그램에서 염기서열을 입력하면 그 웹상에 있는 데이타베이스에서 매취(match)하여 동정하는 방법을 사용한다.
물론 생리 생화학적 실험과 동시에 16S rRNA의 염기서열 분석 두 가지를 가지고 실험을 하는 것이 더 좋지만, 16S rRNA의 염기서열은 계속 발견되는 균주마다 등록이 되어 업데이트(update)가 되어가고 있는 반면 위의 두 방법은 이제는 데이타베이스의 업데이트가 되어지고 있지 않다보니 16S rRNA 염기서열을 가지고 동정한 균주가 Bergy's Manual이나 Biolog의 데이타베이스에는 명시되어 있지 않는 것이 있기 때문에 이런 경우는 생리 생화학적 실험을 하더라도 일치하는 균주가 없는 실정이다.
그리고, 16S rRNA의 염기서열 분석에서 염기서열을 약 1500 base를 분석하여 GeneBank상에서 96% 내지 99% 일치하는 균주를 얻었기 때문에 Bergy's Manual이나 Biolog test 보다 더 정확하리라 판단된다.
이렇게 상기 분리균주의 16S rRNA를 이용하여 시퀀싱하고 GeneBank상에서 염기서열을 비교 분석한 결과, 등록된 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스 염기서열 1536개 중 1529개가 일치하여 99%의 상동성을 가짐을 확인하였고 염기서열은 도 2에 나타내었다.
이상의 결과로부터 본 분리균주는 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스와 유사한 성질을 갖는 근연균으로 동정되었으며, 이를 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(Stenotrophomonas minatitlanensis)라 명명하고, 이를 한국미생물보존센터에 2002년 2월 28일에 기탁하였으며 수탁번호는 KFCC - 11299이다.
실시예 3: 신균주의 투명대 형성 확인
상기 분리균주의 남조류 분해능을 확인하기 위하여 남조류 론(Cyanobacterial lawn) 위에 지름 5 ㎜ 크기의 여과지를 올려놓고 배양한 세균을 20 ㎕씩 접종하여 7일 동안 28 ℃, 40 μMm-2s-1의 빛 조건에서 배양한 결과 도 3과 같이 여과지 주변에 투명대를 형성하는 것을 관찰하였다.
실시예 4: 신균주의 남조류 분해능 조사
남조류 아나배나 사일린드리카를 원심분리법을 통하여 농축하고 새로운 BG-11 액체 배지 100 ㎖에 접종하고, 상기의 방법으로 분리한 신균주 2 ㎖를 이 BG-11 배지에 접종하여 28 ℃, 40 μMm-2S-1의 빛 조건에서 혼합배양하였다. 그 결과, 도 4에서와 같이 신균주를 접종한 배양액에서 남조류가 분해되는 것을 확인하였다. 또한, 도 5와 같이 남조류와 분리세균을 접종한 혼합 배양액과, 분리세균을 접종하지 않은 단일 배양액과의 클로로필 에이(chlorophyll a) 값을 비교한 결과 혼합 배양액에서 접종 4일째에 단일 배양액에 비하여 50%대로 클로로필 에이(chlorophyll a) 값이 감소하는 것을 보였고 접종 6일째에는 단일 배양액에 비하여 30%대로 감소함을 볼 수 있었고, 신균주는 이와 반비례적으로 성장하는 것을 확인하였다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 신균주 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC - 11299)는 남조류 아나배나 사일린드리카를 효과적으로 분해할 수 있어 남조류에 의해 부영양화가 일어나는 수계에서 이 균주를 이용하면 기존에 사용했던 물리, 화학적인 방법 보다 경제적이면서 환경친화적이다. 따라서, 생태계 복원에 매우 유용하리라 기대된다.
<110> HANYANG HAK WON CO., LTD. <120> Stenotrophomonas minatitlanensis Lysing Cyanobacterium Anabaena <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1536 <212> DNA <213> Stenotrophomonas minatitlanensis(KFCC-11299) <400> 1 gagttggatc ctggctcaga gtgaacgctg gcggtaggcc taacacatgc aagtcgaacg 60 gcagcacagg agagcttgct ctctgggtgg cgagtggcgg acgggtgagg aatacatcgg 120 aatctacctt ttcgtggggg ataacgtagg gaaacttacg ctaataccgc atacgaccta 180 cgggtgaaag tgggggaccg caaggcctca cgcgattaga tgagccgatg tccgattagc 240 tagttggcgg ggtaatggcc caccaaggcg acgatcggta gctggtctga gaggatgatc 300 agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt 360 ggacaatggg cgcaagcctg atccagccat accgcgtggg tgaagaaggc cttcgggttg 420 taaagccctt ttgttgggaa agaaatcctg tcgattaata ctcggtgggg atgacggtac 480 ccaaagaata agcaccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggtgcaag 540 cgttactcgg aattaccggg cgtaaagcgt gtgtaggtgg tggtttaagt ctgctgtgaa 600 agccctgggc tcaacctggg aattgcagtg gatactggat cactagagtg tggtagaggg 660 atgcggaatt tctggtgtag cagtgaaatg cgtagagatc agaaggaaca tccgtggcga 720 aggcggcatc ctgggccaac actgacactg aggcacgaaa gcgtggggag caaacaggat 780 tagataccct ggtagtccac gccctaaacg atgcgaactg gatgttgggt gcaacttggc 840 acccagtatc gaagctaacg cgttaagttc gccgcctggg gagtacggtc gcaagactga 900 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag tatgtggttt aattcgatgc 960 aacgcgaaga accttacctg gtcttgacat ccacggaact ttccagagat ggattggtgc 1020 cttcgggaac cgtgagacag gtgctgcatg gctgccgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080 ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg tccttagttg ccagcacgta atggtgggaa 1140 ctctaaggag accgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg 1200 gcccttacga ccagggctac acacgtacta caatggtggg gacagagggc tgcaaacccg 1260 cgagggtgag ccaatcccag aaaccctatc tcagtccgga ttggagtctg caactcgact 1320 ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcag aacagcattg ctgcggtgaa tacgttcccg 1380 ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtttgtt gcaccagaag caggtagctt 1440 aaccttcggg agggcgcttg ccacggtgtg gccgatgact ggggtgaagt cgtaacaagg 1500 tagccgtatc ggaaggtgcg gctggatccc ctcctt 1536

Claims (2)

  1. 남조류 아나배나 사일린드리카(Anabaena cylindrica) 분해능을 갖는 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(Stenotrophomonas minatitlanensis)[KFCC - 11299].
  2. 스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스(KFCC-11299)를 이용하여 남조류 아나배나 사일린드리카(Anabaena cylindrica)를 분해시키는 것을 특징으로 하는 남조류의 제거방법.
KR10-2002-0013923A 2002-03-14 2002-03-14 남조류 아나배나 사일린드리카를 분해하는 신균주스테노트로포노나스 미나티틀라넨시스 KR100460442B1 (ko)

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Title
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Lysis of blue-green algae by myxobacter. J Bacteriol. 1970 Oct;104(1):453-61. *

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