KR0179641B1 - 모라셀라 속 균주와 이를 이용한 남조류의 제거방법 - Google Patents

모라셀라 속 균주와 이를 이용한 남조류의 제거방법 Download PDF

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Abstract

대청호 수계로부터 분리한 모라셀라 속 균주는 수생태계에 치명적인 영향을 주는 남조류의 생장을 억제할 수 있어 수화 및 부영양화 조절을 할 수 있다. 또한, 현재까지 알려진 남조류 분해세균은 남조류 세포에 부착한 상태거나 노쇠한 세포에만 작용하는 것으로 알려져 있는 반면, 본 분리세균은 남조류 세포와 분리된 상태에서 기능물질을 분비함으로써 남조류 세포를 분해하므로, 남조류의 모든 생장과정에서 분해활성을 나타낸다는 점에서 매우 특이하며, 이용의 가능성이 높다.

Description

모라셀라 속 균주와 이를 이용한 남조류의 제거방법
제1도는 본 발명의 분리세균을 남조류에 접종하여 배양한 결과를 나타낸 사진.
제2도는 본 발명의 분리세균과 남조류를 혼합 배양한 배지와 남조류만을 배양한 배지를 비교한 사진.
제3도는 남조류와 본 발명의 분리세균을 혼합 배양한 후 남조류 세포의 수와 분리세포의 수 변화를 나타낸 그래프.
제4도는 (a)는 남조류와 본 발명의 분리세균을 혼합 배양한 것을 40,000배 확대한 전자 현미경 사진.
제4도의 (b)는 남조류와 본 발명의 남조류를 분해하는 기능을 갖는 효소를 혼합 배양한 것을 5,000배 확대한 전자 현미경 사진.
제4도의 (c)는 남조류와 본 발명의 남조류를 분해하는 기능을 갖는 효소를 혼합 배양한 것을 90,000배 확대한 전자 현미경 사진.
제5도의 (a)~(f)는 서로 다른 종의 남조류 론에 본 발명의 분리세균을 접종하여 배양한 사진.
[산업상 이용분야]
본 발명은 Moraxella sp. 균주에 관한 것으로서, 상세하게는 Moraxella sp. 균주, 이들이 분비하는 효소 및 이들을 이용하여 부영양화 수계에서 대량으로 발생하는 남조류를 제거하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
근대에 이르러 공업화, 도시화, 인구증가, 농경활동 등이 급격히 발달되면서 수질의 부영양화가 가속화되고 있다. 부영향와 수계에서는 조류에 의한 1차 생산력이 증가하는데, 특히 수온이 상승하는 하계에는 남조류(cyanobacteria)의 대발생에 의한 수화(water-bloom)가 발생함으로써 다음과 같은 수생태계의 변화를 초래한다(Jeffries and Mill, 1990; Brock, 1985; Dart 등, 1980).
1) 빛의 차단에 의해 수중생물의 광합성이 저하됨으로써 먹이 사슬이 파괴된다.
2) 수표면에 대량증식한 조류가 일시에 소멸하면서 각종 미생물에 의해 분해되는 과정에서 용존산소가 결핍된다.
3) 대발생을 거친 남조류가 먹이사슬의 상층에 속하는 다른 수생물들에 의해 이용됨으로써, 그리고 미생물에 의해 분해되는 과정에서 각종 유기물과 질소, 인등의 무기 염류가 용출되어 수계의 부영양화 현상을 반복 심화시킨다.
4) 이온화되지 않은 암모니아가 어패류 등에 축적되면 심한 독성을 띠면서 수생태계 및 양식업에 치명적인 피해를 초래하게 된다.
5) 다량의 암모니아가 질산화과정을 통해 지산염으로 바뀌어 상수원에 존재함으로써 공중위생을 위협한다. 아민(amine)과 질산염(nitrate)의 화합물로부터 합성되는 니트로스아민(nitrosamine)은 성인에게 발암물질로 작용하며, 어린 아이에게 나타나는 메타에모글로비네미아(methaemoglobinarmia)(일명 '블루 베이비 신드롬'(blue baby syndrome))은 음용수를 통해 흡수한 질소화합물이 헤모글로빈의 산소를 치환함으로써 발병하는 것으로 알려져 있다(Jeffries and Mills, 1990).
8) 설파이드(sulfide)의 생성 등으로 인해 심한 악취를 유발함으로써 불쾌감을 준다(Dart 등, 1980; Galat, 1989).
9) 수표면에 거품(scum)을 형성함으로써 각종 수상생활을 방해하고 정수장의 침전사를 막아 경제적 손실을 초래할 뿐만 아니라 상수원의 정수과정에서 염소처리에 의하여 발암물질인 트리할로메탄(trihalomethane)의 발생 잠재력을 증가시킨다.
10) 독소를 분비함으로써 가축과 야생동물, 사람에게 치명적 피해를 초래한다. 독소를 분비하는 대표적인 남조류로는 Microcystis와 Oscillatoria, Aphanizomenon, Anabaena, Synechococcus, Coelosphaerum, Nodularia, Gloeotricha, Trichodesmium, Nostoc 등이 있으며, 이들이 분비하는 독소는 크게 신경독소와 간독소 2가지로 나누어진다.
남조류의 독소에 의한 야생동물과 가축의 집단폐사 사례는 널리 알려져 있으며, 이들 독소들은 인간에게도 유사한 질병을 유발할 수 있고 발암원으로서 작용할 수 있는 것으로 추정되고 있다(Becker, 1994; Himberg 등, 1989; Steel, 1971).
우리나라에서는 삽교호의 경우 이미 1982년 6월~9월에 걸쳐 Microcystis에 의한 수화현상이 보고된 이후 신갈호, 대청호, 소양호 등 거의 모든 호수에서 Aphanizomenon, Anabaena, Microcystis 등과 같은 남조류에 의한 수화현상이 관찰되고 있으며(조 등, 1989), 유속이 있는 낙동강에서도 막대한 지장을 초래하였다. 따라서 부영양화의 조절 및 남조류의 생장조절에 대한 연구는 공중위생 및 수자원의 원활한 이용을 위하여 시급한 과제이다.
이러한 부영양화에 의한 수화현상을 방지하기 위해서는 표 1에 나타낸 방법들이 이용될 수 있으나(Welch, 1984), 이러한 방법들은 기술적, 경제적 측면에서 제한이 있으며(Dart와 Stretton, 1980), 특히 우리나라의 경우에는 호소 및 저수지를 중심으로 생활의 터전을 마련하고 있는 사람들의 생존권과 좁은 국토를 고려할 때 그 제어가 현실적으로 힘들다. 따라서 이미 부영양화되어 있는 수역에서의 수화조절을 위하여 적극적인 제어책이 요구되어 황산 구리(copper sulfate)나 클로린(chlorine)등과 같은 화학물질들을 부분적으로 사용하고 있기도 하지만(Cannon, 1987), 이러한 화학물질들은 수화현상 원인 조류에 특이(specific)하지 않을 뿐만 아니라, 이 화학물질들에 의해 영향을 받은 조류들은 독소 화합물(toxic compound)을 내어 먹이 사슬(food chain)을 구성하는 구성원들로서의 역할이 부진해지는 등 생태계 구성 생물들의 생존에 영향을 미치게 되는 단점을 지닌다. 뿐만 아니라 조류의 수화현상시 수반되는 환경의 높은 염기적 조건하에서 불안정하므로 많은 양의 처리가 불가피하여 경제적인 측면 및 독성과 부식의 문제가 더욱 심각해진다 할 수 있다(Mitchell, 1974). 따라서 근래에 이르러 수질의 부영양화를 억제하기 위하여 여러 분야에서 생물학적 처리기법의 개발이 활발히 진행되고 있으며, 파지(phage)나 균류(fungi), 동물플랑크톤(zooplankton), 원생동물(protozoa) 등을 이용한 남조류의 생장을 억제함으로써 부영양화를 조절하고자 하는 연구가 진행된 바 있다.(Barnet et al., 1981; Desjardins, 1983). 시아노파지(Cyanophage)는 남조류에 대해 특이하게 작용한다는 장점이 있지만, 각각의 남조류에 대한 시아노파지를 분리하여 이용해야 하며, 시아노파지 저항성 돌연변이주의 출현에 인하여 대규모 생태계에의 적용에 많은 제약이 있는 것으로 알려졌다(Shilo, 1971).
그리고 세균을 이용한 제어방법의 개발에 대한 연구도 이루어진 바 있지만(Daft와 Stewart, 1971; Stewart와 Daft, 1977; Martin 등, 1978) 대부분이 남조류 세포에 부착된 상태에서 작용하거나 노쇄한 세포에만 작용하는 효율상의 문제점이 있다.
[본 발명이 해결하려는 과제]
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 첫째, 남조류를 분해할 수 있는 Moraxella sp.의 균주를 제공하고, 둘째, 남조류를 분해할 수 있는 효소를 제공하고, 셋째, 상기 Moraxella sp.의 균주 또는 상기 효소를 이용하여 수온이 상승하는 하계에 남조류가 대량으로 발생함에 따라 발생되는 수화 현상을 방지할 수 있는 방법을 제공하며, 네째, 따라서 환경을 보호하면서도 수자원을 원활히 이용할 수 있도록 Moraxella sp.의 균주를 제공하는 것이다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 높은 pH에서도 활성을 유지하고, 남조류의 영양 세포를 분해할 수 있는 한국종균협회에 제KFCC-10884호로 기탁된 미생물의 성질을 갖는 Moraxella sp.을 제공한다.
또한, 상기 Moraxella sp.을 배양하고; 상기 배양한 Moraxella sp.을 남조류와 반응시키는 공정을 포함하는 남조류의 제거방법을 제공한다.
상기한 Moraxella sp.이 방출하는 남조류를 분해하는 기능을 갖는 효소를 또한 제공한다.
상기한 본 발명에 있어서, 상기한 효소는 원심분리법으로 농축한 남조류를 BG-11 액체배지에 접종하고; 상기 제1항의 Moraxella sp.을 상기 BG-11 배지에 접종하여 혼합배양한 후; 상기 혼합배양물을 약 10시간 방치한 시료와 상기 Moraxella sp.의 세균외 물질을 농축하는 공정으로 제조된다.
상기한 효소를 남조류 생장배지에 투여하고; 상기 혼합물을 빛조건에서 배양하는 공정을 포함하는 남조류의 제거방법을 역시 제공한다.
또한, Moraxella sp.를 남조류 분해에 이용하는 방법을 제공한다.
[실시예]
이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[Moraxella sp.의 분리방법]
경기도 일대의 저수지와 대청호에서 수질시료를 채취하고, 다양한 토양시료는 적당량의 증류수에 현탁하여 접종시료를 준비하였다. BG-11 배지에서 5~7일간 배양한 남조류의 일종인 Anabaena cylindrica를 원심분리하여 4x10 ~5x10 cell/㎖이 되게 BG-11 배지(2x)에 현탁하고, 현탁액 3㎖와 1㎖의 상기 접종시료, 3㎖의 1.5% 용융 한천(agar)을 45℃에서 잘 섞어(상부 한천 층) 미리 준비된 1.5% 한천이 첨가된 고체 선택배지(BG-11, 하부 한천 층)에 부어 균일하게 퍼지게 하였다. 상부 한천 층 형성을 효과적으로 하기 위하여 4시간 가량 실온에서 방치한 후에 25±1℃, 40μMm s 의 조건에서 배양하였다.
배양 도중 수시로 배지상에 나타나는 투명대(hollow zone)의 형성 여부를 관찰하고, 투명대를 형성하는 콜로니(colony)는 루프(loop)를 이용하여 분리하여 박테리아의 생장을 위한 복합배지(BG-11+0.2% casitone)에 스트리킹(streaking)하여 배양하였다. 형성되는 콜로니를 3~5회 연속 계대배양하여 순수한 균주를 얻었다.
상기한 과정을 거쳐 얻어진 균주의 남조류 생장억제능을 확인하기 위하여 상기의 이중층 방법을 통한 클리어 존 형성을 관찰하고, BG-11 배지에 남조류와 분리균주를 혼합접종하여 빛조건에서 배양하면서 일정 시간 간격으로 남조류 세포(cyanobacteria cells)를 헤마사이토미터(haemacytometer)를 이용하여 광학 현미경하에서 직접 카운팅하므로써 남조류의 분해능이 가장 우수한 균주를 선택 분리하였다.
상기 분리한 균주를 순수배양후 남조류 론(cyanobacterial lawn)에 접종하여 5일간 빛조건에서 배양한 결과 제1도와 같이 콜로니를 중심으로 넓은 투명대를 형성하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 액체배지에서 남조류와 분리세균을 혼합배양하였을 때, 제2도에서와 같이 세균을 접종한 배지에서는 남조류의 생장이 이루어지지 않는 것을 확인하였다.
본 발명자는 상기한 균주를 1995년 12월 8일자로 사단법인 한국종균협회에 수탁번호 KFCC-10884로 기탁하였다.
(Moraxella sp.의 확인방법)
상기한 방법에 따라 얻은 균주가 Moraxella sp.임을 하기한 표 2에 나타낸 성상 측정 결과를 기초로 버기스 매뉴얼을 사용하여 확인하였다.
[실시예 1~12]
상기한 방법으로 Moraxella sp.인지 확인한 후, 하기한 표 3과 같이 남조류의 종류를 바꾸면서 상기한 이중 층 한천 테크닉을 통하여 투명대 형성 여부를 확인하였으며, 그 결과 중 실시예 2,6,7,8,9,11의 사진을 제5도에 (a)~(f)로 각각 나타내었다. 또한, 액체배지에 남조류와 상기한 분리세균을 혼합배양하면서 남조류의 소멸을 확인하여 그 분해능을 하기한 표 3에 나타내었다.
[실시예 13]
남조류의 일종인 Anabaena cylindrica를 원심분리법을 통하여 농축한 다음 새로운 BG-11 액체 배지에 접종하고, 상기한 방법으로 분리한 분리세균 1㎖를 이 BG-11 배지에 접종하여 25±1℃, 40μMm S 의 빛조건에서 혼합배양하였다. 그 결과 제3도에서와 같이 남조류의 영양 세포(vegetative cells)는 24시간 정도 경과 후에 완전히 소멸되었으며, 분리세균은 이와 반비례적으로 성장하는 것을 확인하였다.
[실시예 14]
상기 실시예 13에서 혼합 배양한 배양물을 10시간 경과 후의 시료와 분리세균의 세포의 물질을 농축하여 단백질 양을 정량한 후, 0.08mg/㎖ 정도의 단백질이 함유된 시료를 남조류 생장배지에 투여하여 25±1℃, 40μMm S 의 빛조건에서 2시간동안 배양하여 각각을 전자현미경으로 관찰한 결과 제4도의 (a)~(c)에서와 같이 남조류 세포의 세포벽이 완전히 분해되고, 세포 내용물만 존재하는 것을 알 수 있다.
[효과]
상기한 본 발명의 Moraxella sp. 균주는 다양한 종의 남조류 세포를 효과적으로 분해하며, 남조류의 모든 생장과정에서 분해활성을 나타내고, 수화 발생시에 형성되는 높은 pH 조건(pH 9)에서도 남조류의 생장을 억제할 수 있어서 남조류에 의한 환경 문제를 해결할 수 있다.
또한, 현재까지 알려진 남조류 분해세균은 남조류 세포에 부착한 상태거나 노쇠한 세포에만 작용하는 것으로 알려져 있는 반면, 본 분리세균은 남조류 세포와 분리된 상태에서 기능물질을 분비함으로써 남조류 세포를 분해하므로, 남조류의 모든 생장과정에서 분해활성을 나타낸다는 점에서 매우 특이하며, 이용의 가능성이 높다. 특히 세포의 기능물질을 분리, 농축하여 사용할 경우에는 더 높은 효율을 얻을 수 있다.

Claims (3)

  1. 높은 pH에서도 활성을 유지하며, 남조류의 영양 세포를 분해할 수 있는 한국종균협회에 제KFCC10884호로 기탁된 미생물의 성질을 갖는 Moraxella sp.
  2. 제1항의 Moraxella sp.을 배양하고; 상기 배양한 Moraxella sp.을 남조류와 반응시키는; 공정을 포함하는 남조류의 제거방법.
  3. 한국종균협회에 제KFCC-10884호로 기탁된 미생물의 성질을 갖는 Moraxella sp.를 남조류 분해에 이용하는 방법.
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