KR100440613B1 - Serum cholesterol lowering agent to use phytosterol and bio-flavonoid and methods for preparing them - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가장 부작용이 적고 혈중 콜레스테롤을 효과적으로 낮출 수 있도록 하기 위한 식물성스테롤과 생 플라보노이드의 결합체를 이용한 혈중 콜레스테롤 저하제의 제조방법에 관한 것으로, 종래에도 많은 방법에 의하여 혈중 콜레스테롤을 저하시키기 위하여 시도가 있었으나 가격이 비싸고, 많은 부작용이 있어서 효과적이지 못하였다.The present invention relates to a method for preparing blood cholesterol lowering agents using a combination of phytosterols and raw flavonoids in order to effectively lower blood cholesterol with the least side effects, and there have been attempts to lower blood cholesterol by many methods. The price was expensive and many side effects were not effective.
본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 식물성스테롤(phytosterol)과 디카르복실산(dicarboxylic acid)과의 반응에서 식물성스테롤(phytosterol)의 유도체를 만들고, 다시 이들과 생 플라보노이드(bio-flavonoid)와의 반응에 의하여 얻은 스테롤-플라보노이드 결합물을 제공하여 이를 혈중 콜레스테롤 저하제로 사용하는데 그 특징이 있다.In order to solve this problem, the present invention makes derivatives of phytosterol in the reaction of phytosterol and dicarboxylic acid, and again in the reaction of these with bio-flavonoids. It is characterized by providing a sterol-flavonoid combination obtained by the blood cholesterol lowering agent.
Description
본 발명은 혈중 콜레스테롤을 효과적으로 감소시키기 위한 식물성스테롤과 생 플라보노이드의 결합체를 이용한 혈중 콜레스테롤 저하제의 제조방법과 이에 의해 제조한 혈중 콜레스테롤 저하제에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing a blood cholesterol lowering agent using a combination of phytosterols and raw flavonoids for effectively reducing blood cholesterol and a blood cholesterol lowering agent prepared thereby.
일반적으로 콜레스테롤은 세포막이나 스테로이드 호르몬 형성 등 인체 내에서 매우 중요한 물질로 알려져 있다.In general, cholesterol is known as a very important substance in the human body, such as the formation of cell membranes and steroid hormones.
그러나 혈중 콜레스테롤 특히 LDL(low-density lipoprotein)콜레스테롤이나 혈중 지질의 농도가 지나치게 높고, HDL(high-density lipoprotein) 콜레스 테롤이 낮은 수준을 유지하게 되면 고콜레스테롤증 (hypercholesterolemia)이나 동맥경화증(atherosclerosis)의 가능성이 더욱 증가하고 심혈관 질환 (cpronary heart disease:CHD)을 일으켜서 결국 사망하거나 볼구가 될 수 있다,However, hypercholesterolemia or atherosclerosis may occur when blood cholesterol levels, especially low-density lipoprotein (LDL) cholesterol or blood lipids, are too high, and high-density lipoprotein (HDL) cholesterol is maintained at low levels. Increase the likelihood and cause cpronary heart disease (CHD), eventually leading to death or buccal
따라서 혈중 콜레스테롤 양의 적절한 유지는 각종 질환을 예방할 수 있는 중요한 요소중의 하나이다.Therefore, proper maintenance of blood cholesterol level is one of the important factors to prevent various diseases.
이러한 콜레스테롤은 생체 내에서 다단계를 거쳐 합성되거나 장에서 흡수되어 필요한 곳에 이용된다.These cholesterols are synthesized in multiple stages in vivo or absorbed in the intestine and used where needed.
그러나 필요 이상의 콜레스테롤은 혈중에 과량 존재하게 되면서 동맥에 침착하게 되어 질병을 일으키기 때문에 종래에도 혈중 콜레스테롤을 낮추는 방법으로 음식물 섭취로 인한 콜레스테롤의 흡수를 억제하는 방법과 간에서의 콜레스테롤 생합성(biosynthesis)을 억제하는 방법이 주로 사용되고 있다.However, since excess cholesterol is excessively present in the blood, it is deposited in the arteries and causes disease. Therefore, the method of lowering cholesterol in the blood conventionally suppresses the absorption of cholesterol from food intake and inhibits the biosynthesis of the liver. This method is mainly used.
즉, 혈중 콜레스테롤을 감소시키기 위해서 우선 음식에서 콜레스테롤이나 포화지방산의 섭취를 억제하고 운동량을 늘리는 방법이 권장되고 있으나 쉽지도 않고 큰 효과를 나타내기 어려운 문제점이 있다.In other words, in order to reduce blood cholesterol, a method of inhibiting intake of cholesterol or saturated fatty acids in food and increasing exercise amount is recommended, but it is not easy and does not have a great effect.
이러한 단점을 해결하기 위하여 훨씬 더 구체적인 방법으로 장에서 콜레스테롤의 흡수를 억제하고 운동량을 늘리는 방법이 권장되고 있으나 쉽지도 않고 큰 효과를 나타내기 어려운 문제점이 있다.In order to solve these disadvantages, the method of inhibiting the absorption of cholesterol and increasing the amount of exercise in the intestine in a much more specific way is recommended, but it is not easy and does not have a great effect.
또 다른 방법으로는 장에서 콜레스테롤의 흡수를 억제하는 방법이 있는데, 이를 위해서 몇몇 치료제나 보조식품 등이 이용되고 있지만 효능과 부작용에서 많은 차이를 보이고 있다.Another method is to suppress the absorption of cholesterol in the intestine, which is used for several treatments and supplements, but there are many differences in efficacy and side effects.
그 중에서도 가장 부작용이 적고 혈중 콜레스테롤을 효과적으로 낮출 수 있는 물질로 식물성 스테롤(phytosterol)이 주목받아 왔다.Among them, vegetable sterol (phytosterol) has been attracting attention as the substance having the least side effects and effectively lowering blood cholesterol.
이러한 식물성 스테롤(phytosterol)은 콜레스테롤과 구조가 매우 유사하며 주로 채소나 식물성 오일등으로 인체에 섭취되는 것으로 알려져 오고 있으나 식물성 스테롤이 인체내에 혈중 콜레스테롤을 감소시키는 메카니즘은 명확하지 않다.These phytosterols are very similar in structure to cholesterol and are known to be consumed by the human body mainly as vegetables or vegetable oils, but the mechanism by which phytosterols reduce blood cholesterol in the body is not clear.
그러나 구조상의 유사성으로 인하여 경쟁반응으로 콜레스테롤의 흡수를 방해하는 것으로 생각된다(참조:Atherosclerosis,28,325(1977)).However, due to structural similarities, competition is thought to interfere with the absorption of cholesterol (Atherosclerosis, 28, 325 (1977)).
천연 식물성 스테롤들은 구조면에서 기본 골격은 같고 가지 사슬만 약간 다르며 독성이 없고 값싸게 얻을 수 있으며, 콜레스테롤의 흡수를 효과적으로 억제하는 대표적인 스테롤에는 시토스테롤(sitosterol), 캄피스테롤campesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol)등이 주종을 이룬다.Natural vegetable sterols have the same basic skeleton in structure, slightly different branch chains, and are non-toxic and inexpensive, and representative sterols that effectively suppress the absorption of cholesterol include sitosterol, campesterol and stigmasterol. The back is predominant.
이들은 체내에 섭취된후 장에서 일부만 흡수되었다가 다시 체외로 배출되므로 과량 섭취되어도 소량만이 체내에 남게되어 인체에 큰 부작용이 없다.They are ingested in the body and then absorbed only partially by the intestine and then discharged out of the body, so even when ingested, only a small amount remains in the body and there are no major side effects.
따라서 식물성 스테롤 자체가 콜레스테롤의 흡수를 방해 하는 물질로서 많은 연구가 되어 왔으며 이들의 유사물질로서 수소화 물질인 스타놀(stanol)이나 지방산 에스테르(fatty acid ester) 화합물등이 알려 졌고 (참조:J.Lipid Res.,20,646(1979)), 최근에는 시토스타놀의 에스테르 화합물이 첨가된 마아가린이 시판되었다.Therefore, vegetable sterols themselves have been studied as a substance that interferes with the absorption of cholesterol, and as their analogues, stanols and fatty acid ester compounds, hydrogenated substances, are known (see J.Lipid). Res., 20,646 (1979)), and recently, margarine to which ester compounds of cytostolol are added is commercially available.
그러나 이러한 효과에도 불구하고 실제로는 식물성 스테롤이 소장의 미셀(micelle)상태 내에서 극히 소량만이 흡수가 일어난다는 단점이 있어서 실제의 효과를 얻기 위해선 과량 섭취해야 한다는 어려움이 있다.In spite of these effects, however, there is a drawback that only a small amount of vegetable sterol is absorbed in the micelle state of the small intestine.
따라서 이러한 단점을 극복하고 식물성 스테롤의 이용율(bioavailability)과 용해도를 증가시킬 수 있는 새로운 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.Therefore, there is an urgent need to develop new methods to overcome these shortcomings and to increase the bioavailability and solubility of vegetable sterols.
또 하나의 방법으로는 현재 의약품으로 시판되고 있는 콜레스테롤 저하제 처럼 간에서의 콜레스테롤 생합성(biosynthesis)을 억제하는 방법을 이용한 것이다.Another method is to inhibit cholesterol biosynthesis in the liver like cholesterol lowering drugs currently available in medicine.
이는 스테롤(sterol)이나 이소프레노이드(isoprenoid) 같은 물질의 생합성 과정에서 중간체인 메발로닉산(mevalonic acid)의 합성에 관여하는 HMG-CoA reductase의 기능을 억제함으로써 결국 콜레스테롤의 생합성을 억제하는 것이다.This inhibits cholesterol biosynthesis by inhibiting the function of HMG-CoA reductase, which is involved in the synthesis of mevalonic acid, an intermediate in the biosynthesis of substances such as sterols and isoprenoids.
따라서 이에 대한 효과적인 HMG-CoA reductase의 억제제(inhibitor)를 개발하기 위해 많은 노력들이 이루어져 왔고 실제로 여러 의약품들이 나오게 되었다.Therefore, many efforts have been made to develop an effective inhibitor of HMG-CoA reductase.
그러나 이러한 의약품들은 오래 복용해야 효과가 나타나는 점과 여러 부작용을 수반하며 가격이 비교적 비싼 단점이 있다.However, these drugs have long-term effects and have various side effects and are relatively expensive.
이러한 단점을 극복한 HMG-CoA reductase 억제제(inhibitor)를 개발해야하는 필요성이 꾸준히 제기되었다.There is a constant need to develop HMG-CoA reductase inhibitors that overcome these shortcomings.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위함에 그 목적이 있다.An object of the present invention is to solve the above problems.
최근에 기존의 바이오플라보노이드 화합물이 다양한 생리활성을 갖고 있다는 사실들이 계속 알려지고 있다.Recently, it is known that existing bioflavonoid compounds have various biological activities.
예를들면, 혈액순환의 개선이나 항산화효과, 항바이러스, 항암효과등이 속속 밝혀지고 있어서 플라보노이드 물질의 중요성이 더욱 부각되고 있다(참조:J. Med. Viol.,45,71(1975);Farmaco.,51,219(1996);Free Radical Biol.Med.,19,481(1995)).For example, the improvement of blood circulation, antioxidant effects, antiviral and anticancer effects have been found one after another, and the importance of flavonoids has been highlighted (see J. Med. Viol., 45, 71 (1975); Farmaco). 51,219 (1996); Free Radical Biol. Med., 19,481 (1995).
특히, 레몬이나 그레이프프루츠, 오렌지등의 과일이나 메밀등의 곡식 또는 상치등의 채소에 포함된 플라보노이드 화합물은 루틴, 헤스페리딘, 나린진, 네오헤스페리딘, 나린제닌, 루티노사이드, 탠저리틴, 디오스민궤시틴, 켐프페롤, 루테오린, 헤스페리틴, 퀘시틴등의 성분을 포함하며 다양한 분포와 함유량을 가지고 있다.In particular, the flavonoid compounds contained in fruits such as lemons, grapefruits, oranges, vegetables such as buckwheat or lettuce, may be used as rutin, hesperidin, naringin, neohesperidine, naringenin, lutinoside, tangeridin, diosminoxy It contains ingredients such as tin, kempferol, luteolin, hesperidin and quecithin and has various distributions and contents.
이들은 적당한 알코올과 물을 사용하여 비교적 쉽게 추출할 수 있어서 원하는 플라보노이드가 많이 함유된 식물이나 선택적으로 얻을 수 있는 장점이 있다.They can be extracted relatively easily using a suitable alcohol and water, so that plants containing a large amount of the desired flavonoids can be selectively obtained.
따라서 본 발명에서는 인체에 해가 없어서 안심하고 사용할 수 있는 하나의 식물성 스테롤 유도체와 하나의 플라보노이드를 반응시켜 스테롤-플라보노이드 결합물(conjugate)을 새로이 제조하였다.Accordingly, in the present invention, a sterol-flavonoid conjugate is newly prepared by reacting one vegetable sterol derivative and one flavonoid which can be used safely because it is harmless to the human body.
또한 형성된 물질은 다양한 응용이 가능할 정도로 수용성이 증가하였으며 구성 성분들이 갖고 있는 상승효과를 이용하여 혈중 콜레스테롤을 저하 시키는 연구를 진행한 결과, 매우 좋은 효과를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.In addition, the formed material has increased the water solubility to a variety of applications, and as a result of conducting a study to lower blood cholesterol using the synergistic effect of the components, confirmed a very good effect and completed the present invention.
본 발명은 첫째로 기존에 보고된 식물성 스테롤(phytosterol)이나 그 에스테르 화합물 또는 수소화된 식물성스테롤 에스테르(hydrogenated phytosterol ester)를 이용하는 방법보다 더 적은 양으로도 혈중콜레스테롤을 크게 감소시킬 수 있는 장점을 제공하고자 한다.The present invention firstly provides an advantage that can significantly reduce blood cholesterol in a smaller amount than the method using a previously reported phytosterol or its ester compound or hydrogenated phytosterol ester. do.
둘째로 본 발명은 본 발명의 물질의 구조가 소장의 미셀 상(micelle phase)에까지 전달될 수 있어서 작용하는 기전이 더욱 효과적이다.Secondly, the present invention is more effective in the mechanism by which the structure of the material of the present invention can be transferred to the micelle phase of the small intestine.
세째로 본 발명의 물질에 의하여 의약품 외에도 식품이나 음료에도 다양하게 첨가할 수 있어서 응용 범위가 매우 넓은 특징을 가지고 있다.Third, the material of the present invention can be added to a variety of foods and beverages in addition to pharmaceuticals has a very wide application range.
이하 본 발명을 구체적으로 살펴 보기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에서는 식물성스테롤(phytosterol)은 시토스테롤(sitosterol), 캄피스테롤campesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol),브라시키스테롤(brassicasterol), 데스모스테롤(desmosterol), 샤린스테롤(chalinsterol), 포리페라스테롤(poriferasterol) 등 뿐 아니라 그 유도체나 그밖의 모든 식물성스테롤(phytosterol)을 포함한다.In the present invention, the phytosterol is a phytosterol (sitosterol), campysterol (campesterol), stigmasterol (stigmasterol), brassicasterol (brassicasterol), desmosterol (shamosterol), charinsterol (poriferasterol) ) As well as derivatives or all other phytosterols.
우선 식물성스테롤 (phytosterol)의 유도체를 만들기 위해서 식물성스테롤(phytosterol)과 우선 반응시키는 화합물은 디카르복실산(dicarboxylic acid)이나 그 유도체, 또는 디카르복실산(dicarboxylic acid)의 무수물(anhydride)등을 포함하며 다음과 같은 구조를 갖는다.First, a compound which is first reacted with phytosterol in order to make a derivative of phytosterol is dicarboxylic acid or its derivatives, or anhydrides of dicarboxylic acid. It has the following structure.
HOOC(CH2)nCOOH : 여기서 n=2∼20HOOC (CH 2 ) n COOH: where n = 2-20
또한 만들어진 식물성스테롤(phytosterol) 유도체와 반응하는 플라보노이드 화합물은 루틴, 헤스페리딘, 나린진, 네오헤스페리딘, 나린제닌, 루티노사이드, 탠저리틴, 디오스민퀘시틴, 켐프페롤, 루테오린, 헤스페리틴, 퀘시틴등과 그 유도체등을 포함한다.Flavonoid compounds that also react with phytosterol derivatives that are made include rutin, hesperidin, naringin, neohesperidin, naringenin, lutinoside, tangerine, diosminquecithin, kempferol, luteolin, hesperidin, and queci Tin, and derivatives thereof.
이러한 본 발명을 아래에 반응 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명한다.The present invention will be described in more detail with reference to the following reaction examples.
이 실시 예는 예시적 의미를 지니며 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.This embodiment has an exemplary meaning and does not limit the protection scope of the present invention.
실시예 1 [베타-시토스테롤(beta-sitosterol)과 숙신산 무수물(succinic anhydride)와의 반응]Example 1 [Reaction of Beta-sitosterol with Succinic Anhydride]
식물성 스테롤의 한 종류인 베타-시토스테롤(beta-sitosterol)과 카르복실산 무수물(carboxylic anhydirde)의 일종인 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 용매인 벤젠(또는 톨루엔)에 넣고 촉매로서 DMAP[4-디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine)]를 가한다음 딘-스타크 트랩(Dean-stark trap)을 설치하여 환류시켰다.Beta-sitosterol, a type of vegetable sterol, and succinic anhydride, a type of carboxylic anhydirde, are placed in a solvent of benzene (or toluene) and DMAP [4-dimethylamino as a catalyst. Pyridine (dimethylaminopyridine)] was added and then refluxed by installing a Dean-stark trap.
이때 베타-시토스테롤과 숙신산 무수물 몰비는 1:1이였으며, 몰비는 1:1∼1:1.5 까지가 가장 적당하며 용액의 가열온도는 상온부터 끓는점까지 가능하나 끓는점에서 반응은 빨리 진행되었고, 반응시간은 5부터 10시간 안에 반응은 완결되었다.At this time, the molar ratio of beta-sitosterol and succinic anhydride was 1: 1, and the molar ratio was 1: 1 to 1: 1.5, and the heating temperature of the solution could be from room temperature to boiling point, but the reaction proceeded quickly at boiling point. The reaction was complete in 5 to 10 hours.
반응이 완결된 후 용매를 완전히 제거하고 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)를 이용하여 베타-시토스테롤(beta-sitosterol)의 유도체를 얻었다.After the reaction was completed, the solvent was completely removed and the derivative of beta-sitosterol was obtained by column chromatography.
실시예 2 [베타-시토스테롤(beta-sitosterol)의 유도체와 나링게닌(naringenin)와의 반응에 의한 새로운 혈중 콜레스테롤 저하제의 제조]Example 2 [Preparation of novel blood cholesterol lowering agent by reaction of beta-sitosterol with naringenin]
베타-시토스테롤(beta-sitosterol)의 유도체와 플라보노이드(flavonoid)의 의 일종인 나링게닌(naringenin)을 용매인 톨루엔에 넣고 촉매로서 DMAP[4-디메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine)]와 커프링제인 DDC[1,3-디시클로헥실카보디이미드(1,3-dicyclohexylcarbodiimide)]를 가한 다음 딘-스타크 트랩(Dean-stark trap)을 설치하여 환류시켰다.A beta-sitosterol derivative and a flavonoid, naringenin, were added to a solvent, toluene, and the catalyst was DMAP [4-dimethylaminopyridine] and the cupping agent DDC [1]. , 3-dicyclohexylcarbodiimide] was added thereto, followed by reflux by installing a Dean-stark trap.
이때 베타-시토스테롤(beta-sitosterol)의 유도체와 나링게닌(naringenin)의 몰비는 1:1이였으며, 몰비는 1:1 부터 1:1.2가 적당하며 용액의 가열온도는 상온부터 끓는점까지 가능하나 끓는점에서 반응은 빨리 진행되었고 반응시간은 1부터 10시간 안에 반응은 완결되었다.At this time, the molar ratio of beta-sitosterol derivative and naringenin was 1: 1, and the molar ratio was 1: 1 to 1: 1.2, and the heating temperature of the solution could be from room temperature to boiling point. The reaction proceeded quickly and the reaction time was completed within 1 to 10 hours.
반응이 완결된 후 용매를 완전히 제거하고 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)나 재결정을 이용하여 혈중콜레스테롤 저하제를 얻었다.After the reaction was completed, the solvent was completely removed and the blood cholesterol lowering agent was obtained by column chromatography or recrystallization.
실시예 3 [혈중 콜레스테롤 저하제에 대한 동물시험]Example 3 [Animal Test for Blood Cholesterol Lowering Agent]
생후 4주된 스프라우큐 다우레이(Spraque-Dawley)종 실험 쥐 30마리를 일 주일간 실험실의 생육조건에서 정상화 시킨 후 5 그룹으로 나누고 콜레스테롤 및 콜릭산(cholic acid)을 사료에 1%와 0.5%를 각각 첨가한 후 일주일 간 공급하여 콜레스테롤치를 상승시켰다.Thirty four week-old Spraque-Dawley rats were normalized under laboratory conditions for one week and then divided into five groups. Cholesterol and cholic acid were added to feed and 1% and 0.5%. After each addition, it was supplied for 1 week to raise cholesterol level.
이어서 각기 다른 농도인 0.1%, 0.5%, 1%, 3%의 상기한 저하제를 첨가하여 공급하면서 시간에 따른 총 콜레스테롤치, HDL, LDL 콜레스테롤 치를 측정 하였다.Subsequently, total cholesterol, HDL, and LDL cholesterol levels were measured over time while supplying the above-described lowering agents of 0.1%, 0.5%, 1%, and 3% at different concentrations.
일정 기간동안 식이투여를 한 쥐는 에테르 마취하에서 심장에서 혈액을 채취하였으며, 쥐의 심장에서 채혈한 혈액은 헤파린(heparine)이 처리된 버큐테이너(Vaccutainer)에 넣어 4℃에서 1,500xg에서 20분간 원심분리한 다음, 1.5 mL의 혈청 분획을 에펜도르프튜브(eppendorftube)에 옮겨 담았다.Rats fed a diet for a period of time collected blood from the heart under ether anesthesia, and blood from the rat heart was centrifuged at 1,500xg for 20 minutes at 4 ° C in a heparine-treated vaccutainer. The 1.5 mL serum fractions were then transferred to eppendorftubes.
채혈한 즉시 자동분석기(히타치사 모델 747)를 사용하여 총 콜레스테롤, HDL, LDL의 량을 측정하였다.Immediately after blood collection, the amount of total cholesterol, HDL, and LDL was measured using an automatic analyzer (Hitachi's model 747).
4주 후의 대표적인 결과를 표 1에 요약하여 나타냈다.Representative results after 4 weeks are summarized in Table 1.
표 1Table 1
단위: mg/dlUnit: mg / dl
위의 표 1에서 보는 것과 같이 저하제의 콜레스테롤 저하 효과는 매우 양호하였으며 저하 효과는 7일 후부터 나타나기 시작하였다.As shown in Table 1 above, the cholesterol lowering effect of the lowering agent was very good and the lowering effect began to appear after 7 days.
저하제 투여에 의한 혈중 총 콜레스테롤 수치 변화를 관찰하였을 때 1.5%, 1% 및 3%의 저하제 투여 3군 모두에서 투여기간이 길어짐에 따라 혈중 콜레스테롤의 수준이 유의적으로 저하되었다 (P<0.01).In all three groups of 1.5%, 1%, and 3% of the lowering drugs, blood cholesterol levels were significantly lowered (P <0.01).
그룹 2 는 저하제의 농도가 낮은 이유로 그 효과가 작은 반면에 그룹 3, 4, 5에서는 매우 크게 작용함을 알 수 있었고, 최고 평균 40%이상 콜레스테롤이 감소함을 알 수 있었다.In group 2, the effect was low because of the low concentration of the lowering agent, while in groups 3, 4, and 5, it was found to be very effective, and the highest average of 40% or more cholesterol was found to decrease.
또한 LDL 콜레스테롤의 감소효과도 뚜렷하게 나타났으며 HDL 콜레스테롤의변화는 거의 나타나지 않았으며 HDL 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤의 비도 점차 증가함을 알 수 있었다.In addition, the effect of reducing LDL cholesterol was obvious, and there was almost no change in HDL cholesterol, and the ratio of HDL cholesterol and LDL cholesterol was gradually increased.
따라서 본 발명에서 만든 물질은 혈중의 총 콜레스테롤을 감소시키고 LDL 콜레스테롤을 감소시키지만, 유용한 HDL 콜레스테롤에는 영향을 미치지 않으므로 만족한 결과를 얻게 되었다.Therefore, the substance made in the present invention reduces the total cholesterol in the blood and decreases the LDL cholesterol, but does not affect the useful HDL cholesterol has obtained a satisfactory result.
실시예 4 [HMG-CoA 리덕타아제(reductase) 억제제(inhibitor)로서 혈중 콜레스테롤 저하제의 활성]Example 4 [Activation of Blood Cholesterol Lowering Agents as HMG-CoA Reductase Inhibitors]
저하제의 혈중 콜레스테롤수준을 저하시키는 기전을 연구하기 위하여 이 화합물의 3-hydroxy-3-methylglutary1 CoA reductase (HMG-CoA reductase)의 저해능에 대해 실험용 쥐 마이크로솜(microsome)을 이용하여 실험관(in vitro)내에서 평가하였다.To investigate the mechanism of hypocholesterolemic drugs, the inhibitory ability of 3-hydroxy-3-methylglutary1 CoA reductase (HMG-CoA reductase) of this compound was investigated using an experimental rat microsome. Evaluated within.
이때 실험에 사용한 DL-3-[glutary1-3-14C]-HMG-CoA, RS-[2-14C]-mevalonolactone, R-[5-3H]-mevalonic acid과 Aquasol-2 (liquid scintillation cocktail solution)는 넨사(NEN Co., Boston, MA, USA)에서 구입하였다.At this time, DL-3- [glutary1-3-14C] -HMG-CoA, RS- [2-14C] -mevalonolactone, R- [5-3H] -mevalonic acid and Aquasol-2 (liquid scintillation cocktail solution) Was purchased from NEN Co., Boston, MA, USA.
(가). 실험용 쥐 간의 마이크로솜의 제조(end). Preparation of Microsomes from Laboratory Rat Liver
실험 동물은 6 주령으로 체중이 180g인 SPE 스프라우큐-다우레이종 (Sprague-Dawley)숫놈을 동물실험용 챔버에서 1일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.The experimental animals were 6 weeks old and SPE Sprague-Dawley males weighing 180 g were used in the experiments after one day of adaptation in an animal laboratory chamber.
5마리의 실험용 쥐에서 간을 추출하여 얻어 풀(pool)을 만들어 간 마이크로솜(liver microsome)을 분리하였다.Liver was extracted from five rats to make a pool to isolate liver microsomes.
이때 모든 실험은 0℃∼4℃에서 실시하였고, 실험용 쥐의 간은 3배의 케이티이 버퍼(KTE buffer ;0.154M KCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 1mM EDTA)에 넣어 잘게 자른후 폴리트론(polytron; U1tra turrax, Ika tk, Japan)으로 얼음 위에서 30초간 3∼4회 잘 균질화시킨다.At this time, all experiments were carried out at 0 ℃ ~ 4 ℃, the liver of rats were cut into fine polystyrene (KTE buffer; 0.154M KCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 1mM EDTA) and finely chopped. polytron; U1tra turrax, Ika tk, Japan) and homogenize well 3 to 4 times for 30 seconds on ice.
이러한 간 균질액을 10,000xg에서 20분간 원심분리한 후 상등액 만을 취해 다시 100,000xg 에서 1 시간동안 초 원심분리한다.The liver homogenate is centrifuged at 10,000xg for 20 minutes, then only the supernatant is taken and again centrifuged at 100,000xg for 1 hour.
상등액은 버린 후 입자(pellet)부분만을 취하여 케이텍 버퍼(KTEG buffer;0.154M KCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 1mM EDTA, 20%(w/v) glycerol)에 잘 현탁시킨 후 일정량씩 에펜드로프 듀브(eppendorf tube)에 넣어 -70℃에 보관하였다.The supernatant was discarded and suspended only in the pellet (KTEG buffer; 0.154M KCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 1mM EDTA, 20% (w / v) glycerol) It was placed in a rope dune (eppendorf tube) and stored at -70 ℃.
이때 단백질은 BSA를 기준으로 Bio-Rad의 프로테인 아세이 키트(protein assay kit)를 사용하여 정량하였다.The protein was quantified using a protein assay kit of Bio-Rad on the basis of BSA.
(나). HMG-CoA 리덕터아제(reductase)활성도 측정(I). HMG-CoA Reductase Activity Measurement
Microsomal HMG CoA reductase 활성도는 [14C]-HMG-CoA 가 [14C]메발로네이트(메발로산염; mevaloate)로 전환되는 것을 측정하였다.Microsomal HMG CoA reductase activity was measured to convert [14C] -HMG-CoA to [14C] mevalonate (mevaloate).
HMG-CoA reductase의 활성을 측정하기 위한 50㎕ 의 반응 혼합액은 0.2mg 의 단백질을 함유하는 실험용 쥐 마이크로솜, 25mM potassium phosphate (pH 7.2), 50mM KCl, 1mM EDTA, 5mM dithiotherital, 10mM glucose 6-phosphate, 14mU ofyeart glucose 6-phsophate dehydrogenase, 0.6mM NADPH 및 14uM DL-3-[glutary1-3-14C]-HMG-CoA 을 첨가함으로서 시작하였다.50 μl of the reaction mixture to measure the activity of HMG-CoA reductase was tested in rat microsomes containing 0.2 mg of protein, 25 mM potassium phosphate (pH 7.2), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 5 mM dithiotherital, 10 mM glucose 6-phosphate , 14mU ofyeart glucose 6-phsophate dehydrogenase, 0.6mM NADPH and 14uM DL-3- [glutary1-3-14C] -HMG-CoA were added.
HMG-CoA reductase의 고유 활성도(specific activity) 는 단백질(protein) mg당 분당 형성된 피코몰 메발로네아트[pmol mevalonate(pmol product/min mg protein]으로 나타내었다.The specific activity of HMG-CoA reductase was expressed as pmol mevalonate (pmol product / min mg protein) formed per mg protein.
(다). 로바스테이틴(Lovastatin)과의 IC50 값 비교(All). Comparison of IC50 Values with Lovastatin
저하제의 혈중 코레스테롤 저하 기전을 연구하기 위하여 HMG-CoA reductase 의 저해 정도를 관찰하였다.The degree of inhibition of HMG-CoA reductase was investigated to study the mechanism of cholesterol-lowering cholesterol lowering agent.
이를 위하여 현재 HMG-CoA reductase의 저해제로 개발되어 임상에 사용되고 있는 스테이틴(statin)계 약물의 하나인 로바스테이틴(lovastatin)을 양성대조군(positive control)으로 하여 저하제에 의한 HMG-CoA reductase 저해정도를 비교하였다.To this end, the degree of inhibition of HMG-CoA reductase by a lowering agent was determined by using lovastatin, one of the statin-based drugs currently developed as an inhibitor of HMG-CoA reductase, as a positive control. Was compared.
로바스테이틴(Lovastatin)의 HMG-CoA reductase 에 대한 IC50 값은 69nM로 나타났으며 HMG-Coa reductase 에 대한 본 발명의 저하제의 IC50 값은 879nM 로 나타났다.The IC50 value of Lovastatin for HMG-CoA reductase was 69 nM and the IC50 value of the present lowering agent for HMG-Coa reductase was 879 nM.
이는 로밧테이틴(lovastatin)의 약 1/12 정도의 저해력을 갖고 있는 것으로 사료되었다.It is thought to have an inhibitory effect of about 1/12 of lovastatin.
결국 본 발명에서 얻은 저하제는 소장에서의 콜레스테롤 흡수를 억제할 뿐만 아니라 간에서의 콜레스테롤 합성을 억제하는 이중효과가 있는 것임을 알 수 있다.As a result, it can be seen that the lowering agent obtained in the present invention not only inhibits cholesterol absorption in the small intestine but also has a dual effect of inhibiting cholesterol synthesis in the liver.
이상 상기에서 살펴 본 바와같이, 본 발명에서는 인체에 해가 없어서 안심하고 사용할 수 있는 하나의 식물성 스테롤 유도체와 하나의 플라보노이드를 반응시켜 스테롤-플라보노이드 결합물(conjugate)에 의한 본 발명의 저하제는 고 콜레스테롤증의 치료나 동맥경화증, 심장계 질환들의 예방에 효과적으로 사용될 수 있으므로 이를 활성물로 사용하여 의약품이나 보조식품, 식품첨가제, 음료등의 기능성 식품에 다양하게 이용될 수 있는 매우 유용한 발명임이 분명하다.As described above, in the present invention, the lowering agent of the present invention by the sterol-flavonoid conjugate (conjugate) by reacting one vegetable sterol derivative and one flavonoid which can be used safely without harming the human body is high cholesterol. Since it can be effectively used for the treatment of symptoms, atherosclerosis, and heart disease, it is obvious that it is a very useful invention that can be used in a variety of functional foods such as pharmaceuticals, supplements, food additives, and drinks by using it as an active agent.
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|---|---|
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