KR100433940B1 - 파프 수용체의 활성을 억제하는 캅사제핀을 포함하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 악제학적 조성물 - Google Patents

파프 수용체의 활성을 억제하는 캅사제핀을 포함하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 악제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캅사제핀을 유효성분으로 하여, 면역계에 중요한 역할을 하는 파프 수용체의 활성을 특이적으로 억제함으로써 과다한 면역반응을 억제하고 이를 통해 류마티스성 관절염 및 알러지 치료제로서 유용하게 이용될 수 있는 파프 수용체 반응억제제에 관한 것으로서,
캅사제핀( N-[2[(4-chlophenyl) ethyl]-1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-henzazepine-2-carbothioamide) )은,

Description

파프 수용체의 활성을 억제하는 캅사제핀을 포함하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 악제학적 조성물 {Pharmaceutical Composition for Prevention and Treatment of Rheumatic Arthritis or Allergic Diseases Comprising Capsazepine with Inhibitory Activity of PAF receptor as Active Ingredient}
본 발명은 파프 수용체 반응억제제에 관한 것으로서, 구체적으로 캅사제핀을 유효성분으로 하여, 면역계에서 중요한 역할을 하는 파프 수용체의 활성을 특이적으로 억제함으로써 과다한 면역반응을 억제하고 이를 통해 류마티스성 관절염 및 알러지 치료제로서 유용하게 이용될 수 있는 파프 수용체 반응억제제에 관한 것이다.
일반적으로, 캅사제핀(capsazepine : N-[2[(4-chlophenyl) ethyl]- 1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-henzazepine-2-carbothioamide)은 고추의 매운맛 성분인 캅사이신과 일부 유사한 구조를 가지고 있으며, 캅사이신에 특징적으로 반응하는 바닐로이드 수용체(vanilloid receptor)에 대한 억제제로 알려져 있는 화합물이다.
18세기 중반부터 인류는 해열을 목적으로 버드나무 껍질을 사용하여 왔으며, 1875년에 들어 그 효용성분이 살리실산(salicylic acid)임이 밝혀져 처음으로 류머티즘의 치료에 이용된 이후로 아스피린(aspirin)을 위시한 비스테로이드성 소염진통제(NSAID)의 개발과 이용이 오늘날까지 이어져 오고 있다. 이들은 진통, 해열, 소염작용을 함께 가지고 있어, 다양한 용도로 이용되어 왔다. 1971년 아스피린과 인도메타신(indomethacin)이 프로스타글란딘(prostaglandin)의 합성을 억제함이 밝혀진 이후로부터 비스테로이드성 소염진통제의 작용기작에 대한 이해가 분명해지기 시작하였다. 이후 세포가 상처를 받을 때 프로스타글란딘이 합성된다는 사실과 염증내 체액에 프로스타글란딘이 다량으로 존재한다는 사실, 그리고 비스테로이드성 소염진통제가 이들의 합성을 억제한다는 사실이 밝혀졌다.
상기 비스테로이드성 소염진통제는 세포내에서 아라키돈산(arachidonic acid)을 프로스타글란딘으로 합성하는 사이클로옥시제네이즈(cyclooxygenase : COX)를 억제한다. 이때, 사이클로옥시제네이즈-1은 주로 혈관, 위장판, 신장에 분포하고, 사이클로옥시제네이즈-2는 면역반응이 있는 곳에서 새롭게 유도된다고 알려져 있다. 기존의 비스테로이드성 소염진통제는 이들을 구별하지 않고 억제했기 때문에 위장판 및 신장에서 독성을 보였다.
최근, 이러한 독성을 고려하여 사이클로옥시제네이즈-2에 대하여 선택적으로 작용하는 억제제가 개발되어 주목을 받고 있다. 이들 비스테로이드성 소염진통제의 작용은 크게 해열작용, 진통작용 및 소염작용으로 나눌 수 있다. 비스테로이드성 소염진통제의 처리는 발열유도 물질인 프로스타글란딘의 합성을 억제함으로써 해열작용을 보이며 통증의 역치 감소를 억제함으로써 진통작용을 보인다. 하지만 소염작용에 관해서는 비스테로이드성 소염진통제 및 프로스타글란딘의 작용이 아직 알려져 있지 않다. 프로스타글란딘은 국부적인 홍반과 혈류량 증가를 가져오는 것이 알려져 있으나 프로스타글란딘 자체가 헬퍼 T 세포(helper T cell), B세포 등에 작용을 억제하고 주요 면역유도 물질인 인터류킨-1(interleukin-1)의 합성을 감소시키는 등 오히려 면역억제 작용을 보이기 때문에 이점에 대해서는 논란이 많다. 현재 프로스타글란딘의 합성과 전혀 다른 알려지지 않은 기작을 통할 것이라고 추측되고 있다.
상기 비스테로이드성 소염진통제 중에도 소염작용을 보일 수 있는 아스피린과 인도메타신, 케토프로펜(ketoprofen) 등이 있는가 하면 전혀 소염작용을 보이지 못하여 진통제로만 이용되는 타이레놀(tyrenol : 약물명 acetaminophen)이 있는 점은 이와 같은 가능성을 암시한다 할 수 있다.
현재까지 류마티스성 관절염의 병리기작에 대해서 많은 부분이 알려져 있지 않지만 최근에 가장 주목을 받고 있는 가설은 자가면역(autoimmune) 질환설이다. 즉, 관절부위의 조직을 '나'의 것이 아닌 외부의 것으로 인식한 항체가 관절조직을 파괴하기 위하여 면역반응을 일으킨다는 설이다. 이렇게 유도된 면역반응은 항원-항체 반응에서 유도되는 염증반응과 동일한 현상을 일으킨다. 이러한 염증반응에 관련된 인자는 매우 다양하다. 최근 이들 각각의 인자를 제어함으로써 류마티스성 관절염을 치료하고자 하는 시도가 구상되고 있다. 히스타민 H1수용체 억제물질은 면역반응을 억제할 수는 있으나 그 작용이 초기단계에 한정되는 문제점이 있다.
또한, 브레디키닌(bradykinin)과 세로토닌(serotonin)의 억제물질도 특정한 면역반응에만 그 효과를 보이기 때문에 류마티스성 관절염에 효과를 보지 못하게 되는 문제점이 있다.
최근, 면역학의 발달로 면역반응에 관련된 주요인자가 밝혀졌는데, 면역세포의 유도작용(chemotaxis)과 식균작용(phagocytosis), 사이토카인(cytokine)의 분비, 활성산소기(superoxide)의 분비 등에 파프(platelet activating factor, PAF), 보체 5에이(C5a), 류코트리엔(leukotriene). 인터류킨-1, 종양괴사 인자(tumor necrosis factor) 등이 관련되어 있다. 현재 이들의 억제 및 조절방법에 대한 연구와 개발이 진행되고 있다. 기존 말기 류마티스성 관절염에 한해 이용되고 있는 덱사메타손(dexamethasone) 등의 부신피질 홀몬은 바로 면역세포에서 인터류킨-1 및 종양괴사 인자의 작용을 억제한다고 밝혀졌다. 하지만 이들에 대한 제어는 면역반응 전반에 대한 혼란을 가져옴으로써 감염질환에 대한 저항력 감소 등 보다 심각한 부작용을 수반하게 되는 문제점이 발생하였다.
이 때문에 기존 류마티스성 관절염 치료에는 거의 독보적으로 비스테로이드성 소염진통제가 이용되어 왔다. 하지만 이들이 위 장관에서의 궤양형성, 혈소판응집의 억제, 신장에서 프로스타글란딘의 체액량 조절작용 억제 등 많은 부작용을 가지고 있다. 따라서 비스테로이드성 소염진통제의 적용은 일정수준 이상의 류마티스성 관절염을 치료하기에는 한계가 있다. 이 경우 부신피질 홀몬제제를 이용하기도 하는데 이는 독으로 독을 치료하는 매우 위험한 방법이다. 또한, 소염작용과 비스테로이드성 소염진통제 활성간의 상관관계가 불명확하기 때문에 위장 및 신장 독성이 적은 사이클로옥시제네이즈-2 선택적 비스테로이드성 소염진통제가 개발된다 하더라도 아세트아미노펜(acetaminophen)처럼 전혀 소염작용을 보일 수 없을 가능성도 있다. 실제로 최근에 개발된 2개의 사이클로옥시제네이즈-2 억제제 중 하나인 로페콕시브(rofecoxib)는 류마티스성 관절염의 치료에 그다지 효과적이지 않은 것으로 밝혀졌다.
따라서, 기존의 비스테로이드성 소염진통제를 대치하거나 병용할 만한 새로운 기작의 면역억제 방법이 필요하다. 따라서, 기존의 비스테로이드성 소염진통제를 대치하거나 병용투여하여 그 효과를 강화시킬 수 있는 약물의 개발은 국제적으로 관심을 끌고 있다.
최근 새로운 대상으로 주목받고 있는 파프는 1971년 백혈구에서 유리되어 혈소판의 응집을 유도하는 물질로 처음 발견되었다. 파프는 모세혈관 투과성의 증가와 혈관 확장작용을 가지고 있으며, 백혈구의 유도작용을 유도하고 이들에 작용하여 활성산소기 형성 등 면역반응을 유도한다. 파프는 파프 수용체에 작용하여 포스포라이페이즈 씨(phospholipase C)의 활성화를 일으키고 이로 인해 이노시톨 삼인산(inositol 1,4,5-trisphosphate)과 다이아실글라이세롤(diacylglycerol)의 생성을 유도한다. 이들은 세포내에서 칼슘의 증가와 단백질 인산화 효소 씨(protein kinase C)의 활성화를 가져오게 되는데 이들이 파프에 대한 염증반응을 직접적으로 매개하는 인자로 알려져 있다. 최근 파프의 신호전달을 억제하는 물질을 염증, 기관지천식 치료 등에 이용하고자 하는 시도가 국외에서 추진되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 그 목적은 파프 수용체에 작용하여 그 활성을 억제하고 면역반응을 감소시키는 파프 수용체 반응 억제제를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 파프 수용체의 활성과 관련된 질환 즉, 류마티스성 관절염 관련 질병 또는 알러지 관련 질병의 치료제로 사용될 수 있으며, 부작용이 적고, 안전성이 뛰어난 파프 수용체 반응억제제를 제공하는데 있다.
도 1에서 a는 파프 수용체 활성에 따른 세포내 칼슘이온 증가효과에 대한 캅사제핀의 효과를 나타내는 그래프이고,
b는 외부세포에 칼슘이 없을 때 파프 수용체 활성에 따른 세포내 칼슘이온 증가효과에 대한 캅사제핀의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 파프 수용체 활성에 따른 이노시톨 삼인산과 생성효과에 대한 캅사제핀의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3에서 a는 탑시가긴에 의한 세포내 칼슘증가에 미치는 캅사제핀의 영향을 나타내는 그래프이고,
b는 a의 효과를 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 4는 탑시가긴에 의한 망간이온의 유입에 미치는 캅사제핀의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5에서 a는 탑시가긴에 의한 세포내 칼슘증가에 미치는 캅사제핀과 에스케이에프96365의 영향 비교로 에스케이에프96365에 의한 칼슘억제 이후 캅사제핀의 처리에 대한 효과를 나타내는 그래프이고,
b는 a와 같이 탑시가긴에 의한 세포내 칼슘증가에 대해 캅사제핀에 의한 억제 이후 에스케이에프96365(SKF96365) 처리에 대한 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 파프 수용체의 활성화에 의한 활성산소기의 유리 현상에 미치는 캅사제핀의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 파프 수용체의 활성화에 의한 활성산소기의 생성에 미치는 캅사제핀과 에스케이에프96365의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 8은 피마자유를 경피 도포 하였을 때 생성되는 염증반응에 대한 인도메타신과 캅사제핀의 효과를 나타내는 그래프이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징에 따르면, 하기의 화학식으로 표시되는 캅사제핀( N-[2[(4-chlophenyl) ethyl]-1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-henzazepine-2-carbothioamide) )을 유효성분으로 하여, 파프 수용체의 활성을 억제하여 과다한 면역반응을 억제하고, 활성산소기의 유리 및 파프에 의한 칼슘증가를 억제함으로써 류마티스성 관절염 관련 질병 또는 알러지 관련 질병의 치료제로 사용될 수 있는 파프 수용체 반응억제제를 제공한다.
화학식.
이때, 본 발명의 부가적인 특징에 따르면, 상기 캅사제핀의 유효성분은 전체 조성물의 0.01 내지 99.99 중량%를 차지하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 캅사핀제의 50% 저해농도(50% inhibition concentration, IC50)는 약 100 μM 인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 다른 부가적인 특징에 따르면, 상기 화학식으로 표현되는 캅사제핀의 화합물의 유효량은 0.1㎍/Kg 내지 1g/Kg 인 것이 바람직하다. 특히, 상기 캅사제핀의 화합물의 유효량은 50㎍/Kg 내지 200㎍/Kg 인 것이 바람직하다.
본 발명의 상술한 목적과 여러 가지 장점은 이 기술 분야에 숙련된 사람들에 의해 첨부된 도면을 참조하여 후술되는 발명의 바람직한 실시예로부터 더욱 명확하게 될 것이다.
이하, 본 발명에 의한 캅사제핀을 유효성분으로 하는 파프 수용체 반응억제제의 바람직한 실시예를 상세히 설명하고자 한다.
먼저, 본 발명자는 최근 저장고-의존성 칼슘 유입현상(store-operated Ca2+entry)이 활성산소기 형성 및 유리 등 면역반응에 매우 중요하다는 보고에 주목하였다. 저장고-의존성 칼슘 유입현상은 파프와 같은 홀몬이 수용체를 활성화시킨 이후 생성된 이노시톨 삼인산이 세포내의 칼슘 저장고를 고갈시킬 때 세포 외부로부터 칼슘의 유입을 유도하는 현상이다. 본 발명자는 저장고-의존성 칼슘 유입현상을 연구하면서 상기 기술한 캅사제핀이 이를 조절할 수 있는 물질임을 확인하였다. 이들은 세포 수준에서 다양한 실험을 통해 면역억제 효과가 검증되었다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 캅사제핀의 파프 수용체에 대한 억제 활성을 다각적으로 검증하고 그 원인기작을 규명하였다. 인간 백혈구전구세포(humanpromyelocytoma cell) 즉, HL-60 세포는 면역세포에 존재하는 파프 수용체와 동일한 파프 수용체를 가지고 있어서 동 수용체의 활성 검색을 위한 좋은 모델세포가 될 수 있다.
상기 파프 수용체가 활성화될 경우 세포내 칼슘이온의 농도가 증가하는데, 먼저 캅사제핀을 처리한 뒤 파프를 처리하여 파프 수용체 활성화에 의한 세포내 칼슘증가의 변화를 스펙트로플루오로메트리(spectrofluorometry)법으로 관찰하였다.
상기 캅사제핀은 파프 처리시 나타나는 칼슘증가를 억제하였다. 이러한 억제효과는 세포 내에서 유리되는 칼슘보다 세포 밖으로부터 유입되는 칼슘에 대해 보다 분명하였다. 하지만 파프의 처리시 합성되는 이노시톨 삼인산의 합성에는 캅사제핀이 억제효과를 보이지 못하였다. 이는 캅사제핀이 파프 수용체를 길항하기 보다는 그 이후의 과정을 억제한다는 가설을 가능케 한다. 파프는 세포 내 칼슘 유리 이후 기작인 저장고-의존성 칼슘 유입현상(store-operated Ca2+entry)을 일으킬 수 있다. 따라서, 이 칼슘 유입과정에 대한 효과를 알아보기 위해 탑시가긴(thapsigarin)을 이용하여 세포 내 칼슘 유리 및 저장고-의존성 칼슘 유입현상을 유도하고 이에 대한 캅사제핀의 효과를 알아보았다.
상기에서 캅사제핀은 탑시가긴에 의해 유도된 저장고-의존성 칼슘 유입현상을 농도 의존적으로 억제하였다. 이러한 세포 외부로부터의 유입 기작을 보다 분명하게 검증하기 위하여 세포 내 칼슘 유리에는 영향을 미치지 않으나 세포 외부로부터의 칼슘 유입만을 관찰할 수 있는 망간 유입현상 및 바륨 유입현상을 실험한 바, 캅사제핀은 이들에도 억제작용을 보였다. 또한, 캅사제핀은 저장고-의존성 칼슘 유입현상을 통하여 형성되는 활성산소기의 합성 및 이의 유리에도 영향을 주었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 캅사제핀이 면역기작에 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었다.
<실시예 1>
도 1을 참조하여, 파프 수용체 활성에 따른 세포내 칼슘이온 증가효과에 대한 캅사제핀의 효과를 설명한다.
캅사제핀의 전처리시 파프 수용체의 활성화에 따른 세포내 칼슘 증가 현상에 미치는 영향을 검사하였다. 혈구전세포인 HL-60 세포에 캅사제핀을 전처리 한 뒤 3분 후 파프를 처리하여 세포내 칼슘농도를 측정하였다. 세포내 칼슘농도의 변화를 측정하기 위해 칼슘과 특이적으로 결합하는 형광색소인 퓨라2/AM(fura-2/AM; Molecular Probe사, 미국)가 세포내로 들어가도록 상기 색소 3μM을 배지에 첨가하여 HL-60 세포를 섭씨 37도에서 40분 동안 배양하였다. 이후, 세포내로 유입되지 않는 퓨라2/AM을 세척해낸 후, 스펙트로플루오로포토메터(spectrofluorophotometer)를 이용하여 340nm와 380nm의 자외선을 교대로 조사한 다음, 500nm 영역의 형광을 측정함으로써 세포 내 칼슘 농도에 대한 비율을 구하였다. 이 값을 하기 수학식 1(Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY, 1985, J. Biol. Chem. 260: 3440-3450)을 이용하여 칼슘 농도를 정량하였다.
수학식 1
세포내 칼슘 농도 = KD[(R-Rmin)/(Rmax-R)]/(Sf2/Sb2)
KD : 퓨라2와 칼슘 결합체의 해리 상수
R : 340nm와 380nm에서의 형광의 비율
Rmin : 칼슘 농도가 0에 가까울 때의 형광의 비율
Rmax : 칼슘 농도가 퓨라2와 반응하여 포화상태일 때의 형광의 비율
Sf2 : 칼슘 농도가 0에 가까울 때의 형광의 비율
Sb2 : 칼슘 농도가 퓨라2와 반응하여 포화상태일 때의 형광의 비율
첨부도면 도 1의 a는 파프 수용체에 작용하는 파프를 처리했을 때 일어나는 세포내 칼슘농도 증가현상에 대해 캅사제핀(10μM)이 미치는 영향을 관찰한 것이다. 실선은 캅사제핀이 없을 때, 점선은 캅사제핀을 처리한 후의 칼슘변화를 나타낸다. 캅사제핀은 파프의 칼슘증가 가운데 초기의 빠른 칼슘증가 부분 보다 그 이후의 서서히 감소하는 칼슘증가 부분에 보다 큰 억제효과가 보임을 알 수 있다. 도 1의 b는 상기 a에서 이루어진 시도를 반복하되 세포 외부의 칼슘을 제거한 뒤 실험을 시작하여 파프를 처리한 뒤 다시 칼슘을 넣어준 경우이다. 세포 외부 칼슘이 존재하지 않는 상태에서 파프를 처리하면 세포 내 저장고에서 칼슘이 유리되는데 이 기작에는 캅사제핀이 영향을 주지 않음을 보았다. 이때, 세포 외부에 다시 칼슘을 넣어주면 칼슘의 유입이 일어나는데 본 기작에 캅사제핀이 억제양상을 보였다. 이 결과는 캅사제핀이 파프에 의한 칼슘이온 증가 중 특히, 세포 외부로부터의 유입에 영향을 미침을 나타낸다.
<실시예 2>
도 2를 참조하여, 파프 수용체 활성에 따른 이노시톨 삼인산의 생성효과에대한 캅사제핀의 효과를 설명한다.
캅사제핀이 파프 수용체 활성에 의한 이노시톨 삼인산의 생성에 미치는 영향을 검사하였다. 상기에서 이노시톨 삼인산은 세포내 칼슘 저장고로부터 칼슘을 유리시키는 작용을 한다. 캅사제핀을 3분 전처리 한 후 파프, 용매와 이 세포에서 포스포라이페이즈 씨를 활성화시키는 에이티피(ATP)를 3O초간 처리한 뒤 세포 추출물을 얻은 후 [3H]으로 표지된 이노시톨 삼인산을 이노시톨 삼인산 수용체에 경쟁적으로 결합시킨 뒤 결합체를 모아 액상폭광계수기(liquid scintillation counter)로 방사능을 측정하였다. 이때, 농도를 알고 있는 이노시톨 삼인산을 이용하여 여기서 얻어진 방사능을 표준으로 하여 시료의 이노시톨 삼인산 농도를 결정하였다. 캅사제핀(30μM)은 파프 혹은 에이티피에 의한 이노시톨 삼인산 생성에 아무런 영향을 주지 못하였다. 이는 상기 실시예 1에서 얻어진 결과와 함께 고려할 때 캅사제핀이 파프의 활성기작 중 세포 내부에서의 칼슘 유리 이후의 기작에 영향을 미친다는 사실을 암시한다.
<실시예 3>
도 3을 참조하여, 탑시가긴에 의한 세포내 칼슘증가에 미치는 캅사제핀의 영향을 설명한다.
탑시가긴은 세포내 칼슘 에이티피에이즈(Ca2+-ATPase) 억제제로서 세포질에서 세포내 칼슘저장고로 칼슘을 수송하는 기작을 억제하여 세포내 칼슘저장고를 고갈시킨다. 이때, 저장고-의존성 칼슘 유입현상(store-operated Ca2+entry)을 일으킨다. 도 3에서 보이는 바와 같이 캅사제핀은 상기 캅사제핀에 의한 세포내 칼슘증가를 억제한다. 여러 가지 농도의 캅사제핀을 이용했을 때(a, 용매; b, 3μM; c, 10μM; d, 30μM) 이들은 농도의존적으로 탑시가긴에 의한 칼슘증가를 억제하였으며 10μM에서 50% 억제효과를 나타냈다.
<실시예 4>
도 4를 참조하여, 탑시가긴에 의한 망간이온의 유입에 미치는 캅사제핀의 영향을 설명한다.
탑시가긴에 의하여 유도되는 저장고-의존성 칼슘 유입현상은 칼슘과 함께 망간이온의 유입도 허용한다. 망간이온이 유입될 경우 360nm의 형광조사에 의한 퓨라2의 형광(500nm)을 억제하게 되는데 이는 곧 저장고-의존성 칼슘 유입현상의 정도와 비례하게 된다. 화살표로 표시된 시간에 탑시가긴을 처리할 경우(c)에는 용매만을 처리할 때(a) 보다 급격한 형광감도의 감소를 일으킨다. 이때, 탑시가긴과 캅사제핀을 함께 처리하면(b) 탑시가긴만 처리했을 때 보다 덜한 형광의 감소를 가져온다. 이는 캅사제핀이 탑시가긴에 의한 저장고-의존성 칼슘 유입현상을 억제함을 말해준다.
<실시예 5>
도 5를 참조하여, 탑시가긴에 의한 세포내 칼슘증가에 미치는 캅사제핀과 에이케이에프96365(SKF96365)의 영향을 비교 설명한다.
에이케이에프96365는 저장고-의존성 칼슘 유입현상에 관한 억제제로 잘 알려져 있다. 도 5의 a에서 보는 바와 같이, 탑시가긴에 의한 세포내 칼슘증가에 대해상기 실시예 3에서와 동일한 실험을 수행할 경우 에이케이에프96365에 의해 탑시가긴의 저장고-의존성 칼슘 유입현상이 억제됨을 확인하였다. 이때, 에이케이에프96365 처리 후 캅사제핀을 처리하면 더 이상의 칼슘 감소가 일어나지 않는다. 또한, 도 5의 b에서 보는 바와 같이 이를 반대의 순서로 하여, 캅사제핀에 의한 억제가 일어난 후에 에이케이에프96365를 처리하여도 더 이상의 칼슘감소가 보이지 않는다. 이는 캅사제핀과 에이케이에프96365가 같은 경로 즉, 저장고-의존성 칼슘 유입현상을 억제한다는 것을 말해준다.
<실시예 6>
도 6을 참조하여, 파프 수용체의 활성화에 의한 활성산소기의 유리현상에 미치는 캅사제핀의 영향을 설명한다.
분화를 마쳐 호중구의 특성을 가지고 있는 HL-60 세포에 파프를 처리할 경우 도 6에 보이는 바와 같이 활성산소기를 유리한다. 유리된 활성산소기의 양은 이들에 의해 사이토크롬 피450(cytochrome P450)가 산화되는 정도를 570nm에서의 흡광도를 측정하여 하기 수학식 2(Cohen HJ and Chovaniec ME. 1978. J. Clin. Invest. 61:1081)에 의해 산출한다.
수학식 2
합성된 활성산소기 = Av/t/K/l/세포의 갯수
A : 570nm에서의 흡광도의 변화
v : 반응액의 용량
t : 반응시간
K : 사이토크롬 씨 및 산화된 사이토크롬 씨 간의 변화를 위한 흡광계수 21 x 103cm-1M-1
l : 반응물이 담긴 큐뱃(cuvette)의 길이
상기에서 캅사제핀을 3분간 전처리할 경우 파프의 처리에 의해 유리되는 활성산소기의 양을 농도의존적으로 억제함을 알 수 있다.
<실시예 7>
도 7을 참조하여, 파프 수용체의 활성화에 의한 활성산소기의 생성에 미치는 캅사제핀과 에이케이에프96365의 영향을 설명한다.
분화를 마쳐 호중구의 특성을 가지고 있는 HL-60 세포에 파프를 처리할 경우 도 7에서 보이는 바와 같이, 활성산소기를 생성하여 세포내 활성산소기의 농도가 높아진다. 세포내 활성산소기의 농도는 산화-감지 형광색소인 디씨에프-디에이(DCFH-DA; Molecular probe사, 미국)가 세포내로 들어가도록 상기 색소 2μM을 배지에 첨가하여 분화를 마친 HL-60 세포를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하였다. 이후, 세포내로 유입되지 않은 디씨에프-디에이를 세척해낸 후, 스펙트로플루오로포토메터(spectrofluorophotometer)를 이용하여 488nm,의 자외선을 교대로 조사한 다음, 530nm 영역의 형광을 측정함으로써 세포내 활성산소기의 양적변화를 측정하였다.
전처리시 용매만을 처리하고(a) 파프를 처리한 경우 파프에 의한 활성산소의 증가가 관찰되었다. 이때, 캅사제핀을 전처리한 뒤(b) 파프를 처리하면 상기 파프의 활성산소 증가보다 약한 증가가 관찰되었다. 또한, 실시예 5에서 이용되었던 에이케이에프96365를 전처리할 경우(c), 캅사제핀을 전처리할 경우와 유사한 정도로 파프의 활성산소 생성을 억제함을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 캅사제핀이 저장고-의존성 칼슘 유입현상을 억제함으로써 파프에 의한 활성산소의 생성과 유리를 억제한다는 사실을 증명한다.
<실시 예 8>
도 8을 참조하여, 피마자유를 경피 도포 하였을 때 생성되는 염증반응에 대한 인도메타신과 캅사제핀의 효과를 설명한다.
백서 (rat)의 귀 뒷부분에 피마자유를 도포하면 부종이 형성되는데 이는 면역반응과 알러지 현상을 연구하는데 좋은 모델이 될 수 있다. 이렇게 유도된 부종에 대하여 캅사제핀과 인도메타신이 어떠한 영향을 주는지를 시험하여 면역억제 효과를 검증코자 하였다. 용매인 아세톤만을 발라준 쥐의 귀에서 보이는 중량의 변화를 기준으로 하였을 때 인도메타신의 처리는 부종으로 인한 중량의 변화를 억제하였다. 같은 조건으로 캅사제핀을 처리하였을 경우 역시 중량의 변화를 억제하였다. 이와 같은 결과는 캅사제핀이 인도메타신과 유사한 작용, 즉 면역억제효과를 가짐을 생체에서 증명한 결과라고 할 수 있다.
결국, 각각의 실시예에서 상기 화학식으로 표시되는 본 발명의 화합물은 파프 수용체에 작용하여, 파프 수용체가 활성화 되면 그 세포내 농도가 증가하는 칼슘이온의 세포내 농도를 감소기키고, 파프에 의한 활성산소기 유리를 억제시킨다. 따라서, 상기 화합물은 파프 수용체 활성과 관련된 면역이상 질환, 즉 류마티스성 관절염, 알러지 및 관련질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은 비독성, 불활성, 제약상 적합한 부형제 이외에, 본 발명에 따른 1종 이상의 화합물을 함유하거나, 또는 본 발명에 따른 1종 이상의 유효화합물로 이루어지는 제약 조성물 및 이 조성물의 제조 방법을 포함한다. 본 발명의 화합물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
실제 임상투여시에 경피, 경구 및 기타 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 상용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
또한, 본 발명은 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약형태, 에를 들면 페이스트제(paste), 연고제, 겔제, 정제, 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약, 및 앰플제로 존제하고, 약제 중 유효화합물의 함량은 개별 투약량의 분율 또는 배수에 해당한다. 투약단위는, 예를 들면 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3또는 1/4배에 해당한다.
비독성이고 불활성인 제약상의 작합한 부형제는 고상, 준고상 또는 액상 희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형 보조물 이다. 바람직한 제형으로는 페이스트제, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 정제, 피복정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 산제 및 분무제 등이 포함된다.
이상의 설명에서 본 발명은 특정의 실시예와 관련하여 도시 및 설명하였지만, 특허청구범위에 의해 나타난 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 한도내에서 다양한 개조 및 변화가 가능하다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 쉽게 알 수 있을 것이다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의한 캅사제핀은 파프 수용체에 작용하여 파프 수용체의 활성화에 의한 칼슘의 증가를 억제하고, 활성산소기의 생성 및 유리를 억제하는 등 파프에 의한 면역반응을 저해하므로, 부작용이 적으며 안전성이 높은 파프 수용체 활성과 관련된 질병의 치료제로 유용하게 이용될 수 있는 효과가 있다. 특히, 류마티스성 관절염 및 알러지 치료제로 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (8)

  1. (a) 파프 (PAF) 수용체의 활성을 억제하는 유효 성분으로서 하기 화학식 1로 표시되는 캅사제핀(N-[2-(4-chlorophenyl)ethyl]-1,3,4,5-tetrahydro-7,8-dihydroxy-2H-2-benzazepine-2-carbothioamide)의 약제학적 유효량; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 세포내 칼슘 이온의 농도 감소 및 활성산소기의 유리 억제에 의하여 과다 면역 반응을 억제하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
    화학식 1
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 캅사제핀의 함량은 상기 조성물의 총 중량에 대하여 0.01-99.99 중량%인 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 캅사제핀의 50% 저해농도 (50% inhibition concentration, IC50)는 약 100 μM인 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 캅사제핀의 약제학적 유효량은 0.1 ㎍/kg 내지 1 g/kg인 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 캅사제핀의 약제학적 유효량은 50-200 ㎍/kg인 것을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 캅사제핀의 세포내 칼슘 이온의 농도 감소 효과는 저장고-의존성 칼슘 유입 (store-operated Ca2+entry)의 억제에 의한 것임을 특징으로 하는 류마티스성 관절염 또는 알러지성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
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