KR100431285B1

KR100431285B1 - 텔로머라제 유전자의 다형성 ｖｎｔｒ과 이를 이용한ｄｎａ 타이핑 및 텔로머라제 관련 질병의 진단방법

Info

Publication number: KR100431285B1
Application number: KR10-2001-0088152A
Authority: KR
Inventors: 임선희; 김중현
Original assignee: 학교법인 동아대학교
Priority date: 2001-12-29
Filing date: 2001-12-29
Publication date: 2004-05-12
Also published as: KR20030058023A

Abstract

본 발명은 새로 클론닝되어 그 염기서열이 결정된 인간 텔로머라제 유전자(hTERT: human telomerase reverse transcriptase)내의 인트론 6영역의 다형성 hTERT-VNTR 6-1,hTERT내의 인트론 2 또는 인트론 6 영역의 다형성(hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2)을 검출하기 위한 프라이머 세트, 와 상기 프라이머 세트를 이용한 DNA 타이핑 방법 및 텔로머라제 관련 질병의 진단방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면,hTERT의 VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2이 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되므로, 이를 DNA 타이핑함으로써 개체의 친자확인, 혈연확인 또는 법의학적 감정에 효과적으로 사용될 수 있으며, 암조직으로부터의hTERT의 VNTR 6-1 및 6-2은 정상조직과 달리 염색체 재배열(rearrangements)이 관찰되므로, 이러한 재배열을 판정함으로써 텔로머라제 관련 질병, 예컨대 결장, 고환, 피부, 위장, 또는 신장 암 등을 효과적으로 진단할 수 있다.

Description

텔로머라제 유전자의 다형성 ＶＮＴＲ과 이를 이용한 ＤＮＡ 타이핑 및 텔로머라제 관련 질병의 진단방법{Polymorphic VNTRs of human telomerase gene and methods for DNA typing and detecting telomerase-related diseases using the same}

본 발명은 텔로머라제 유전자의 다형성 VNTR에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 새로 분리되어 염기서열이 결정된 인간 텔로머라제 유전자(hTERT)내의 인트론 6영역의 다형성 hTERT-VNTR 6-1,hTERT내의 인트론 2 또는 인트론 6 영역의 다형성(hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2)을 검출하기 위한 프라이머 세트, 와 상기 프라이머 세트를 이용한 DNA 타이핑 방법 및 텔로머라제 관련 질병의 진단방법에 관한 것이다.

텔로미어(Telomeres)는 진핵세포 염색체의 말단에서 발견되며 염색체들의 분해나 말단-대-말단 융합을 방지하는 특별한 구조이다(Blackburn, 2000). 텔로머릭(telomeric) DNA는 짧은 염기서열의 직렬 반복 (인간의 경우 TTAGGG)으로 구성된 일차적 구조로서, 그 길이는 하등 진핵세포의 수백 bp에서부터 포유동물 세포의 수천 bp까지 변화한다. 텔로머릭 DNA 부분은 동원체(centromere) 영역에서와 같이 GC의 불균형(GC-rich)을 나타낸다. 이러한 성질은 염색체가 복제될 때 종래 DNA 폴리머라제에 의한 G-가닥의 불완전 복제를 야기하여, 노출된 반대가닥의 C-가닥이 핵산제거효소에 의해 분해되거나 텔로머라제에 의한 합성으로 텔로머릭 말단부위가 완성될 수 있다.

텔로머라제(Telomerase)는 활성 소단위인 TERT (human telomerase reverse transcriptase)효소와 텔로머릭 DNA의 합성을 위한 주형을 제공하는 RNA 성분인 TR(Telomerase RNA)로 구성된 리보뉴클레오프로테인(ribonucleoprotein) 복합체이다(Greider and Blackburn, 1989). 모든 텔로머라제 활성 소단위에서 보존된(conserved) 도메인은 레트로바이러스 및 레트로트랜스포존로부터의 역전사효소(RT)의 활성 도메인과 구조적으로 관련되어 있다. 비록 TERT와 TR이 텔로머라제 리보뉴클레오프로테인 구조체의 최소 단위이지만, 다른 단백질들도 이 효소 복합체와 구조적으로 또는 일시적으로 연관되어 있다(Bryan and Cech, 1999).

텔로머라제는 주로 생식세포(germ line) 및 성인 체세포의 재생 조직인 간세포 (stem cell) 등에서는 발현되지만, 다른 체세포에서는 발현되지 않게 되어 텔로미어 영역의 길이는 세포 분열 횟수에 따라 점차 짧아지게 된다. 그리하여 텔로미어가 매우 짧아지게 되면 DNA 상해 체크포인트가 활성화되고, 세포는 더 이상의 분열을 멈추고 노화가 유도된다. 따라서, 텔로미어 길이는 포유동물의 세포 수명에 영향을 주는 생물학적 시계로서 작용한다고 간주된다(Chiu and Harley, 1977). 이와 일치된 사실로서, 텔로머라제는 세포 노화가 일어나지 않는 대부분의 불멸 종양 세포에서는 활성화가 나타난다.

텔로머라제의 RNA 성분은 대부분의 배아 및 성인 조직에서 발현되나(Feng et al., 1995; Avilion et al., 1996); 이와 대조적으로TERT의 발현은 고도로 조절되며 텔로머라제 활성과 직접 관련되어 있다.(Kilian et al., 1997; Meyerson et al., 1997; Nakamura et al., 1997). TERT를 암호화하는 인간 유전자인hTERT의5'-프로모터 영역 내에는 그 발현을 조절하는 여러 전사인자의 결합부위를 포함하며, 더욱이hTERT전사체의 여러 형태가 검출되었다(Kilian et al., 1997; Meyerson et al., 1997; Nakamura et al., 1997). 이들 결과는 텔로머라제가 전사적 메카니즘 및/또는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)과 같은 전사후 메카니즘에 의해 그 발현이 조절될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 스플라이싱의 변이는 인트론 부위에서 발견되어 인트론 부위가 텔로머라제의 활성에 중요한 역할을 할 것으로 사료된다.

hTERT로부터의 게놈 단편의 분리를 보고한 종래의 연구는 Takakura et al. (1999)은hTERT프로모터 영역을 단리하였고, Cong et al. (1999)은 인트론-엑손 접점을 검출하기 위해 사용되는 BAC 클론을 단리하였다. 또한,hTERT에 걸쳐있는 5개 중첩하는 파지 클론의 서열이 Wick et al. (1999)에 의해 결정되었으며, 그는hTERT유전자가 약 40 kb를 포함하며 104 내지 8616 bp 길이를 갖는 15 개의 인트론과 16 개의 엑손으로 이루어진 것을 보여주었다. 그러나, 인트론 6의 서열은 이러한 연구에서 의해 밝혀지지 않았으며, 따라서hTERT의 서열은 GenBank에 미지 크기의 갭으로 분리된 두 개의 단편으로 등록되었다.

본 발명에서, 전장hTERT유전자가 분리되고 종전에서 알려지지 않았던 인트론 6의 영역의 서열뿐만 아니라hTERT의 상류 및 하류 영역의 서열이 결정되었다. 본 발명자들은 인트론 6 영역 내에 38 bp 서열의 직렬 반복 변이수(VNTR: varible number of tandem repeats), (hTERT-VNTR 6-1)을 포함한다는 것을 처음으로 밝혀냈다. 27 내지 47 반복 범주를 가지는 hTERT-VNTR 6-1의 8개 대립유전자(alleles)가103명의 서로 상관성 없는 개체 중에서 동정되었다.

또한 본 발명자들은 종래 보고(Szutorisz et al., 2001)와 달리hTERT유전자의 인트론 2의 61 bp의 소위성 (minisatellite) 반복배열(hTERT-VNTR 2-2)이 다형성이라는 것을 처음으로 밝혀냈다. hTERT-VNTR 2-2는 100명의 비상관성 개체로 부터 적어도 4개 대립유전자로 구별될 수 있었다. 종전 연구는 소위성 hTERT-VNTR 2-1(인트론 2의 42 bp 반복) 및 hTERT-VNTR 6-2(인트론 6의 36bp 반복)에 대한 다형성(polymorphisms)만을 기술하였다. 이러한 반복 구조는 인트론 12에서 발견된 또 다른 소위성 (minisatellite)과 합쳐서hTERT유전자내에 존재하는 5개의 소위성 (minisatellite) 구조를 이룬다.

본 발명자들은hTERT소위성 (minisatellite)의 분리(segregation)를 각 20 가족 이상 분석하여 VNTR이 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달된다는 것을 발견하고,hTERT의 소위성 (minisatellite)을 종양 환자의 정상 및 암 조직으로부터 비교 분석하여 종양을 갖는 환자에서 인트론 6의 두 개의 VNTR(6-1 및 6-2)이 재배열(rearrangements)이 일어나는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 새로 분리되어 그 염기서열이 결정된 인간 텔로머라제 유전자(hTERT)내의 인트론 6영역의 다형성 hTERT-VNTR 6-1을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은hTERT내의 인트론 2 또는 인트론 6 영역의 다형성(VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2)을 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 개체의 친자확인, 혈연확인 또는 법의학적 감정에 유용한 DNA 타이핑 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 결장, 고환, 피부, 위장, 또는 신장 암과 같은 텔로머라제 관련 질병을 효과적으로 진단하는 방법을 제공하는데 있다.

도 1은 인간TERT유전자 내의 VNTR (Variable Number Tandom Repeat)의 위치를 보여주는 개략도이다.

도 2는 hTERT-VNTR 6-1의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 3은 hTERT-TR 12의 단형성(monomorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 4는 hTERT-VNTR 2-2의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 5는 hTERT-VNTR 6-2의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 6는 hTERT-VNTR 2-1의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 7는 hTERT-VNTR 2-1, 2-2 및 6-1이 부모와 자식간에 있어서 유전적으로 안정적으로 전달되는 것을 보여주는 전기영동 사진이다

도 8은 hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 및 6-2의 피부, 위장 및 신장 종양환자의 정상 및 암조직에서의 다형성(polymorphism)을 비교한 전기영동 사진이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는hTERT유전자내의 인트론 6 영역의 다형성 hTERT-VNTR 6-1을 제공한다.

hTERT유전자내의 인트론 6의 서열은 종래 연구에서 완성되지 않았으나, 본 발명에서 인트론 6이 38bp 서열의 직렬 반복 변이수(VNTR: varible number of tandem repeats), (hTERT-VNTR 6-1)을 포함한다는 것을 처음으로 밝혀냈다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 hTERT 유전자내의 인트론 2 영역의 다형성 hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2를 검출하기 위한, 서열번호 2 내지 9 중 어느 한 쌍의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개체의 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2 내지 9 중 어느 한 쌍의 염기서열을 갖는 프라이머 세트를 사용하여 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및, 상기 중합효소 연쇄반응 산물을 전기영동으로 분리하여 TERT 유전자내의 인트론2 또는 인트론6 영역의 다형성(VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2)을 동정하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 DNA 타이핑(typing) 방법을 제공한다.

TERT 유전자내의 인트론2 또는 인트론6 영역의 다형성(VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2)은 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 분리되어 전달되므로(하기 실시예 참조), 본 발명의 DNA 타이핑 방법은 개체의 친자확인, 혈연확인 또는 법의학적 감정 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 내지 9 중 어느 한 쌍의 염기서열을 갖는 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 dNTPs(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 포함하는 hTERT 유전자내의 인트론2 또는 인트론6 영역의 다형성(hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2)에 대한 DNA 타이핑 키트를 제공한다.

본 발명의 DNA 타이핑 키트에서는, 검체의 조직으로부터 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하여 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행함으로써 해당 다형성 VNTR에 대한 DNA를 타이핑하며, 따라서, DNA 중합효소는 PCR에 적합한 taq 폴리머라제가 바람직하다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 환자의 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 6 내지 9의의 VNTR 6-1 및/또는 6-2 특이적 프라이머 세트를 사용하여 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및, 상기 중합효소 연쇄반응 산물을 전기영동으로 분리하여 VNTR 6-1 및/또는 6-2 다형성의 재배열(rearrangements) 유무를 판정하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 DNA 타이핑(typing) 방법을 제공한다.

hTERT의 소위성 (minisatellite)을 종양을 갖는 환자의 정상 조직 및 암 조직으로부터 비교 분석한 결과, 암조직에서의 인트론 6 영역 내의 두 개의 VNTR(6-1 및 6-2)이 재배열(rearrangements)되었으므로 (하기 실시예 참조), 이는 VNTR 6-1 및/또는 6-2를 포함하는 염색체 재배열이 암 세포에서 텔로머라제(telomerase) 발현의 활성화와 연관될 수 있다는 것을 제시한다. 따라서, 본 발명의 진단방법은 텔로머라제 관련 질병, 예컨대, 결장, 고환, 피부, 위장, 또는 신장 암 등을 진단하는 데 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 진단방법에 있어서, 상기 다형성 VNTR 6-1 또는 6-2의 재배열(rearrangements)은 1 대립유전자의 소 결실 또는 이형접합성의 상실인 것을 특징으로 한다. 이러한 재배열은 암조직으로부터의 다형성 VNTR을 정상조직으로부터의 다형성 VNTR과 전기영동사진을 통해 비교함으로써 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 6 및 7 또는 서열번호 8 및 9 의 염기서열을 갖는 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 dNTPs(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 포함하는 인간을 포함한 포유동물의 텔로머라제 관련 질병의 진단키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트에서는, 검체의 조직으로부터 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하여 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행함으로써 해당 다형성 VNTR의 재배열을 판정하며, 따라서, DNA 중합효소는 PCR에 적합한 taq 폴리머라제가 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예]

실시예 1. 전체 hTERT 유전자를 포함하는 게놈 단편의 단리

전체hTERT유전자를 수반하는 54 kb YAC 클론이 TAR (Transformation-Associated Recombination) 클로닝(Kouprina et al. 1998)에 의해 단리되었다. 상기 YAC 클론은 PCR 프라이머를 사용하여 분석되었으며, 이는 그들이 16 엑손과 올바른 엑손-인트론 경계를 포함한다는 것을 확인시켰다.

hTERT유전자의 방사상(radial) TAR 클로닝을 위하여, 우선 인간TERT유전자의 3' 서열 및AluBLUR13 서열(Kouprina et al., 1998)을 포함하는 TAR 벡터, pVC604-RT1을 기본 TAR 클로닝 벡터 pVC604 (HIS3-CEN6)(Kouprina and Larionov, 1999)를 사용하여 구축하였다. 100 bphTERT후크[게놈 서열에서 위치 64 300-64 399(GenBank 수탁번호 AY007685)]를BamHI-EcoRI 단편으로서 그리고 280 bpAlu후크를XhoI-EcoRI 단편으로서 pVC604 폴리링커내에 클로닝하였다. TAR 클로닝 벡터를 형질전환전에EcoRI으로 절단하여 한쪽 말단에 유전자-특이적 후크로 다른 쪽 말단에 일반적 반복 인간 DNA 요소(즉,Alu) 후크로 결합된 선형 분자를 수득하였다. 형질전환 실험은 앞에서 기술한 TAR 클로닝 프로토콜(Kouprina and Larionov, 1999)에 따라 새로 제조된 효모 스피로플라스트를 가지고 실시하였다. TAR 클로닝을 위한 고분자량 인간 게놈 DNA는 Promega에서 구입하였다.hTERT유전자를 포함하는 형질전환체를 동정하기 위하여, 형질전환체들을 특이적 프라이머 쌍(예컨대, 엑손1의 경우: Ex1-F gca cgt ggg aag ccc t 및 Ex1-R acc tcg cgg tag tgg ct)을 사용하여 PCR에 의해 엑손 서열의 존재에 대해 시험하였다. 54 kb 환형 YAC을 포함하는 클론중 하나는 분석된 모든 엑손(1-16) 서열에 대해 양성이었다. 이 클론은 ATG 시작코돈의 상류 약 11 kb 서열과 함께 전체hTERT유전자를 포함한다. 표준 리튬아세테이트 형질전환 방법을 이용하여hTERTYAC을 BRV1 벡터를 사용하여 BAC 내로 레트로피팅(retrofitting)하였다 (Kouprina et al., 1998). 이 방법이 의해 클론된 YAC 벡터는 YAC/BAC 구조체로 전환되어 이미 기술된 일렉트로포레이션에 의해E.coli로 형질전환하여 BAC 상태의 DNA를 분리하였다. 먼저 이 BAC DNA를 이용하여 인트론 6-갭(Int6-Gap F gtg aag aag tat ccc tgg agc 및 Int6-Gap R gaa agc tcg cct tga act ctg)을 증폭하여 염기서열 분석에 사용하여 종래 엑손 6과 7사이에 존재하던 갭을 채워 주었다.

따라서, 전체hTERT유전자의 염기서열이 결정되었으며,hTERT영역에서 5군데의 직렬 반복 소위성(minisatellite)을 발견하였다. 이 영역을 제외하고는, 본 발명의 서열과 종래 제출된 부분적 서열사이에 큰 차이가 없었다. 대부분의 이들 소위성 (minisatellite) 반복은 정상 개체로부터의 PCR 증폭에 의해 보여지듯이 매우 다양한 크기 다형성을 보유하고 있다(하기 실시예 2 참조).

도 1은 인간TERT유전자 내의 VNTR (Variable Number Tandom Repeat)의 위치를 보여주는 개략도이다. 총 5군데의 직렬 반복(Tandom repeat) 소위성 (minisatellite) 중에 4군데가 VNTR로서 다형성(polymorphism)임을 보여준다. 염기서열을 탠덤 리피트 파인더 프로그램(Benson, 1999)에 의해 분석하여 검출된 소위성의 대략적인 위치는 별표로 나타냈다. 밑줄친 박스는 종전에 공개된 hTERT 서열에서 빠져있던 인트론 6 부분을 가리킨다. 여기서 다형성을 갖는 새로운 소위성(hTERT-VNTR 6-2, 38 bp 반복)이 발견되었으며, 그 반복단위서열을 본 명세서에서 서열번호1로 나타내었다. 또한hTERT는 4개의 추가적인 소위성을 포함한다: 인트론 2에 두 개의 소위성(hTERT-VNTR 2-1 및 2-2, 각각 42 bp 및 61 bp 주기 크기를 가짐), 인트론 6에 하나의 추가적 36 bp 반복 소위성 (hTERT-VNTR 6-2), 및 인트론 12에 하나의 28 bp 반복 소위성 (hTERT-TR 12).

상기 5개의 hTERT 소위성 (minisatellite) 반복 단위의 염기서열은 하기 표 1에 보여진다. 인트론 2 및 6의 소위성 (minisatellite)은 다형성인 반면, 인트론 12의 소위성 (minisatellite)은 검사한 집단 샘플에서 단형성이었다.

[표 1] hTERT 소위성 (minisatellite) 반복 단위의 염기서열

실시예2. hTERT 유전자내의 VNTR 다형성

실시예1에서 얻어진hTERTYAC 클론을 PCR 분석하여 VNTR 다형성을 검출하였다. PCR 분석에 사용된 모든 프라이머는hTERT게놈 서열에 기초하였고 그 염기서열은 하기 표 2와 같다.

[표 2] 다형성(polymorphisms) 검출에 사용되는 프라이머

다형성	프라이머	염기서열	서열번호
VNTR 2-1	VNTR 2-1 F	gct gcg tct tgc gtg act gg	2
VNTR 2-1	VNTR 2-1 R	tac cca ggc aat ggg caa cc	3
VNTR2-2	VNTR 2-2 F	tgg gag cat cac tca cag ga	4
VNTR2-2	VNTR 2-2 R	gga aca cag cca acc cct ta	5
VNTR 6-1	VNTR 6-1 F	gtg acg ttg ctt ctg tgc ctc ctt	6
VNTR 6-1	VNTR 6-1 R	cga ccc cag agt gga aga aac aga	7
VNTR 6-2	VNTR 6-2 F	act ctt ctc ctg cct gtg ctg tgg	8
VNTR 6-2	VNTR 6-2 R	gtt tct tcc gat cag gac gtg tgg	9
TR 12	TR 12 F	tgc cac tcc tta cag ggt gag acg	10
TR 12	TR 12 R	gaa gga acc agg aga ggg agt gga	11

게놈 DNA를 표준 PCR 조건(50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 3.0 mM MgCl₂, 0.2 mM dTTP, dCTP, dGTP 및 dATP, 최종부피 50 ㎕)하에 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 9600 서머사이클러(Perkin-Elmer)에서hTERT소위성 (minisatellite)의 다형성 정도를 평가하기 위하여, 서로 상관성이 없는 103명의 건강한 개체로부터 얻은 혈액에서 뽑은 DNA를 분석하였다. 표준방법을 사용하여 말초혈 림프구로부터 DNA를 단리하였다. 피부, 위장 및 신장암의 정상 및 암 조직의 비교 샘플은 PCR 분석을 위해 한국의 동아대학병원에서의 외과수술로부터 수득하였다. 서머사이클링 조건은 다음과 같다: 인간 DNA 샘플의 PCR 분석을 100 ng 게놈 DNA로 타카라LA Taq폴리머라제(Takara Co., Japan)를 사용하여 수행하였다. 특히 hTERT-VNTR 6-1과 2-1은 게놈 DNA를 PCR 수행전에 Pst1효소를 처리하면 반응이 더 명확히 보인다. 사이클 조건은 94℃에서 2분 동안 1회 열처리한 후, 94℃에서 45초 및 68℃에서 3분의 30사이클 수행한 후, 마지막 신장 단계는 72℃에서 10분 연장한다. PCR 산물을 0.7% 아가로스 겔 (25 cm 길이)에 주입한 후, TAE 버퍼에서 전기영동(1볼트/cm)에 의해 분석하였다.

종전에 발표된hTERT의 서열은 인트론 6에 갭을 가지고 있었다. 먼저 클론된 YAC을 이용하여 인트론 6의 갭을 메우기 위해, 종래 알려진 엑손 6과 7의 염기서열을 이용하여 갭 부분의 PCR을 수행하였다. 이러한 PCR 산물의 염기서열 결정한 결과 이 영역에서의 반복서열이 확인되었다. 이 반복서열은 상기 클론된 YAC에서 1.16 kb DNA 단편으로 동정되었으며, 이는 38 bp 단위의 21 사본에 해당한다. 이 영역의 다형성 여부를 103명의 비관련 개체로부터 DNA를 단리하고, PCR에 의해 분석하였다. 그 결과는 상기 반복의 18 내지 38 사본에 해당하는 1.05 kb 내지 1.81 kb 길이 범위의 이 소위성 (minisatellite)의 8개 대립유전자(도 2)와 0.621의 이형접합도(degree of heterozygosity) 정도를 보여주었다. 대부분의 일반적 대립유전자는 22 반복을 가졌다. 또한 서로 다른 크기의 PCR 산물들 (20, 22, 26, 35, 38 회 반복의 PCR산물)을 분리하여 프라이머 VNTR 6-1 F와 R을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과 이 서로 크기가 다른 PCR 산물이 모두 동일한 (약 10%의 서열분화) 반복서열을 지니고 있음이 밝혀졌다. 이 직렬 반복 변이수는 hTERT-VNTR 6-1로 명명하였다.

도 2는 hTERT-VNTR 6-1의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다. hTERT-VNTR 6-1(인트론 6내 38bp 반복)의 다형성을 프라이머 VNTR 6-1 F 및 VNTR 6-1 R (표 2 참조)로 PCR에 의해 103명 개체로부터의 DNA에서 분석되었다. hTERT-VNTR 6-1의 8개 대립유전자가 동정되었다. 도면에 이러한 PCR 산물의 전기영동 패턴이 보여진다. 첫 번째 및 마지막 레인은 사이즈 마커이고, 레인 Y는hTERTYAC DNA를 사용한 양성 대조군이다. hTERT-VNTR 6-1의 대립유전자 빈도, PCR 산물의 크기, 반복수가 하기 표 3에 보여진다.

[표 3]

도 3은 hTERT-TR 12의 단형성(monomorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다. 도면에서 TR 12는 단형성으로 1 대립유전자만을 나타낸다. 하기 표 4에 hTERT-TR 12의 대립유전자 빈도, PCR 산물의 크기, 반복수가 보여진다.

[표 4]

도 4는 hTERT-VNTR 2-2의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진이다. hTERT-VNTR 2-2의 다형성을 PCR 프라이머 VNTR 2-2 F 및 VNTR 2-2 R (표 2참조)을 사용하여 103명 개체로부터의 DNA에서 분석하였다. 그러나, 종래보고(Szutorisz et al., 2001)와 달리, 인트론 2의 61 bp 반복(hTERT-VNTR 2-2)은 다형성인 것으로 밝혀졌다. hTERT-VNTR 2-2의 4개의 대립유전자 발견되었으며, 이들은 40 내지 44 반복의 범위를 가지며 가장 일반적인 대립유전자는 44 반복이고, 0.476의 대응하는 이형접합도를 가진다. hTERT-VNTR 2-2의 4개 대립유전자가 동정되었다 hTERT-VNTR 2-2의 대립유전자 빈도, PCR 산물의 크기, 반복수가 하기 표 5에 보여진다.

[표 5]

도 5에서는 hTERT-VNTR 6-2의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진으로 인트론 6의 36 bp 직렬 반복(hTERT-VNTR 6-2)또한 특성화되었다. hTERT-VNTR 6-2의 다형성을 프라이머 VNTR 6-2 F 및 VNTR 6-2 R (표 2 참조)로 PCR에 의해 100명 개체로부터의 DNA에서 분석하였다. 그 결과, 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의해 hTERT-VNTR 6-2의 30개 대립유전자를 동정하였다. 반복수는 23 내지 88로 변화하였으며, 가장 일반적 대립유전자에서 47 반복을 가졌다(도 5). 대부분의 개체는 이 VNTR에 대해 이형접합체이었다(0.95의 이형접합도). hTERT-VNTR 6-2의 대립유전자 빈도, PCR 산물의 크기, 반복수가 하기 표 6에 보여진다.

[표 6]

도 6는 hTERT-VNTR 2-1의 다형성(polymorphism)을 보여주는 전기영동 사진으로, 프라이머 VNTR 2-1 F 및 VNTR 2-1 R (표 2 참조)로 PCR에 의해 100명 개체로부터의 DNA에서 분석하였다. 그 결과, hTERT-VNTR 2-1의 6개 대립유전자가 동정되었다. 반복수는 40 내지 111로 변화하였고, 가장 일반적인 대립유전자에서 40 반복을 가졌다. 이 VNTR은 0.569의 측정된 이형접합도를 가졌다.

hTERT-VNTR 2-1의 다형성을 hTERT-VNTR 2-1의 대립유전자 빈도, PCR 산물의 크기, 반복수가 하기 표 7에 보여진다.

[표 7]

따라서,hTERT는 4개의 VNTR과 한 개의 단형성으로 보여지는 소위성 (minisatellite)을 포함한다.

실시예 3. hTERT 에서 다형성 소위성 (minisatellite)의 유전

hTERT에서의 VNTR 분리(segregation) 분석을 위해 23 가족을 선택하였다. 각 가족마다 부모와 1 내지 3명의 아이들로부터 혈액을 수집하였다. 대부분의 경우에, hTERT-VNTR 2-1, 2-2 및 6-1의 대립유전자가 동정되었고, 그들의 전달을 부모로부터 아이로 추적하였다. 그 결과는 이들 hTERT-VNTR이 멘델리안 유전에 따른다는 것을 보여주었다(즉, 아이들이 각 부모로부터 한 개의 VNTR 대립유전자를 전달받는다)(도 7). 이 분석에서 새로운 소위성 (minisatellite) 대립유전자는 관찰되지 않았다. 따라서,hTERT내의 이들 3개의 VNTR은 감수분열적으로 안정하며, hTERT 대립유전자의 감수분열적 분리를 확인하는 마커로서 사용될 가능성이 있다.

도 7는 hTERT-VNTR 2-1(A 패널), 2-2(B 패널) 및 6-1(C 패널)이 부모와 자식간에 있어서 유전적으로 안정적으로 전달되는 것을 보여주는 전기영동 사진이다. 4군데의 VNTR 다형성(polymorphism)이 부모와 자식간에 있어서 유전적으로 안정적으로 전달되는 것을 각 부분별로 조사하였다. F (Father), M (Mother), 1, 2 or 3: (number of children). Y는 대조군으로서 본 연구에서 클론닝된 유전자를 사용하였다. 본 도면은 2-1, 2-2 그리고 6-1만을 나타내었으나 6-2에서도 같은 결과를 보여줄 것이라는 것은 당업자에게 자명하다.

실시예 4. 암 세포에서 VNTR의 분석

텔로머라제 활성은 악성 종양 세포의 약 85%에서 검출되며, 그 존재는 특정 암 질병에 대한 신호로서 고려될 수 있다 (Colgin and Reddel, 1999; Poole et al., 2001). VNTR은 많은 포유동물 유전자에서 동정되었으며, 그 중 몇몇 소위성 (minisatellite) 대립유전자는 인간 질병 및 인접 유전자의 발현과 연관되어 있다(Bailly et al., 1996; Nakamura et al., 1998; MacKenzie and Quinn, 1999; Fiskerstrand et al., 1999; Alakurtti et al., 2000). 예컨대,H-ras유전자의 3'-측접 영역에의 VNTR은 rel/NF-κB 패밀리의 전사인자에 결합하여H-ras의 전사 활성화에 기여한다(Trepicchio and Krontiris, 1992). 이 VNTR의 희귀한 대립유전자는 다양한 유형의 암의 높은 위험성과 연관되어 있다(Krontiris et al., 1993)고보고되었다. 그러므로 hTERT-VNTR이 다형성일 뿐만 아니라, 그들 중 적어도 하나는 주요 전사인자에 대한 공통 서열을 수반하고 있기 때문에, 그들이 종양발생동안hTERT를 활성화하는데 한 역할을 할 수 있을 것으로 보인다. 이 아이디어는 결장, 고환, 피부, 위장 및 신장 종양을 갖는 5명의 환자로부터의 매치하는 암조직과 정상조직의 DNA에서 VNTR 반복의 개수를 비교함으로써 시험되었다. 4명 환자의 두 조직으로부터의 DNA에서 4개 다형성 hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 및 6-2는 유사한 반복수와 이형접합성을 가졌다. 그러나, 신장 종양을 갖는 한 환자의 암 조직으로부터의 DNA는 hTERT-VNTR 6-1의 1 대립유전자의 소 결실과 동시에 hTERT-VNTR 6-2에서 이형접합성의 상실을 보여주었다(도 8).

도 8은 hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 및 6-2의 피부, 위장 및 신장 종양 환자의 정상 및 암조직에서의 다형성(polymorphism)을 비교한 전기용동 사진이다. 피부, 위장 또는 신장 암을 갖는 환자의 정상 및 암 조직으로부터 분석되었다. hTERT-VNTR의 길이를 PCR에 의해 분석하였다. hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 및 6-2에 대한 결과가 패널 A-D에 보여진다. 레인 1, 3, 5 및 7은 정상 조직 샘플이고, 레인 2, 4 및 6은 암 조직 샘플이다. 레인 1-3은 피부암 환자로부터이고, 레인 4-5는 위암 환자로부터이고, 레인 6-7은 신장암 환자로부터이다. 첫 번째 및 마지막 레인은 사이즈 마커이고, 레인 Y는hTERTYAC DNA의 양성 대조군이다.

본 발명에서는hTERT인트론 6의 종래 분실된 영역에서 38 bp 반복 소위성 (minisatellite), hTERT-VNTR 6-1을 동정하였다. 이것은hTERT유전자내의 5번째소위성 (minisatellite)이다: 다른 것들은 인트론 2내의 hTERT-VNTR 2-1 및 2-2, 인트론 6내의 hTERT-VNTR 6-2, 및 인트론 12내의 28 bp 반복 소위성 (minisatellite)을 포함한다.

또한, 본 발명에서는 hTERT-VNTR 2-2가 다형성이라는 것을 밝혔다. 따라서, 본 발명은 종래의 보고(Szutorisz et al., 2001)와 함께 hTERT-VNTR 2-1 및 6-2이 다형성이라는 것을 보여준다. 여기서 보여진 바와 같이, 이들 VNTR은 멘델리안 방식으로 유전되므로, 그들의 다형성은 텔로머라제-관련 질병의 연구에서hTERT대립유전자의 감수분열적 분리(segregation)에 대한 마커로서 유용할 것이다.

hTERT는 4개의 다형성 소위성 (minisatellite) VNTR 2-1, 2-2, 6-1 및 6-2, 그리고 1개의 단형성 소위성 (minisatellite) TR 12를 가진다. 이들 VNTR이 하는 기능적 역할은 명백하지 않으나,hTERT발현에 영향을 주는 조절 메카니즘에 관여할 것이다. 다음과 같은 여러 관찰이 이러한 가능성을 뒷받침해준다. hTERT-VNTR 2-1의 많은 반복이 MYC 패밀리의 발암유전자 전사인자에 대한 프로모터 영역에도 존재하는 정규(canonical) CACGTG 결합부위를 포함하고 있으며, 한편 c-MYC의 과발현이 이 요소를 통해hTERT전사를 활성화한다(Wu et al., 1999). VNTR 2-2는 리포터 유전자 측정법에서hTERT프로모터 활성을 억제하였고(Horikawa I, 비공개 데이터), 인트론내 VNTR이 mRNA 스플라이싱에도 영향을 줄 가능성이 있다(Turri et al., 1995).hTERT유전자는 적어도 6개의 선택적 스플라이싱 부위를 가지며, 그중 하나(β부위)는 엑손 7 및 8을 결여하는 mRNA를 생산하여 촉매적으로 불활성의 C-말단 절지된 hTERT 단백질을 수득하게 한다(Yi et al., 2000). 인트론 6내의VNTR은 이러한 선택적 스플라이싱을 조절할 수도 있으나, 이를 뒷받침하는 증거는 아직 없다.

본 발명에서,hTERT유전자내의 VNTR을 5명의 암환자의 정상 및 암 세포로부터의 DNA에서 시험하였다. 신장 종양을 갖는 한명의 환자의 암 세포로부터의 DNA는 hTERT VNTR 6-1 및 6-2의 동시 재배열을 가졌다. 그 재배열은 hTERT-VNTR 6-1의 소 결실과 hTERT-VNTR 6-2의 이형접합성의 상실을 포함하였다. 본 관찰이 암세포에서의 텔로머라제의 발현과 이들 소위성 (minisatellite)을 포함하는 재배열의 직접적인 관계를 증명할 수는 없으나, 이러한 질병을 지닌 환자로부터 게놈에서의 변화를 인식할 수 있는 중요한 마커가 될 수 있을 것이다. 또한 본 발명은 hTERT-VNTR 다형성 및 그들의 암 위험뿐만 아니라 세포 증식 및 노화와 연관된 인간 질병과의 연관관계에 대한 대규모 전염병학 연구(Mitchel et al., 1999; Shay and Wright, 1999)와 같은 더 이상의 연구를 촉진할 것이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면,hTERT의 VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2이 멘델리안 유전에 따라 감수분열을 통해 전달되므로, 이를 DNA 타이핑함으로써 개체의 친자확인, 혈연확인 또는 법의학적 감정에 효과적으로 사용될 수 있으며, 암조직으로부터의hTERT의 VNTR 6-1 및 6-2은 정상조직과 달리 염색체 재배열(rearrangements)이 관찰되므로, 이러한 재배열을 판정함으로써 텔로머라제 관련 질병, 예컨대 결장, 고환, 피부, 위장, 또는 신장 암등을 효과적으로 진단할 수 있다.

Claims

서열번호 1의 염기서열로 구성된 hTERT 유전자내의 인트론 6 영역의 다형성 hTERT-VNTR 6-1.
hTERT 유전자내의 인트론 2 영역의 다형성 hTERT-VNTR 2-1을 검출하기 위한, 서열번호 2 및 3의 염기서열을 갖는 프라이머 세트.
hTERT 유전자내의 인트론 2 영역의 다형성 hTERT-VNTR 2-2를 검출하기 위한, 서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 프라이머 세트.
hTERT 유전자내의 인트론 6 영역의 다형성 hTERT-VNTR 6-1을 검출하기 위한, 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 프라이머 세트.
hTERT 유전자내의 인트론 6 영역의 다형성 hTERT-VNTR 6-2을 검출하기 위한, 서열번호 8 및 9의 염기서열을 갖는 프라이머 세트.
개체의 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;

상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 2항 내지 제 5항중 어느 한 항의 프라이머 세트를 사용하여 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및

상기 중합효소 연쇄반응 산물을 전기영동으로 분리하여 TERT 유전자내의 인트론2 또는 인트론6 영역의 다형성(VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2)을 동정하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 DNA 타이핑(typing) 방법.
제 6항에 있어서, 개체의 친자확인, 혈연확인 또는 법의학적 감정에 사용되는 것을 특징으로 하는 DNA 타이핑 방법.
제 2항 내지 제 5항중 어느 한 항의 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 dNTPs(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 포함하는 hTERT 유전자내의 인트론2 또는 인트론6 영역의 다형성(hTERT-VNTR 2-1, 2-2, 6-1 또는 6-2)에 대한 DNA 타이핑 키트.
환자의 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;

상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 4항의 VNTR 6-1 특이적 프라이머 세트를 사용하여 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및

상기 중합효소 연쇄반응 산물을 전기영동으로 분리하여 VNTR 6-1 다형성의 재배열(rearrangements) 유무를 판정하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 결장, 고환, 피부, 위장, 또는 신장 암의 진단방법.
환자의 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;

상기 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 5항의 VNTR 6-2 특이적 프라이머 세트를 사용하여 DNA 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및

상기 중합효소 연쇄반응 산물을 전기영동으로 분리하여 VNTR 6-2 다형성의 재배열(rearrangements) 유무를 판정하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 결장, 고환, 피부, 위장, 또는 신장 암의 진단방법.
삭제
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 다형성의 재배열은 1 대립유전자의 소 결실 또는 이형접합성의 상실인 것을 특징으로 하는 진단방법.
제 4항 또는 제 5항중 어느 한 항의 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 dNTPs(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)를 포함하는 인간을 포함한 포유동물의 텔로머라제 관련 질병의 진단키트.