KR100406832B1

KR100406832B1 - 전능의 조혈 간세포 수용체

Info

Publication number: KR100406832B1
Application number: KR1019990039635A
Authority: KR
Inventors: 레미쉬카아이오알.
Original assignee: 더 트러스티즈 오브 프린스턴 유니버시티
Priority date: 1991-04-02
Filing date: 1999-09-15
Publication date: 2003-11-21
Also published as: CA2107463A1; US5185438A; EP0580760A4; AU1924892A; DE69233676D1; EP1231261A2; EP1231265A2; EP1231261B1; WO1992017486A1; EP1808445A3; EP1231265B1; EP0909813B1; DE69232952T2; EP1231260B1; US5621090A; DE69232687D1; DE69232952D1; DE69233788D1; EP1231261A3; EP1808445A2

Abstract

본 발명은 미분화된 조혈세포에서는 발현되나 성숙한 조혈세포에서는 발현되지 않는 수용체 단백질 티로신 키나아제를 암호화하고 있는 분리된 포유류의 핵산분자를 제공한다.

본 발명은 또한 그러한 핵산분자에 의해 암호화된 수용체; 제1도(flk-2) 및 제2도 (flk-1)에 나타난 서열을 함유하는 수용체 단백질 티로신 키나아제를 암호화하고 있는 핵산분자; 제1도(flk-2) 및 제2도 (flk-1)에 나타난 아미노산 서열을 함유하는 수용체 단백질 티로신 키나아제; 수용체에 대한 리간드; 리간드를 암호화하고 있는 핵산분자; 및 미분화된 포유류의 조혈세포에서는 발현되나 성숙한 조혈세포에서는 발현되지 않는 수용체 단백질 티로신 키나아제와 결합하는 리간드를 간세포와 접촉시키는 것을 포함하는 미분화된 포유류의 간세포의 증식 및/또는 분화를 자극하는 방법을 포함하고 있다.

Description

전능의 조혈 간세포 수용체{TOTIPOTENT HEMATOPOIETIC STEM CELL RECEPTORS}

본 출원에 기술된 발명은 국립보건연구소에 의해 부여된 허가번호 R01-CA45339 및 R01-DK 42989로부터 미국정부지원 하에서 완성되었다.

본 발명은 조혈간세포 수용체, 그 수용체에 대한 리간드 및 그 수용체 및 리간드를 암호화하고 있는 핵산분자에 관한 것이다.

포유류의 조혈기관은 적혈구 및 백혈구를 포함한다.

이 세포들은 더 미분화되고 계통이 한정된 세포로부터 생성되는 성숙한 세포이다.

조혈 조직의 세포는 세포생물학 3의 연간보고(423-441(1987))에서 덱스터(Dexter)와 스푼서(Spoonser)에 의해 세밀히 조사되었다.

적혈구 또는 에리트로사이트는 덱스터와 스푼서에 의해 적혈구계의 폭발 형성단위(BFU-E)로 언급되는 미분화세포에서 생성된다.

적혈구계의 폭발형성단위의 바로 다음후대는 적혈구계의 군체형성단위(CFU-E)로 일컬어진다.

백혈구는 림프 및 골수조직의 성숙한 세포를 포함한다.

림프세포는 B림프구 및 T림프구를 포함한다.

B 및 T 림프구는 덱스터와 스푼서에 의해 Pre T 및 Pre B 세포로 언급된 바로 앞세대의 세포로부터 생성된다.

골수조직은 과립백혈구(granulocytes), 혈소판(platelets), 단핵백혈구(monocytes), 대식세포(macrophages) 및 거핵세포(megakaryocytes)를 포함한 많은 세포로 구성된다.

과립백혈구는 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils) 및 마스트세포(mastcells)로 나누어진다.

성숙한 조혈세포는 각각 특이한 기능을 위해 분화되어 있다.

예를 들면, 적혈구는 산소 및 이산화탄소 운반 기능을 수행한다.

T 및 B 림프구는 각각 세포성면역 및 체액성 면역반응을 수행한다.

혈소판은 혈액응고와 관련이 있다.

과립백혈구 및 대식세포는 일반적으로 침입하는 유기체 및 그것의 부산물에 대항하는 면역반응에서 포착제 및 부속세포로서 작용한다.

조혈조직의 중심에 한 개 또는 그 이상의 전능의 조혈간세포가 있고, 이것은여러 분화 단계를 거쳐 점증적으로 계통이 한정된 선조세포를 유도한다.

더 성숙한 선조세포는 한 개 또는 2개의 계통을 생산하는 것으로 한정된다.

덱스터 및 스푼서에 의해 언급된 계통이 한정된 선조세포의 몇 가지 예로는 과립백혈구/대식세포 군체형성세포(GM-CFC), 거핵세포 군체형성세포(Meg-CFC), 호산구 군체형성세포(Eos-CFC) 및 호염기구 군체형성세포(Bas-CFC)를 들 수 있다.

선조세포의 다른 예는 위에서 언급되어 있다.

조혈조직은 여러 종류의 성숙한 계통을 정확한 통제 하에서 생산함에 의해 그 기능을 수행한다.

전능의 간세포는 스스로 재생하는 능력 및 모든 조혈계통을 위해 위임된 선조세포로 분화하는 능력을 소유한다.

조혈세포 중 가장 미분화된 이 세포는 포유류에서 방사 제거된 조혈조직의 완전하고 영구적인 재구성을 위해 필요하며 충분하다.

완전한 조혈조직을 재구성하는 간세포의 능력은 골수이식 치료에 기초가 된다.

성장인자가 포유류의 조혈조직의 발육 및 작동에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

그러나, 성장인자의 역할이 복잡하고, 현재도 잘 이해되지 않고 있다.

불확실한 이유 중의 하나가 조혈성장인자에 관해 알려진 것의 대부분이 시험관 내의 실험으로부터 밝혀졌다는 점이다.

그러한 실험은 반드시 생체 내 사실을 반영하지 않는다.

게다가, 시험관 내 조혈은 골수 기질세포가 배지에 더해진다면, 성장인자를 더하지 않고 수행될 수 있다.

생체 내에서 기질 세포와 조혈성장인자 사이의 관계는 이해되지 않고 있다.

그럼에도 불구하고, 조혈성장인자는 생체 내에서 고활성인 것으로 나타났다.

알려진 바에 의하면, 조혈성장인자는 활성의 스펙트럼을 나타낸다.

스펙트럼의 한쪽 끝에 성숙한 적혈구계 선조세포만의 증식을 촉진시킨다고 생각되는 에리트로포이에틴(erythropoietin)과 같은 성장인자가 있다.

스펙트럼의 중앙에 수많은 선조세포뿐 아니라 초기 간세포의 성장과 발육을 용이하게 한다고 생각되는 IL-3과 같은 성장인자가 있다.

IL-3에 의해 유도된 선조세포의 몇 가지 예로는 과립백혈구/대식세포, 호산구, 거핵세포, 적혈구계 및 마스트 세포계통에 한정된 선조세포를 들 수 있다.

스펙트럼은 다른 쪽 끝에는 1990년 10월 5일 발행된 (Cell)에서 연속기사로 대응하는 수용체와 함께 토의되었던 조혈성장인자가 있다.

수용체는 수용체 단백질 티로신 키나아제 부류의 한 일원인 W 유전자 좌의 산물, C-Kit 이다.

간세포인자(SCF) 및 마스트 세포 성장인자(MGF)와 같은 여러가지 이름으로 언급되는 C-Kit에 대한 리간드는 쥐에서 초기 조혈간세포 및 적혈구계와 마스트 세포계통에 한정된 세포의 발육에 필수적인 것으로 생각된다(Copeland et al., Cell 63, 175-183(1990)).

그러므로, 오로지 성숙한 세포에만 영향을 미치는 성장인자가 있는 것을 알수 있고, 또한 성숙한 세포 및 간세포 모두에 영향을 미치는 성장인자가 있는 것을 알 수 있다.

두 가지 타입의 세포에 영향을 미치는 성장인자는 적은 수의 성숙한 세포에 영향을 미칠 수 있고 또는 많은 수의 성숙한 세포에 영향을 미칠 수도 있다.

더우기 성숙한 세포에 영향을 미치는 성장인자의 능력과 간세포에 영향을 미치는 성장인자의 능력 사이에 역비례 관계가 있다는 것을 알 수 있다.

예를 들면, 작은 수의 성숙한 세포를 자극하는 C-Kit 리간드는 많은 수의 성숙한 세포의 증식을 자극한다고 보고된 IL-3보다 간세포의 재생 및 발육에 더 중요하다고 생각된다.

본 명세서 이전에는 성숙한 세포에 영향을 주지 않고 오로지 간세포만 자극하는 성장인자에 관한 보고가 없었다.

그러한 성장인자의 발견은 특히 중요할 것이다.

상술하였듯이, C-Kit는 단백질 티로신 키나아제(pTK)이다.

단백질 티로신 키나아제가 조혈성장인자에 대한 세포 수용체로서 중요한 역할을 한다는 것이 점차 명백히 되어 가고 있다.

또 다른 수용체 pTK로 군체자극인자 1(CSF-1) 및 PDGF의 수용체를 들 수 있다.

pTK류는 촉매 영역에서 몇 개의 보존된 아미노산 부위에 의해 인식될 수 있다.

이 보존된 부위는 Hanks et al., in Science 241, 42-52(1988)(Figure 1 onpage 46) 및 Wilks in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603-1607(1989)(Figure 2 on page 1605)에 요약되어 있다.

조혈성장인자 수용체를 나타내는 부가적인 단백질 티로신 키나아제가 전능의 조혈간세포의 자기재생 및 시험관내에서도, 생체내에서도 조혈조직의 모든 세포의 발육을 더 효과적으로 자극하기 위해 필요하다.

미분화된 간세포에만 존재하고, 성숙한 선조세포에 존재하지 않는 신규한 조혈성장인자 수용체가 특히 바람직하다.

신규한 수용체에 대한 리간드도 또한 조혈 성장인자로서 작용하는데 바람직하다.

수용체 및 리간드를 암호화하고 있는 핵산 서열은 재조합 수용체 및 리간드를 생산하기 위해 필요하다.

제 1a-1e도는 쥐의 flk-2의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.

아미노산 잔기는 오픈리딩 프레임의 뉴클레오티드 바로 아래에 나타나 있다.

아미노산 1-27은 소수성 리더서열을 구성한다.

아미노산 28-544는 세포외 수용체 영역을 구성한다.

아미노산 545-564는 막을 가로지르는 부위를 구성한다.

나머지 아미노산은 세포내 촉매영역을 구성한다.

세포내영역에 있어서 다음의 아미노산 잔기는 행크에 의해 확인된 촉매 하위영역이다(545-564, 618-623, 811-819, 832-834, 857-862, 872-878).

잔기 709-785의 서열은 flk-2의 특징을 이루는 신호서열이다.

단백질 티로신 키나아제는 일반적으로 이 부위에서 한 개의 신호서열을 함유한다.

제 1f도는 인간 flk-2의 세포외영역의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.

인간 flk-2의 아미노산 1-110은 쥐의 flk-2의 아미노산 43-152와 일치한다.

제 1g도는 인간 flk-2의 세포내(키나아제)영역의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.

인간 flk-2의 아미노산 1-94는 쥐의 flk-2의 아미노산 751-849와 일치한다.

제 2도는 flk-1의 cDNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.

아미노산 763-784는 flk-1의 막을 가로지르는 부위를 구성한다.

제 3도는 쥐의 기질세포계통(2018)과 APtag-flk-1 뿐만 아니라 APtag-flk-2 사이의 결합의 시간 반응을 나타낸다.

수용체 없는 APtag(SEAP)는 대조군으로 이용된다(실시예 8).

제 4도는 기질세포(2018)와 APtag-flk-1 뿐만 아니라 APtag-flk-2 사이의 결합의 양적 반응을 나타내다.

수용체없는 APtag는 대조군으로 이용된다(실시예 8).

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백하게 될 이 목적 및 다른 목적은 미분화 조혈세포 내에서는 발현되나 성숙한 조혈세포에서는 발현되지 않는 수용체 단백질 티로신 키나아제를 암호화하는 분리된 포유류 핵산분자를 제공함에 의해 달성되었다.

또한 본 발명은 그러한 핵산분자에 의해 암호화되어 있는 수용체; 제 1도(flk-2) 및 제 2도(flk-1)에 나타난 서열을 갖는 수용체 단백질 티로신 키나아제를 암호화하고 있는 핵산분자; 제 1도(flk-2) 및 제 2도(flk-1)에 나타난 아미노산 서열을 갖는 수용체 단백질 티로신 키나아제; 그 수용체에 대한 리간드; 그 리간드를 암호화하고 있는 핵산 서열; 및 간세포를 미분화된 포유류 조혈세포에서는 발현되나 성숙한 조혈세포에서는 발현되지 않는 수용체 단백질 티로신 키나아제와 결합하는 리간드와 접촉시키는 것을 포함하는 미분화 포유류의 조혈간세포의 증식을 자극하는 방법을 포함한다.

수용체

구체적으로, 본 발명은 미분화된 조혈세포에서는 발현되나 성숙한 조혈세포에서는 발현되지 않는 수용체 단백질 티로신 키나아제를 암호화하고 있는 분리된 포유류의 핵산분자에 관한 것이다.

그 핵산분자는 DNA, cDNA 또는 RNA 분자일 수 있다.

핵산분자가 존재하는 포유류는 새앙쥐, 쥐, 토끼 또는 인간과 같은 어떤 포유류라도 상관없다.

핵산분자는 단백질 티로신 키나아제(pTK)를 암호화하고 있다.

pTK류의 일원은 촉매 영역 내의 보존된 아미노산 부위에 의해 인식될 수 있다.

pTK 콘센서스 서열의 예는 Hank et al., in Science 241, 42-52(1988)(특히 Figure 1 Standing on page 46) 및 Wilks in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603-1607(1989)(특히 Figure 2 on page 1605)에 의해 제공되었다.

보존된 서열 WMAPES 내의 위치 205에 메티오닌 잔기는 수용체인 pTK의 특징부이다.

Hanks et al 기사는 pTK 콘센서스 잔기 및 서열을 함유하는 11개 촉매 하위 영역을 확인해준다.

본 발명의 pTKs는 이 콘센서스 잔기 및 서열을 대부분 또는 모두를 가지고 있을 것이다.

몇 개의 특히 강하게 보존된 잔기 및 서열이 표 1에 나타나 있다.

1. Hanks et al., Science 241, 42-52(1988)

2. Hanks et al., Id. 에 따라 조정됨

본 발명의 pTK는 이 고도로 보존된 잔기 및 서열 모두 13개를 함유할 수 있다.

자연돌연변이 또는 인공돌연변이의 결과로 본 발명의 pTK는 11개, 9개 또는 7개의 그러한 서열과 같은 13개보다 더 적은 강하게 보존된 잔기 및 서열을 함유할 수 있다.

본 발명의 수용체는 일반적으로 c-kit가 속하는 pTK 서열과 똑같은 부류에 속한다.

그러나, 놀랍게도, 새로운 기능적인 부류의 pTKs가 존재한다는 것이 발견되었다. 새로운 기능적인 수용체 pTKs 부류는 미분화된 조혈세포내에서는 발현되었지만 성숙한 조혈세포에서는 발현되지 않는다.

본 명세서의 목적을 달성키 위해, 미분화된 조혈세포는 전능하다.

즉, 생체 내에서 모든 조혈 혈구를 재구성할 수 있다.

성숙한 조혈세포는 자기 재생능력은 없고, 제한된 증식능력 즉, 다수의 계통을 생성하는 제한된 능력을 가지고 있다.

성숙한 조혈세포는 본 명세서의 목적을 달성하기 위해, 일반적으로 시험관 내에서 또는 생체 내에서 단지 한 개 또는 두 개의 계통만을 생성할 수 있다.

조혈조직은 복잡하며, 미분화된 전능의 조혈간세포와 위에서 한정된 전체로 위임된 성숙한 조혈세포사이에 많은 중간세포를 함유한다.

간세포가 점차 성숙한 계통이 제한된 세포로 발육됨에 따라 간세포는 자기 재생 능력을 소실한다.

본 발명의 수용체는 이 중간세포 내에서 발현될 수 있고 또한 발현되지 않을 수도 있다.

신규한 부류의 수용체의 일원을 한정하는 필요 충분 조건은 그 수용체가 미분화되고 전능의 간세포 내에서는 존재하지만, 한 개 또는 기껏해야 두 개의 계통만으로 한정된 성숙한 세포 내에서는 존재하지 않는 것을 의미한다.

신규한 부류의 수용체 pTKs의 일원의 한 개의 예는 발견된 기관의 이름을 따서 태아 간 키나아제 2(flk-2)라 부른다.

쥐에서 임신중의(14일) 태아간에서 대략 10⁴세포당 1개의 전능의 간세포가 있다.

태아간에 덧붙여 flk-2가 또한 태아 비장, 태아 흉선, 성체 뇌 및 성체 골수에서 발현된다.

예를 들면, flk-2는 도말할 때 많은 다수 계통의 군체를 생성할 수 있는 개개의 다수 잠재성의 CFU-블라스트 군체 내에서 발현된다.

그러므로, flk-2는 조혈 체계의 완전히 미분화된(즉, 자기-재생)부분에서 발현된다고 생각된다.

이 발견은 flk-2가 환경으로부터 추정상의 자기재생신호를 형질 도입하는 데 있어 중요하다는 것과 일치하다.

flk-2 mRNA의 발현이 가장 미분화된 흉선 림프구 서브세트 내에서 일어나는 것이 특히 적절하다.

IL-2 수용체의 발현에 있어서 차이가 나는 2개의 밀접하게 관련된 미성숙 서브세트에서조차도, flk-2 발현은 IL-2 수용체가 결핍된 더 미분화된 서브세트로 분리시킨다.

가장 초기의 흉선림프구 서브세트는 위임을 받지 않은 것으로 생각된다.

그러므로, flk-2를 발현시키는 흉선림프구는 다수의 잠재능력을 가질 수 있다.

flk-2는 T-림프구 계통에서 발현된다고 알려진 최초의 수용체 티로신 키나아제이다.

태아 간 mRNA는 대략 3.5kb에서 포름알데히드 아가로스겔 위의 285 및 185 리보솜 띠에 비례하여 이동하는 반면 뇌메세지는 상당히 더 크다.

성인 조직에서 뇌와 골수로부터의 flk-2mRNA는 대략 3.5kb에서 이동한다.

본 발명은 또한 2차 pTK 수용체를 포함한다.

태아 간 키나아제 1(flk-1)이라 불리는 이 제 2수용체는 flk-2와 같은 부류의 수용체의 일원이 아니다.

왜냐하면, flk-1은 어떤 더 성숙한 조혈세포내에서 발견될 수 있기 때문이다.

flk-1의 아미노산 서열은 제 2도에서 나타나 있다.

본 발명은 flk-1을 암호화하고 있는 DNA, cDNA 및 RNA 뿐만 아니라 flk-1 수용체를 포함한다.

flk-1의 DNA 서열은 또한 제 2도에 나타나 있다.

flk-1은 태아 뇌, 위, 신장, Vp, 심장 및 장에서 및 성체 신장, 심장, 비장, 폐, 근육 및 림프절에서 뿐만 아니라 flk-2가 발견되는 기관에서 발견될 수 있다.

본 발명의 수용체 단백질 티로신 키나아제는 쉽게 발견된 영역으로 나뉘어진다고 알려져 있다.

pTK에 대응하는 DNA 서열은 5'-말단에서 시작하여 특이한 리간드와 결합하고특이한 리간드에 의해 활성화되는 친수성 세포외 영역이 뒤따르는 소수성 리더서열을 암호화하고 있다.

세포외 수용체영역 바로 아래에 소수성막을 가로지르는 부위가 있다.

막을 가로지르는 부위 다음에 위에서 논의된 Hanks et al., 및 Wilks 기사를 참조하여 쉽게 확인될 수 있는 기본적인 촉매영역이 뒤따른다.

본 발명은 막을 가로지르는 부위 및 촉매영역이 결핍된 세포외 수용체 영역을 포함한다.

바람직하게는 소수성 리더 서열은 또한 세포외 영역으로부터 제거된다.

flk-2의 경우에 있어서, 소수성 리더 서열은 아미노산 1-27을 포함한다.

이 부위 및 영역은 예상된 pTK 내의 아미노산 서열을 검토하고 그것을 알려진 pTKs와 비교함에 의해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 쉽게 눈으로 확인될 수 있다.

예를 들어, 제 1a-1e도에 따르면, 세포 외 수용체영역과 촉매 영역을 분리하는 flk-2의 막을 가로지르는 부위는 뉴클레오티드 1663(T) 내지 1722(C)에 의해 암호화되어 있다.

이 뉴클레오티드는 아미노산 잔기 545(Phe) 내지 564(Cys)에 대응한다.

막을 가로지르는 부위와 하위 영역 I(즉, GXGXXG)와 같은 Hanks et al.에 의해 확인된 촉매하위영역(아미노산 618-623) 사이의 아미노산 서열은 수용체 단백질 티로신 키나아제의 특징부이다.

그 세포외 영역은 또한 세포외 아미노산 서열의 보통 인식된 기준을 통해서확인될 수 있다.

적당한 기준의 결정은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있고, 예를 들어

Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78, 3824-3828(1981); Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105-132(1982); Emini, J. Virol. 55, 836-839(1985); Jameson et al., CA BIOS 4, 181-186(1988); and Karplus et al., Naturwissenschaften 72, 212-213(1985)에 의해 알려져 있다.

이 기준에 의해 표면이 노출되어 있다고 예측되는 아미노산 영역은 세포외 영역의 특징을 이룬다.

아래에서 더 상세히 토의될 것처럼, 본 발명의 수용체를 암호화하고 있는 핵산분자는 통상 재조합 DNA 기술에서 사용하기 위해 공지의 벡터안으로 삽입될 수 있다.

통상의 재조합 DNA 기술은 Sambrook et al., 'Molecular Cloning', Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987) 및 Ausubel et al., Eds, 'Current Protocols in Molecular Biology', Green Publishing Associates and Wiley-Interscreuce, New York(1987)에 기술된 것과 같다.

벡터는 고리형(즉, 플라스미드)일 수도 있고, 비고리형일 수도 있다.

통상 벡터는 숙주에서 클로닝과 형질 발현을 위해 이용될 수 있다.

숙주는 원핵세포일 수도 있고 진핵세포일 수도 있다.

원핵세포숙주는 바람직하게는 이. 콜라이 이다.

바람직한 진핵세포숙주는 효모, 곤충 및 포유류세포를 포함한다.

바람직한 포유류세포는 예를 들면 CHO, COS 및 인간 세포를 포함한다.

리간드

본 발명은 또한 본 발명의 수용체 pTKs와 결합하는 리간드를 포함한다.

결합에 더하여 리간드는 부가적인 미분화 간세포의 증식을 자극하고 더 성숙한 선조세포로의 분화를 자극한다.

리간드는 포유류, 바람직하게는 대응하는 수용체를 생산하는 동물과 같은 포유류에서 자연적으로 발생하는 성장인자일 수 있다.

성장인자는 분리되어 정제되거나 기질세포와 같은 분리된 세포군의 표면에 존재할 수 있다.

리간드는 또한 포유류에서 자연적으로 발생하지 않는 분자일 수도 있다.

예를 들면, 본 발명의 수용체에 대항하거나 항-리간드 항체에 대항하여 발생하는 항체, 바람직하게는 단일 클론항체는 만일 리간드가 수용체 또는 항-리간드 항체의 결합 부위의 네거티브상을 구성한다면 리간드의 형태를 닮거나 리간드로서 작용한다.

리간드는 또한 수용체와 결합할 때 또는 다른 방법으로 접촉하게 될 때 리간드로서 작용하는 비단백질 분자일 수도 있다.

또 하나의 구체화에서 본 발명의 리간드를 암호화하고 있는 핵산분자가 제공된다.

핵산분자는 RNA, DNA 또는 cDNA일 수 있다.

간세포 증식의 자극

본 발명은 또한 앞서 정의를 내린 미분화된 포유류 조혈 간세포의 증식 및/또는 분화를 자극하는 방법을 포함한다.

그 방법은 본 발명에 따라 간세포를 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다.

증식 및/또는 분화의 자극은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 일어날 수 있다.

본 발명에 의한 시험관 내에서 및 생체 내에서 간세포의 증식을 자극하는 리간드의 능력은 중요한 치료에 응용된다.

그러한 응용은 미분화된 간세포가 자기 재생을 충분히 하지 못하는 인간을 포함하여 포유류를 치료하는 것을 포함한다.

그러한 의학적 문제의 한가지 예는 조혈간세포 또는 그것에 관련된 성장 인자 내에서의 결함이 백혈구 수를 감소시킬 때 일어나는 문제를 포함한다.

그러한 의학적 문제의 또 다른 예는 대적혈구 빈혈 및 재생불량성 빈혈과 같은 빈혈을 포함한다.

암의 화학요법과 방사능 치료로부터 발생하는 골수파괴는 본 발명의 간세포인자에 의해 도움을 받을 수 있는 의학적 문제의 또 한 가지의 예이다.

기능적 등가물

본 발명은 상술된 pTK 수용체, 수용체영역 및 리간드를 암호화하고 있는 핵산서열뿐만 아니라 pTK 수용체, 수용체영역의 리간드의 기능적 등가물을 포함한다.

만일 등가단백질이 본 발명의 수용체 및 리간드와 면역학적으로 교차 반응하며 똑같은 기능을 갖는다면, 단백질은 특이한 기능에 대해 다른 한 개의 단백질의 기능적 등가물로 생각된다.

그 등가물은 예를 들어 단백질의 단편, 또는 치환, 부가, 삭제, 돌연변이가 일어난 단백질일 수 있다.

예를 들어, 한 개의 서열에서 아미노산을 등가 아미노산으로 치환하는 것이 가능하다.

통상적으로 등가라고 알려진 아미노산군은 다음과 같다.

(a) Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G);

(b) Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q);

(c) His(H) Arg(R) Lys(K)

(d) Met(M) Leu(L) Ile(I) Val(V); 및

(e) Phe(F) Tyr(Y) Trp(W).

수용체 및 리간드에서의 치환, 부가 및/또는 삭제에 의해 생기는 등가수용체 및 리간드가 천연수용체 및 리간드와 면역학적으로 교차 반응하며 똑같은 기능을 갖는 한 수용체 및 리간드에서의 치환, 부가 및 또는 삭제를 할 수 있다.

등가수용체 및 리간드는 통상적으로 천연수용체 및 리간드와 실질적으로 똑같은 아미노산 서열을 가질 것이다.

또 한 개의 서열과 실질적으로 똑같지만, 한 개 또는 그 이상의 치환, 부가 및/또는 삭제에 의하여 다른 서열에서 차이가 나는 아미노산 서열은 등가서열이라 생각된다.

바람직하게는 천연 수용체 및 리간드의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기수의 25% 미만, 더 바람직하게는 10% 미만 가장 바람직하게는 5% 미만이 치환되거나 부가되거나 삭제된다.

등가핵산분자는 앞서 정의를 내린 등가 수용체 및 리간드를 암호화하고 있는 핵산서열을 포함한다.

등가핵산분자는 또한 대응하는 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 방식으로 천연 핵산서열과 차이가 나는 핵산서열을 포함한다.

핵산분자 및 단백질의 분리

수용체를 암호화하고 있는 핵산분자의 분리

포유류의 간세포 수용체를 암호화하고 있는 핵산분자를 생산하기 위해 간세포의 원천(source)이 제공된다.

적합한 원천은 태아 간, 비장, 또는 흉선세포 또는 성인 골수 또는 뇌세포를 포함한다.

예를 들면, 적합한 쥐의 태아 간세포는 임신 14일경에 수득될 수 있다.

쥐의 태아 흉선세포는 임신 14-18일경에 바람직하게는 임신 15일에 수득될 수 있다.

적합한 다른 포유류의 태아 간세포는 쥐의 세포에 상당하는 임신기간에 수득된다.

토탈 RNA는 간세포 수용체를 함유하는 조직으로부터 통상의 절차에 의해 제조된다.

토탈 RNA는 cDNA 합성을 지시하는 데 이용된다.

RNA를 분리하고 cDNA를 합성하는 통상적인 방법은 분자 생물학의 통상적인 책자에 기술되어 있다(in Sanbrook et al., 'Molecular Cloning', Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987) 및 in Ausubel et al.,(Eds), 'Current Protocols in Molecular Biology', Greene Associates/Wiley Interscience, New York (1990)).

수용체의 cDNA는 공지된 방법에 의해 증폭된다.

예를 들면, cDNA는 폴리메라제 연쇄반응(PCR)에 의한 증폭을 위한 주형으로서 이용될 수 있다(Saiki et al., Science, 239, 487(1988) 또는 Mullis et al., U. S. Pa-tent 4,683,195).

PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 제 1도 및 제 2도에 나타난 flk-2 및 flk-1 바람직하게는 flk-2로부터 유래한 서열과 같이 공지된 수용체의 서열로부터 유도된다.

올리고뉴클레오티드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 수단에 의해 합성된다.

적합한 방법은 카루터스(Caruthers)에 의해 기술된 방법을 포함한다(in Science 230, 281-285(1985)).

본 발명의 수용체에 대한 완전한 단백질을 암호화하고 있는 부위를 분리하기 위해 위로 향하는 올리고뉴클레오티드는 5' -말단의 서열과 상보적이고 바람직하게는 ATG 개시 코돈 및 개시코돈의 앞에 적어도 5-10 뉴클레오티드를 포함한다.

아래로 향하는 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 서열과 상보적이고, 선택적으로 정지 코돈을 포함한다.

위로 향하는 올리고뉴클레오티드 및 아래로 향하는 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 PCR 증폭에서 이용된다.

그 조건은 통상의 절차에 따라 각각 특이한 프라이머쌍에 최대한으로 이용된다.

PCR 산물은 프라이머 사이의 서열에 대응하는 정확한 크기의 cDNA에 대한 전기영동에 의해 분석된다.

택일적으로, 암호화 부위는 2개 또는 그 이상의 중첩 단편에서 확대될 수 있다.

중첩 단편은 단편으로부터 본래대로의 cDNA의 집합을 허용하는 제한부위를 포함하도록 고안된다.

본 발명의 수용체를 암호화하고 있는 증폭된 DNA는 매우 다양한 숙주세포내의 매우 다양한 클로닝 벡터 내에서 복제될 수 있다.

그 숙주세포는 원핵세포일 수도 있고 진핵세포일 수도 있다.

DNA는 자연적으로 수득될 수 있고, 선택적으로는 변경될 수 있고 또는 전체 또는 일부가 합성될 수도 있다.

DNA가 봉합되는 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열의 단편을 포함할 수 있다.

어떤 적합한 원핵세포의 클로닝 벡터는 colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pVC,pKSM 및 RP4와 같은 이. 콜라이의 플라스미드를 포함한다.

원핵세포의 벡터는 또한 M13과 같은 파아지 DNA의 유도체 및 다른 섬유상의 단일 가닥 DNA 파아지를 포함한다.

수용체의 분리

본 발명의 수용체를 암호화하고 있는 DNA는 적합한 벡터 안으로 삽입되어 적합한 원핵 세포숙주 또는 진핵세포숙주 내에서 발현된다.

박테리아, 특히 이. 콜라이 내에서 단백질을 발현하기 위한 벡터는 공지되어 있다.

그러한 백터는 디크만(Dieckmann)과 차고로프(Tzogoloff)에 의해 기술된 PATH 벡터를 포함한다(J. Biol. Chem. 260, 1513-1520(1985)).

이 벡터는 카르복실 말단에 폴리링커가 뒤따르는 안트라닐레이트 합성효소(anthra-nilate synthetase: TrpE)를 암호화하고 있는 DNA 서열을 함유한다.

다른 발현 벡터 시스템은 베타-갈락토시다아제(pEX); 람다 P_L; 말토오스 결합단백질(pMAL); 글루타티온 S-트랜스페라아제(pGST)에 기초를 두고 있다(Gene 67, 31(1988) 및 Peptide Research 3, 167(1990)).

효모 내의 유용한 벡터가 이용될 수 있다.

적합한 예는 2μ 플라스미드이다.

포유류 세포 내에서 이용하기 위한 적합한 벡터가 또한 공지되어 있다.

그러한 벡터는 SV-40, 아데노바이러스, 리트로바이러스에 의해 유도된 DNA 서열의 잘 알려진 유도체 및 플라스미드와 파아지 DNA의 조합에 의하여 유도된 벡터를 포함한다.

게다가 진핵세포 발현 벡터가 발명이 속하는 기술분야에서 공지되어 있다.

예를 들면

P. J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 372-341(1982); S. Subrama-ni et al, Mol. Cell. Biol. 1,854-864(1981); R. J. Kaufmann and P. A. Sharp, 'Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with A Modular Dihy-drofolate Reductase Complementary DNA Gene', J. Mol. Biol. 159, 601-602(1982); R. J. Kaufmann and P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol., 159, 601-664(1982); S. I. Scahill et al., 'Expression And Characterization of The Product of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells', Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4654-4659(1983); G. Urlaub and L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220(1980)에 기술되어 있다.

본 발명에서 유용한 형질 발현 벡터는 발현되는 DNA 서열 또는 단편과 작동할 때 연결되는 적어도 한 개의 형질 발현 조절 서열을 함유한다.

조절 서열은 클로닝된 DNA 서열의 발현을 조절하고 규제하기 위하여 벡터 내에 삽입된다.

유용한 형질 발현 조절서열의 예는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 파아지 람다의 주요한 오퍼레이터 프로모터 부위, fd 피막단백질의 조절부위, 효모의 해당 프로모터, 예를 들면 3-포스포글리세르산 키나아제에 대한 프로모터 효모산 포스파타제(예:Pho 5)의 프로모터, 효모 알파-교배 인자의 프로모터 및 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 리트로바이러스, 시미안바이러스로부터 유도된 프로모터 예를 들면 초기 및 후기 프로모터, 또는 SV 40 및 진핵세포 또는 원핵 세포 및 그것의 바이러스 또는 그들의 조합의 유전자의 형질 발현을 조절한다고 알려진 다른 서열 등이다.

수용체를 암호화하고 있는 DNA 및 조절 신호를 함유하는 벡터는 수용체의 형질 발현을 위해 숙제 세포 안으로 삽입된다.

어떤 유용한 형질 발현 숙주세포는 잘 알려진 진핵세포 및 원핵세포를 포함한다.

어떤 적당한 원핵세포 숙주는 예를 들면, 이. 콜라이 SG-936, 이. 콜라이 HB 101, 이. 콜라이 W3110, 이. 콜라이 × 1776, 이. 콜라이 × 2282, 이. 콜라이 DHI 및 이. 콜라이 MRC 1과 같은 이. 콜라이, 수도모나스(Pseudornonas), 바실러스 서브틸리스와 같은 바실러스(Bacillus) 및 스트렙토마이스(Streptomyces)를 포함한다.

적합한 진핵세포는 조직배양중인 효모 및 다른 곰팡이, 곤충, COS 세포 및 CHO 세포와 같은 동물세포, 인간세포 및 식물세포를 포함한다.

상술한 쥐의 수용체의 인간 유사물은 비슷한 전략에 의해 분리된다.

수용체를 암호화하고 있는 RNA는 미분화된 간세포가 풍부한 인간세포의 원천으로부터 수득된다.

적합한 인간세포는 성인의 뇌, 골수세포 뿐만 아니라 태아의 비장, 흉선, 간세포, 탯줄혈액을 포함한다.

인간 태아세포는 바람직하게는 쥐의 임신중에 상당하는 임신일자에 수득된다.

인간 flk 수용체를 암호화하고 있는 핵산 서열 뿐만 아니라 인간 flk 수용체의 아미노산 서열은 쥐의 수용체의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열과 유사하다.

1차 단백질 또는 핵산 분자의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 2차 단백질 또는 핵산 분자의 각각의 서열과 적어도 약 30% 유사(바람직하게는 적어도 약 50% 유사, 더 바람직하게는 적어도 약 65% 유사)하다면 본 명세서에서 수용체 또는 리간드와 같은 1차 단백질의 서열 또는 그 단백질을 암호화하고 있는 핵산 분자의 서열은 2차 단백질 또는 핵산 분자와 유사하다고 생각된다.

고도의 유사성을 갖는 단백질의 경우에 있어서, 1차 단백질 또는 핵산 분자의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 제 2차 단백질 또는 핵산 분자의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 75% 유사하며, 바람직하게는 적어도 약 85% 유사하며 더 바람직하게는 약 95% 유사하다.

쥐의 올리고뉴클레오티드 쌍의 조합은 서열의 다양성을 설명하기 위하여 세포로부터의 인간 유사물을 증폭하는 PCR 프라이머로서 이용된다.

인간 flk 유사물을 수득하는 절차의 나머지는 쥐의 flk 수용체를 수득하기 위해 상술된 절차와 유사하다.

인간 flk 유사물과 쥐의 올리고뉴클레오티드 사이의 완전하지 못한 유사성이잡종형성(hybridization) 조건의 유력함을 결정하는 데 고려된다.

간세포위의 수용체의 형질발현에 대한 분석

미분화된 조혈간세포의 표면에 flk 수용체의 형질 발현을 실증하기 위해 수용체를 인식하는 항체를 만든다.

그 수용체는 자연상태에서 존재하는 완전한 단백질이거나 전단백질의 항원 단편일 수 있다.

바람직하게는, 그 단편은 예상되는 분자의 세포외 부분을 포함한다.

항원단편은 본 발명에 기술분야에서 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다.

항원서열을 함유하는 단편은 잠재적 항원성 및/또는 노출의 일반적인 허용 기준을 기초로 하여 선택될 수 있다.

그러한 기준은 단백질의 표면 노출분석에 의해 결정되듯이 친수성 및 상대적 항원지수를 포함한다.

적당한 기준의 결정은 본 발명의 기술분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있고, 예를 들면 Hopp et al., Proc, Nat'l Acad. Sci. USA 78, 3824-3828(1981); Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105-132(1982); Emini, J. Virol. 55, 836-839(1985); Jameson et al., CA BIOS 4, 181-186(1988); and Karplus et al., Naturwissenschaften 72, 212-213(1985)에 기술되어 있다.

이 기준에 의해 표면이 노출된다고 예상되는 아미노산 영역은 바람직하게는 더 소수성이거나 감추어져 있다고 예상되는 영역을 넘어서 선택된다.

항원으로서 이용되는 수용체의 단백질 및 단편은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.

그러한 방법은 단백질 및 단편을 암호화하고 있는 DNA를 분리하거나 합성하는 것 및 상술했듯이 DNA를 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 것을 포함한다.

단백질의 단편 및 단편을 암호화하고 있는 DNA가 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 의해 개개의 아미노산 및 뉴클레오티드로부터 화학적으로 합성될 수 있다.

단백질 단편을 합성하는 적합한 방법은 스튜어트(Stuart)와 영(Young)에 의해 기술된다('Solid Phase Peptide Synthesis', Second Edition, Pierce Chemical Company(1984)).

DNA 단편을 합성하는 적합한 방법은 카루터스(Caruthers)에 의해 기술된다(Science 230, 281-285(1985)).

만일, 수용체 단편이 에피토프(분자상의 특이항원결정부위)를 한정하지만 너무 작아서 항원성이 되지 못한다면, 항체를 생산하기 위해서 운반체 분자와 접합될 수 있다.

어떤 적합한 운반체 분자는 열쇠구멍조개(Keyhole limpet)의 헤모시아닌, Ig 서열, TrpE 및 인간 또는 소의 혈청 알부민을 포함한다.

접합은 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

한가지 접합방법은 단편의 시스테인 잔기와 운반체 분자 위에 시스테인 잔기를 결합시키는 것이다.

본 발명의 항체는 본 발명의 기술분야에서 잘 알려진 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 항체는 단일 클론항체이나 또한 본 발명에서 단일특이성 다중클론 항체의 사용도 가능하다.

단일특이성 다중클론 항체는 적당한 면역원으로 제조되어진 다중 클론항체의 제조로부터 불필요한 특이성을 흡착시킴으로써 제조될 수 있다. 항체의 제조에 적당한 면역원은 가용성 단백질, 단백질 단편, 바람직하게 단백질로부터의 세포외 영역, 단백질의 펩티드 및 이러한 분자들과의 융합 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적절한 분자(예: 펩티드)에는 BSA, KLH와 같은 담체(carrier) 또는 본 발명의 기술분야에서 알려진 담체를 부착시킬 수 있다.

단일 클론항체의 제조에 사용되는 기술은 이에 한정되지는 않으나 혼성세포(hybridoma) 기술(Kohler and Milstein,Nature256, 495-497(1975)), 파아지 디스플레이 기술(Hoogenboom et al.,Nucleic Acid Research19(15):4133-37(1991)), 인간 B-세포 혼성세포 기술(Kozbor et al.,Immunology Today4:72(1983)) 및 인간 단일 클론항체를 생산하기 위한 EBV-혼성세포 기술(the EBV-hybridoma technique to produce human monoclonal antibodies, Cole et al., 1985, In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77-96)을 포함한다.본 발명의 기술분야에 알려진 수단에 의해 항체를 얻는 것은 이러한 항체 및 다른 것들이 공지된 항체의 전부 또는 일부를 클로닝하고 발현시킴으로써 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 기술분야에 공지된 이러한 기술을 사용하면 비인간 항체의 인간 변형을 제조할 수 있다. 예를 들면, 단일 클론 항체의 인간으로의 변형은 이 항체를 암호화하는 유전자를 적절한 발현 벡터에 클로닝함으로써 쉽게 제조될 수 있다. 이와 관련하여 유용한 핵산은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체의 가변부, 고도 가변 영역 또는 둘다를 포함하는 아미노산 서열을 해독화하는 것이다.재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 산물을 생산하기 위해 숙주 세포에서의 구성들이 통상의 방법으로 사용된다. 사용하기 위한 원핵 및 진핵 숙주를 갖는 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 샘브룩 등의 분자클로닝에 기재되어 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).인간 불변부 및 가변부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 방법에 따라 다양한 인간 세포, 바람직하게 불멸 B-세포(immortalized B-cell)로부터 분리된다. 유사한 방법이 비인간 원천으로부터 비인간 면역글로블린 서열을 분리하는데 사용되어진다. 폴리뉴클레오티드에 대한 적당한 원천 세포 및 이들의 발현 및 분비 산물이 미국 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)과 같은 수많은 원천으로부터 얻어진다("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Fifth edition(1985) Rockville, Md., U.S.A.)면역글로블린 사슬의 자연 발생 형태에 더하여, 실질적으로 동일한 개질된 무거운 사슬 및 가벼운 사슬이 본 발명의 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 잘 알려진 다양한 재조합 DNA 기술을 이용하여 쉽게 고안되어지고 제조된다. 예를 들면, 사슬은 몇 개의 아미노산 치환, 말단 및 중간 첨가 및 결실 등에 의해 일차 구조 수준에서 자연 발생 서열로부터 변이한다. 선택적으로, 일차 구조의 한 부분만을 포함하는 폴리펩티드 단편이 제조되고 이 단편이 하나 또는 그 이상의 면역글로블린 활성(즉, 결합 활성)을 갖는다.특히, 많은 유전자와 같이 면역글로블린 관련 유전자는 각각이 하나이상의 다른 생물학적 활성을 가지면서 별개의 기능 영역을 함유한다는 것이 알려져 잇다. 일반적으로, 원하는 에피토프 결합 성분을 암호화하는 유전자의 개질은 지정부위돌연변이유발(site-directed mutagenesis)과 같은 다양한 공지 기술에 의해 쉽게 수행된다(참조: Giliman Smith, Gene 8:81-97 (1979) 및 Roberts, et at., Nature 328:731-734(1987), 둘 다 본 명세서에 참조문헌으로 삽입된다).본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 항체의 에피토프 결합 성분은 키메라 또는 인간과 같은(humanized) 면역글로블린 유전자에 의해 암호화된다(본 명세서에 참조문헌으로 삽입되는 Queen (1991) Natutr 351:501을 일반적으로 참조). 일단 발현되면, 항체, 에피토프 결합 성분, 이들의 이합체 또는 개별적인 가벼운 사슬 및 무거운 사슬이 본 발명의 기술분야의 표준 절차, 예를 들면 황산암모늄 침강반응, 분별 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등에 따라 정제된다(Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.(1982)). 일단 원하는 바에 따라 부분적으로 또는 동질성을 갖도록 정제되면 항체 및 이의 단편이 예를 들면 약제선별기술 또는 면역형광염색 등과 같은 발생 및 수행 분석 절차에서 치료학적으로, 진단적으로 사용된다.

생존하여 증식할 수 있는 세포의 표면에 발현된 flk-1 및 flk-2로 암호화된 단백질과 같은 수용체로 암호화된 천연단백질과 반응할 것으로 나타난 다중 클론 또는 단일 클론 항혈청은 항체 양성세포를 분리하는 데 사용된다.

그러한 세포를 분리하기 위한 한 가지 방법은 플로우 시토메트리(flow cytometry)이다. (예:Loken et al., European Patent application 317,156).

수득된 세포는 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 따라 분화능력을 잃은 숙주 안으로 접목시킴에 의해 간세포에 대하여 분석된다(예: Jordan et al., Cell 61, 953-963(1990)).

간세포내에서 발현된 신규한 간세포 수용체 티로신 키나아제에 대한 기준

부가적인 신규한 수용체 티로신 카나아제 cNDA는 PCR 프라이머와 같은 올리고뉴클레오티드를 이용하여 간세포군으로부터 cDNA를 증폭시킴에 의해 수득된다(위에 기술됨).

적합한 올리고뉴클레오티드의 예는 Wilks et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603-1607(1984)에서 기술된 pTK1 및 pTK2이다.

신규한 cDNA는 공지된 키나아제를 나타내는 탐침을 이용한 분별 잡종형성 스크리닝을 기초로 하여 선택된다.

낮은 스트린젠스(야생형 세균에 있어 정상적으로 일어나는 RNA 합성이 배지에서 필수 아미노산을 제거하였을 때 저하하는 것)에서만 잡종 형성하는 cDNA 클론이 선택되고 서열이 밝혀진다.

아미노산 삼중체 DFG의 존재는 서열이 키나아제를 나타낸다는 것을 확인해 준다.

WMAPES 모티브에서 진단 메티오닌 잔기는 상술된 것처럼 수용체와 같은 키나아제를 나타낸다.

수득된 잠재적으로 신규한 서열은 유일함을 확인하기 위해 겐뱅크(Genbank)와 같은 데이타 베이스를 이용하여 수득된 서열과 비교된다.

유전자가 특이한 올리고뉴클레오티드는 상술하였듯이 수득된 서열에 기초하여 제조된다.

올리고뉴클레오티드는 간세포가 풍부한 발현군 및 간세포가 고갈된 발현군을 분석하는 데 이용된다.

쥐의 그러한 세포집단은 예를 들면, Jordan et al.에 의해 Cell 61, 953-956(1990)에서; Ikuta et al.에 의해 Cell 62, 863-864(1990)에서; Spangrude et al.에 의해 Science 241, 58-62(1988)에서; 및 Szilvassy et al.에 의해 Blood 74,930-939(1989)에서 개시되어 있다. 그런 인간 세포 집단의 예들은 Andrews et al.에 의해 the Journal of Experimental Medicine 169, 1721-1731(1989)에 CD33^-CD34⁺로 기술되어 있다.

다른 인간의 간세포군은 예를 들어 Civin et al., 유럽특허출원 395,355 및 Loken et al., 유럽특허출원 317,156에 기술되어 있다.

리간드 및 리간드를 암호화하고 있는 핵산분자의 분리

리간드를 수득하는 데 이용될 수 있는 세포는 기질세포, 예를 들면, 태아 간장, 태아 비장, 태아 흉선 및 태아 또는 성체의 골수의 기질 세포를 포함한다.

리간드를 발현하는 세포 계통은 확립되어 있고 스크리닝되어 있다.

예를 들면, 태아간의 기질(비조혈) 세포와 같은 세포는 공지된 방법에 의해 불멸화되어 있다.

불멸화시키는 세포의 공지된 방법의 몇 가지 예로는 리트로바이러스의 벡터 내에서 발현된 온도에 민감한 SV 40 T-항원의 형질 도입을 포함한다.

태아 간장세포를 이 바이러스로 감염시키면 다수의 독립한 세포 계통이 신속하고 효율적으로 확립된다.

이 계통은 아래에 기술하는 바와 같이 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 의해 리간드 활성에 대하여 스크리닝된다.

flk-1 및 flk-2와 같은 본 발명의 수용체에 대한 리간드는 몇 개의 방식으로 세포로부터 수득될 수 있다.

예를 들면, 리간드 활성에 대한 생물학적 분석 시스템은 키메라로 표시된 수용체를 이용한다(예: Flanagan et al., cell 63, 185-194(1990)).

한 가지 전략은 조직화학적 분석을 통하여 직접 리간드 결합을 측정하는 것이다.

세포외 수용체 및 분비될 수 있는 알칼리성 포스파타아제(SEAP)로 구성된 융합단백질을 제조하여 NIH/3T3 또는 COS 세포와 같은 적합한 세포 안으로 형질 도입시킨다.

플라나겐(Flanagen et al.)은 수용체의 이름이 뒤따르는 APtag(즉, Aptag-c-kit)와 같은 DNA 또는 아미노산 구조물을 언급하고 있다.

그 융합단백질은 표면에 결합된 리간드를 발현하는 세포와 고도의 친화력을 나타내며 결합한다.

결합은 배지 안으로 분비된 알칼리성 포스파타제의 효소 활성에 의해 검출될 수 있다.

종종 기질세포인 결합된 세포는 APtag-수용체 복합체로부터 분리될 수 있다.

예를 들면, APtag-flk1 및 APtag-flk2 융합단백질과 결합하는 어떤 기질 세포는 쥐의 태아 간장 세포(실시예 1); 인간의 태아 비장세포(실시예 3); 및 인간의 태아 간장세포(실시예 3)를 포함한다.

어떤 기질 태아 흉선세포는 flk-1 리간드를 함유한다(실시예 3).

리간드를 암호화하는 cDNA를 클로닝하기 위해, cDNA 라이브러리가 적합한 발현벡터, 바람직하게는 CDM 8, pSV Sport(BRL Gibco) 또는 piH3(Seed et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365-3369(1987))와 같은 파아지내의 분리된 기질세포로부터 제조된다.

그 라이브러리는 COS 세포와 같은 적합한 숙주세포안으로 형질 도입한다.

표면 위에 리간드를 함유하는 세포는 상기하였듯이 공지된 방법에 의하여 검출된다.

한가지 방법으로서, 형질 도입된 COS 세포를 단일 세포 서스펜션에 살포하고, Flanagen et al. 에 의해 기술된 방법에 의해 제조된 NIH/3T3 또는 COS 세포로부터의 배지 내에 존재하는 분비된 알칼리성 포스파타제-flk 수용체 융합 단백질과 함께 배양한다.

세포에 결합되지 않은 알칼리성 포스파타제-수용체 융합단백질을 원심분리에 의해 제거하며, 알칼리성 포스파타제에 대한 항체로 덮여진 판 위에서 그 세포를 가려낸다.

PBS 내의 5% 태아 소 혈청과 같은 적합한 세척제로 여러 번 세척하여 결합된 세포를 분리하고, 그 세포로부터 DNA를 추출한다.

상술된 가려내는 방법의 부가적인 상세한 것은 한 기사에서 발견될 수 있다(Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365-3369(1987)).

2차 전략에서, 수용체의 추정상의 세포외 리간드 결합 영역이 인간 c-fms 티로신 키나아제의 막을 가로지르는 영역 및 키나아제 영역과 융합되어, 3T3 섬유아세포 안으로 도입된다.

인간 c-fms 키나아제는 flk-1 또는 flk-2 리간드와 함께 적당한 활성 후에이 세포 내의 증식신호를 형질 도입하는 데 필요하고 형질 도입하기에 충분하다.

키메라를 발현하는 3T3 세포는 세포 증식 분석에서 리간드의 추정적 원천을 스크리닝하는데 이용된다.

융합 수용체를 발현하는 3T3 세포 및 삽입활성화를 이용하여 리간드를 분리하기 위한 교호의 접근법이 또한 이용된다.

리트로바이러스는 거대한 군의 이 세포내의 임의적 염색체 위치 안으로 도입된다.

작은 단편에서 리트로바이러스는 리간드를 암호화하고 있는 유전자 근처에 삽입되며 이렇게 함으로써 그 유전자를 활성화시킨다.

이 세포는 수용체의 자극에 의해 증식한다.

리간드 유전자는 리트로바이러스에 의해 표지되고, 그렇게 함으로써 리간드 유전자의 분리를 쉽게 한다.

(실시예 1)

쥐의 flk-1 및 flk-2 리간드를 함유하는 세포

쥐의 기질세포계통 2018

기질세포계통을 확립하기 위해, 태아 간장세포를 콜라겐과 함께 분해하여 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 및 10% 열로 비활성화된 태아 송아지 혈청의 혼합물 내에서 37℃에서 성장시킨다.

통상의 방법으로 그 세포를 불멸화시킨다.

적합한 방법은 성장 조절유전자 또는 발암유전자를 암호화하고 있는 서열을 담고 있는 DNA를 표적숙주세포 안으로 도입하는 것을 포함한다.

재조합 바이러스의 입자 내에서의 형질 도입 또는 플라스미드 내에서의 형질 도입에 의해 DNA를 도입할 수 있다(예: Hammerschmidt et al., Nature 340, 393-397(1989) 및 Abcouwer et al., Biotechnology 7, 939-946(1989)).

SV 40 및 엡스타인-바 바이러스도 또한 성장을 증진시키는 서열의 공여체로서 작용할 수 있다 하더라도, 리트로 바이러스는 더 바람직한 바이러스 벡터이다.

적합한 리트로 바이러스는 맥케이(Mckay)에 의해 기술된(cell 66, 713-729(1991)) 온도에 민감한 SV 40 T-항원(tsA 58) 및 G418 내성 유전자를 함유하는 에코트로픽 리트로바이러스(자신이 기원한 종의 숙주 내에서만 복제할 수 있는 리트로 바이러스)이다.

37℃에서 며칠 지난후에, 배지의 온도는 32℃까지 저하된다. 세포는 G418(0.5㎎/ml)로 선택된다. 그 선택된 세포들은 확대되고 유지된다.

이 절차에 의해 생성된 쥐의 기질세포는 2018이라고 일컬어지며 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA(ATCC)에 1991년 10월 31일에 수탁번호 CRL 10907로 기탁되었다.

(실시예 2)

인간의 flk-1 및 flk-2 리간드를 함유하는 세포

낙태시 인간의 태아간장(낙태후 18, 20 및 33주), 비장(낙태후 18주), 또는흉선(낙태후 20주)을 제거하여, 균형된 염용액 내에서 얼음 위에 저장한다.

1mm 단편으로 잘게 썰고, 철사 그물망을 통해 밀어넣은 후, 행크스-균형된 염용액(Hanks Balanced Salt Solution; HBSS) 내에서 조직을 1회 세척한다.

파열된 조직을 실내 온도로 15분간 200xg로 원심분리기에서 회전시킨다.

그 결과로 생기는 침전물을 조직배양 구배 트립신-EDTA 용액(Flow Laboratories)의 10-20ml 내에서 재현탁시킨다.

재현탁된 조직을 살균된 플라스크로 옮기고, 10분 동안 실내온도에서 막대기로 휘젓는다.

트립신 활성을 억제하기 위해서 10%의 최종 농도 용액에 열로 비활성화된 태아 송아지 혈청(Hyclone) 1ml을 더한다.

기질세포를 파괴하기 위해 콜라게나아제 타입 IV(Sigma)를 군체용액에서 최종 농도 100㎍/ml가 되게 한다.

2.5시간 동안 추가로 실내 온도에서 조직을 휘젓고, 원심분리(400xg, 15분)에 의해 수집한 다음, 10%의 열로 비활성화된 태아 송아지 혈청, 5%의 열로 비활성화된 인간 혈청(Sigma), 4mM L-글루타민, 1X 피루브산나트륨, (100X Sigma의 군체), 1X 비필수아미노산(100X의 군체, FLOW) 및 항생물질 카노마이신, 네오마이신, 페니실린, 스트렙토마이신의 혼합물로 보충된 DMEM의 이스코브(Iscove)의 수정용액을 함유한 기질세포의 배지 내에서 재현탁시킨다.

기질세포의 배지에서 침전물을 재현탁시키기에 앞서, 침전물을 HBSS로 1회 세척한다.

배지의 60ml 내의 세포를 현탁시키는 것이 편리하다.

배양되는 수는 조직의 수에 좌우된다.

(실시예 3)

기질세포의 분리

5% 이산화탄소를 넣어 37℃에서 배양한 재현탁세포(실시예 2)는 10-48시간 내에 플라스틱 평판에 접착하기 시작한다.

초기 접종에서 도말된 세포 수에 좌우되는 융합성의 단세포층을 7-10일 내에 관찰할 수 있다.

콜로니로서 기질세포에 접착하는 비접착 및 고굴절 세포를 따로따로 피펫으로 제거한 후 얼린다.

비접착세포는 flk-2를 함유하는 자기재생 간세포군의 있음직한 원천이다.

접착기질세포층을 장래 연구를 위해 분취하여 얼리거나 또는 배양액에서 성장시키기 위해 팽창시킨다.

태아 비장세포와 결합하는 기대치않은 고수준의 APtag-flk-2 융합단백질을 관찰한다.

2개의 태아 비장세포 계통을 실시예 2에 기술된 것처럼 기질세포 배지에서 성장시킨다.

비접착 태아 간세포는 기질세포에 부착하여 콜로니를 형성한다(콜로니 형성단위-CFU).

기질세포 및 CFU를 살균한 유리실린더에 의해 분리하여 배양액에서 팽창시킨다.

Fsp 62891로 일컬어지는 클론은 flk-2 리간드를 함유한다.

Fsp 62891을 1991년 11월 21일에 the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U. S. A에 수탁번호 CRL 10935로 기탁하였다.

태아간장 및 태아흉선세포를 유사한 방법으로 제조한다.

이러한 세포형 모두 flk-1을 생산하고, 간장세포의 경우에는 약간의 flk-2를 생산한다.

F. thy 62891이라 일컬어지는 한 개의 태아 흉선세포계통 및 FL 62891이라 일컬어지는 한 개의 태아 간장세포 계통을 the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U. S. A에 수탁번호가 각각 CRL 10936 및 CRL 11005로 1991년 11월 21일 및 1992년 4월 2일에 기탁하였다.

안정된 인간세포계통을 실시예 1에 기술된 쥐의 세포계통을 제조하는 데 이용된 같은 온도에 민감한 불멸화시키는 바이러스를 이용하여 제조한다.

(실시예 4)

인간의 기질세포클론의 분리

고굴절세포는 아마도 기질세포가 CFU의 형성을 허락하는 인자를 생산하기 때문에 기질세포의 조각 전면에서 자란다.

기질세포클론을 분리하기 위해, 진공 그리스로 덮여진 살균유리실린더를 CFU위에 배치한다.

세포를 분리하기 위해 트립신-EDTA 용액(100ml)을 더한다.

5ml의 기질세포배지에 세포를 더하고, 각각의 클론을 6개의 웰 평판의 한 개의 웰에 도말시킨다.

(실시예 5)

분비될 수 있는 알칼리성 포스파타제(SEAP)를 발현하기 위한 플라스미드(Aptag)

분비될 수 있는 알칼리성 포스파타제를 발현하는 플라스미드는 플라나간 및 레더(in Cell 63, 185-194(1990))에 의해 기술되어 있다.

그 플라스미드는 LTR 프로모터와 같은 프로모터, Hind Ⅲ 및 Bgl Ⅱ를 포함하는 폴리링커, SEAP를 암호화하고 있는 DNA, 폴리 A신호, 및 암피실린 내성 유전자 및 복제부위를 함유한다.

(실시예 6)

APtag-flk-2 및 APtag-fkl-1 융합단백질을 발현하기 위한 플라스미드

SEAP 및 flk-1 또는 flk-2의 세포 외 부분의 융합단백질을 발현하는 플라스미드를 플라나간과 레더(in cell 63, 185-194(1990)) 및 베르거(Berger et al., Gene 66, 1-10(1988))의 조서에 따라 제조한다.

요약하면 flk-1 또는 flk-2의 세포외 부분을 함유하는 HindⅢ-BamH Ⅰ 단편을 제조하여 실시예 5에 기술된 플라스미드의 HindⅢ-BglⅡ 부위 안으로 삽입한다.

(실시예 7)

APtag-flk-1 또는 flk-2 융합단백질의 생산

실시예 6의 플라스미드를 DEAE-덱스트란(in Current Protocols in Molecular Biology, Vnit 16.13, 'Transient Expression of Proteins Using Cos Cells', 1991)에 의해 cos-7 세포 안으로 형질 도입시키고, pSV7neo와 같은 식별력있는 표지를 이용하여 칼슘 침전에 의해 NTH/3T3 세포 안으로 상호 형질 도입시킨다.

100mm 평판에서 600㎍/ml G418을 이용하여 NTH/3T3 세포를 선택한다.

태반의 알칼리성 포스파타제 활성의 비밀에 대하여 300클론 이상을 스크리닝한다.

주변 포스파타제 활성을 비활성화시키기 위하여 10분 동안 65℃에서 상등액 부분을 가열하고, 1M 디에탄올아민(pM 9.8), 0.5mM MgCl₂, 10mM L-호모아르기닌(포스파타제 억제제), 0.5mg/ml BSA 및 12mM P-니트로페닐 포스페이트와 함께 배양한 후에 OD405를 측정함으로써 분석을 수행한다.

인간 태반의 알칼리성 포스파타제는 표준 곡선을 이행하는 데 이용된다.

APtag-flk-1 클론(F-1AP21-4)은 1ml당 10㎍ 알칼리성 포스파타제 활성까지 생산하며, APtag-flk-2 클론(F-2AP26-0)은 1ml당 0.5㎍ 알칼리성 포스파타제 활성까지 생산한다.

(실시예 8)

세포와 결합하는 APtag-flk-1 또는 APtag-flk-2에 대한 분석

APtag-flk-1 또는 APtag-flk-2의 적당한 리간드를 함유한 세포와 결합을 통상적 방법에 의해 분석한다(예: Flanagan and Leder, cell 63 :185-194, 1990).

세포(쥐 기질세포, 인간 태아 간장, 비장 또는 흉선 또는 여러 개의 조절세포)를 6개의 웰 평판 안에서 성장시켜 융합시키고, HBHA(0.5mg/ml BSA, 0.02% NaN₃, 20mM HEPES, pH7.0을 함유하는 행크의 균형된 염용액)으로 세척한다.

APtag-flk-1 융합단백질, APtag-flk-2 융합단백질뿐 아니라 대조군으로서 수용체가 없는 APtag를 함유하는 형질도입된 COS 또는 NIH/3T3 세포로부터의 상등액을 세포 단일층에 더하고, 회전하는 플랫폼 위에서 실내온도에서 2시간 동안 배양한다.

APtag-flk-1 융합단백질, APtag-flk-2 융합단백질 또는 수용체가 없는 APtag의 농도는 통상의 알칼리성 포스파타제 곡선에 의해 결정되는 바와 같이 알칼리성 포스파타제 60mg/ml이다.

그 후 세포를 HBHA로 7번 헹구고, 1% 트리톤 X-100, 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 350㎕에서 용균시킨다.

그 용균액을 똑같은 용액을 갖는 150㎕ 린스와 함께 마이크로 퓨지 튜브로 옮긴다.

샘플을 강하게 소용돌이치게 한 후, 마이크로 퓨지에서 5분동안 회전시키고 세포 포스파타제를 비활성화시키기 위해 12분동안 65℃에서 가열하고, 이전에 기술된 바와 같이 포스파타제 활성에 대하여 분석한다.

flk-2 및 flk-1에 대한 리간드를 함유하는 기질세포와 APtag-flk-2, APtag-flk-1 및 수용체 없는 APtag(대조군) 사이의 결합의 반응 횟수 및 반응량을 나타내도록 고안된 실험의 결과는 제 3도 및 제 4도에 각각 나타나 있다.

8A. flk1/fms 및 flk2/fms 융합단백질을 발현시키기 위한 플라스미드

flk-1 및 flk-2의 세포외 부분 및 c-fms(이것 또한 콜로니-자극인자-1 수용체로서 공지되어 있다)의 세포내 부분의 융합단백질을 발현하는 플라스미드를 실시예 6에서 기술된 방법(APtag-flk-2 및 APtag-flk-1 융합단백질에 대한 플라스미드)과 유사한 방법으로 제조한다.

요약하면, flk-1 또는 flk-2의 세포외 부분을 함유하는 HindⅢ-BamHⅠ 단편을 제조하여 c-fms의 세포내 부분을 함유하는 pLH 발현벡터의 HindⅢ-BglⅡ 부위 안으로 삽입한다.

8B. 3T3 세포내에서 flk-1/fms 또는 flk-2/fms의 발현

실시예 11에서의 플라스미드를 칼슘에 의해 NIH/3T3 세포안으로 형질 도입시킨다.

c-fms의 세포내 부분을 웨스턴 블로팅에 의해 검출한다.

(실시예 9)

flk-1 및 flk-2 수용체에 대한 쥐 리간드에 대하여 암호화하고 있는 cDNA의 클로닝 및 발현

flk-1 및 flk-2d에 대한 쥐 리간드를 발현하는 cDNA를 공지된 방법에 의해 제조한다(예: Seed, B., 및 Aruffo, A. PNAS 84 : 3365-3369, 1987 ; Simmons, D. 및 Seed, B. J. Immunol. 141 : 2797-2800; 및 D'Andrea, A. D., Lodish, H. F, 및 Wong, G. G. Cell 57 : 277-285, 1989).

프로토콜이 아래에 차례로 기술된다.

(a) RNA 분리;

(b) 폴리A RNA 제조;

(c) cDNA 합성;

(d) cDNA 크기분별;

(e) 플라스미드(벡터)의 증식;

(f) 플라스미드 DNA의 분리;

(g) 클로닝을 위한 벡터 pSV 스포트(BRL Gibco)의 제조

(h) 상기 단계에 대한 버퍼의 편집

(i) COS7 세포내의 리간드를 암호화하고 있는 cDNA의 형질 도입

(j) 패닝(panning) 절차

(k) 오토크라인 고리의 형성에 의하여 flk-1 또는 flk-2의 발현 클로닝

9a. RNA 분리를 위한 구아니디니엄 티오시아네이트/LiCl 프로토콜

구하는 혼합물의 각 ml에 대하여 0.55ml의 25% LiCl 안에서 0.5g의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN)를 용해시킨다.

20㎕의 메르캅토에탄올을 더한다(그 결과로서 생기는 용액은 실내온도에서 약 1주일 이상 지나면 나쁘다).

2018 기질세포를 원심분리시키고, 상술한 용액 1ml를 5 × 10⁷세포 혼합물이 비점성이 될 때까지 폴리트론에 의하여 세포를 절단한다.

소규모제조(<10⁸세포)를 위해 5.7MCsCl(RNase 없음, 10mM EDTA pH 8 매 ml마다 1.26g CsCl을 더함)의 1.5ml 위에 절단된 혼합물을 놓으며, 만일 필요하다면 RNase가 없는 물로 입힌다.

2시간 동안 50krpm 속도로 SW 55로우터 내에서 혼합물을 회전시킨다.

대규모 제조에 대하여 SW 28 튜브 내의 12ml CsCl 위에 혼합물 25ml를 놓고, 상기한 대로 입힌 후, 8시간 동안 24krpm 속도로 회전시킨다.

튜브의 내용물을 진공 플라스크에 연결된 멸균 파스퇴르 피펫으로 주의깊에 빨아낸다.

일단 튜브 주변의 띠가 CsCl 경계면을 지나면, 벽 위의 세포층이 튜브 아래쪽으로 기어내려가는 것을 막기 위하여 피펫 끝으로 튜브 주변의 띠를 긁는다.

잔류 CsCl 용액을 빨아낸다.

그 결과로 생기는 침전물을 물 속에서 흡수되지만 다시 용해되지 않는다.

아세트산나트륨 1/10 부피 및 에탄올 3부피를 혼합물에 더한 후 휘젓는다.

만일 필요하다면 그 침전물을 70℃에서 물속에서 재현탁시킨다.

RNA 농도는 1mg/ml로 조정한 후, 그것을 얼린다.

작은 RNA 분자(예를 들면, 5S)는 내려가지 않는 점이 주목된다.

소량의 세포에 대하여, 부피를 단계적으로 줄인 후, 그 혼합물을 RNase 부재물안에 GuSCN으로 입힌다(RNA가 희석될 때, 침전은 비효율적이다).

9b. 폴리A RNA 제조

(언급된 모든 버퍼를 아래에서 따로 따로 수집한다)

처치할 수 있는 폴리프로필렌 컬럼을 5M NaOH로 세척한 후 RNase 부재물로 헹굼에 의해 제조한다.

토탈 RNA의 매 밀리그램마다 올리고 dT 셀룰로오스의 약 0.3ml(final packed head)를 더한다.

1ml의 0.1M NaOH 내에서 약 0.5ml의 건조 분말을 재현탁시킨 후 그것을 컬럼 안으로 옮김에 의해 또는 이전에 이용된 컬럼을 통하여 0.1M NaOH를 삼투시킴에 의해 올리고 dT 셀룰로오스를 제조한다.

pH가 중성이 될 때까지 여러개의 컬럼 부피의 RNase 부재물로 컬럼을 세척하고, 2-3ml의 로우딩 버퍼로 헹군다.

컬럼 베드를 4-6ml의 로우딩 버퍼에 의해 멸균한 15ml 튜브로 옮긴다.

2081 세포 계통으로 유래한 토탈 RNA를 2-3분 동안 70℃까지 가열한다.

RNase 부재 군체로부터 LiCl을 혼합물에 더하여 최종 농도가 0.5M이 되게 한다.

15ml 튜브 안에서 혼합물을 올리고 dT 셀룰로오스를 결합시킨 후 10분 동안그 혼합물을 와동시키거나 휘젓는다.

그 혼합물을 컬럼 안으로 쏟아붓고, 3ml 로우딩 버퍼로 씻은 후 3ml의 보통 세척 버퍼로 씻는다.

1.5ml의 2mM EDTA 및 0.1% SDS로 mRNA를 SW 55 튜브 안으로 직접 용출하며 최초의 2개 또는 3개의 방울을 버린다.

용출된 mRNA를 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨을 더한 후 에탄올로 튜브를 채움에 의해 침전시킨다.

튜브의 내용물을 혼합하고, 20℃에서 30분 동안 냉각시킨 후 30분 동안 5℃에서 50krpm 속도로 회전시킨다.

에탄올을 가만히 따르고 튜브의 공기를 건조시킨 후, mRNA 침전물을 50-100㎕의 RNase 부재물 안에서 재현탁시킨다.

5㎕의 재현탁 mRNA를 MOPS/EDTA/포름알데히드 내에서 70℃로 가열하여 RNase-부재 1% 아가로스 겔 위에서 조사한다.

9c. cDNA 합성

이용된 프로토콜은 구브러(Gubler)와 호프만(Holfmann)에 의해 기술된 방법의 변형이다(Gene 25, 263-270(1983)).

1. 첫째 가닥

4㎍의 mRNA를 마이크로퓨즈튜브에 더하고 30초 동안 약 100℃까지 가열하고, 얼음 위에서 식힌다.

부피를 RNAase 부재물로 70㎕까지 조정한다.

20㎕의 RT₁버퍼, 2㎕의 RNAase 억제자(Boehringer 36u/㎕),1㎕의 5㎍/㎕의 올리고 dT(Collaborative Research), 2.5㎕의 20mM dXTP'S(Ultrapure-US Biochemicals), 1㎕의 1M DTT 및 4㎕의 RT-XL(Life Science, 24u/㎕)을 더한다. 그 혼합물을 40분 동안 42℃에서 배양하고, 10분 동안 70℃에서 가열함에 의해 비활성시킨다.

2. 둘째 가닥

320㎕의 RNAase 부재물, 80㎕의 RT2 버퍼, 5㎕의 DNA 폴리메라제 I(Boehringer, 5Ⅴ/㎕), 2㎕ RNAase H(BRL, 2u/㎕)를 첫째 가닥을 포함하는 용액에 더한다.

그 용액을 1시간 동안 15℃에서 배양하고, 1시간 추가로 22℃에서 배양한다.

20㎕의 0.5M EDTA, pH 8.0을 더한 후, 그 용액을 페놀로 추출하고 NaCl을 20㎍/㎖ 농도로 0.5M 선형 폴리아크릴아미드(운반체)에 더함에 의하여 침전시킨 후, EtOH로 튜브를 채운다.

그 튜브를 마이크로 퓨즈 내에서 2-3분 동안 회전시키고, 튜브벽으로부터 침전된 물질을 제거하기 위해 와동시키고 1분 동안 다시 회전시킨다.

3. 어댑터

어댑터는 클로닝을 용이하게 하는 특이한 제한 부위를 제공하며 BRL Gibco, New England Biolabs 등으로부터 이용할 수 있다.

천연 그대로의 어댑터를 1㎍/㎕ 농도에서 재현탁시킨다.

MgSO₄를 10mM의 최종 농도로 더하고, 5 부피의 EtOH를 더한다.

그 결과로 생기는 침전물을 70% EtOH로 헹구고, 1㎍/㎕의 농도에서TE안에서 재현탁시킨다.

인산기를 전이하기 위해서 3㎕의 10X 인산기전이 버퍼 및 20 단위의 키나아제에 25㎕의 재현탁 어댑터를 더한다.

그 혼합물을 하룻밤동안 37℃에서 배양한다.

침전된 cDNA를 240㎕의 TE(10/1)안에서 재현탁시킨다.

30㎕의 10X 저염버퍼, 30㎕의 0.1mM ATP를 갖는 10X 리게이션 버퍼, 3㎕(2.4㎍)의 인산기가 전이된 12-메르 어댑터 서열, 2㎕(1.6㎍)의 인산기가 전이된 8-메르 어댑터 서열 및 1㎕의 T4 DNA 리가아제(Biolabs, 400u/㎕, 또는 Boehringer, 1Weiss unit ㎖)를 더한 후, 그 혼합물을 하룻밤동안 15℃로 배양한다.

여분의 운반체를 생략하고, 100㎕의 TE 안에서 재현탁시키는 것을 제외하고, 상기한 바대로 cDNA를 페놀로 추출하고 침전시킨다.

9d. cDNA 크기 분별

20% KOAc, 2mM EDTA, 1㎍/㎖ 에티디엄 브로마이드 용액 및 5% KOAc, 2mM EDTA, 1㎍/㎖ 에티디엄 브로마이드 용액을 제조한다.

2.6㎖의 20% KOAc 용액을 소 기울기 메이커의 뒷방에 더한다.

20% 용액을 앞방으로 흐르도록 하고 기울기 메이커를 기울여서 그 용액을 뒷방으로 되돌려 보냄에 의해, 그 두 개의 방을 연결하는 튜브로부터 공기 거품을 제거한다.

방사이의 통로를 닫고, 앞방에 2.5㎖의 5% 용액을 더한다.

이전의 흐름으로부터 튜브 안에 있는 어떠한 액체라도 5% 용액을 튜브의 끝으로 흐르게 한 후 방으로 되돌려 보냄에 의해 제거한다.

그 기구를 스터플레이트(stirplate) 위에 놓고, 신속하게 휘저음과 함께 두 개의 방을 연결하는 마개 및 앞꼭지를 연다.

폴리알로머 5W 55 튜브를 밑바닥으로부터 KOAc 용액으로 채운다.

기울어진 부분은 100㎕의 cDNA 용액으로 입히고, 22℃에서 50Krpm으로 3시간동안 회전시킨다.

기울어진 부분으로부터 단편을 수집하기 위해 버터플라이 주입세트(루에르허브를 잘라냄)로 SW55 튜브 바닥 가까이에 구멍을 뚫는다.

3개의 0.5㎖ 단편을 마이크로 퓨즈 튜브에서 수집한 후, 6개의 0.25㎖ 단편을 수집한다(각각 약 22 및 11방울).

선형 폴리아크릴아미드를 20㎍/㎖로 더하고, 그 튜브를 꼭대기까지 에탄올로 채움에 의해 그 단편을 침전시킨다.

그 튜브를 냉각시키고, 30분 동안 마이크로 퓨즈 튜브안에서 회전시키고 1분 동안 와동시키면서 재회전시킨다.

그 결과로서 생기는 침전물을 70% 에탄올로 헹구고 그 침전물이 완전히 건조되지 않도록 주위를 기울이면서 다시 회전시킨다.

0.25㎖ 단편을 각각 10㎕의 TE 안에서 재현탁시키고, 1㎕를 1% 아가로스미니겔 위에서 흐르게 한다.

최초 3개의 단편 및 1kb 보다 더 작은 물질을 함유하지 않는 마지막 6개의 단편을 합동한다.

9e. 플라스미드의 증식

황갈색의 돌연변이성 암피실린 및 테트라사이클린 항생제 내성요소를 함유하는 2차 플라스미드, p3를 함유하는 비억제 박테리아 숙주내에서 SupF 플라스미드를 선택한다.

p3 플라스미드는 RP1으로부터 유도되며, 길이가 57kb이고, 안전하게 보존되며, 단일 카피 에피솜이다.

이 플라스미드의 암피실린 내성은 높은 비율로 변환되어 p3-함유 균주에서 amp 플라스미드는 보통 이용될 수 없다.

테트라사이클린 내성만을 선택하는 것은 암피실린-테트라사이클린 내성에 대한 선택과 거의 같다.

그러나, 염색체의 억제자 tRNA 돌연변이의 자발적인 출현은 이 시스템 내에서 피할 수 없는 배경(빈도가 약10^-9)을 제공한다.

자발적인 억제자 돌연변이로부터 발생하는 콜로니는 보통 플라스미드 형질전환으로부터 발생하는 콜로니보다 더 크다.

12.5㎍/㎖의 암피실린 및 7.5㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 루리아브로쓰(LB) 배지에서 억제자 플라스미드를 선택한다.

비율에 따라 늘어나는 플라스미드의 제조를 위해서, 글리세롤(0.8%)을 함유하는 M9 카스아미노산 배지를 탄소원으로 이용한다.

그 박테리아를 포화상태까지 성장시킨다.

선택적으로, 이.콜라이에서 복제 및 암피실린 내성에 대하여 필요한 서열뿐 만 아니라 COS7 세포에서 복제, 전사시작과 종결에 대한 SV 40으로 유도된 서열을 제공하기 위하여 pSV Sprot(BRL, Gaithersberg, Maryland)를 이용할 수 있다.

9f. 벡터 DNA/플라스미드의 분리

포화된 박테리아 세포 11을 25분 동안 4.2krpm으로 J6병 안에서 회전시켜 가라 앉힌다.

그 세포를 40㎖ 10mM EDTA, pH 8에서 재현탁시킨다.

80㎖ 0.2M NaOH 및 1% SDS를 더하고, 그 혼합물을 투명하고 점성이 생길 때 까지 와동시킨다.

40㎖의 5M KOAc; pH 4.7(2.5M KOAc, 2.5M HOAc)를 더하고, 덩어리의 크기가 약 2-3mm가 될 때까지 반쯤 강하게 흔든다.

그 병을 5분 동안 4.2krpm에서 회전시킨다.

그 상등액을 치즈 클로쓰를 통하여 250㎖병 안으로 붓고 그 후 그 병을 이소프로필 알코올로 채우고 5분 동안 4.2krpm으로 회전시킨다.

그 병을 서서히 배수시키고 침전물이 단편화되지 않도록 주의하면서 70% 에탄올로 헹군다.

병을 거꾸로 하여 소량의 에탄올을 제거한 후에 그 혼합물을 3.5㎖ Trisbase/EDTA(20mM/10mM)안에서 재현탁시킨다.

3.75㎖의 재현탁 침전물 및 0.75㎖의 10㎎/㎖ 에티디엄 브로마이드를 4.5g CsCl에 더한다.

VTi80 튜브를 용액으로 채우고, 적어도 2.5시간 동안 80kprm 속도로 회전시킨다.

1mM 주사기 및 20게이지 또는 그보다 작은 바늘로 가시광선하에서 띠를 추출한다.

튜브의 꼭대기를 가위로 잘라내고, 바늘의 경사가 위로 향하게 띠 아리 약 3mm되는 위치에서 튜브에 대하여 30도 각도로 튜브안으로 위쪽으로 바늘을 삽입한다.

띠를 제거한 후, 튜브의 내용물을 표백제 안으로 붓는다.

추출된 띠를 13㎖ 사르스테트(sarstedt) 튜브안에 가라앉힌 후, 1M NaCl 추출물로 포화된 n-부탄올로 꼭대기까지 채운다.

만일 DNA의 양이 많다면, 발췌 절차를 반복한다. 에티디엄을 분해하기 위해 부탄올을 빨아내어 5M NaOH를 함유하는 트랩 안으로 보낸 후에, 약 동일 부피의 1M 아세트산 암모니아 및 약 2 부피의 95% 에탄올을 DNA에 더한 후, 5분 동안 10krpm으로 회전시킨다.

침전물을 70% 에탄올로 주의깊게 헹구고, 자루걸레(swab) 또는 동결건조 장치(lyop-hilizer)로 건조시킨다.

9g. 클로닝을 위한 벡터의 제조

온도조절이 잘되고, 순환이 잘되는 물통 안에서 50℃로 하룻밤 동안 200㎕ 반응물에서 100 단위의 BstXⅠ(New York Biolabs)로 20㎍의 벡터를 자른다. 아세트산 칼륨용액(5 및 20%)을 위에서 기술된 5W55 튜브 안에서 제조한다.

100㎕의 분해된 벡터를 각 튜브마다 더하고, 22℃에서 50krpm 속도로 3시간 동안 회전시킨다.

300nm UV 광 하에서, 구하는 띠가 튜브의 길이의 2/3를 이동한 것으로 관측된다.

그때의 앞선 경로는 경사면이 과부하되었음을 나타낸다.

20게이지 바늘을 달은 1㎖ 주사기로 그 띠를 제거한다.

선형 폴리아크릴아미드를 더하고, 3 부피의 에탄올을 더함으로써 플라스미드를 침전시킨 후, 그 플라스미드를 50㎕의 TE 안에서 재현탁시킨다.

일정한 양의 벡터 및 증가한 양의 cDNA를 이용하여 리게이션 시험을 수행한다.

이 리게이션 시험을 기초로 하여 대규모 리게이션을 수행한다.

보통 완전한 cDNA 침전물은 1-2㎍의 잘린 벡터를 필요로 한다.

9h. 버퍼

로우당 버퍼: 0.5M LiCl, 10mM Tris pH 7.5, 1mM EDTA 0.1% SDS.

중간세척버퍼: 0.15M LiCl, 10mM Tris pH 7.5, 1mM EDTA 0.1% SDS

RT₁버퍼: 0.25M Tris pH 8.8(8.2 at 42), 0.25M KCl, 30mM MgCl₂.

RT₂버퍼: 0.1M Tris pH 7.5, 25mM MgCl, 0.5M KCl, 0.25㎎/㎖ BSA, 50mM 디티오트레이톨(DTT).

10X 저염: 60mM Tris pH 7.5, 60mM MgCl₂, 50mM NaCl, 2.5㎎/㎖ BSA, 70M DME.

10X 리게이션 부가물: 1mM ATP, 20mM DTT, 1㎎/㎖ BSA, 10mM 스퍼미딘.

10X 인산기전이 버퍼: 0.5M Tris pH 7.5, 10mM ATP, 20mM DTT, 10mM 스퍼미딘, 1㎎/㎖ BSA, 100mM MgCl₂.

9i. COS7 세포 내에서 리간드를 암호화하고 있는 cDNA의 형질도입

COS7 세포를 1:5 비로 잘라 Dulbecco's modified Eagles medium (DME)/10% 태아송아지 혈청(FCS)이 들어있는 100mm 평판 위에 놓고 하룻밤동안 성장시킨다.

형질 도입되는 COS7 세포의 100mm 접시마다 400㎍/㎖ DEAE-덱스트란(Sigma, D-9885)을 함유하는 3㎖ Tris/DME(0.039M Tris, pH 7.4 in DME)를 제조한다.

평판마다 10㎍의 플라스미드 DNA 제조물을 더한다. COS-7 세포의 배지를 제거하고 DNA/DEAE-덱스트란 혼합물을 더한다.

세포를 4.5시간 동안 배양한다.

그 세포의 배지를 제거하고 2% 태아 송아지 혈청(FCS) 및 0.1mM 클로로퀸을 함유하는 DME 3㎖로 대체한다.

그 세포를 1시간 동안 배양한다.

클로로퀸을 제거하고 PBS에서 1.5㎖ 20% 글리세롤로 대체한 후, 그 세포를 1분 동안 실내 온도에서 둔다.

3㎖ Tris/DME를 더한 후, 그 혼합물을 빨아내어 Tris/DME로 2회 세척한다.

10㎖ DME/10% FCS를 더한 후, 그 혼합물을 하룻밤 배양한다.

형질 도입된 COS 7세포를 1:2비로 잘라 (DME)/10% FCS가 포함된 신선한 100mm 평판 안에 놓고, 성장시킨다.

9j. 리간드를 발현하는 COS7 세포에 대한 패닝절차

1)항체로 덮인 평판

세균학의 100mm 평판을 10㎖의 50mM Tris, HCl, pH 9.5에서 1:500으로 희석된 토끼의 항인간 태반 알칼리성 포스파타제(Dako, California)로 1.5 시간동안 덮는다.

그 평판을 0.15M NaCl로 3회 세척하고, 하룻밤동안 3㎎ BSA/㎖ PBS를 넣고 하룻밤 배양한다.

블록킹 용액을 빨아내고, 즉시 그 평판을 이용하거나 후의 사용을 위해 그 평판을 얼린다.

2)세포의 패닝

형질도입된 COS7 세포의 배지를 빨아내고, 3㎖의 PBS/0.5mM EDTA/0.02% 아지화나트륨을 더한다.

세포를 분리하기 위해 평판을 30분 동안 37℃에서 배양한다.

세포를 파스퇴르 피펫으로 강하게 빻고 15㎖ 원심 분리 튜브 안에 수집한다.

2㎖ PBS/EDTA/아지드화 용액을 더하여 평판을 세척한 후, 그 용액을 원심 분리 튜브에 더한다.

5분 동안 200xg에서 원심분리한 후, 형질 도입된 NIH/3T3 세포(실시예7)의 APtag-flk-1(F-1AP21-4) 또는 flk-2(F-2AP26-0) 상등액 3㎖안에서 세포를 재현탁시키고 얼음 위에서 1.5시간 동안 배양한다.

그 세포를 5분 동안 200xg로 다시 원심 분리시킨다.

그 상당액을 빨아내고 3㎖ PBS/EDTA/아지드 용액 내에서 세포를 재현탁시킨다.

그 세포를 현탁액을 주의깊게 3㎖ PBS/EDTA/아지드/2% Ficoll 위에 놓고, 4분 동안 200xg로 원심분리시킨다.

그 상등액을 빨아내고, 0.5㎖ PBS/EDTA/아지드 용액에서 세포를 재현탁시킨다.

그 세포를 4㎖ PBS/EDTA/아지드/5% FBS를 함유하는 항체로 덮인 평판에 더하고 1-3시간 동안 실내 온도에 둔다.

비접착세포를 3㎖ PBS/5% FBS로 2-3번 가볍게 세척하여 제거한다.

3)허트 상등액

0.4㎖ 0.6% SDS 및 10mM EDTA를 패닝된 평판에 더한 후, 20분간 둔다. 점성 혼합물을 피펫을 이용하여 마이크로 퓨즈 튜브 안으로 더한다.

0.1㎖ 5M NaCl을 튜브에 더하고, 혼합한 후, 적어도 5시간 동안 얼음 위에서 냉각시킨다.

튜브를 4분 동안 회전시키고, 상등액을 주의깊게 제거한다.

튜브의 내용물을 페놀로 한번 추출하거나 만일 처음의 경계면이 깨끗치 못하며, 두 번 추출한다.

10 마이크로 그램의 선형 폴리아크릴아미드(또는 다른 운반체)를 더하고 그 튜브를 꼭대기까지 에탄올로 채운다.

그 결과로 생기는 침전물을 0.1㎖ 물 또는 TE 안에서 재현탁시킨다.

3 부피의 EtOH/NaOAc를 더한 후, 세포를 재침전시키고 0.1㎖ 물 또는 TE안에서 재현탁시킨다.

수득된 cDNA를 전기영동에 의해 어떤 적합한 이.콜라이 숙주 안으로 형질 도입한다. 적합한 숙주는 여러 가지 유사물로 기술되어 있고, MC 1061/P3 또는 BRL Gibco의 일렉트로맥스 DH 10B 세포를 포함한다.

cDNA를 통상의 방법으로 추출한다.

포유류 세포를 형질 도입시킬 수 있고, 적극적인 패닝 분석을 얻을 수 있는 유일한 재조합 플라스미드로서 cDNA를 갖는 순수 이.콜라이 클론이 분리될 때까지 상기한 패닝 절차를 반복한다.

통상적으로 3번 반복으로 충분하다.

9k. 오토크라인 고리의 형성에 의한 flk1 또는 flk2의 발현 클로닝

flk1/fms 또는 flk2/fms(실시예 10)을 발현하는 세포를 각각 기질세포를 발현하는 flk1 리간드 및 flk2 리간드로부터 유래한 cDNA 라이브러리 20-30㎍으로 형질도입시킨다.

cDNA 라이브러리를 상기한 바대로(a-h) 제조한다.

그 세포를 1㎍ pLTR 네오 cDNA와 상호 형질 도입시킨다.

형질 도입한 후 세포를 1:2로 이동시키고 10% CS로 보충된 둘베코의 배지(DME) 내의 G418의 800㎍/㎖에서 배양한다.

약 12일 후에 세포의 콜로니를 이동시켜 폴리-D-리신(1㎎/㎖) 및 인간피브로넥틴(15㎍/㎖)으로 덮인 평판 위에 놓는다.

그 배양배지를 DME 및 Ham's F12 배지의 혼합액(3:1)인 혈청 부재배지로 한정한다.

그 배지보충물은 8mM NaHCO₃, 15mM HEPES pH 7.4, 3mM 히스티딘, 4μM MnCl₂, 10μM 에탄올아민, 0.1μM 셀렌산, 2μM 히드로코티손, 5㎍/㎖ 트랜스페린, 500㎍/㎖ 소의 혈청 알부민/리놀린산 복합체 및 20㎍/㎖ 인슐린이다(Ref. Zhan, X, et al., Oncogene 1:369-376,1987).

한정배지조건 하에서 성장할 수 있는 세포만 남을 때까지 배양액을 그 다음날 및 매 3일 마다 재공급한다.

세포의 잔류 콜로니를 확대하여 APtag-flk1 또는 APtag-flk2와 세포와의 결합에 대한 분석(실시예 8에 기술됨)에 의해 리간드의 존재를 시험한다.

flk1 또는 flk2의 존재 및 그 서열을 실증하는 세포로부터 DNA를 추출한다.

(실시예 10)

리간드 cDNA의 발현

cDNA의 서열을 밝히고, 포유류 세포, 바람직하게는 COS, CHO 또는 NIH/3T3 세포와 같은 적합한 숙주세포 내에서 cDNA를 발현시킨다.

리간드와 APtag-flk-2 융합 단백질의 결합을 실증함에 의해 리간드의 존재를 확인한다.

(실시예 11)

수용체 및 리간드의 화학적 교차결합

교차 결합실험을 Blume-Jensen et al., EMBO J., 10, 421-4128(1991)에 의해 기술된 절차를 변경하여 본래대로의 세포 위에서 수행한다.

반쯤 융합하도록 100mm 조직배양 평판에서 세포를 배양하고, PBS-0.1% BSA로 1회 세척한다.

가용성 수용체와 막과 결합된 리간드 사이의 화학적 교차 결합을 검진하기 위해, 2018 기질 세포계통중의 기질 세포를 가용성 수용체 flk2-APtag를 발현하는 형질 도입된 3T3 세포의 조건부 배지(CM)에서 배양한다.

가용성 리간드와 막과 결합된 수용체 사이의 교차 결합연구를 flk2-fms 융합구조물을 발현하는 형질 도입된 3T3 세포의 조건부 배지에서 2018 세포를 배양한다.

수용체의 내재화를 방지하기 위해 0.02% 나트륨화 아지드를 함유하는 CM에서 실내온도로 또는 수용체의 탈인산화를 방지하기 위해서 바나듐산나트륨을 보충한 CM(및 버퍼)에서 4℃로 2시간 동안 결합을 수행한다.

세포를 PBS-0.1% BSA로 2번, PBS로 4번 세척한다.

실내온도에서 30분 동안 250mM 디숙시니미딜 슈베르산(DSS: Pierce)을 함유하는 PBS에서 교차결합을 수행한다.

그 반응을 Tris-HCl pH 7.4로 최종 농도가 50mM이 되게 억제한다.

세포를 가용화 버퍼(0.5% 트리톤-X100, 0.5% 디옥시콜린산, 20mM Tris pH 7.4, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 1mM PMFS, 50㎎/㎖ 아프로티닌, 2㎎/㎖ 베스타틴, 2㎎/㎖ 펩스타틴 및 10㎎/㎖ 류펩틴)에서 용해시킨다.

분해된 세포를 즉시 1.5㎖ 날겐(Nalgene) 튜브로 옮기고, 4℃에서 45분 동안 철저히 회전시킴에 의해 용해시킨다.

그후 용균액을 10분 동안 14,000g으로 마이크로 퓨지 안에서 회전시킨다.

용해된 교차 결합 수용체 복합체를 2시간 동안 또는 하룻밤 4℃에서 10%(v/v) 밀종자렉틴-세파로오스 6MB 구슬(pharmacia)과 함께 상등액을 배양함에 의해 용균액으로부터 회수한다.

구슬을 트리스-버퍼 염수(TBS)로 1회 세척하고, 2X SDS-폴리아크릴-아미드 비환원 샘플 버퍼에서 재현탁시킨다.

5분 동안 95℃로 가열함으로써 결합된 복합체를 구슬로부터 용출한다.

샘플을 비환원 및 환원 조건하에서 4-12% 농도구배겔(NOVEX) 위에서 분리한 후, 노벡스 블로팅 기구를 이용하여 2시간 동안 PVDF막으로 옮긴다.

블로트를 실내온도에서 1시간 동안 TBS-3% BSA에서 차단한 후 적당한 항체와 함께 배양한다.

교차로 연관된 flk2-APtag 및 flk2-fms 수용체를 인간 알칼리성 포스파타제 및 fms 단백질 각각에 대항해서 만들어지는 토끼의 복합항체를 이용하여 검출한다.

그 절차의 나머지를 AB키트(Pieice)에서 제공된 정보에 따라 수행한다.

그 키트는 검출을 위하여 바이오티닐레이티드 제 2차 항체 및 아비딘-바이오티닐레이티드 호스래디쉬 퍼옥시다아제 복합체를 이용하는 것을 기초로 한다.

실행가능성의 보충

청구된 본 발명은 명세서와 쉽게 이용할 수 있는 참고 문헌 및 출발 물질에 의해 실행될 수 있다.

그럼에도 불구하고 출원인은 아래에 열거된 세포균주를 ATCC(the American Type Culture Collection)에 기탁하였다.

1991년 10월 30일에 기탁된 2081, ATCC 수탁번호 CRL 10907.

1991년 11월 21일에 기탁된 Fsp 62891, ATCC 수탁번호 CRL 10935.

1991년 11월 21일에 기탁된 F. thy 62891, ATCC 수탁번호 CRL 10936.

1992년 4월 2일에 기탁된 FL 62891, ATCC 수탁번호 CRL 11005.

본 기탁은 특허절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약의 조문 및 그 하위의 규칙에 따라 이루어졌다.

이것은 기탁일로부터 30년 동안 생존할 수 있는 배양액의 유지를 보증한다.

미생물은 부다페스트 조약의 내용에 따라 ATCC에 의해 이용될 수 있을 것이며, 적절한 U.S. 특허의 발행시 무제한적으로 이용될 수 있음을 보증하는 출원인과 ATCC간의 일치를 조건으로 하고 있다.

기탁된 균주를 이용할 수 있음은 특허법에 따라 모든 정부의 권한하에 허여되는 권리에 위반되어 본 발명을 실행하는 라이센스로 해석되어서는 아니된다.

수용체 및 리간드를 암호화하고 있는 핵산 서열은 재조합 수용체 및 리간드를 생

하기 위해 필요하다.

Claims

도 2에 나타난 서열을 함유하는 단백질 티로신 키나아제 flk-1인 분리된 핵산분자.
제1항에 있어서, 상기 핵산분자가 DNA임을 특징으로 하는 분리된 핵산분자.
제1항에 있어서, 상기 핵산분자가 cDNA임을 특징으로 하는 분리된 핵산분자.
제1항에 있어서, 상기 핵산분자가 RNA의 대응 서열을 함유함을 특징으로 하는 분리된 핵산분자.
미분화된 조혈세포에서는 발현되나 성숙한 조혈세포에서는 발현되지 않는 수용체 단백질 티로신 키나아제인 flk-1을 암호화하고 있는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
미분화된 조혈세포에서는 발현되나 성숙한 조혈세포에서는 발현되지 않으며, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵산분자의 서열에 의해 암호화되는 분리된 단백질 티로신 키나아제.
도 2에 나타난 서열을 포함하는 단백질 티로신 키나아제인 flk-1의 세포외 부분을 에피토프로 하여 발생하는 분리된 항체.
제7항에 있어서, 상기 flk-1이 쥐의 flk-1인 항체.
제7항에 있어서, 상기 항체가 단클론성인 항체.