KR100400638B1 - Method for separating variants of recombinant human growth hormone - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 인간 성장호르몬(hGH)의 제조에 있어서, hGH의 변형체 또는 유사체를 효과적으로 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 산업적 대량 생산 규모에 적용가능한 소입자 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체를 사용하고 생체적합성 완충용액을 사용함으로써, 탈아미드 형태 또는 N-아세틸메티오닌 형태 등과 같은 hGH 유사체를 효과적으로 분리·제거하여 정상적인 구조를 갖는 hGH를 회수할 수 있다.The present invention relates to a method for effectively separating a variant or analog of hGH in the production of recombinant human growth hormone (hGH). In the present invention, by using a small particle anion exchange chromatography gel medium applicable to an industrial mass production scale and using a biocompatible buffer, it is possible to effectively separate and remove hGH analogues such as deamide form or N-acetylmethionine form to remove the normal structure. HGH can be recovered.
Description
본 발명은 재조합 인간 성장호르몬(human growth hormone; 이하, "hGH"라 한다)의 제조에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 재조합 hGH의 제조에 있어서, 소입자 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체(gel matrix)를 사용하여 hGH의 정상체(normal forms)로부터 hGH의 변형체 또는 유사체(variants or relatedproteins)를 대량의 산업적 규모로 분리·제거하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to the production of recombinant human growth hormone (hereinafter referred to as "hGH"). More specifically, in the production of recombinant hGH, the present invention uses a small particle anion exchange chromatography gel medium to mass produce variants or related proteins of hGH from normal forms of hGH. To remove and remove on an industrial scale.
hGH는 사람의 뇌하수체에서 분비된다. 완전한(mature) 형태의 hGH는 191 개의 아미노산으로 구성되며 약 22,000의 분자량을 갖는다. 이 호르몬은 2 개의 디설파이드 결합을 포함하는 선형의 폴리펩타이드이다. 재조합 DNA 기술이 발달하기 전에는 죽은 사람의 뇌하수체로부터의 추출을 통해서만 hGH를 소량으로 얻을 수 있었다. 따라서, hGH는 뇌하수체로부터 기인한 왜소증(hypopituitary dwarfism)의 치료에 제한적으로 이용되어 왔다. 게다가, 뇌하수체 유래의 hGH를 접종받은 어린이중 4 명이 바이러스에 감염되어 사망한 것으로 보고됨에 따라 미국 식품의약국에서 이의 사용을 금지시켰다(Science, 234, 22, 1986).hGH is secreted by the human pituitary gland. The full form of hGH consists of 191 amino acids and has a molecular weight of about 22,000. This hormone is a linear polypeptide that contains two disulfide bonds. Prior to the development of recombinant DNA technology, small amounts of hGH could be obtained only by extraction from the pituitary gland of the dead. Thus, hGH has been limitedly used in the treatment of hypopoptuitary dwarfism resulting from the pituitary gland. In addition, the US Food and Drug Administration banned its use as four of the children receiving hGH from pituitary gland were reported infected with the virus (Science, 234, 22, 1986).
최근에는 유전공학 기술을 이용하여 대장균 및 효모에서 hGH를 발현 및 분리·정제하여 임상에 이용하고 있다(대장균; 대한민국 특허공고 제89-1244호 및 제87-701호, 및 특허공개 제87-2258호 및 제84-8695호, 효모; 대한민국 특허공고 제92-99호, 및 특허공개 제90-9973호 및 제90-9976호). 그러나, 재조합 DNA 기술에 의해 hGH를 생산하는 경우, hGH의 정상적인 아미노산 서열과는 다른, 변형된 구조가 번역후 변형(post-translational modification)이나 화학적 분해(degradation)의 산물로서 생성되며 이들에 대한 분석법들이 보고되었다(Acta Padiatr. Scand 370, 93-100, 1990; Anal. Chem. 68, 4044, 1996; Int. J. Peptide Protein Res. 44, 215-222, 1994; Eur. J. Biochem. 219, 365-373, 1994; J. Chromatogr, 435, 307-318, 1988; Bioseparation, 3, 257-265, 1993; Anal. Biochem. 167, 199-209, 1987; Biotechnol. Appl. Biochem. 10, 326-337, 1988; J.Chromatogr. 625, 207-215, 1992; J. Biol. Chem. 264, 14262-14271, 1989). 이러한 hGH의 변형체로는 탈아미드 형태(deamidated form or desamido form) 및 산화 형태(oxidized form)가 존재하는 것이 보고되었다. 또한, 효모로부터 재조합 hGH를 생산하는 경우, N-아세틸메티오닌 형태(N-acetyl met-hGH form)가 번역후 변형에 의해 생성되어 정상적인 형태와 공존하는 것으로 밝혀졌다.Recently, hGH is expressed, isolated and purified from E. coli and yeast using genetic engineering technology (E. coli; Korean Patent Publication Nos. 89-1244 and 87-701, and Patent Publication No. 87-2258). And 84-8695, Yeast; Korean Patent Publication Nos. 92-99, and Patent Publication Nos. 90-9973 and 90-9976). However, when producing hGH by recombinant DNA techniques, a modified structure, which is different from the normal amino acid sequence of hGH, is produced as a product of post-translational modification or chemical degradation and assays for them. (Acta Padiatr. Scand 370, 93-100, 1990; Anal. Chem. 68, 4044, 1996; Int. J. Peptide Protein Res. 44, 215-222, 1994; Eur. J. Biochem. 219, 365-373, 1994; J. Chromatogr, 435, 307-318, 1988; Bioseparation, 3, 257-265, 1993; Anal. Biochem. 167, 199-209, 1987; Biotechnol. Appl. Biochem. 10, 326- 337, 1988; J. Chromatogr. 625, 207-215, 1992; J. Biol. Chem. 264, 14262-14271, 1989). Variants of such hGH have been reported to exist in deamidated form or desamido form and oxidized form. In addition, when producing recombinant hGH from yeast, it has been found that the N-acetyl methionine form (N-acetyl met-hGH form) is produced by post-translational modification and coexists with the normal form.
hGH의 변형체들은 정상적인 형태와 비교하여 특정한 아미노산 잔기에서 변형이 일어나고 나머지 부분은 동일하기 때문에 분자의 물리화학적 성질은 거의 동일하다. 그러므로, 이를 효과적으로 제거하는 것은 hGH 제품의 품질을 결정하는 중요한 요소중의 하나이다. 유럽약전(European Pharmacopoeia) 및 미국약전 초록 (USP Preview) 등에서도 유사체의 함량을 품질관리의 중요한 요소로 규정하고 있다. 따라서, 의약용 hGH의 제조시에는 변형체를 정상적인 형태로부터 효과적으로 제거하는 것이 필수적이다.Variants of hGH have almost identical physicochemical properties because the modifications take place at specific amino acid residues compared to their normal form and the remainder are identical. Therefore, removing it effectively is one of the important factors that determine the quality of hGH products. The European Pharmacopoeia and the USP Preview also define the content of analogs as an important component of quality control. Therefore, it is essential to effectively remove the variant from its normal form in the preparation of the medicinal hGH.
특히, 탈아미드 형태는 hGH의 제조과정뿐만 아니라 hGH의 보관중에도 쉽게 생성되는 유사체이다. 따라서, 탈아미드 형태를 분리하는 방법은 hGH의 분석법으로 사용될 수 있을뿐 아니라, 최소한의 수율 손실을 통해 이 유사체를 제거하는 방법으로 사용될 수 있다. 결국, 이러한 유사체의 효과적인 제거방법은 hGH의 품질향상과 생산량 증대에 기여할 수 있다.In particular, the deamide form is an analog that is readily produced during the manufacture of hGH as well as during storage of hGH. Thus, the method of separating the deamide form can be used not only for the analysis of hGH but also for removing this analogue with minimal loss of yield. As a result, effective removal of these analogues can contribute to the improvement of the quality and production of hGH.
정상적인 hGH와 변형체를 분리하여 분석하는 크로마토그래피 방법들은 지금까지 여러 문헌들에서 보고된 바 있다. 그러나, 분석방법으로 사용되는 크로마토그래피법은 대부분 유기용매를 전개액으로 사용하고, 극소량의 단백질만이 적용될수 있는 고가의, 미리 충진된 분석용 HPLC 칼럼을 사용하므로, 유기용매의 안전성에 대한 우려가 따르고 산업적 대량 생산 규모에서 적용하기가 불가능하다. 따라서, 스케일-업(scale-up)이 용이한 겔을 사용하고 수용액상에서 완충용액의 조성을 조절하여 변형체를 효과적으로 제거하는 방법을 개발하는 것이 제품 생산에 있어서 필요하다.Chromatographic methods for separating and analyzing normal hGH and variants have been reported in many literatures. However, most of the chromatographic methods used as analytical methods use organic solvents as development solutions, and use expensive, pre-filled analytical HPLC columns to which only a small amount of protein can be applied. And is not applicable on industrial mass production scale. Therefore, there is a need in the production of a product that uses a gel that is easy to scale up and develops a method for effectively removing the deformable substance by adjusting the composition of the buffer solution in an aqueous solution.
예를들면, 대한민국 특허공고 제96-3548호는 불용성 봉입체로부터 모노머성 hGH를 분리하는 방법을 보고하고 있다. 카나오카(Kanaoka) 등은 소수성기를 갖는 수불용성 담체를 이용하여 hGH를 분리하는 방법을 보고하고 있다(미국특허 제4,332,717호). 또한, 나가토미(Nagatomi) 등은 청색 색소가 결합된 담체를 이용하여 hGH를 정제하는 방법을 기술하고 있고(미국특허 제5,760,187호), 그리난(Grinnan) 등은 역상 대공성 아크릴레이트 에스테르 코폴리머에서 유기용매를 포함하는 전개액을 사용하여 hGH의 유사체를 분리하는 방법을 보고하기도 하였다(대한민국 특허공고 제89-1244호, 미국특허 제4,612,367호). 또한, 헥트(Hecht) 등은 음이온 교환 수지와 등전위 초점 칼럼을 사용한 뇌하수체 후엽 호르몬의 정제방법을 보고한 바 있다(미국특허 제4371462호).For example, Korean Patent Publication No. 96-3548 reports a method for separating monomeric hGH from an insoluble inclusion body. Kanaoka et al. Report a method for separating hGH using a water-insoluble carrier having a hydrophobic group (US Pat. No. 4,332,717). In addition, Nagatomi et al. Describe a method for purifying hGH using a carrier in which a blue pigment is bound (US Pat. No. 5,760,187), and Grinnan et al. Show a reversed phase porosity acrylate ester copolymer. In addition, a method of separating an analogue of hGH using a developing solution containing an organic solvent has been reported (Korean Patent Publication No. 89-1244, US Patent No. 4,612,367). Hecht et al. Also reported a method for purifying the pituitary lobe hormone using an anion exchange resin and an equipotential focal column (US Patent No. 4371462).
특히, 대한민국 특허공고 제99-194002호는 hGH의 변형체를 수용액상에서 분리하는 방법을 제시하고 있다. 이 방법에 따르면, 산업적 이용을 위한 크로마토그래피 담체로서 평균 입자크기가 50 ㎛ 이상인 대입자 겔 매체를 사용하고 있다. 그러나, 이와 같이 입자가 큰 겔 매체를 사용하는 경우에는 재조합 hGH의 유사체를 효과적으로 분리·제거하는데 많은 어려움이 따르는 것으로 밝혀졌다.In particular, Korean Patent Publication No. 99-194002 discloses a method for separating a variant of hGH in an aqueous solution. According to this method, a large particle gel medium having an average particle size of 50 µm or more is used as a chromatography carrier for industrial use. However, it has been found that there is a lot of difficulty in effectively separating and removing analogues of recombinant hGH when using such a large particle gel medium.
상기한 바와 같이, hGH의 제조에 있어서 다수의 정제방법이 보고되기는 하였지만, 이들 대부분은 다른 불순 단백질로부터 hGH를 회수 또는 정제하는 방법에 관한 것에 불과하고 구체적으로 hGH의 정상체와 유사체를 분리하는 방법을 제시하지 못하고 있다. 또한, 상기 미국특허 제4,612,367호는 유기용매를 사용하는 역상 크로마토그래피 방법을 제시한 바 있고 과학적 논문들에는 hGH의 유사체를 분리·분석하는 방법들이 다수 보고되어 있지만, 이러한 방법들은 모두 HPLC 칼럼에 의존하고 유기용매를 사용하는 방법이다. 게다가, 상기 대한민국 특허공고 제99-194002호는 hGH의 변형체를 수용액상에서 분리하는 방법을 제시한 바 있으나, 이 또한 산업적 규모에서 hGH의 유사체를 효과적으로 분리할 수 없었다. 따라서, 수용액상에서 개폐식 칼럼을 사용하여 산업적 규모로 hGH의 유사체를 분리하는 방법은 지금까지 전혀 보고된 바 없다.As mentioned above, although a number of purification methods have been reported in the preparation of hGH, most of them are only related to a method for recovering or purifying hGH from other impure proteins, and in particular, a method for separating a normal from an analog of hGH. Has not been presented. In addition, U.S. Patent No. 4,612,367 proposed a reverse phase chromatography method using an organic solvent, and scientific papers have reported a number of methods for separating and analyzing analogs of hGH, but all these methods depend on HPLC columns. And an organic solvent. In addition, the Korean Patent Publication No. 99-194002 discloses a method of separating the hGH variant in an aqueous solution, but this also could not effectively separate the analogue of hGH on an industrial scale. Thus, no method of separating analogs of hGH on an industrial scale using closed columns in aqueous solution has been reported at all.
본 발명의 목적은 재조합 hGH의 제조에 있어서, hGH의 변형체 또는 유사체를 hGH의 정상체로부터 대량의 산업적 규모에서 효과적으로 분리·제거하는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for effectively separating and removing variants or analogs of hGH from the normal of hGH on a large industrial scale in the production of recombinant hGH.
도 1은 대입자 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체인 DEAE-세파로스 FF와 트리스 완충용액을 사용하여 hGH의 정상체와 유사체를 분리한 결과를 나타내는 크로마토그램;1 is a chromatogram showing the result of separating the normal and the analog of hGH using DEAE-Sepharose FF and Tris buffer solution, which are large-particle anion exchange chromatography gel medium;
도 2는 소입자 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체를 사용하여 hGH의 정상체와 탈아미드 형태의 hGH 유사체를 분리한 결과를 나타내는 크로마토그램; 및FIG. 2 is a chromatogram showing the results of separating normal and deamide hGH analogues of hGH using small particle anion exchange chromatography gel media; FIG. And
도 3은 소입자 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체와, 히스티딘 및 요소를 함유하는 완충용액을 사용하여 hGH의 정상체와 탈아미드 형태 및 N-아세틸메티오닌 형태의 hGH 유사체를 동시에 분리한 결과를 나타내는 크로마토그램.Fig. 3 is a chromatogram showing the results of simultaneous separation of hGH analogues from hGH analogues and deamide form and N-acetylmethionine form using small particle anion exchange chromatography gel medium and a buffer containing histidine and urea. .
본 발명은 개폐식 칼럼용 겔 매체로서 평균 입자크기가 50 ㎛ 미만인 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체를 사용하고, pH 5∼9의 완충용액에서 염화나트륨 농도구배로 용출시키는 칼럼 크로마토그래피를 수행하여, hGH의 유사체를 분리하는 방법을 제공한다.The present invention uses an anion exchange chromatography gel medium having an average particle size of less than 50 μm as a gel medium for a gate column, and performs column chromatography eluting with a sodium chloride concentration gradient in a buffer solution of pH 5-9 to obtain analogs of hGH. Provides a way to separate.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체는 리간드로서 DEAE(dihydroxyethylaminoethyl) 또는 Q(Quaternary ammonium)가 결합된 것이 바람직하다. 또한, 평균 입자크기가 20∼40 ㎛인 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체를 사용하는 것이 바람직하며, 특히 소스 30Q(Source 30Q), Q-세파로스 HP(Q-Sepharose HP) 또는 매크로프랩-25Q(Macroprep-25Q)로부터 선택되는 단백질 정제용 겔 매체인 것이 바람직하다. 한편, 완충용액으로서 트리스(Tris), 인산(phosphate), 히스티딘(histidine), 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate) 또는 시트레이트(citrate)를 포함하는 것을 사용하는 것이 바람직하며, 추가로 요소(urea)를 포함하는 것을 사용하는 것이 바람직하다.In the method according to the present invention, it is preferable that the anion exchange chromatography gel medium is bound with a dihydroxyethylaminoethyl (DEAE) or quaternary ammonium (Q) as a ligand. In addition, it is preferable to use an anion exchange chromatography gel medium having an average particle size of 20 to 40 μm, in particular, Source 30Q, Q-Sepharose HP or Macroprep-25Q. -25Q) is preferably a gel medium for protein purification. On the other hand, it is preferable to use a tris, phosphate, histidine, ammonium bicarbonate or citrate as a buffer solution, and further urea It is preferable to use what contains.
본 발명에 있어서, 유사체는 탈아미드 형태, 산화 형태 또는 N-아세틸메티오닌 형태일 수 있다.In the present invention, the analog may be in deamide form, oxidized form or N-acetylmethionine form.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 hGH의 정상체와 hGH의 유사체, 특히, 탈아미드 형태 또는 N-아세틸메티오닌 형태를 효과적으로 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 산업적 규모에서 적용가능한 개폐식 칼럼 크로마토그래피를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 인체에 유해한 유기용매를 사용하지 않고 수용액 상태의 완충용액을 사용하여 hGH의 유사체를 분리하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for effectively separating the normal of hGH and the analogue of hGH, in particular the deamide form or the N-acetylmethionine form. The present invention provides a method of using closed column chromatography applicable at industrial scale. In addition, the present invention provides a method for separating analogs of hGH using a buffer solution in an aqueous state without using an organic solvent harmful to the human body.
본 발명에서는 칼럼 크로마토그래피 겔 매체로서 음이온 교환 (anion-exchange) 수지를 사용한다. 보다 바람직하게는, 리간드로서 DEAE 또는 Q를 포함하는 음이온 교환 수지를 사용한다. 본 발명에서는 수용성 완충용액으로서 수소이온 농도를 5∼9 범위에서 조절하기에 적절한 완충용액 성분을 사용한다. 보다 바람직하게는, 트리스, 히스티딘, 인산, 암모늄 바이카보네이트 또는 시트레이트를 포함하는 완충용액을 사용한다.In the present invention, anion-exchange resin is used as the column chromatography gel medium. More preferably, an anion exchange resin containing DEAE or Q is used as the ligand. In the present invention, a buffer component suitable for controlling hydrogen ion concentration in the range of 5 to 9 is used as an aqueous buffer solution. More preferably, a buffer containing tris, histidine, phosphoric acid, ammonium bicarbonate or citrate is used.
본 발명에서는 hGH 유사체의 선택적 분리능(selectivity: 정상체와 유사체가 혼재하지 않고 선택적으로 분리되는 정도)을 증대시키기 위하여 완충용액내에 생체적합성 첨가물질을 포함시킬 수 있다. 보다 바람직하게는, 요소 또는 에탄올을 적절한 함량으로 완충용액에 혼합하여 사용한다.In the present invention, a biocompatible additive may be included in the buffer solution to increase the selective resolution of the hGH analogue (selectivity: the degree to which the normal and analogues are not mixed and selectively separated). More preferably, urea or ethanol is mixed and used in a buffer in an appropriate amount.
본 발명에서는 크로마토그래피 방법으로 낮은 염농도의 완충용액에서 hGH 정상체와 유사체를 포함하는 혼합물을 결합시키고 염농도를 점차 증가시키는 농도 구배에 의해 정상체와 유사체가 분리되도록 한다.In the present invention, the chromatographic method combines the mixture containing the hGH normal and the analog in a low salt buffer and allows the normal and the analog to be separated by a concentration gradient that gradually increases the salt concentration.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these Examples are only for the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these Examples.
비교예: 대입자 음이온 교환 크로마토그래피 겔 매체와 다양한 완충용액을 사용한 hGH 유사체의 분리Comparative Example: Separation of hGH analogues using large particle anion exchange chromatography gel media and various buffer solutions
본 비교예에서는 비교적 가격이 저렴한 음이온 크로마토그래피 매체로서 DEAE-세파로스 FF(파마시아(Pharmacia) 제품), Q-세파로스 FF(파마시아 제품), 매크로프랩-DEAE(바이오래드(Bio-Rad) 제품)를 사용하여 다양한 완충용액 조건에서칼럼 크로마토그래피를 수행하여 hGH의 정상체와 유사체의 분리를 비교하였다. hGH 시료로는 유트로핀((주)엘지화학)의 제조공정을 실험실 규모에서 적용하여 유사체가 다량으로 포함된 시료를 중간단계에서 회수하여 사용하였다. 이 시료는 약 15% 이상의 유사체를 포함하고 있었다. 정상체와 유사체의 분리정도에 대한 기준은 크로마토그래피상에서 피크가 분리되는 정도를 통하여 파악하였다. 하기 표 1에 유사체와 정상체를 적절히 분리하기 위하여 시도된 조건들을 열거하였다.In this comparative example, DEAE-Sepharose FF (Pharmacia), Q-Sepharose FF (Pharmacia), Macroprep-DEAE (Bio-Rad) as a relatively inexpensive anion chromatography medium Column chromatography was performed at various buffer conditions using to compare the separation of analogs from normals of hGH. As a hGH sample, the production process of Eutropin (LG Chem. Co., Ltd.) was applied at a laboratory scale, and a sample containing a large amount of an analog was recovered and used in an intermediate step. This sample contained more than about 15% analogs. Criteria for the separation of normals and analogs were determined by the degree of separation of peaks on chromatography. Table 1 below lists the conditions attempted to properly separate analogs and normals.
그 결과, 시도된 어떠한 조건하에서도 정상체와 유사체는 분리되지 않았다. 따라서, 입자가 큰 겔 매체를 사용한 경우에는 어떠한 완충요액 조건을 적용하더라도 유사체를 제거하기 어려운 것으로 판단되었다. 일례로서, 도 1은 DEAE-세파로스 FF에서 트리스 완충용액 조건하에서의 크로마토그램을 나타낸다.As a result, normals and analogs did not separate under any conditions attempted. Therefore, it was judged that the analogs were difficult to remove under any buffer conditions when large gel media were used. As an example, Figure 1 shows a chromatogram under Tris buffer conditions in DEAE-Sepharose FF.
따라서, 하기 실시예에서는 입자크기가 비교적 작은 크로마토그래피 매체를사용하여 정상체와 유사체의 분리를 시도하였다.Thus, in the following examples, separation of normals and analogs was attempted using chromatography media with relatively small particle sizes.
실시예 1: 소입자 음이온 크로마토그래피 겔 매체를 사용한 탈아미드 유사체의 분리Example 1 Isolation of Deamide Analogues Using Small Particle Anion Chromatography Gel Media
hGH의 정상체와 유사체간의 분리능을 향상시키기 위하여 입자크기가 작은 크로마토그래피 매체를 사용하였다. 여기서 사용한 매체는 고가의 HPLC용이 아니라 대량 구입가능하고 개폐식 칼럼에 적용이 가능한 것들이었다. 하기 표 2에 사용한 매체 및 완충용액의 조건들을 요약하였다.Small particle size chromatography media were used to improve the resolution between normal and analogues of hGH. The media used here were not for expensive HPLC but were available in large quantities and applicable to closed columns. The conditions of the medium and buffer used in Table 2 below are summarized.
소입자 매체를 적용한 경우, 비교예에 비하여 유사체의 분리능(resolution)이 크게 향상되어 정상체와 유사체가 약간은 겹치지만 분리된 피크의 형태로 나타났다. 또한, 크로마토그램상의 시료들을 일정한 간격으로 HPLC로 재분석하여 정상체와 유사체의 상대적인 비율을 확인하고 최종적으로 정상체와 유사체의 선택적 분리능을 비교하였다.When the small particle medium was applied, the resolution of the analogue was greatly improved compared to the comparative example, and the normal and the analog appeared to be in the form of separated peaks although they slightly overlapped. In addition, samples on the chromatogram were re-analyzed by HPLC at regular intervals to confirm the relative ratios of normals and analogs, and finally the selective resolution of normals and analogs was compared.
도 2는 트리스 완충용액 조건에서 수행한 크로마토그래피 양상을 나타낸 것이다. 도 2에서 화살표는 유사체가 포함되지 않은 정상적인 hGH만을 포함하는 구간을 나타낸다. 본 실시예에서는 hGH의 정상체와 탈아미드 유사체의 분리에 중점을 두었고 분리 정도를 확인하는 방법으로는 DEAE-HPLC 분석법을 사용하였다. 그 결과, 소입자 음이온 겔 매체를 사용한 경우 크로마토그램은 모두 비슷하게 우수한 분리능을 나타내었다. 그러나, 각 크로마토그램상의 시료 성분을 분석하였을때 매크로프랩-25Q가 약간 더 우수한 선택적 분리능을 보였다.Figure 2 shows the chromatography pattern performed in Tris buffer conditions. In FIG. 2, the arrow indicates a section including only normal hGH without an analog. In this example, the emphasis was on the separation of normal and deamide analogues of hGH, and DEAE-HPLC method was used to confirm the degree of separation. As a result, when small particle anion gel media were used, the chromatograms all showed similarly good resolution. However, when analyzing the sample components on each chromatogram, Macroprep-25Q showed slightly better selective resolution.
본 실시예에서는 약 50 ㎖의 겔 매체를 개폐식 칼럼에 충진하여 수소 이온농도를 중성 이상으로 유지하는 트리스 완충용액을 사용하였을 때, 탈아미드 유사체가 hGH의 정상체와 효과적으로 분리·제거될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기 조건에서는 N-아세틸메티오닌 유사체를 정상체로부터 제거하기에는 다소 분리능이 떨어지는 것으로 나타났다.In this example, when a Tris buffer solution containing about 50 ml of gel medium in a closed column is used to maintain the hydrogen ion concentration above neutral, deamide analogues can be effectively separated and removed from the normal of hGH. Turned out. However, under these conditions, N-acetylmethionine analogs appeared to be somewhat poorly resolved to remove from normal.
실시예 2: 매크로프랩-25Q를 사용한 탈아미드 유사체 및 N-아세틸메티오닌 유사체의 분리Example 2: Isolation of Deamide Analogue and N-Acetylmethionine Analogue Using Macroprep-25Q
본 실시예에서는 매크로프랩-25Q를 사용하였고 히스티딘과 요소를 함유하는 완충용액내에서 염화나트륨 농도구배에 의해 hGH의 정상체와 탈아미드 유사체 및 N-아세틸메티오닌 형태의 유사체를 동시에 분리하였다. 구체적으로는, 약 250 ㎖의 겔 매체를 개폐식 칼럼에 충진하여 완충용액으로 0.5 M 요소를 포함하는 히스티딘 10 mM(pH 5.7)을 사용하였고 단백질의 용출을 위하여 0에서 50 mM까지의 염화나트륨 농도구배를 적용하였다. 본 실시예에서는 hGH의 산업적인 생산과정에서 유래한 시료를 직접 사용하였고 산업적인 생산 규모의 약 1/50 규모에서 수행되었다.In this example, macroprep-25Q was used and the normal and deamide analogues of hGH and analogues of N-acetylmethionine form were simultaneously separated by sodium chloride concentration gradient in buffer containing histidine and urea. Specifically, about 250 ml of gel medium was filled in a closed column, using a histidine 10 mM (pH 5.7) containing 0.5 M urea as a buffer solution, and a sodium chloride concentration gradient of 0 to 50 mM was used to elute the protein. Applied. In this example, samples derived from the industrial production of hGH were used directly and performed at about 1/50 of the industrial production scale.
결과로 나타난 크로마토그램에서 각 구획 시료들의 조성을 RP-HPLC 방법으로 분석해본 결과, 주 피크의 대부분은 순수하게 정상체만을 포함하고 있었다. 또한, hGH가 침전되거나 변형되지 않는 범위에서 실험 조건을 약간 변경하였을 경우(pH의 변경, 히스티딘 농도의 변경, 요소 농도의 변경 등)에도 비슷한 결과를 나타내었다.In the resulting chromatogram, the composition of each compartment sample was analyzed by the RP-HPLC method. As a result, most of the main peaks were purely pure. In addition, when the experimental conditions were slightly changed (change of pH, change of histidine concentration, change of urea concentration, etc.) in the range where hGH was not precipitated or modified, similar results were shown.
도 3에서는 유트로핀의 제조공정에서 준비된 시료를 적용하여 탈아미드 형태들뿐만 아니라 N-아세틸메티오닌 형태의 유사체들을 동시에 제거한 결과를 나타내었다. RP-HPLC 분석에서 정상체의 순도가 약 100.0%에 근접하는 구간을 화살표로 표시하였다.Figure 3 shows the results of removing the analogs of the N- acetylmethionine form as well as the deamide form by applying the sample prepared in the production process of eutropin. In the RP-HPLC analysis, a section in which the purity of the normal body approaches about 100.0% is indicated by an arrow.
본 발명에 따르면, 재조합 hGH를 제조하는 과정에서, hGH의 유사체, 특히, 탈아미드 형태뿐만 아니라 N-아세틸메티오닌 형태의 유사체를 효과적으로 분리하여 제거할 수 있고, 그 결과 hGH 제품의 품질 향상과 생산량 증대에 기여할 수 있다. 본 발명에 따른 hGH의 분리방법은 개폐식 칼럼을 사용할 수 있고 산업적 규모로 공급가능한 겔 매체를 사용하므로 산업적 규모에 직접 적용할 수 있다.According to the present invention, in the process of producing a recombinant hGH, it is possible to effectively isolate and remove analogs of hGH, in particular N-acetylmethionine form as well as deamide form, resulting in improved quality and yield of hGH products Can contribute to The separation method of hGH according to the present invention can be applied directly to the industrial scale because it can use a retractable column and using a gel medium that can be supplied on an industrial scale.
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