KR840001516B1 - Process for preparing human fibroblast interferon - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 친화 크로마토그라피와 고압액체 크로마토그라피(HPLC)법을 사용하여 균질한 단백질 상태의 인체 섬유아세포 인터페론을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing human fibroblast interferon in homogeneous protein state using affinity chromatography and high pressure liquid chromatography (HPLC).
아이작 및 린덴만(Isaacs 및 Lindenmann)에 의해 1957년 인터페론이 처음 발견된 이래로, 백혈구 또는 섬유아세포형을 불문하고, 인터페론의 생물학적 특성 및 화학적 특성을 확인하기에 충분한 양만큼 균질한 펩티드로 인터페론을 분리하기 위하여, 전 세계의 과학자들이 20년 이상에 걸쳐 시도하였음에도 불구하고 인터페론을 균질펩티드로서 분리하는데 실패하였다. 몇몇 학자가 마우스 또는 인체 인터페론을 균질성물질로 정제하였다고 주장하였으나, 단백물질의 균질성은 입증되지 않았으며, 주장하는 바대로 순수한 화합물로서의 특성은 기술되어 있지 않다.Since interferon was first discovered in 1957 by Isaac and Lindenmann, regardless of leukocytes or fibroblast types, the interferon is isolated into homogeneous peptides in amounts sufficient to confirm the biological and chemical properties of the interferon. In order to do so, scientists all over the world have failed to isolate interferon as a homologous peptide, despite attempts over 20 years. Several scholars have claimed that mouse or human interferon has been purified to homogeneity, but the homogeneity of the protein has not been demonstrated and, as claimed, the properties as pure compounds have not been described.
단백질 정제를 위한 고성능 액체 크로마토그라피의 사용은 선행기술에서 잘 알려진 방법이다. 문헌에는 단백질정제에 관한 이온교환 및 입자분리형 컬럼(size exclusion type columns)에 대해 기술되어 있고(예 : Regnier and Noel, J. Chromatog. Sci. 14, 316 [1976] and Chang et al., Anal. Biochem. 48, 1839 [1976]), 또한 역상분배 크로마토그라피(Reverse phase Partition Chromatograpy)를 수행함에 있어서, Lichrosorb RP-18(옥타데실형 실리카 미립자컬럼)을 사용하여 β-엔도르핀과 같은 펩티드를 성공적으로 정제하였음이 기술되어 있다. (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4969 [1977]).The use of high performance liquid chromatography for protein purification is a well known method in the prior art. The literature describes ion exchange and size exclusion type columns for protein purification (eg Regnier and Noel, J. Chromatog. Sci. 14, 316 [1976] and Chang et al., Anal. Biochem. 48, 1839 [1976]), and also in the case of reverse phase partition chromatography, Lichrosorb RP-18 (octadecyl silica fine particle column) was used to successfully obtain peptides such as β-endorphin. Purification is described. (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4969 [1977]).
선행기술에서 인체 섬유아세포 인터페론을 정제하는 조작단계로서 친화크로마토그라피를 사용할 수 있음이 기술되어 있다. 데이비 등은 정제된 인체섬유아세포 인터페론을 제조하기 위한 콘카나발린 A-세파로즈 4B(Concanavalin A-Sepharose 4B) 친화크로마토그라피의 사용을 기술하고 있으며 [Davey et al., J. Biol. chem. 251, 7620 (1976)], 잔코스키 등이 이와 동일한 목적을 위해 블루덱스트란-세파로즈(Blue Dextran-Sepharose)를 사용함을 기술하고 있다. [Jankowski et al., Biochemistry 15, 5182 (1976)] 끝으로 미합중국 특허 제4,172,071호(de Maeyer 등)에 따르면, 백혈구 및 섬유아세포 인터페론 조(粗) 용액의 정제는 블루덱스트란-세파로즈 컬럼을 사용한 친화 크로마토그라피법으로 수행함으로써 1 내지 5×108인터페론 국제단위의 활성을 갖는 제재를 제조하였음이 기술되어 있다. 이 밖의 정제단계가 기술되어 있지 않으며, 수득된 인터페론 제제는 오염된 단백질을 거의 함유하지 않고, 인터페론형 활성을 갖는 고농도 생성물을 함유하고 있음을 기술하고 있다.It has been described in the prior art that affinity chromatography can be used as a manipulation step to purify human fibroblast interferon. Davy et al. Describe the use of Concanavalin A-Sepharose 4B affinity chromatography to prepare purified human fibroblast interferon and described by Davey et al., J. Biol. chem. 251, 7620 (1976), Zankoski et al. Describe the use of Blue Dextran-Sepharose for this same purpose. [Jankowski et al., Biochemistry 15, 5182 (1976)] Finally, according to US Pat. No. 4,172,071 (de Maeyer et al.), Purification of leukocyte and fibroblast interferon crude solution was performed on a bluedextran-sepharose column. It is described that preparations having activities of 1 to 5 × 10 8 interferon international units were prepared by performing by the affinity chromatography used. No other purification steps have been described, and the resulting interferon preparations contain little contaminated protein and contain high concentration products with interferonic activity.
본 발명의 개선된 제법은 친화 크로마토그라피와 고압액체 크로마토그라피 단계를 결합시킴으로서 인체 섬유아세포 인터페론을 효과적으로 정제할 수 있게 하였다.The improved formulation of the present invention allows for efficient purification of human fibroblast interferon by combining affinity chromatography and high pressure liquid chromatography steps.
특히 본 발명 제법은 다음의 단계를 조합한 것이다 :In particular, the inventive method combines the following steps:
A. 불순한 상태의 인체섬유아세포 인터페론 수용액을 친화 크로마토그라피 컬럼에 통과시켜 인터페론을 컬럼에 흡착시킨 후 컬럼으로부터 인터페론을 용출시켜 순도가 증가된 상태의 인터페론을 함유하는 용출물의 특정분획을 수득하고 ;A. Impure human fibroblast interferon aqueous solution is passed through an affinity chromatography column to adsorb the interferon to the column, and then the interferon is eluted from the column to obtain a specific fraction of the eluate containing the interferon of increased purity;
B. 수득된 인터페론 분획을 고압액체 크로마토그라피 조건하에서 1가지 이상의 완충액으로 평형된 탄화수소 결합성 실티카 매트릭스컬럼(여기에서 탄화수소는 사이클로헥실, 페닐, 디페닐, 옥틸, 옥타데실 및 시아노 프로필 중에서 선택된다)에 통과시켜 인터페론을 컬럼에 흡착시킨 후, 수혼화성 용매의 산성수성 완충화혼합물 구배를 사용하여 인터페론을 컬럼으로부터 용출시키고, 수득한 용출물 중 특정분획에서 1개의 특정피이크로서 균질한 단백질 상태의 인터페론을 수득한다.B. The obtained interferon fraction is a hydrocarbon-bonded siltica matrix column equilibrated with one or more buffers under high pressure liquid chromatography conditions, wherein the hydrocarbon is selected from cyclohexyl, phenyl, diphenyl, octyl, octadecyl and cyano propyl. Interferon is adsorbed on the column, and the interferon is eluted from the column using an acidic aqueous buffered mixture gradient of water-miscible solvent, and the homogeneous protein state as one specific peak in a specific fraction of the eluate obtained. To obtain interferon.
본 발명에 따른 친화 크로마토그라피 공정에서 콘카나발린 A-세파로즈 4B 또는 블루덱스트린-세파로즈가 사용될 수 있으며, 콘카나발틴 A-세파로즈 4B 공정보다 아주 높은 수율과 또한 더 안정한 생성물을 제공한다는 점에서 블루 덱스트란-세파로즈를 사용하는 것이 더 바람직하다.Concanavalin A-Sepharose 4B or Bluedextrin-Sepharose can be used in the affinity chromatography process according to the present invention, providing a much higher yield and also a more stable product than the Concanabaltin A-Sepharose 4B process. More preferably using blue dextran-sepharose.
콘카나발린 A-세파로즈 4B 공정은 다음과 같은 방법으로 수행할 수 있다 :The Concanavalin A-Sepharose 4B process can be performed in the following manner:
(a) 이글즈(Eagle's)의 최저 필수매질을 함유하는 5% 태생송아지 혈청중의 컬럼의 20 내지 30배 부피의 인체 조(粗) 섬유아세포인터페론(고유활성 약 104단위/㎎)을 30 내지 60㎝/시간의 유속으로 콘카나발린 A-세파토즈 4B 컬럼에 펌핑하고(a) 20 to 30 times the volume of human crude fibroblast interferon (highly active about 10 4 units / mg) of the column in 5% native calf serum containing Eagle's lowest essential medium Pumped into a Concanavalin A-Sephatose 4B column at a flow rate of from 60 cm / hour
(b) pH 7.2의 인산염 완충화염수(PBS)로 세척하며,(b) washed with phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.2,
(c) PBS-0.1M α-메틸 만노시드(α-MM)로써 세척하고,(c) washed with PBS-0.1M α-methyl mannoside (α-MM),
(d) 50% 에틸렌글리콜을 함유하는 PBS-0.1M α-MM으로 용출시킨다.(d) elute with PBS-0.1M α-MM containing 50% ethylene glycol.
(d)단계로부터 수득된 정제된 인터페론에 대한 고유활성은 약 107단위/㎎이며, 수율은 약 10 내지 30%이다.The specific activity for the purified interferon obtained from step (d) is about 10 7 units / mg, and the yield is about 10-30%.
친화 크로마토그라피 단계에서 블루덱스트란-세파로즈를 사용하기에 적합한 순서는 다음과 같다.A suitable sequence for using bluedextran-sepharose in an affinity chromatography step is as follows.
(a) 컬럼의 10 내지 40배 부피의 배양상등액(1 내지 3×104단위/㎖, 0.2 내지 1㎎ 단백질/㎖)에 포화 염화 나트륨용액을 첨가하여 1.25M 염화나트륨 용액으로 조절하고, 이어 20 내지 40㎝/시간의 일정유속으로 컬럼에 펌핑하고,(a) A saturated sodium chloride solution was added to a culture supernatant (1-3 × 10 4 units / ml, 0.2-1 mg protein / ml) of 10 to 40 times the volume of the column, and adjusted to 1.25M sodium chloride solution. Pumping the column at a constant flow rate of from 40 cm / hour,
(b) 컬럼의 5 내지 15배 부피의 1M NaCl/0.02 내지 0.05M 인산염으로 세척하고 이어 5 내지 15%(부피/부피)의 에틸렌글리콜(pH 7.2)을 함유하는 컬럼의 5 내지 15배 부피의 1M NaCl/0.02 내지 0.05M 인산염으로 세척하며,(b) 5 to 15 times the volume of the column, washed with 5 to 15 times the volume of 1 M NaCl / 0.02 to 0.05 M phosphate followed by 5 to 15 times the volume / volume of ethylene glycol (pH 7.2). Washed with 1M NaCl / 0.02 to 0.05M phosphate,
(c) 50%(부피/부피) 에틸렌글리콜(pH 7.2)을 함유하는 1M NaCl/0.02 내지 0.05M 인산염으로 인터페론을 용출시킨다. 수득한 인터페론은 고유활성도가 약 3×106단위/㎎이며 수율은 약 80%이다.(c) Eluate the interferon with 1M NaCl / 0.02 to 0.05M phosphate containing 50% (volume / volume) ethylene glycol pH 7.2. The obtained interferon has an intrinsic activity of about 3 × 10 6 units / mg and a yield of about 80%.
상술한 친화 크로마토그라피에서 사용된 블루덱스트란-세파로즈는 블루-덱스트란 [덱스트란과 결합시킨 시바크론블루 F3GA]을 pH9.5에서 시아노겐브로마이드-활성세파로즈 4B와 결합시킴으로서 편리하게 제조할 수 있다.The bluedextran-sepharose used in the affinity chromatography described above can be conveniently prepared by combining blue-dextran [Cibacronblue F3GA combined with dextran] with cyanogenbromide-activated Sepharose 4B at pH9.5. Can be.
수지의 세척 및 숙성(Ageing), 컬럼부하 및 용출은 물론 상술한 결합방법 또한 인체섬유아세포 인터페론 제제를 최대수율 및 최대순도로 수득하기 위하여 매우 중요한 사항이다.Washing and aging of the resin (Ageing), column load and elution as well as the above-mentioned binding method is also very important for obtaining the human fibroblast interferon formulation in maximum yield and maximum purity.
혈청부재 매질로부터 인터페론 시료를 분리하는 경우에는 30 내지 50%(부피/부피) 에틸렌글리콜/완충화수용액(pH 7.2)을 용출제로 블루세파로즈-4B 컬럼을 1 또는 2회 통과시킴으로써 균질한 상태로 정제할 수 있다.When separating the interferon sample from the serum-free medium, 30 to 50% (volume / volume) ethylene glycol / buffered aqueous solution (pH 7.2) was passed through the Blue Sepharose-4B column as an eluent once or twice in a homogeneous state. It can be purified.
친화 크로마토그라피 단계에서 생성된 인터페론을 더 정제시키기 위해서, 인터페론을 제조용 규모로 1회 또는 그 이상 고압액체 크로마토그라피 단계를 수행할 경우 분리도 및 수율이 높다. 액체크로마토그라피 공정에서는 사이클로헥실, 옥틸, 옥타데실, 페닐, 디페닐 또는 시아노프로필기가 결합된 다공성 실리카매트릭스를 함유하는 컬럼을 사용한다. 다양한 pH 및 유기용매구배 조건하에서 연속적으로 사용될 수 있는 이 컬럼은 나트륨도데실설페이트(NaDodSO4) 폴리아크릴아미드겔 전기영동상의 단일 밴드, 일정한 고유활성도, HPLC상의 단일 피이크 및 일치하는 활성 및 단백질 농도에 의해 확인되는 바와 같이 인체섬유아세포 인터페론을 균질한 물질로 정제할 수 있음을 알 수 있다.In order to further purify the interferon produced in the affinity chromatography step, the separation and yield are high when the interferon is subjected to one or more high pressure liquid chromatography steps on a production scale. The liquid chromatography process uses a column containing a porous silica matrix bonded to cyclohexyl, octyl, octadecyl, phenyl, diphenyl or cyanopropyl groups. This column, which can be used continuously under various pH and organic solvent gradient conditions, is characterized by a single band on sodium dodecyl sulfate (NaDodSO 4 ) polyacrylamide gel electrophoresis, constant intrinsic activity, a single peak on HPLC and matching activity and protein concentrations. As confirmed by the human fibroblast interferon can be seen to be purified to a homogeneous material.
본 발명에서 사용되는 사이클로헥실, 옥틸, 옥타데실, 페닐 또는 시아노프로필기가 결합된 불규칙한 모양을 한 전체적으로 다공성의 실리카 미세입자컬럼(입자크기 약 10미크론, 기공크기 약 100Å)은 시판된다.A generally porous silica microparticle column (particle size about 10 microns, pore size about 100 mm 3) having an irregular shape combined with cyclohexyl, octyl, octadecyl, phenyl or cyanopropyl groups used in the present invention is commercially available.
상술한 컬럼을 사용하기에 편리한 고압액체 크로마토그라피에 관한 것은 미합중국 특허 제4,116,046(Stanley Stein)호에 기술되어 있다.High pressure liquid chromatography, which is convenient to use the aforementioned columns, is described in US Pat. No. 4,116,046 (Stanley Stein).
본 공정을 수행함에 있어 친화 크로마토그라피에 의해 정제된 pH4 내지 8의 수성완충액 중의 인체섬유아세포 인터페론 용액을 실리카 매트릭스 컬럼에 통과시킨다. 본 발명 목적에 바람직한 완충액은 피리딘/포름산/물(8 : 8 : 84 부피/부피) 용액이다. 통상적으로 본 공정은 가압하에서, 바람직하게는 약 3.4 내지 약 340 기압하에서 수행한다. 인터페론을 컬럼에 흡착시킨 후 이어서 수성완충액에 수혼화성 용매의 양을 변화시키면서 가한 용액을 사용하여 선택적인 방법에 따라 용출시킨다. 본 목적에 따른 수혼화성 용매로 적합한 것으로는 n-프로판올, 이소-프로판올, n-부탄올, 3급-부탄올, 에탄올, 메탄올 등과 같은 알칸올이 있다. 인체 섬유아세포 인터페론의 용출에 특히 바람직한 것은 프로판올과 부탄올의 혼합물이다.In carrying out the process, a solution of human fibroblast interferon in an aqueous buffer of pH 4-8 purified by affinity chromatography is passed through a silica matrix column. Preferred buffers for the purposes of the present invention are pyridine / formic acid / water (8: 8: 84 vol / vol) solutions. Typically the process is carried out under pressure, preferably from about 3.4 to about 340 atmospheres. The interferon is adsorbed on the column and then eluted according to an optional method using a solution added to the aqueous buffer with varying amounts of water miscible solvent. Suitable water-miscible solvents for this purpose include alkanols such as n-propanol, iso-propanol, n-butanol, tert-butanol, ethanol, methanol and the like. Particularly preferred for the elution of human fibroblast interferon is a mixture of propanol and butanol.
용출물의 분류는 고감도로 작동되는 펩티드 모니터에 의해 각 분획에 함유된 단백질함량을 동시에 추적하면서 공지된 방법에 따라 분획수집기를 사용하여 수행한다. 본 목적에 적합한 시스템은 볼턴등에 의해 기술되어 있다. [참조 : Bohlen et al., Anal. Biochem. 67, 438 (1975)] 또한 미합중국 특허 제3,876,881호를 참조할 수 있다.Classification of the eluate is carried out using a fraction collector according to known methods while simultaneously tracking the protein content contained in each fraction by means of a peptide monitor operated with high sensitivity. Suitable systems for this purpose are described by Bolton et al. [Bohlen et al., Anal. Biochem. 67, 438 (1975). See also US Pat. No. 3,876,881.
고압액체 크로마토그라피 단계에서 사용되는 특정한 수지형태의 선택은 본 단계에서 사용되는 인체 섬유아세포 인터페론 출발물질 공급원과 순도에 따라 결정된다. 따라서 콘카나발린 A-세파로즈 칼럼상의 친화 크로마토그라피에 의해 제조된 물질은 사이클로헥실 결합성실리카 컬럼상의 고압액체 크로마토그라피를 수행하고 이어서 옥틸결합성 실리카 컬럼상의 고압액체 크로마토그라피를 수행함으로써 편리하게 균질물로 정제한다. 반면에 친화 크로마토그라피 단계에서 블루덱스트란 컬럼을 사용할 경우에는, 1개 또는 그 이상의 옥틸결합성 실리카컬럼을 1회 이상 통과시키거나 경우에 따라서는 옥틸결합성 실리카컬럼을 통해주고, 이어서 시아노프로필 결합성 실리카컬럼을 통과시킨 후 필요하면, 디페닐결합성 실리카컬럼을 통해 줌으로써 균질물질로 정제할 수 있다. 블루세파로즈-4B 컬럼 및 혈청부재 물질을 사용하는 경우에는 옥틸결합성 실리카컬럼에 1회만 통과시켜도 균질의 제제를 얻을 수 있다.The choice of the particular resinous form used in the high pressure liquid chromatography step depends on the source and purity of the human fibroblast interferon starting material used in this step. Thus, the material prepared by affinity chromatography on a concanavalin A-Sepharose column is conveniently homogenized by performing high pressure liquid chromatography on a cyclohexyl bound silica column followed by high pressure liquid chromatography on an octyl bound silica column. Purify with water. On the other hand, when using a bluedextran column in an affinity chromatography step, one or more octyl-bonded silica columns are passed through one or more times, or in some cases, through an octyl-bonded silica column, followed by cyanopropyl. After passing through the bound silica column, it can be purified to a homogeneous material by passing through the diphenyl bound silica column if necessary. In the case of using the Blue Sepharose-4B column and the serum-free material, a homogeneous preparation can be obtained by only passing the octyl-bonded silica column once.
프로판올, 부탄올 또는 2-메톡시에탄올과 같은 유기용매의 존재하에 중성 pH에서의, 인체섬유 아세포인터페론 활성의 민감성 때문에 크로마토그라피는 산성 pH에서 수행한다. 인체섬유 아세포 인터페론은 백혈구 인터페론보다 소수성이 더 크고, 또 부분적으로 정제된 섬유아세포 인터페론 제제에는 이보다 소수성이 큰 다른 단백질이 존재하는 관계로, 프로판올 및 부탄올의 혼합액을 역상컬럼의 용출용매로 사용하는 것이 n-프로판올을 단독 사용하는 것보다 더 바람직하다. 이와 같은 혼합물/용매를 사용함으로써 흡수된 단백질의 완전용출에 필요한 유기용매 농도가 제한되며, 이와 같이 함으로써 단백질의 저용해도에 기인하여 교부하에서 인위구조가 발생되는 것을 감소시킨다.Chromatography is performed at acidic pH due to the sensitivity of human fibroblast interferon activity at neutral pH in the presence of organic solvents such as propanol, butanol or 2-methoxyethanol. Human fibroblast interferon has a higher hydrophobicity than leukocyte interferon, and partially purified fibroblast interferon preparations contain other proteins with higher hydrophobicity. Therefore, it is recommended to use a mixture of propanol and butanol as the eluting solvent of the reversed phase column. More preferred is the use of n-propanol alone. The use of such mixtures / solvents limits the organic solvent concentrations required for complete elution of the absorbed protein, thereby reducing the generation of artificial structures under load due to the low solubility of the protein.
본 발명에 따라 수득된 균질인체 섬유아세포 인터페론은 최종단계의 고성능액체 크로마토그라피 컬럼내에서 1개의 피이크로서 유도되며, 2-머캅토에탄올 존재하의 NaDodSO4폴리아크릴아미드겔 전기영동상에서 1개의 좁은 밴드를 형성한다. 겔의 추출물은 단백질 밴드와 일치하는 항바이러스 활성을 갖는 1개의 피이크를 갖는다. 인체 섬유아세포 인터페론 활성에 대한 통상의 항바이러스 활성분석은 본 발명 목적을 위해 사용될 수 있다.The homogeneous fibroblast interferon obtained according to the present invention is derived as one peak in the final high performance liquid chromatography column, and one narrow band on NaDodSO 4 polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 2-mercaptoethanol. Form. The extract of the gel has one peak with antiviral activity consistent with the protein bands. Conventional antiviral activity assays for human fibroblast interferon activity can be used for the purposes of the present invention.
폴리아크릴아미드겔 방법에 의해 측정된 균질인체 섬유아세포 인터페론의 분자량은 약 20,500이다. 본 정제물질의 고유활성도는 약 4×108단위/㎎이다. 균질인체 섬유아세포 인터페론시료에서 수록된 N-말단부분 서열은 Met1-Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg-Ser-Ser-Asn-Rhe15-Gln-…-Gln-Lys19-…이다.The molecular weight of the homogenous fibroblast interferon measured by the polyacrylamide gel method is about 20,500. The specific activity of this purified material is about 4x10 8 units / mg. The N-terminal sequence included in the homogenous fibroblast interferon sample was Met 1 -Ser-Tyr-Asn-Leu 5 -Leu-Gly-Phe-Leu-Gln 10- Arg-Ser-Ser-Asn-Rhe 15- Gln- … -Gln-Lys 19 -... to be.
인터페론은 항바이러스성, 항암성, 성장억제 및 면역억제활성을 갖는다. 이 활성들은 1% 이하의 인체인터페론을 함유하는 비교적 조(粗) 제제를 1일 1 내지 10×106단위로 사용한 임상실험에서 확인되었다. 본 발명의 정제된 균질의 인체 섬유아세포 인터페론은 투여량을 조절하여, 인터페론을 필요로 하는 수준으로 제공함으로써 지금까지 사용된 조제제와 동일한 방법으로 사용될 수 있다.Interferon has antiviral, anticancer, growth inhibitory and immunosuppressive activities. These activities were confirmed in clinical trials using relatively crude formulations containing less than 1% human interferon in 1-10 × 10 6 units per day. The purified homogeneous human fibroblast interferon of the present invention can be used in the same manner as the preparations used so far by adjusting the dosage to provide the interferon at the required level.
본 발명 공정과 제품에 관한 것은 참고로 든 다음 실시예에 의해 더 자세히 설명된다. 모든 인터페론의 역가는 미합중국 국립보건성에 의해 마련된 인체백혈구 인터페론(GO 23-901-527)용 표준품에 대한 표준단위/㎖ 또는 표준 단위/㎎으로 표시한다.Regarding the process and product of the present invention, it is explained in more detail by the following examples which are incorporated by reference. Titers of all interferons are expressed in standard units / ml or standard units / mg for the standard for human leukocyte interferon (GO 23-901-527) prepared by the US Department of Health.
[실시예 1]Example 1
[콘카나발린 A 친화 크로마토그라피][Concanavalin A Affinity Chromatography]
0.1M α-MM을 함유하는 pH7.2의 PBS로 평형시킨 50㎖의 큰카나발린 A-세파로즈 4B를 폴리에틸렌 원판프릿(Frit)이 장치된 50㎖ 폴리에틸렌컬럼에 충진시킨다. 여기에 고유활성도 2×104단위/㎎의 조(粗) 인터페론(2×107단위 1.25ℓ를 180㎖/시간(35.5㎝/시간)의 유속으로 부하시킨다. 충진된 컬럼을 150㎖의 PBS 완충액 및 0.1M α-MM을 함유하는 600㎖의 PBS 완충액으로 세척한다. 최종적으로 인터페론을 50%(부피/부피) 에틸렌글리콜을 함유하는 상술한 완충용액으로 용출시킨다. 본 공정에서 고유활성도가 약 1×107단위/㎎인 생성물의 수율은 9%(1.8×106단위)이다. 고유활성도가 2 내지 4×106단위/㎎인 그밖의 분획을 포함한 광범위한 분획절단물의 수율은 15%(3×106단위)이다.50 ml of large cannavaline A-Sepharose 4B equilibrated with PBS at pH 7.2 containing 0.1 M α-MM was charged into a 50 ml polyethylene column equipped with polyethylene disc frit. It was loaded with crude interferon (1.25 L of 2 × 10 7 units of specific activity of 2 × 10 4 units / mg) at a flow rate of 180 mL / hour (35.5 cm / hour). Wash with 600 mL PBS buffer containing 0.1 M α-MM buffer and finally interferon is eluted with the above-mentioned buffer containing 50% (volume / volume) ethylene glycol. The yield of the product at 1 × 10 7 units / mg is 9% (1.8 × 10 6 units) The yield of a wide range of fractional cuts including other fractions with an intrinsic activity of 2 to 4 × 10 6 units / mg is 15% ( 3 × 10 6 units).
[HPLC][HPLC]
콘카나발린 A-세파로즈 4B 컬럼으로부터의 총 120㎖의 용출물(2.5×106단위 : 약 2 내지 4×106단위/㎎)을 최대배압을 306기압 이하로 유지시키면서, 0.4 내지 0.8㎖/분의 유속으로 피리딘/포름산/이소프로판올/물(8 : 8 : 20 : 64 : 부피/부피 ; 완충용액 A)로 평형된 크로메가본드 10μ사이클로헥실컬럼(4.6×300㎜)에 직접 적용한다. HPLC 공정에 사용된 장치는 볼런(Bohlen) 등에 의해 기술되어 있다(Anal. Biochem. 67, 438 [1975]).A total of 120 mL of eluate (2.5 × 10 6 units: about 2-4 × 10 6 units / mg) from the Concanavalin A-Sepharose 4B column was 0.4-0.8 mL while maintaining the maximum back pressure below 306 atm. It is applied directly to a chromegabond 10 μcyclohexyl column (4.6 × 300 mm) equilibrated with pyridine / formic acid / isopropanol / water (8: 8: 20: 64: volume / volume; buffer A) at a flow rate of / min. The apparatus used for the HPLC process is described by Bohlen et al. (Anal. Biochem. 67, 438 [1975]).
다음 구배의 평형완충액 A로부터 최종완충액 B(피리딘/포름산/이소프로판올/n-부탄올/물, 8 : 8 : 25 : 20 : 39, 부피/부피)까지를 0.4㎖/분의 속도로 유출시킨다. 0 내지 25% B, 32분 ; 25 내지 60% B, 225분 ; 60 내지 100% B, 63분, 2.0㎖의 분획을 합친다. 활성도 피이크의 중심부에서 26 내지 29(2×106단위) 분획을 취하여 4㎖의 피리딘/포름산으로 희석한다. 이 용액을 펌프를 통해서 크로메가본드 10μ 옥틸컬럼(4.6×300㎜)에 적용한다. 용출조건은 상술한 사이클로헥실컬럼에서와 동일하다. 활성도 피이크 중심부에서의 고유활성도는 약 4×108단위/㎎으로서 정제된 인체섬유 아세포인터페론 총수득량은 106단위이다.From the next gradient of equilibration buffer A, the final buffer B (pyridine / formic acid / isopropanol / n-butanol / water, 8: 8: 25: 20: 39, volume / volume) is drained at a rate of 0.4 ml / min. 0-25% B, 32 minutes; 25 to 60% B, 225 min; Combine 60-100% B, 63 minutes, 2.0 ml fractions. Take 26-29 (2 × 10 6 units) fractions from the center of the activity peak and dilute with 4 ml of pyridine / formic acid. This solution is applied to a chromobond 10μ octyl column (4.6 x 300 mm) via a pump. Elution conditions are the same as in the cyclohexyl column described above. Activity The intrinsic activity at the center of the peak is about 4 × 10 8 units / mg, and the total amount of purified human fibroblast interferon is 10 6 units.
콘카나발린 A 상에서 정제된 인터페론을 사이클로헥실컬럼 또는 옥틸컬럼상에서 HPLC시킬 경우, 이 2개 컬럼의 인터페론 용출위치는 주된 중심피이크와 매우 근접된다는 사실을 주지해야 한다. 최초 HPLC 단계를 옥틸컬럼상에서 수행하는 경우, 인터페론은 주된 중심피이크 바로 직전에서 용출되는 한편, 사이클로헥실컬럼상의 동일 크로마토그라피 조건하에서는 이 주된 피이크 바로 직후에 용출된다. HPLC로 정제된 인체섬유 아세포 인터페론시료를 실험용 1㎍ 단백질과 함께 트리스/글리신 완충액 중의 12.5 또는 15% NadodSO4폴리아크릴아미드 겔상에서 실험하였다. 전기영동 후 코마시(Coomassie) 블루로 착색시키면 1개의 밴드가 형성된다. 동일한 시료물질을 상기와 같은 종류의 겔에 적용하고 절단하여 항바이러스 실험용으로 사용한다. 항바이러스 활성의 최대치는 착색된 밴드의 중심부와 일치한다. 소혈청알부민, 카이모트립신, 시토크롬 C 및 리보뉴클레아제를 표준물질로 사용하여 이 시료의 분자량을 측정하면 약 20,500이다. 인체섬유 아세포 인터페론밴드의 상대이동도는 머캅토에탄올이 시료중에 존재하느냐 않느냐와 동일하다.Note that when the interferon purified on Concanavalin A is HPLCed on a cyclohexyl column or octyl column, the interferon elution locations of these two columns are very close to the main central peak. If the initial HPLC step is carried out on an octyl column, the interferon elutes immediately before the main central peak, while under the same chromatographic conditions on the cyclohexyl column, immediately after this main peak. Human fibroblast interferon samples purified by HPLC were tested on 12.5 or 15% NadodSO 4 polyacrylamide gels in Tris / Glycine buffer with experimental 1 μg protein. After electrophoresis, staining with Coomassie blue forms one band. The same sample material is applied to the same type of gel, cut and used for antiviral experiments. The maximum value of antiviral activity coincides with the center of the colored band. Bovine serum albumin, chymotrypsin, cytochrome C and ribonucleases were used as standards to determine the molecular weight of this sample about 20,500. The relative mobility of human fibroblast interferon bands is the same as whether mercaptoethanol is present in the sample.
[실시예 2]Example 2
[블루덱스트란-세파로즈 4B 수지의 제조][Production of Bluedextran-Sepharose 4B Resin]
50g의 충진된 세파로즈 4B를 1ℓ의 물로 세척하고 50㎖의 증류수 중에 재현탁시킨다. 미세하게 분쇄한 시아노겐 브로마이드 15g을 상기 현탁액을 서서히 교반시키면서 이 현탁액에 첨가하고 10N NaOH를 적가하여 pH를 11±0.2로 조절하고 이 상태를 유지한다. 분쇄얼음을 소량 가하여 온도를 20±5℃로 유지한다. 반응이 정지하면(15 내지 20분) 약 1배량의 얼음물을 첨가하고 현탁액을 부크니(Buchner) 깔대기에 옮긴 다음 5배량의 0.01N HCl로서 세척한다.50 g of packed Sepharose 4B is washed with 1 L of water and resuspended in 50 ml of distilled water. 15 g of finely ground cyanogen bromide is added to the suspension with gentle stirring and the pH is adjusted to 11 ± 0.2 by the addition of 10N NaOH dropwise and maintained. Add a small amount of crushed ice to maintain the temperature at 20 ± 5 ℃. When the reaction is stopped (15-20 minutes) about 1x of ice water is added and the suspension is transferred to a Buchner funnel and washed with 5x 0.01N HCl.
활성화된 수지는 바로 1.00g의 용해된 블루덱스트란을 함유하는 50㎖의 0.4M 탄산나트륨완충액(pH9.5)에 현탁시키고 4℃에서 환저 플라스크에 넣어 철야 흔들에 준다. 다음에 수지를 10배량의 1M NaCl, 2배량의 1M NaCl 및 0.05M 인산나트륨을 함유하는 50% 에틸렌글리콜(pH7.2)로 세척하고, 50% 에틸렌글리콜 중에서 철야방치한 후, 1배량의 80% 에틸렌글리콜 및 5% 태생 송아지혈청(MEM)을 함유하는 5배량의 기브코(Gibco) No.11의 최저량의 필수매질로서 세척하고 이 매질중에서 50℃로 철야 방치시킨다. 다음에 수지를 1M NaCl을 함유하는 3배량의 80% 수성 에틸렌 글리콜로 더 세척하고 이어서 2배량의 MEM으로 세척한 후 MEM 중에 슬러리상으로 만들어 사용할 컬럼에 충진시킨다.The activated resin is immediately suspended in 50 ml of 0.4 M sodium carbonate buffer (pH9.5) containing 1.00 g of dissolved bluedextran and placed in a round bottom flask at 4 ° C. for overnight shaking. The resin was then washed with 50% ethylene glycol (pH 7.2) containing 10 times of 1M NaCl, 2 times of 1M NaCl and 0.05M sodium phosphate, left overnight in 50% ethylene glycol, then 1x 80 Wash as the lowest essential medium of 5 times Gibco No. 11 containing% ethylene glycol and 5% native calf serum (MEM) and leave at 50 ° C. in this medium overnight. The resin is then further washed with three times 80% aqueous ethylene glycol containing 1M NaCl followed by two times MEM and then slurryed in MEM to fill the column for use.
[친화 크로마토그라피]Affinity Chromatography
1.5ℓ의 조섬유아세포 인터페론(2×104단위/㎖ : 1㎎ 단백질/㎖ ; 고유활성도 2×104단위/㎎ 단백질)을 0.27배량의 포화염수(약 6.3M)와 혼합한다. 이 용액을, 하부에 다공성 폴리에틸렌 원판이 장치된 50㎖ 폴리프로필렌컬럼에 충진된 블루덱스란-세파로즈 4B(35㎖)를 통해 유속 100㎖/시간(20㎝/시간)으로 펌핑한다. 충진된 수지를 0.05M 인산나트륨 완충액(pH7.2)을 함유하는 200㎖의 1M NaCl, 0.05M 인산나트륨 완충액(pH : 7.2)을 함유하는 500㎖의 1M NaCl 및 75㎖의 에틸렌글리콜로 연속해서 세척하고, 또 최종적으로 0.05M 인산나트륨(pH7.2)을 함유하는 500㎖의 1M NaCl과 250㎖의 에틸렌 글리콜로 용출시킨다. 50% 에틸렌글리콜로 용출시키면 전반부에서 약 90% 인터페론이 피이크에서 나타난다. 총 인터페론의 50% 이상이 용출된 최대 피크치에서의 고유활성도는 1×107단위/㎎이다.1.5 L of crude fibroblast interferon (2 × 10 4 units / ml: 1 mg protein / ml; intrinsic activity 2 × 10 4 units / mg protein) is mixed with 0.27 times saturated saline (about 6.3 M). This solution is pumped at a flow rate of 100 ml / hr (20 cm / hr) through Bluedexran-Sepharose 4B (35 ml) filled in a 50 ml polypropylene column equipped with a porous polyethylene disc at the bottom. The filled resin was successively washed with 200 ml of 1 M NaCl containing 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.2), 500 ml of 1 M NaCl and 75 ml ethylene glycol containing 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.2). It is washed and finally eluted with 500 ml of 1 M NaCl and 250 ml of ethylene glycol containing 0.05 M sodium phosphate (pH 7.2). Elution with 50% ethylene glycol reveals about 90% interferon in the peak in the first half. The specific activity at the maximum peak at which 50% or more of the total interferon was eluted is 1 × 10 7 units / mg.
[HPLC][HPLC]
(A) 블루덱스트란-세파로즈 4B 컬럼(3×107단위 : 1×107단위/㎎)으로부터 용출시켜 합친 총 125㎖의 인터페론을, 50% 에틸렌글리콜을 함유하는 1M NaCl로 미리 평형시킨 4.6×300㎜ 크로메가본드 10μ 옥틸컬럼에 펌핑한다. 시료를 투입한 후 바로 완충액 A(피리딘/포름산/이소프로판올/n-부탄올/물, 8 : 8 : 20 : 3.3 : 60.7, 부피/부피)를 컬럼으로 펌핑한다. 완충액 B(피리딘/포름산/이소프로판올/n-부탄올/물 : 8 : 8 : 25 : 20 : 39, 부피/부피)에 대한 다음 구배의 용출제를 유속 0.45㎖/분으로 유출시킨다 ; 0 내지 25% B, 30분 ; 25 내지 55% B, 190분 ; 55 내지 100% B, 20분 ; 100% B, 60분. 인터페론활성은 18 내지 23분획(각 분획은 1.5㎖의 용출제를 함유한다)에서 확인된 1개의 단백질 피이크와 거의 일치한다.(A) A total of 125 ml of interferon, eluted from a Bluedextran-Sepharose 4B column (3 × 10 7 units: 1 × 10 7 units / mg), was previously equilibrated with 1M NaCl containing 50% ethylene glycol. Pump into a 4.6 x 300 mm chromobond 10μ octyl column. Immediately after the sample was added, buffer A (pyridine / formic acid / isopropanol / n-butanol / water, 8: 8: 20: 3.3: 60.7, volume / volume) was pumped into the column. The following gradient of eluent for Buffer B (pyridine / formic acid / isopropanol / n-butanol / water: 8: 8: 25: 20: 39, volume / volume) flows out at a flow rate of 0.45 mL / minute; 0-25% B, 30 minutes; 25 to 55% B, 190 minutes; 55-100% B, 20 minutes; 100% B, 60 minutes. Interferon activity is almost identical to one protein peak identified in 18-23 fractions, each fraction containing 1.5 ml of eluent.
(B) 상기 (A)에서의 약 1/4부하량의 인터페론을 동일컬럼에 걸고 또 실시예 2에서 사이클로헥실 컬럼에 사용된 용출조건을 적용한 경우, 인터페론활성은 24 내지 26분획에서 확인된 단백질 피이크치와 일치한다.(B) When about 1/4 load of interferon in (A) was applied to the same column and the elution conditions used for the cyclohexyl column in Example 2 were applied, the interferon activity was found in 24 to 26 fractions of protein peaks. Coincides with
(C) (A)에서와 동일한 부하, 구배 및 유출속도와 (B)에서 사용된 A 및 B완충액을 사용하고, 9.6×500㎜ 크로메가본드 옥틸컬럼을 사용함으로써 컬럼부피당 부하량이 약 1/9로 줄고, 분리능력이 더 좋아진다.(C) Approximately 1/9 of the load per column volume by using the same load, gradient and outflow rate as in (A) and the A and B buffers used in (B), and using a 9.6 × 500 mm chromagabond octyl column. And the separation is better.
(D) 상기 (A)에서 최대의 고유활성도(4×108단위/㎎)를 갖는 물질을 피리딘/포름산/물(8 : 8 : 84, 부피/부피)을 사용하고, 유출속도 0.3㎖/분으로 1시간에 걸쳐 0 내지 40%(부피/부피)의 n-프로판올 구배로 시아노프로필컬럼상에서 재크로마토그라피하여 대칭으로 주된 피이크가 생성되었다.(D) Using pyridine / formic acid / water (8: 8: 84, volume / volume) as the substance having the maximum specific activity (4 × 10 8 units / mg) in (A), and the flow rate was 0.3 ml / The major peak was symmetrically produced by rechromatography on a cyanopropyl column with an n-propanol gradient of 0-40% (volume / volume) over 1 hour in minutes.
[NaDodSO4폴리아크릴아미드 겔 전기영동][NaDodSO 4 Polyacrylamide Gel Electrophoresis]
상술한 공정 (A), (B) 및 (C)로부터 수득한 시료에 대해 실시예 1에서 기술한 바와 같이 전기영동을 수행할 경우 20,500MV밴드에 주밴드가 나타나고, 겔상물질을 떼어내서 분석할 경우 활성도 피이크 중심부와 일치된다. 제2의 강력한 밴드(10,500MW/염색 강도로부터 추정하여 전 물질의 20 내지 50% 정도)는 시료에 따라 변화가 크며, 항바이러스 활성을 갖고 있지 않다. 시료를 머캅토 에탄올로 처리하지 않는 경우, 40,000MW밴드를 관찰할 수 있는데, 이것은 경계활성을 갖는다. 20,000MW 밴드 및 40,000MW밴드의 아미노산 분석결과는 특이하지 않은 반면, 10,000MW밴드의 분석결과는 매우 특이하다.When electrophoresis was performed on the samples obtained from the above-mentioned steps (A), (B) and (C) as described in Example 1, the main band appeared in the 20,500 MV band, and the gelled material was separated and analyzed. If activity is also coincident with peak center. The second strong band (about 20-50% of all material, estimated from 10,500 MW / staining intensity) varies greatly from sample to sample and has no antiviral activity. If the sample is not treated with mercapto ethanol, a 40,000 MW band can be observed, which has borderline activity. The results of amino acid analysis of the 20,000 MW band and the 40,000 MW band are not unusual, whereas the results of the 10,000 MW band are very unusual.
상술한 공정 (D)로부터 시료를 전기영동하면 분자량이 약 20,500이고, 고유활성도가 4×108단위/㎎인 1개의 밴드가 생성된다. 6N HCl 중에서 24시간 동안 가수분해를 수행한 이 균질펩타이드 등의 아미노산 분석결과는 루신을 대략 25.0으로 잡을 때 다음과 같다.Electrophoresis of the sample from step (D) described above yields one band having a molecular weight of about 20,500 and an intrinsic activity of 4x10 8 units / mg. The result of amino acid analysis of the homogeneous peptide, which was hydrolyzed in 6N HCl for 24 hours, is as follows when the leucine is approximately 25.0.
[실시예 3]Example 3
[블루덱스트란-세파로즈 친화 크로마토그라피][Bluedextran-Sepharose Affinity Chromatography]
(a) 19,400단위/㎖의 섬유아세포 인터페론을 함유하는 5ℓ의 배양상등액을 0.3μ필터를 통해 여과한 다음 배드 부피 275㎖의 블루덱스트란-세파로즈를 함유하는 컬럼에 적용한다. 상등액에 1350㎖의 NaCl 포화용액(6.3M)을 첨가하여 1.25M의 NaCl 농도로 조절하고, 360㎖/시간의 유속으로 컬럼에 덤핑한다. 약 4내지 6%의 인터페론이 컬럼에 잔유되지 않는 속도로 통과한다.(a) 5 L of the culture supernatant containing 19,400 units / mL of fibroblast interferon is filtered through a 0.3 μ filter and then applied to a column containing 275 mL of blue dextran-sepharose with bad volume. To the supernatant was added 1350 mL saturated NaCl solution (6.3 M) to adjust to a NaCl concentration of 1.25 M and dumped into the column at a flow rate of 360 mL / hour. About 4-6% of interferon passes at a rate that does not remain in the column.
(b) 이어서 컬럼을 15%(부피/부피) 에틸렌글리콜, 1M NaCl 및 0.02M 인산나트륨(pH 7.2)을 함유하는 1300㎖의 수용액으로 420㎖/시간의 유속으로 세척한다. 컬럼에 가해진 인터페론의 약 1%가 용출된다.(b) The column is then washed with a flow rate of 420 ml / h with 1300 ml of an aqueous solution containing 15% (volume / volume) ethylene glycol, 1 M NaCl and 0.02 M sodium phosphate, pH 7.2. About 1% of the interferon added to the column is eluted.
(c) 이어 50%(부피/부피) 에틸렌글리콜, 1M NaCl 및 0.02M 인산나트륨(pH7.2)을 함유하는 수용액으로 420㎖/시간의 유속으로 인터페론을 용출시킨다. 최초에 용출되는 200㎖의 용출물에서 용출되는 인터페론은 거의 없으며, 컬럼에 가해진 대부분의 인터페론은 다음 표에서 보는 바와 같이 그후 300㎖의 용출물에서 용출된다.(c) The interferon is then eluted at a flow rate of 420 ml / hour with an aqueous solution containing 50% (volume / volume) ethylene glycol, 1 M NaCl and 0.02 M sodium phosphate (pH 7.2). Few interferons are eluted in the first 200 ml eluting eluent, and most of the interferon added to the column is then eluted in 300 ml eluent as shown in the following table.
[HPLC][HPLC]
블루덱스트란-세파로즈 친화 컬럼으로부터 용출된 분획 2 내지 6(250㎖ ; 13×107단위 ; 고유활성 8.12×106단위/㎎)을 4㎖/분의 유속으로 9.5×500㎜ 옥틸결합 실리카매트릭스 컬럼에 덤핑한다. 다음에 완충액 A(피리딘/포름산/2-프로판올/n-부탄올/물, 8/8/20/2.5/61.5, 부피/부피)를 유속 2㎖/분으로 12분간 컬럼에 덤핑한다. 이어서 1.25㎖/분의 유속으로 완충액 B(피리딘/포름산/2-프로판올/n-부탄올/물, 8/8/25/25/34, 부피/부피)를 다음과 같은 구배로 펌핑한다 : 0 내지 20% B, 18분 ; 20 내지 29% B, 57분 ; 29% B, 27분 ; 29 내지 30% B, 3분 ; 30 내지 100% B, 36 ; 100% B, 54분.Fractions 2 to 6 (250 mL; 13 × 10 7 units; high activity 8.12 × 10 6 units / mg) eluted from the Bluedextran-Sepharose affinity column were 9.5 × 500 mm octyl-bonded silica at a flow rate of 4 mL / min. Dump to the matrix column. Buffer A (pyridine / formic acid / 2-propanol / n-butanol / water, 8/8/20 / 2.5 / 61.5, volume / volume) is then dumped into the column for 12 minutes at a flow rate of 2 ml / min. Buffer B (pyridine / formic acid / 2-propanol / n-butanol / water, 8/8/25/25/34, volume / volume) is then pumped at a flow rate of 1.25 ml / min in the following gradient: 0 to 20% B, 18 minutes; 20 to 29% B, 57 minutes; 29% B, 27 minutes; 29 to 30% B, 3 minutes; 30 to 100% B, 36; 100% B, 54 minutes.
인터페론활성은 29% B 구배로 용출시킨 부분에서 나타나며, 플루오르에스카민 추적계로서 측정되는 피이크와 함께 용출된다. 45×106단위의 인터페론이 회수되며(수율 35%), 집결물(50㎖)에 대한 고유활성도가 2×108단위/㎎이다. -20℃에서 밀폐된 폴리프로필렌 바이알중에 2개월간 저장한 후의 활성도는 HPLC 단계에서의 값이 10%로 감소되며, 단백질은 소실되지 않는다.Interferon activity appears in the fraction eluted with a 29% B gradient and elutes with the peak measured as a fluoroescamine tracer. 45 × 10 6 units of interferon were recovered (yield 35%), and the specific activity of the aggregates (50 mL) was 2 × 10 8 units / mg. After two months of storage in a closed polypropylene vial at −20 ° C., the activity is reduced to 10% in the HPLC step and no protein is lost.
앞의 HPLC 컬럼으로부터의 집결물 50㎖(고유활성도 약 0.2×108단위/㎎)를 1㎖의 티오디글리콜 및 20㎖의 n-프로판올과 혼합한다. 본 혼합물을 분석한 결과 총 4.26×106단위였다. 여기에 100㎖의 0.1% 트리톤×-100/0.3% 티오디글리클을 가한다. 이 혼합물은 총 5.1×106단위가 되며 또 미리 1.5㎖/시간 유속으로 피리딘/포름산/물(8 : 8 : 84, 부피/부피, 완충액 A) 혼합물로 30분간 평형시킨 5μ/80Å 4.6×250㎜ 스페리솔브 CN컬럼으로 덤핑한다. 0.5㎖/분 유속으로 완충액 B, 피리딘/포름산/n-프로판올/물(8 : 8 : 50 : 34, 부피/부피)을 다음과 같은 구배로 덤핑한다 : 0 내지 25% B, 30분 ; 25 내지 50% B, 210분. 인터페론 활성은 관찰된 단지 1개의 피이크와 같이 발생된다. 3개의 1㎖ 분획에서 4.2×106단위가 회수된다(82%).50 ml of the aggregate from the previous HPLC column (about 0.2 × 10 8 units / mg high activity) are mixed with 1 ml thiodiglycol and 20 ml n-propanol. Analysis of this mixture yielded a total of 4.26 × 10 6 units. To this was added 100 ml of 0.1% Triton × -100 / 0.3% thiodiglycle. This mixture is a total of 5.1 × 10 6 units and 5μ / 80Å 4.6 × 250 previously equilibrated with a mixture of pyridine / formic acid / water (8: 8: 84, volume / volume, buffer A) at a flow rate of 1.5 ml / hour for 30 minutes Dump with a millimeter Sphersolve CN column. Buffer B, pyridine / formic acid / n-propanol / water (8: 8: 50: 34, volume / volume) at 0.5 mL / min flow rate with the following gradient: 0-25% B, 30 min; 25-50% B, 210 minutes. Interferon activity occurs with only one peak observed. 4.2 × 10 6 units are recovered (82%) in three 1 ml fractions.
당초 시아노컬럼에 가한 총 단백질의 69%에 해당되는 상기 집결물을 2㎖의 0.1% 트리톤×-100과 혼합하여 앞에서 사용한 것과 동일한 시아노컬럼에 덤핑한다. 총 구배시간의 반에 해당하는 시간에 앞에서와 동일한 구배로 행한다. 모든 활성인터페론(11.75×106단위, 280% 회수)은 단 1개의 피이크와 함께 용출된다.The aggregates corresponding to 69% of the total protein initially added to the cyanocolum were mixed with 2 ml of 0.1% Triton × -100 and dumped into the same cyanocolumn as used previously. At the time corresponding to half of the total gradient time, the same gradient is performed. All active interferon (11.75 × 10 6 units, 280% recovery) elute with only one peak.
제2시아노컬럼(4㎖)으로부터의 인터페론 활성집결물을 2시간 구배로 완충액 A로부터 완충액 B로(시아노컬럼에서의 완충액과 동일) 사전 순환시켜 1.5㎖/분 속도로 완충액 A로 평형시킨 4.6×250㎜ 디페닐 결합성 실리카 매트릭스 컬럼으로 덤핑한다.The interferon active aggregates from the second cyanocolumn (4 ml) were pre-circulated from buffer A to buffer B (same buffer as cyano column) in a 2 hour gradient to equilibrate buffer A at 1.5 ml / min. Dump into a 4.6 × 250 mm diphenyl bonded silica matrix column.
유출속도 0.5㎖/분 및 다음 구배로 용출을 수행한다 ; 0 내지 25% B, 22분 ; 25 내지 50%, 98분. 구배계가 33% 완충액 B를 지시할 때에 용출된 제2의 피이크는 인터페론 활성도 플롯과 일치된다. 총 2.6×106단위(22%) 및 40㎍의 단백질이 이 피이크에서 용출된다.Elution is carried out with a flow rate of 0.5 ml / min and the following gradient; 0-25% B, 22 minutes; 25-50%, 98 minutes. The second peak eluted when the gradient system indicates 33% buffer B is in agreement with the interferon activity plot. A total of 2.6 × 10 6 units (22%) and 40 μg of protein elute at this peak.
디페닐결합성 실리카 매트릭스 컬럼은 다음과 같이 제조한다.Diphenyl-bonded silica matrix columns are prepared as follows.
실리카 지지체(10㎛, 10㎚ 기공크기)를 이따금 교반시키면서 6N HCl(10 : 1 부피/중량)에 24시간 동안 침지시킨다. 이 지지체를 소성유리필터상에서 세척물이 중성이 될 때까지 물로서 세척하고 이어 아세톤 및 메탄올로 세척하여 수분을 제거한다. 진공하에서 1야간 건조한 후, 지지체(10g)를 10㎖의 디클로로디페닐 실란을 함유하는 무수톨루엔(100㎖) 중에서 6시간 동안 환류시킨다. 결합된 지지체는 소성유리필터를 사용하여 톨루엔용액으로부터 분리시켜 200㎖의 톨루엔으로 세척한다. 그 후에 연속해서 이 결합지지체를 속스렛추출기(Soxhlet extractor) 중에서 250㎖의 톨루엔, 아세톤 및 메탄올로 각각 8시간씩 처리하고 이어서 트리메틸클로로실란으로 상술한 바와 동일한 방법에 따라 처리한다.The silica support (10 μm, 10 nm pore size) is immersed in 6N HCl (10: 1 volume / weight) for 24 hours with occasional stirring. The support is washed with water until the wash is neutral on a calcined glass filter and then with acetone and methanol to remove water. After overnight drying in vacuo, the support (10 g) was refluxed for 6 hours in anhydrous toluene (100 mL) containing 10 mL of dichlorodiphenyl silane. The bonded support is separated from the toluene solution using a sintered glass filter and washed with 200 ml of toluene. Subsequently, this bonded support was successively treated with 250 ml of toluene, acetone and methanol for 8 hours in a Soxhlet extractor followed by trimethylchlorosilane in the same manner as described above.
결합된 지지체는 3g의 지지체를 현탁시키기 위해 클로로포름(10.7㎖) 및 n-부탄올(2.3㎖)의 혼합물을 사용하여 340기압에서 4.6×250㎜ 스테인레스 스틸컬럼에 충진한다.The bound support is filled into a 4.6 × 250 mm stainless steel column at 340 atm using a mixture of chloroform (10.7 mL) and n-butanol (2.3 mL) to suspend 3 g of the support.
생성된 인터페론 피이크의 중앙분획시료에 대해 각종 가수분해 조건하에서 아미노산조성을 분석하였으며, 그 결과를 요약하면 다음과 같다(모든 가수분해는 산으로 세척한 진공유리관내의 5.7N HCl 중에서 행하였다. 시료완충액 및 HCl 공시험치는 보정하였다).The amino acid composition of the resulting interferon peak was analyzed under various hydrolysis conditions, and the results were summarized as follows (all hydrolysis was performed in 5.7 N HCl in a vacuum glass tube washed with acid.) And HCl blanks were corrected).
디페닐컬럼의 중앙피이크 분획으로부터 수득된 용출물을 사용하여 0.02% 티오글리콜산을 함유하는 5.7N HCl로써 110℃에서 6, 14 및 24시간 동안 인터페론을 가수분해한 후 헥소즈아민 분석결과 섬유아세포 인터페론은 약 3가지 잔유물의 글루코자민을 함유하고 있음을 나타내고 있다. 갈락토자민 또는 만노자민은 발견되지 않았다.Fibroblasts from the hexamine assay after hydrolysis of the interferon at 110 ° C. for 6, 14 and 24 hours with 5.7 N HCl containing 0.02% thioglycolic acid using an eluate obtained from the central peak fraction of the diphenyl column. Interferon has been shown to contain about three residues of glucosamine. Galactosamine or mannozamine was not found.
디페닐컬럼 섬유아세포 인터페론 피이크의 중앙분획 시료 90피코볼로써 말단기 측정을 수행한 바 N-말단으로서 Met이 검출되었다.The end group measurement was performed with 90 picoballs of a central fraction sample of diphenyl column fibroblast interferon peak, and Met was detected as the N-terminus.
섬유아세포 인터페론 및 백혈구 인터페론 시료 각 150피코몰을 트립신 침지시키고 침지물을 크로마토그라피한 바, 이 두 가지의 인터페론에 공통적인 펩티드 단편을 발견할 수 없었다.Fibroblast Interferon and Leukocyte Interferon Samples Each of the 150 picomoles of trypsin immersed and chromatographically immersed, no peptide fragments common to both interferons were found.
섬유아세포 인터페론 1.25나노몰의 서열은 N-말단으로 Met이 확인되고 또한 헌커필러 및 후드(Hunkapillar and Hood)에 의해 서열 3 내지 10은 Tyr3-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-임이 확인되었다. [참조 Biochemistry 17, 2124 (1978)] 추가로 5.9 나노몰의 섬유아세포 인터페론의 서열을 분석한 결과 다음과 같은 NH2-말단 서열로 구성됨을 알 수 있었다 : H2N-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu5-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe15-Gln-…-Gln-Lys19-…The sequence of fibroblast interferon 1.25 nanomole is Met-identified at the N-terminus, and SEQ ID NOs: 3 to 10 by Hunkapillar and Hood indicate Tyr 3 -Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln 10 -has been confirmed. [Reference Biochemistry 17, 2124 (1978)] Further analysis of the sequence of 5.9 nanomole fibroblast interferon showed that the NH 2 -terminal sequence was composed of the following: H 2 N-Met-Ser-Tyr- Asn-Leu 5 -Leu-Gly-Phe-Leu-Gln 10 -Arg-Ser-Ser-Asn-Phe 15 -Gln-... -Gln-Lys 19 -...
[실시예 4]Example 4
인체섬유아세포(세포선 GM 2504A)로부터 조(粗) 인터페론을 제조한다. 이 조 인터페론은 포화염나트륨을 첨가하여 1M 염화나트륨용액으로 만든다. 이 물질을 블루세파로즈-4B 컬럼(배드부피 20 내지 25㎖, 2.5㎝, 직경 2.5㎖/분)을 통해 준다. 조(粗) 물질은 부하에 걸려있는 동안 얼음중에 보관한다. 부하를 걸어준 후, 컬럼을 250㎖의 다음 용액(2.5㎖/분)으로 세척한다 : 30% 에틸렌글리콜, 1M NaCl, 50mM Na2HPO4(pH7.2).Crude interferon is prepared from human fibroblasts (cell line GM 2504A). This crude interferon is made into 1M sodium chloride solution by the addition of saturated sodium chloride. This material is passed through a Blue Sepharose-4B column (bed volume 20-25 mL, 2.5 cm, diameter 2.5 mL / min). Crude material is stored in ice while under load. After loading, the column is washed with 250 ml of the following solution (2.5 ml / min): 30% ethylene glycol, 1 M NaCl, 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 7.2).
최종적으로, 인터페론을 250㎖의 다음 용액으로써 2.5㎖/분의 유속으로 용출시킨다 : 50% 에틸렌글리콜, 1M NaCl, 50mM Na2HPO4(pH 7.2).Finally, the interferon is eluted with 250 ml of the following solution at a flow rate of 2.5 ml / min: 50% ethylene glycol, 1 M NaCl, 50 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2.
최초의 블루세파로즈 컬럼으로부터 피이크분획을 집결시켜 다음 용액으로써 10% 에틸렌글리콜로 희석한다 : 2M NaCl, 50mM Na2HPO4(pH7.2).The peak fractions are collected from the original Blue Sepharose column and diluted with 10% ethylene glycol as the following solution: 2M NaCl, 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 7.2).
이 물질을 블루세파로즈 컬럼(20 내지 25㎖ 배드부피, 직경 2.5㎝, 유속 2.5㎖/분)에 걸어서 2M NaCl, 50mM Na2HPO4(pH7.2) 및 30% 에틸렌글리콜을 함유하는 250㎖의 용액으로 세척하고, 2M NaCl, 50mM Na2HPO4(pH7.2)및 50% 에틸렌글리콜을 함유하는 용액으로 용출시킨다.250 ml of 2M NaCl, 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 7.2) and 30% ethylene glycol were suspended on a Blue Sepharose column (20-25 mL bed volume, 2.5 cm diameter, 2.5 mL / min flow rate). Washed with a solution of 2M NaCl, 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 7.2) and eluted with a solution containing 50% ethylene glycol.
[HPLC][HPLC]
시료 : 사용된 최초 시료는 블루 세파로즈로부터의 50% 에틸렌글리콜 절단물이다. 차후 시료는 블루 세파로즈를 통해 2회 가동된 것으로서, 이 경우 30% 또는 50% 에틸렌글리콜 절단물중의 인터페론을 사용할 수 있다.Sample: The first sample used was a 50% ethylene glycol cut from Blue Sepharose. Subsequent samples were run twice through Blue Sepharose, in which case interferon in 30% or 50% ethylene glycol cleavage may be used.
25×0.46㎝ 린크로소브 RP-8컬럼을 사용한다. 이 컬럼을 처음 물로 세척하고 이어 블루-세파로즈 용출물을 펌핑시킨다. 펌핑전에 5㎖ 혼합쳄버를 사용한다. HPLC 컬럼은 1M 포름산/0.8M 피리딘으로 유지된 일정 pH4.2에서 단계적으로 다음 구배의 n-프로판올로 첨가하여 22㎖/시간의 속도로 유출시킨다.Use a 25 × 0.46 cm Linkrosov RP-8 column. The column is first washed with water and then the blue-sepharose eluate is pumped. Use 5 ml mixing chamber before pumping. The HPLC column is added stepwise to the next gradient of n-propanol at constant pH4.2 maintained at 1 M formic acid / 0.8 M pyridine and flowed out at a rate of 22 ml / hour.
이어서 컬럼을 60% n-프로판올로 세척한 다음 조작을 위해 0%로 재평형시킨다.The column is then washed with 60% n-propanol and then rebalanced to 0% for operation.
인터페론은 32% 단계(80 내지 90분)의 종말에서 용출된다. 이 물질은 고오마시블루(Coomassie Blue)로서 착색하거나 프로람(Fluram)으로 시료를 사전 표지하여 NaDodSO4아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정되는 바와 같이 균질물질이다.Interferon elutes at the end of 32% steps (80-90 minutes). This material is homogeneous, as measured by NaomadSO 4 acrylamide gel electrophoresis, either stained as Coomassie Blue or pre-labeled with Fluram.
4가지의 별도 제법에 의해 제조된 9개의 별개시료에 대해 아미노산분석(24시간 가수분해, 0.2% TGA, 5.7N HCl)을 수행하였다. 루신을 대략 22.0으로 잡을 때, 상대치로서의 아미노산 평균조성이 다음 표에 나타난 바와 같다.Amino acid analysis (24 hour hydrolysis, 0.2% TGA, 5.7N HCl) was performed on nine separate samples prepared by four separate preparations. When leucine is set at approximately 22.0, the amino acid average composition as a relative value is shown in the following table.
본 실시예 및 이전 실시예에서 제시한 것과 같은 다른 조작법에 따라 조작되고, 다른 시간에 분석된 몇개 시료를 기준으로 0.2% 티오글리콜산을 함유하는 6N HCl 중에서 24시간 가수분해하여 균질의 섬유아세포 인터페론을 분석한 대표적인 아미노산의 분석치(±15%)는 다음과 같다.Homogeneous fibroblast interferon by hydrolysis in 6N HCl containing 0.2% thioglycolic acid based on several samples analyzed at different times and manipulated according to different manipulations as shown in this and previous examples The analysis value of the representative amino acids analyzed (± 15%) is as follows.
[실시예 5]Example 5
[균질 인체 섬유아세포 인터페론의 비경구 투여용 제형][Formula for parenteral administration of homogeneous human fibroblast interferon]
고유활성도가 4×108단위/㎎인 균질인체 섬유아세포 인터페론 총 1.5㎎을 25㎖의 5% 정상인간 혈청알부민에 용해한다. 이 용액을 세균여과기를 통과시킨 다음 무균상태에서 100개 바이알에 분배한다. 각 바이알은 비경구적 투여에 적합한 순수한 인터페론 6×106단위를 함유한다. 바이알은 사용전 냉소(-20℃)에 보관하는 것이 바람직하다.A total of 1.5 mg of homogeneous fibroblast interferon with an intrinsic activity of 4 × 10 8 units / mg is dissolved in 25 ml of 5% normal human serum albumin. The solution is passed through a bacterial filter and then dispensed into 100 vials aseptically. Each vial contains 6 × 10 6 units of pure interferon suitable for parenteral administration. The vial is preferably stored in a cold (-20 ° C.) prior to use.
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