KR100380147B1 - Process for the detection of rheumatoid autoimmune antibodies and kit for the detection thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈장이나 혈청내에 존재하는 류마티스성 자가면역 항원에 특이적인 여러 자가항체의 동시 검출방법 및 검출키트에 관한 것으로서, 1 회의 시험으로 1 항체만을 검출하는 기존의 방법에 비해 사용이 편리하고 적은 양의 시료를 필요로 하므로 류마티스성 자가면역 항체의 검출 및 그의 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.The present invention relates to a method and kit for the simultaneous detection of several autoantibodies specific for rheumatoid autoimmune antigens present in plasma or serum, which are easier and less convenient than conventional methods for detecting only one antibody in a single test. Since a positive sample is required, it can be used as a very useful tool for the detection and study of rheumatoid autoimmune antibodies.
Description
본 발명은 류마티스성 자가면역 항체(rheumatoid autoimmune antibodies)의 검출에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 혈장이나 혈청중에 존재하는 류마티스성 자가면역 항원(rheumatoid autoimmune antigens)에 특이적인 여러 자가항체(autoantibodies)를 동시에 검출하는 방법 및 류마티스성 자가면역 항체의 검출키트에 관한 것이다.The present invention relates to the detection of rheumatoid autoimmune antibodies, and more specifically, to a variety of autoantibodies specific to rheumatoid autoimmune antigens present in plasma or serum. The present invention relates to a method for simultaneous detection and a detection kit for rheumatoid autoimmune antibodies.
류마티스성 질환은 관절, 뼈 및 근육 등의 전신에 통증을 일으키며, 관절염 (rheumatoid arthritis), 전신 홍반성 낭창(SLE; systemic lupus erythematosus) 등 그 종류도 100 여종에 달하는 자가면역 질환이다. 이러한 류마티스성 질환은 남성보다 여성에게 더 많이 일어나고, 그 원인에 대해서는 아직 명확하게 밝혀진 것이 없으며 다만 유전적인 요인, 약물, 환경오염 물질 등에 의해 유발되는 것으로 추측되고 있을 뿐이다. 이와 같이 질병의 원인이 불분명하여 아직 특별한 치료제가 개발되어 있지 않은 상태로 완치되기가 상당히 어렵다. 게다가, 질병의 증상이 다양하여 단순히 증상만으로 질병을 판단하기가 쉽지 않아, 조기 발견 및 치료를 위해서는 환자를 정확하게 진단하는 것이 무엇보다 중요하다.Rheumatoid disease causes pain in the whole body such as joints, bones, and muscles, and is one of 100 types of autoimmune diseases including arthritis (rheumatoid arthritis) and systemic lupus erythematosus (SLE). Rheumatoid disease is more common in women than in men, the cause of which is not yet clear, but only genetic factors, drugs, environmental pollutants, etc. are supposed to be caused. As such, the cause of the disease is unclear, and it is very difficult to cure a state in which a special therapeutic agent is not yet developed. In addition, since the symptoms of the disease are various and it is not easy to judge the disease simply by the symptoms, it is important to accurately diagnose the patient for early detection and treatment.
보통 류마티스성 질환을 진단하는데에는 여러 가지 검사방법을 복합적으로 사용하는데, 그중 표지체에 대한 면역학적 검사는 유용한 참고자료로 사용되고 있다. 류마티스성 질환의 표지체로는 류마티스 인자(RF; rheumatoid factor), 항핵항체(ANA; anti-nuclear antibody), 추출가능한 핵항원(ENA; extractable nuclear antigen)에 대한 항체, Jo-1 단백질 등을 들 수 있다. RF 시험은 인간 IgG Fc단편에 대한 항체(IgG, IgM 및 IgA)를 검출하는 정량적 방법으로, 환자중 70∼80%가 양성으로 나타나고 정상인들중 일부도 양성으로 나타난다. ANA 시험은 DNA나 RNA와 같은 핵산에 대해 생성된 항체를 검출하는 방법이다. 또한, ENA 시험은 핵으로부터 추출가능한 RNA-단백질 복합체와 일부 핵산관련 단백질을 검출하는 방법이다. 이중 RNP(ribonucleoprotein) 항원은 U1 snRNA와 단백질의 복합체로서, 복합 결합조직 질환(mixed connective tissue diseases), 전신 홍반성 낭창 또는 진행성 전신 경화(progressive systemic sclerosis) 등의 표지항원으로 알려져 있다. RNP 항원은 보통 Sm(Smith) 항원과 복합체를 이루고 있어 분리하지 않고 함께 사용하고 있다. Sm 항원은 비히스톤 당단백질(non-histone glycoprotein)로서, U1, U2, U4, U5, U6 snRNA와 복합체를 이루고 있으며 전신 홍반성 낭창에 매우 유용한 표지체이다. 한편, 눈물샘이나 침샘 등에 염증이 발생하여 눈물이나 침의 분비가 저해되는 스죠그렌스 증후군(Sjogren's syndrome)의 표지체인 SS-A와 SS-B는 RNA-단백질 복합체로서, 전신 홍반성 낭창 환자의 일부도 이 항원에 대한 항체를 갖고 있다. 상기한 바와 같은 항원들은 핵으로부터 추출가능한 RNA-단백질 복합체로서 보통 "ENA"라 명한다. Scl-70은 토포이소머라제(topoisomerase) I으로 핵뿐만 아니라 세포질에서도 발견되며 피부병변(scleroderma) 등의 진단에 사용된다. Jo-1은 히스티딜 tRNA 합성효소(histidyl tRNA synthetase)로서 다발성 근육염(polymyositis)이나 피부근육염(dermatomyositis)과 같은 만성 근육염 등의 진단에 사용된다.Usually, a variety of test methods are used in the diagnosis of rheumatic diseases, among which immunological tests for markers are used as useful references. The markers for rheumatic diseases include rheumatoid factor (RF), anti-nuclear antibody (ANA), antibodies to extractable nuclear antigen (ENA), and Jo-1 protein. have. RF testing is a quantitative method of detecting antibodies to human IgG F c fragments (IgG, IgM and IgA), with 70-80% of patients positive and some of the normal persons positive. The ANA test is a method of detecting antibodies generated against nucleic acids such as DNA or RNA. ENA testing is also a method of detecting RNA-protein complexes and some nucleic acid-related proteins extractable from the nucleus. Dual RNP (ribonucleoprotein) antigens are complexes of U1 snRNAs and proteins, and are known as marker antigens such as mixed connective tissue diseases, systemic lupus erythematosus or progressive systemic sclerosis. RNP antigens are usually complexed with Sm (Smith) antigens and used together without separation. Sm antigen, a non-histone glycoprotein, is complexed with U1, U2, U4, U5, and U6 snRNA and is a very useful marker for systemic lupus erythematosus. Meanwhile, SS-A and SS-B, which are markers of Sjogren's syndrome, which cause inflammation of the tear glands or salivary glands and inhibit the secretion of tears or saliva, are RNA-protein complexes. It has an antibody against this antigen. Antigens as described above are commonly termed "ENA" as RNA-protein complexes extractable from the nucleus. Scl-70 is a topoisomerase I found not only in the nucleus but also in the cytoplasm and used to diagnose skin lesions (scleroderma). Jo-1 is a histidyl tRNA synthetase and is used for the diagnosis of chronic myositis, such as polymyositis or dermatomyositis.
상기한 표지체들은 주로 혈청학적 방법에 의해 검출되며 질병의 진단에 매우 유용한 근거를 제공한다. 예를들어, 대부분의 전신 홍반성 낭창에서는 ANA가 검출되고, RNP 항원, Sm 항원, SS-A 및 SS-B 항원 또한 검출되는 빈도가 높다. 또한, 스죠그렌스 증후군의 경우 SS-A 및 SS-B 항원이 검출된다. 따라서, 단일 항원에 대해서만 시험하는 것은 부정확한 결과를 초래할 수 있으므로, 통상적으로 여러 항원에 대해 시험을 해야만 정확한 진단이 이루어질 수 있다.Such labels are mainly detected by serological methods and provide a very useful basis for the diagnosis of disease. For example, in most systemic lupus erythematosus, ANA is detected and the frequency of RNP antigen, Sm antigen, SS-A and SS-B antigen is also high. In addition, for Sjogren's syndrome, SS-A and SS-B antigens are detected. Therefore, testing only against a single antigen can lead to inaccurate results, and therefore, an accurate diagnosis can usually be made only by testing against multiple antigens.
한편, 류마티스성 자가면역 항체의 면역학적 검출방법으로는효소면역측정법(enzyme immunoassay), 이원 면역확산법(double immunodiffusion) 및 면역형광법(immuno-fluorescence) 등이 알려져 있다. 그러나, 이와 같은 기존의 방법에 따르는 경우, 정확한 진단을 위해서는 각각의 자가면역 항원에 대해 별도로 시험을 수행해야 하므로, 사용하기가 번거롭고 다량의 시료를 필요로 하는 문제점이 있다. 따라서, 1 회의 시험으로 여러 류마티스성 자가면역 항원에 대한 자가항체를 동시에 검출할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요청되어 왔다.On the other hand, as an immunological detection method of rheumatoid autoimmune antibodies, enzyme immunoassay, double immunodiffusion, immunofluorescence and the like are known. However, according to this conventional method, since the test must be performed separately for each autoimmune antigen for accurate diagnosis, it is troublesome to use and requires a large amount of samples. Therefore, there has been a demand for the development of a new method capable of simultaneously detecting autoantibodies against several rheumatic autoimmune antigens in one trial.
본 발명자들은 단 1 회의 시험으로 여러 류마티스성 자가면역 항원에 대한 자가항체를 동시에 검출해낼 수 있는 면역측정법(immunoassay)을 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행해왔다. 그 결과, 여러 류마티스성 자가면역 항원이 서로 독립적으로 부착된 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막과 같은 고정체를 사용함으로써 류마티스성 자가면역 환자의 혈액중에 존재하는 여러 자가항체를 동시에 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.The inventors have carried out ongoing studies to develop immunoassays that can simultaneously detect autoantibodies against several rheumatic autoimmune antigens in just one test. As a result, it was confirmed that by using a fixture such as a nitrocellulose membrane to which several rheumatic autoimmune antigens were independently attached to each other, it was possible to simultaneously detect several autoantibodies present in the blood of rheumatoid autoimmune patients. The present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 여러 류마티스성 자가면역 질환의 표지체를 항원으로 사용하여 혈액내에 존재하는 여러 자가항체를 동시에 검출하는 방법 및 류마티스성 자가면역 항체의 검출키트를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for simultaneously detecting various autoantibodies present in blood using markers of various rheumatic autoimmune diseases and a detection kit for rheumatoid autoimmune antibodies.
도 1은 류마티스성 자가면역 항원이 부착된 스트립 및 판정기준을 나타낸 도면;1 shows a strip attached with rheumatoid autoimmune antigens and criteria for determination;
도 2는 류마티스성 자가면역 환자의 혈장을 이용한 면역블롯 자가면역 시험결과를 나타낸 도면; 및,Figure 2 shows the results of immunoblot autoimmune test using plasma of rheumatoid autoimmune patients; And,
도 3은 정상인의 혈장을 이용한 면역블롯 자가면역 시험결과를 나타낸 도면.Figure 3 is a diagram showing the results of immunoblot autoimmunity test using plasma of a normal person.
본 발명은 2 이상의 류마티스성 자가면역 항원이 서로 독립적으로 부착된 고정체에 시료를 가하여 시료내에 존재하는 자가항체(autoantibody)를 상기 항원과 결합시킴으로써 시료내의 2 이상의 자가항체를 동시에 검출하는, 류마티스성 자가면역 항체의 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 류마티스성 자가면역 항원은 바람직하게는 류마티스 인자, 핵항원(nuclear antigen) 및 ENA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 것, 보다 바람직하게는 RNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 및 Jo-1이다. 또한, 자가항체는 인간 IgG인 것이 바람직하고, 고정체는 니트로셀룰로스 막인 것이 바람직하며, 상기 니트로셀룰로스 막을 스트립(strip) 형태로 제조하여 사용하는 것이 보다 바람직하다.The present invention is to detect two or more autoantibodies in a sample simultaneously by adding a sample to a fixture to which two or more rheumatoid autoimmune antigens are independently attached to each other and binding an autoantibody present in the sample to the antigen. The present invention relates to a method for detecting autoimmune antibodies. In the method according to the invention, the rheumatic autoimmune antigen is preferably at least one selected from the group consisting of rheumatoid factor, nuclear antigen and ENA, more preferably RNP / Sm, Sm, SS- A, SS-B, Scl-70 and Jo-1. In addition, the autoantibody is preferably human IgG, the fixture is preferably a nitrocellulose membrane, and more preferably, the nitrocellulose membrane is prepared in a strip form.
예를들어, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는 것이다:For example, the method of the present invention includes the following steps:
ⅰ) 2 이상의 류마티스성 자가면역 항원이 서로 독립적으로 부착된 니트로셀룰로스 스트립에 혈장 또는 혈청시료를 가하여 시료내에 존재하는 자가항체를 상기 항원과 결합시키는 단계;Iii) adding a plasma or serum sample to a nitrocellulose strip to which two or more rheumatoid autoimmune antigens are independently attached to each other to bind autoantibodies present in the sample with the antigens;
ⅱ) 상기 자가항체에 대한 표지항체 접합체를 가하여 스트립에 부착된 자가항체와 결합시키는 단계;Ii) adding a labeled antibody conjugate to the autoantibody to bind to the autoantibody attached to the strip;
ⅲ) 결합한 표지항체 접합체의 표지를 이용하여 발색을 유도하는 단계; 및,Iii) inducing color development using the label of the conjugated label antibody conjugate; And,
ⅳ) 상기 발색 정도를 대조군(control band)과 비교하는 단계.Iii) comparing the degree of color development with a control band.
상기 방법에서, 단계 ⅲ)의 표지항체 접합체는 바람직하게는 인간 IgG에 특이적으로 결합하는 항체이고, 단계 ⅳ)에서는 대조군을 2 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.In this method, the labeling antibody conjugate of step iii) is preferably an antibody that specifically binds to human IgG, and in step iv) it is preferred to use a control at a concentration of at least two.
본 발명은 또한 ⅰ) 2 이상의 류마티스성 자가면역 항원이 서로 독립적으로 부착된 고정체; ⅱ) 표지항체 접합체; 및, ⅲ) 발색제를 함유하는 기질용액을 포함하는 류마티스성 자가면역 특이항체의 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트에있어서, 류마티스성 자가면역 항원은 바람직하게는 류마티스 인자, 핵항원 및 ENA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 것, 보다 바람직하게는 RNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 및 Jo-1이다. 고정체는 니트로셀룰로스 막인 것이 바람직하고, 특히 스트립 형태로 제조된 니트로셀룰로스 막이 보다 바람직하며, 2 이상의 농도의 대조군이 추가로 부착된 것이 바람직하다. 또한, 표지항체 접합체는 인간 IgG에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다.The present invention also provides a display comprising: a) a fixture wherein two or more rheumatoid autoimmune antigens are independently attached to each other; Ii) labeling antibody conjugates; And iii) a diagnostic kit for a rheumatoid autoimmune specific antibody comprising a substrate solution containing a color developer. In the kit of the invention, the rheumatoid autoimmune antigen is preferably at least one selected from the group consisting of rheumatoid factor, nuclear antigen and ENA, more preferably RNP / Sm, Sm, SS-A, SS-B , Scl-70 and Jo-1. It is preferred that the fixture is a nitrocellulose membrane, in particular a nitrocellulose membrane made in strip form, more preferably two or more concentrations of control attached. It is also preferred that the label antibody conjugate specifically binds to human IgG.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
첫째, 본 발명은 류마티스성 자가면역 질환의 표지체를 항원으로 사용하여 그에 대한 자가항체를 검출하는 면역측정법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 여러 류마티스성 자가면역 질환의 표지항원이 서로 독립적으로 부착된 고정체를 이용하여 혈액내에 존재하는 그에 대한 자가항체들을 동시에 검출하는 면역블롯(immunoblot) 측정법을 제공한다. 이를 위하여, 본 발명은 고정체로서 스트립 형태로 제조된 니트로셀룰로스 막을 사용할 수 있다. 예를들어, 본 발명에 따른 면역블롯 측정법은First, the present invention provides an immunoassay for detecting autoantibodies using a label of a rheumatoid autoimmune disease as an antigen. Specifically, the present invention provides an immunoblot assay for simultaneously detecting autoantibodies present in blood using a fixture to which labeled antigens of various rheumatic autoimmune diseases are independently attached to each other. To this end, the present invention may use nitrocellulose membranes prepared in strip form as fixtures. For example, the immunoblot measurement method according to the present invention
a) 류마티스성 자가면역 항원이 부착된 니트로셀룰로스 스트립에 혈청이나 혈장시료 또는 시료희석액을 가하여 반응시키는 단계;a) reacting the nitrocellulose strip to which the rheumatoid autoimmune antigen is attached by adding serum, a plasma sample, or a sample diluent;
b) 스트립을 세척하는 단계;b) washing the strip;
c) 자가면역 항체와 그에 대한 표지항체 접합체를 반응시키는 단계;c) reacting the autoimmune antibody with a labeled antibody conjugate thereto;
d) 스트립을 세척하는 단계;d) washing the strips;
e) 발색제와 완충용액을 함유하는 기질용액을 첨가하여 발색시키는 단계;및,e) coloring by adding a substrate solution containing a coloring agent and a buffer solution; And,
f) 발색된 스트립을 판독하는 단계를 포함한다.f) reading the colored strip.
본 발명에 따른 방법에서 류마티스성 자가면역 항원이 부착된 니트로셀룰로스 스트립에 진단하고자 하는 환자의 혈청이나 혈장을 가하면 혈청이나 혈장내에 존재하는 자가항체는 니트로셀룰로스 스트립에 부착된 자가면역 항원에 결합한다. 여기에 표지항체 접합체를 가하면 접합체는 스트립에 부착된 자가항체를 인식하여 결합한다. 이와 같이 결합한 접합체는 발색제를 이용하여 발색하게 되어 자가항체를 검출할 수 있다.In the method according to the present invention, when serum or plasma of a patient to be diagnosed is added to a nitrocellulose strip to which a rheumatic autoimmune antigen is attached, autoantibodies present in the serum or plasma bind to an autoimmune antigen attached to the nitrocellulose strip. When a label antibody conjugate is added thereto, the conjugate recognizes and binds to the autoantibody attached to the strip. The conjugate thus bound is colored using a colorant to detect autoantibodies.
둘째, 본 발명은 2 이상의 류마티스성 자가면역 항원이 부착된 고정체, 표지항체 접합체 및 발색제를 함유하는 기질용액을 포함하는 류마티스성 자가면역 항체의 검출키트를 제공한다. 본 발명의 검출키트는 표지항체 접합체를 포함하는데, 바람직하게는 HRP(horsereddish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloidal gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 본 발명에서는 예를들어, 염소 유래의 항-인간 IgG-HRP 접합체(goat anti-human IgG-HRP conjugate)를 사용한다. 또한, 본 발명의 검출키트는 효소표지항체 접합체와 반응하여 발색반응이 유도되는 기질용액을 포함하는데, 바람직하게는 효소표지항체 접합체의 표지체와 반응하여 발색 침적체를 유발하는 4-클로로-1-나프톨(4-chloro-1-naphtol) 등의 발색제와 완충용액을 함유하는 기질용액을 사용한다. 상기 기질용액내 4-클로로-1-나프톨과 같은 발색제는 효소표지항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체가 생성되고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인하여 자가항체의 존재 유무를 검출한다.Secondly, the present invention provides a detection kit for rheumatoid autoimmune antibodies comprising a substrate solution containing two or more rheumatoid autoimmune antigen-attached fixtures, a labeled antibody conjugate, and a coloring agent. The detection kit of the present invention includes a label antibody conjugate, preferably a horsereddish peroxidase (HRP), a basic alkaline phosphatase, a colloidal gold, a fluorescein, a dye, and the like. Labels can be used. In the present invention, for example, goat anti-human IgG-HRP conjugates are used. In addition, the detection kit of the present invention includes a substrate solution that induces a color reaction by reacting with an enzyme-labeled antibody conjugate. Preferably, 4-chloro-1 reacts with a label of the enzyme-labeled antibody conjugate to cause a color deposit. -Use a substrate solution containing a colorant such as naphthol (4-chloro-1-naphtol) and a buffer solution. A color developing agent such as 4-chloro-1-naphthol in the substrate solution was decomposed by HRP used as a label of the enzyme-labeled antibody conjugate to generate a color deposit, and visually confirm the degree of deposition of the color deposit. Detects the presence or absence.
본 발명에 따른 방법 및 키트에 사용되는 류마티스성 자가면역 항원은 류마티스 인자, DNA, RNA, 히스톤 등의 핵항원, ENA 등이며, 예를들어 RNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 및 Jo-1이다. 상기 자가면역 항원은 토끼나 돼지 등의 동물로부터 유래된 것으로서, 바람직하게는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 고순도로 정제된 것을 사용한다.Rheumatoid autoimmune antigens used in the methods and kits according to the invention are rheumatoid factor, DNA, RNA, nuclear antigens such as histones, ENAs, etc. For example, RNP / Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 and Jo-1. The autoimmune antigens are derived from animals such as rabbits and pigs, and preferably those purified by high purity by immunoaffinity chromatography are used.
또한, 본 발명에서는 자가항체의 양에 따라 발색반응의 강도를 나타내기 위하여 대조군으로 인간 IgG를 사용할 수 있는 바, 바람직하게는 2 이상의 농도로 인 간 IgG를 니트로셀룰로스 막에 부착시켜 반응의 정도를 나타내는 지표로 사용한다. 보다 상세하게는, 가장 높은 농도의 IgG 보다 반응이 강하게 나오는 것은 강양성으로, 중간 농도의 IgG 보다 강하고 가장 높은 IgG 보다 약한 것은 중양성으로, 중간 농도의 IgG와 비슷한 것은 약양성으로 하여 자가항체의 양을 판정할 수 있도록 한다. 3 가지 농도의 IgG를 사용하는 경우에는 가장 낮은 농도의 IgG 보다 같거나 강하고 중간 농도의 IgG 보다 낮은 경우에는 반응이 일어나지 않는 시료와 마찬가지로 음성으로 처리하지만 약간의 반응이 있는 것으로 인정하여 항체의 양이 적거나 비특이적인 반응에 의한 것으로 판단할 수 있도록 한다.In addition, in the present invention, human IgG can be used as a control to indicate the intensity of the color reaction according to the amount of autoantibodies. Preferably, human IgG is attached to the nitrocellulose membrane at a concentration of 2 or more to improve the degree of reaction. Use as an indicator to indicate. More specifically, the response is stronger than that of the highest concentration of IgG, which is strongly positive, the weaker than the highest IgG, and the neutral of the weaker than the highest IgG. Allow the quantity to be determined. When three concentrations of IgG are used, the same or stronger than the lowest IgG and lower than the medium IgG, the reaction is treated as negative as the sample that does not occur, but the amount of antibody is recognized as having a slight reaction. Allow for judging by small or nonspecific reactions.
일반적으로, 단백질을 니트로셀룰로스 막에 부착시키는 방법으로는 단순히 단백질 용액을 적하한후 건조시키는 방법, 분사장치를 이용하여 용액을 분사하는 방법 또는 감압장치와 연결된 몰드를 이용하는 방법 등이 있다. 단백질이 니트로셀룰로스 막에 부착되는 형태로는 띠 모양과 작은 원 모양이 사용되고 있다. 본 발명에서는 예를들어, 감압장치와 연결된 몰드를 이용하여 띠 모양으로 자가면역 항원을 니트로셀룰로스 막에 부착시켜 사용한다.In general, a method of attaching a protein to a nitrocellulose membrane may include simply dropping a protein solution and then drying it, spraying the solution using an injector, or using a mold connected to a decompression device. Bands and small circles are used as proteins to attach to nitrocellulose membranes. In the present invention, the autoimmune antigen is attached to the nitrocellulose membrane in a band shape using, for example, a mold connected to a pressure reducing device.
본 발명의 방법 및 키트를 류마티스성 자가면역 환자 및 정상인의 혈장에 대해 적용한 결과, 55 명의 자가면역 환자중 53 명이 자가면역 항원에 반응하였고 52 명의 정상인중 단 2 명만이 약하게 반응하였다. 따라서, 본 발명에 따른 방법 및 키트는 류마티스성 자가면역 항체의 검출 및 그의 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.The methods and kits of the present invention were applied to the plasma of rheumatoid autoimmune patients and normal subjects. As a result, 53 of 55 autoimmune patients responded to autoimmune antigen and only 2 of 52 normal individuals responded weakly. Thus, the methods and kits according to the present invention can be used as very useful tools for the detection and study of rheumatoid autoimmune antibodies.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these Examples are only for the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these Examples.
실시예 1: 류마티스성 자가면역 환자 및 정상인에 대한 면역블롯 측정Example 1 Immunoblot Measurement for Rheumatic Autoimmune Patients and Normal Subjects
본 실시예에서는 류마티스성 자가면역 질환의 표지항원으로서 RNP/Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 및 Jo-1 항원(바이오디자인(Biodesign)사, 친화성 정제, 미국)을 사용하였다. 또한, 대조군으로서 인간 IgG를 사용하여 자가항체에 대한 정성적 측정뿐만 아니라 판정기준을 통해 반응의 강도를 분석할 수 있도록 하였다(도 1).In this example, RNP / Sm, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 and Jo-1 antigens (Biodesign, Affinity Tablet, USA) were used as marker antigens for rheumatoid autoimmune diseases. Used. In addition, human IgG was used as a control to analyze the intensity of the response through the criteria as well as qualitative measurement of autoantibodies (FIG. 1).
자가면역 항원이 부착된 스트립을 다음과 같이 제조하였다. 감압장치와 연결된 슬롯 몰드에 여과지와 니트로셀룰로스 막을 끼워넣어 조립한후 각각의 자가면역 항원과 대조군으로 인간 IgG 항체를 3 가지 농도로 하여 인산염 완충용액(pH 7.0)에 1∼10 mg/㎖이 되도록 희석한후 2 ㎖씩 각 슬롯 몰드에 첨가하였다. 용액이 다 들어가면 몰드를 해체하고 니트로셀룰로스 막을 떼어내어 3∼4 시간동안 상온에서 건조시켰다. 1% 카제인이 포함된 인산염 완충용액에서 2 시간동안 상온에서 방치한후 니트로셀룰로스 막을 꺼내고 18 시간동안 건조시켰다. 건조가 완료된후 접착 지지대로 니트로셀룰로스 막을 붙인후 가로 0.3 cm, 세로 4cm 정도의 스트립 형태로 절단하여 사용하였다(도 1).Strips to which autoimmune antigens were attached were prepared as follows. Insert the filter paper and the nitrocellulose membrane into the slot mold connected to the decompression device, and assemble them. Then, each concentration of human IgG antibody and autoimmune antigen and control were adjusted to 1-10 mg / ml in phosphate buffer (pH 7.0). After dilution, 2 ml was added to each slot mold. Once the solution had entered, the mold was dismantled and the nitrocellulose membrane was removed and dried at room temperature for 3 to 4 hours. After leaving at room temperature for 2 hours in phosphate buffer containing 1% casein, the nitrocellulose membrane was taken out and dried for 18 hours. After the drying was completed, the nitrocellulose membrane was attached to the adhesive support, and then cut into strips having a length of about 0.3 cm and about 4 cm.
자가면역 항원이 부착된 스트립을 가로 1 cm, 세로 10 cm 정도의 웰이 있는 플레이트에 하나씩 넣은후 1.0% 카제인과 0.1∼1.0% 트리톤 X-100이 함유된 인산염 완충용액을 시료희석액으로 하여 각각의 스트립에 1 ㎖씩 첨가하고 시료를 20 ㎕씩 첨가하여 잘 혼합한후 상온에서 교반하면서 2 시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된후 0.05% 트윈 20을 함유한 인산염 완충용액을 사용하여 스트립을 5 회에 걸쳐 세척하였다. 염소 유래의 항-인간 IgG-HRP의 접합체(카펠(Cappel)사, IgG Fc특이적, 친화성 정제, 미국)를 30% FBS와 0.1% 트윈 20이 포함된 인산염 완충용액(pH 7.0)을 희석액으로 사용하여 1:500∼1:2000의 비율로 희석한후 효소표지항체 접합체 1 ㎖씩을 상기 스트립에 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된후 웰 플레이트를 0.05% 트윈 20이 포함된 인산염 완충용액으로 5 회 세척하고, 15∼20 mM의 4-클로로-1-나프톨을 0.015%의 과산화수소, 0.28% 트리에탄올아민 및 0.15 M 염화나트륨으로 구성된 기질 완충용액(pH 7.5)에 1:5의 비율로 희석한 것을 1 ㎖씩 첨가하여 20 분간 발색시켰다. 적당하게 발색이 이루어진후 스트립을 증류수로 2 회 세척하여 반응을 종결시켰다. 상기와 같은 방법으로 류마티스성 자가면역 환자의 혈장시료 55 개와 정상인의 혈장시료 52 개를 대상으로 자가항체 검출시험을 수행하고, 자가면역 환자의 혈장을 이용한 시험결과를 하기 표 1 및 도 2에, 정상인의 혈장을 이용한 시험결과를 도 3에 각각 나타내었다.Put the strips attached with autoimmune antigens one by one on a plate with a width of 1 cm and 10 cm, and then use phosphate buffer solution containing 1.0% casein and 0.1-1.0% Triton X-100 as sample dilution solution. 1 ml each was added to the strip and 20 µl each sample was mixed well, followed by reaction for 2 hours with stirring at room temperature. After the reaction was completed, the strip was washed five times using phosphate buffer containing 0.05% Tween 20. A conjugate of goat-derived anti-human IgG-HRP (Cappel, IgG F c specific, affinity purified, USA) was prepared using phosphate buffer (pH 7.0) containing 30% FBS and 0.1% Tween 20. After diluting at a ratio of 1: 500 to 1: 2000 using a diluent, 1 ml of each enzyme-labeled antibody conjugate was added to the strip and reacted at room temperature for 30 minutes. After completion of the reaction, the well plate was washed five times with phosphate buffer solution containing 0.05% Tween 20, and 15-20 mM 4-chloro-1-naphthol was washed with 0.015% hydrogen peroxide, 0.28% triethanolamine and 0.15 M sodium chloride. 1 ml of the diluted 1: 5 ratio was added to the constructed substrate buffer (pH 7.5) and developed for 20 minutes. After proper color development, the strip was washed twice with distilled water to terminate the reaction. The autoantibody detection test was performed on the plasma samples of the rheumatoid autoimmune patients and the plasma samples of the normal subjects in 52 and the plasma samples of the autoimmune patients in Table 1 and FIG. 2. Test results using the plasma of normal persons are shown in FIG. 3.
상기 표 1, 및 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 자가면역 환자의 혈장시료 55 개중 53 개를 양성으로 판정하였고 정상인의 혈장시료 52 개중 50 개를 음성으로 판정하였다.As shown in Table 1 and FIGS. 2 and 3, 53 out of 55 plasma samples of autoimmune patients were determined to be positive, and 50 out of 52 plasma samples of normal individuals were determined to be negative.
실시예 2: 류마티스성 자가면역 항체의 검출키트의 제조Example 2 Preparation of a Detection Kit for Rheumatoid Autoimmune Antibodies
각각 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 자가면역 항원 부착 니트로셀룰로스 스트립, 염소 유래 항-인간 IgG-HRP 접합체 용액 및 4-클로로-1-나프톨 함유 기질완충용액을 약제학적으로 허용되는 용기에 포장하여 류마티스성 자가면역 항체의 검출키트를 제조하였다.Each of the autoimmune antigen-attached nitrocellulose strips, goat-derived anti-human IgG-HRP conjugate solution and 4-chloro-1-naphthol containing substrate buffer solution prepared according to the method described in Example 1 above was placed in a pharmaceutically acceptable container. The package was prepared for the detection kit of rheumatoid autoimmune antibody.
본 발명에 따르면, 1 회의 시험으로 여러 류마티스성 자가면역 항체를 동시에 검출할 수 있게 되므로, 1 회의 시험으로 1 항체만을 검출하는 기존의 방법과 비교하여 사용이 편리하고 적은 양의 시료를 필요로 하여 류마티스성 자가면역 항체의 검출 및 그의 연구에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있다.According to the present invention, since it is possible to detect several rheumatoid autoimmune antibodies at the same time in one test, it is easier to use compared to the conventional method of detecting only one antibody in one test. It can be used as a very useful tool for the detection and study of rheumatoid autoimmune antibodies.
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Cited By (2)
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WO2013105721A1 (en) * | 2012-01-13 | 2013-07-18 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Rheumatoid arthritis diagnosis kit |
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Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100988458B1 (en) * | 2007-12-11 | 2010-10-18 | 한국전자통신연구원 | Semi-quantitative immunological detection device with differential antibodies or substrates |
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PL2768851T3 (en) | 2011-10-21 | 2018-05-30 | Augurex Life Sciences Corp. | Antigens derived from citrullinated 14-3-3 and uses thereof in the diagnosis of rheumatoid arthritis |
BR112014016808B1 (en) | 2012-01-06 | 2022-01-11 | Anji Pharma (Us) Llc | USE OF A BIGUANIDE COMPOUND FOR THE MANUFACTURE OF A DRUG TO LOWER BLOOD GLUCOSE LEVELS AND FOR THE TREATMENT OF A DISORDER OF GLUCOSE METABOLISM |
JP6175074B2 (en) | 2012-01-06 | 2017-08-02 | エルセリクス セラピューティクス インコーポレイテッド | Compositions and methods for treating metabolic disorders |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4314987A (en) * | 1979-04-04 | 1982-02-09 | Rheumatology Diagnostics Laboratory | Method for diagnosing rheumatological diseases |
US5518881A (en) * | 1993-11-02 | 1996-05-21 | Flinders Medical Centre | Transfected cell lines expressing autoantigens and their use in immunoassays for the detection of autoimmune disease |
KR0182853B1 (en) * | 1995-08-07 | 1999-05-15 | 김신규 | Diagnostic technique of autoimmune disease |
KR20020021813A (en) * | 1999-08-17 | 2002-03-22 | 페르 크비스트 | Specific autoimmune reactions against isomerised/optically inverted epitopes: application for diagnosis of autoimmune diseases |
-
2001
- 2001-01-18 KR KR10-2001-0002790A patent/KR100380147B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4314987A (en) * | 1979-04-04 | 1982-02-09 | Rheumatology Diagnostics Laboratory | Method for diagnosing rheumatological diseases |
US5518881A (en) * | 1993-11-02 | 1996-05-21 | Flinders Medical Centre | Transfected cell lines expressing autoantigens and their use in immunoassays for the detection of autoimmune disease |
KR0182853B1 (en) * | 1995-08-07 | 1999-05-15 | 김신규 | Diagnostic technique of autoimmune disease |
KR20020021813A (en) * | 1999-08-17 | 2002-03-22 | 페르 크비스트 | Specific autoimmune reactions against isomerised/optically inverted epitopes: application for diagnosis of autoimmune diseases |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013105721A1 (en) * | 2012-01-13 | 2013-07-18 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Rheumatoid arthritis diagnosis kit |
KR101458100B1 (en) | 2012-01-13 | 2014-11-05 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Diagnostic kit for rheumatoid arthritis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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