KR100379756B1

KR100379756B1 - 이성질체 분할방법

Info

Publication number: KR100379756B1
Application number: KR10-2000-0057916A
Authority: KR
Inventors: 정찬성; 이소하; 임대식; 신평균; 이강봉
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2000-10-02
Publication date: 2003-04-11
Also published as: KR20020026684A

Abstract

본 발명은 이성질체 분할방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 버르콜데리아 코코베네난스 SY-01(KFCC-11111)로부터 생산된 리파제를 사용하여 히드록시기 또는 에스테르기를 포함하는 키랄화합물을 효과적으로 분할하는 방법에 관한 것이다.

Description

이성질체 분할방법{Resolution of chiral compounds}

리파제(Lipase; E.C.3.1.1.3)는 아실글리세롤의 카르복실 에스테르 결합에 작용하여 유기산과 글리세롤을 생성시키는 가수분해효소이다. 리파제는 리피드와 물의 접촉부위(interface)에서 반응성이 활성화(interfacial activation)되는 특징을 갖고 있어 다른 가수분해효소와 구분된다. 리파제를 이용한 반응은 매우 다양하여 계면활성제[1993, Enzyme Engineering Conference XII, Deauville], 식품[1986, J. Dairy Res. 53, 481∼505], 화장품 및 정밀화학제품[유럽특허 제343,714호, 제644,949호; 미국특허 제5,420,037호; 국제특허공개 WO 91/04334]의 제조에 유용하게 응용되고 있다. 특히 최근에는 정밀화합물 중에서도 의약품의 단일이성질체(single-isomer) 제조에 매우 유용하게 응용되고 있는 바, 이것은 리파제의 기질에 대한 특이성(subsrate specificity)을 이용한 것으로 히드록시기 또는 에스테르기가 포함된 키랄화합물(chiral compound) 중의 특정 이성질체와 선택적으로 반응하는 특성에 기인한 것이다. 리파제를 이용한 단일이성질체의 합성반응은 가수분해반응[유럽특허 제 494,203호] 또는 에스테르화반응[미국특허 제 5,639,662호]에 의해서 수행될 수 있으며, 특히 클리바노프(Klibanov) 연구 결과[미국특허 제4,601,987호]가 발표된 이래로 이 분야에 대한 연구가 폭발적으로 진행되고 있다.

리파제는 박테리아, 균, 식물, 고등동물로부터 다양하게 얻어지는데, 대표적으로 수도모나스 세파시아, 수도모나스 후루오레슨스, 캔디다 루고사, 캔디다 앤타라티카 비, 아스펠지러스 니거, 무코르 미하이, 피그 판크레아틱, 수도모나스 글루매, 수도모나스 알칼리제네스, 크로모박테륨 비스코슘 등에 의해 생산된 리파제가 현재 상업화되어 있다. 이러한 다양한 리파제는 각각 특정화합물에 대하여 반응특이성을 나타낼 수 있으나, 대부분 목적화합물의 단일이성질체 합성에 만족할 만한 결과를 나타내지는 못하였다. 특히 분자구조적으로 키랄센터가 여러 종류의 치환체로 치환되어 있는 화합물의 경우 리파제의 분할능이 떨어지는 것이 일반적이다. 따라서, 리파제의 분할능을 증대시키기 위하여 일반적으로 생합성된 공지의 리파제를 화학적 방법으로 그 구조를 변경하거나 또는 생합성 반응조건을 변화시키는 방법을 적용하고 있다. 그러나, 바람직하기로는 분할능이 우수한 리파제를 자연으로부터 생합성하여 얻는 것이다.

본 발명자들은 히드록시기 또는 에스테르기가 포함된 키랄화합물(chiral compound)에 대한 입체선택적 분할능이 우수한 리파제를 자연으로부터 생합성하여 얻고자 연구 노력하였다. 그 결과, 버르콜데리아 코코베네난스(Burkholderia Cocovenenans) SY-01(KFCC-11111)로부터 생산된 리파제가 히드록시기 또는 에스테르기가 포함된 키랄화합물에 대한 입체선택적 분할능이 우수함을 알게되었고, 또 리파제를 이용한 이성질체 분할방법상의 반응온도, 반응용매 등의 조건을 최적화하여 효소반응의 효능을 극대화할 수 있음을 알게됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 생합성된 리파제를 이용하여 히드록시기 또는 에스테르기가 포함된 키랄화합물을 효과적으로 분할하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 버르콜데리아 코코베네난스(Burkholderia Cocovenenans) SY-01(KFCC-11111) 균주로부터 생산된 리파제를 사용하여 히드록시기 또는 에스테르기를 포함하는 키랄화합물을 분할하는 이성질체 분할방법을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명은 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 리파제는 버르콜데리아 코코베네난스 SY-01(KFCC-11111)로부터 생산된 것으로 올리브 유(olive oil)를 함유한 트립톤-글루코스-효모추출물 액체배지에서 3일 정도 플라스크 배양 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 조효소액으로얻는다.

본 발명의 SY-01 리파제는 표준단백질과 함께 SDS-PAGE를 행한 결과 분자량이 39 KD 정도이며, 최적 pH 범위는 7.0 ∼ 9.0이고, pH 6에서 9까지 안정하였다. 또한, SY-01 리파제의 최적 활성온도는 45℃에서 50℃ 범위이고, 40℃ 내지 60℃까지는 안정하였다. SY-01 리파제는 은, 구리, 니켈, 칼슘이온 등에 의해 저해를 받으며, 소디움 도데실설페이트에 의해서는 효소의 활성이 강한 저해를 받으나, 트윈 80이나 트리톤 X-100, 담즙산염(Gall Powder), 소디움 데옥시콜레이트를 첨가할 경우 활성이 크게 증가한다.

상기한 SY-01 리파제를 분할제로 적용함에 있어, 효소액으로 직접 사용할 수 있으나 사용상의 편리성을 감안하여 다이알리시스 및 리포필라이즈하여 고체상으로 제조하여 사용할 수도 있다.

한편, 본 발명의 SY-01 리파제는 히드록시기 또는 에스테르기를 포함하는 키랄화합물의 입체선택적 분할을 위한 분할제로 사용되어 우수한 분할능을 나타낸다. 따라서, 다음에서는 몇몇 키랄화합물에 대한 분할만을 예시하고 있으나, 실제로는 다음에서 예시하지 않은 히드록시기 또는 에스테르기를 포함하는 키랄화합물에 모두 적용할 수 있는 것이다.

상기에서 예시한 화합물은 현재 의약 및 농약분야에서 광범위하게 적용되고 있는 유용한 키랄화합물이다. 상기 키랄화합물중 화합물 1을 제외하고는 비대칭 탄소를 1개 포함하는 키랄화합물이며 거울이성질체가 동량으로 구성된 라세미체이다. 화합물 2는 비대칭탄소가 2개 있으므로 4개의 이성질체가 존재하지만 이중에서 입체적으로 시스 형태를 갖는 거울이성질체만 분할하여 사용한다. 이들 화합물에 대해 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 화합물 1은 의약품의 일종인 아졸계 살균제로 사용되는 이트라코나졸 및 케토코나졸의 전구체로서, 살균제 시장의 상당부분을 차지하고 있고 현재까지는 이성질체의 혼합물로 시장에서 팔리고 있으나 이성질체 각각의 약리학적 연구에 의해서 이중 한 이성질체(2R, 4S)가 더욱 활성이 높다는 것이 밝혀짐에 따라 단일이성질체의 제조에 많은 관심을 갖게 되었다.

상기 화합물 2는 시클로헥실피페리딘-2,6-디온과 같은 화합물을 단일이성질체로 합성할 수 있는 전구체이고 유방암을 발병시키는 아로마테이즈의 저해물질[1982, Cancer Res. 3261; 1986, J. Med. Chem. 520]로서 효과적으로 이용할 수 있다. 이 화합물은 비대칭 탄소의 입체화학이 (S)-형태가 그 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다.

상기 화합물 3은 농약품의 일종인 시스탠의 전구물질로 사용되고, 이 화합물은 상기 화합물 1과 유사한 반응기전을 갖고 있지만 스테롤 합성을 저해하는 약물로 사용된다.

상기 화합물 4는 항암제로 사용되는 베라파밀의 단일 이성질체 합성의 전구체 역할을 할 수 있으며, 이중 다른 이성질체는 다중약물에 저항성이 높은 항암제의 단일 이성질체 합성에 중요한 전구체이다.

상기 화합물 5는 SY-01 리파제가 입체적으로 장애가 되는 화합물을 어떻게 효율적으로 분할할 수 있는지를 알아보기 위하여 합성된 유도체이다.

본 발명에 따르면, 상기에서 예시한 화합물을 비롯한 히드록시기 또는 에스테르기를 포함하는 키랄화합물은 SY-01 리파제를 이용한 가수분해반응 및 트랜스에스테르화반응을 수행함으로써 분할할 수 있다.

가수분해반응은 pH 7.09의 인산완충용액을 사용하여 5 ∼ 35 ℃에서 수행한다.

그리고, 트랜스에스테르화반응은 유기용매 및 아실화제를 사용하여 0 ∼ 55 ℃에서 수행한다. 이때, 유기용매로는 n-헥산, 에틸 아세테이트, 벤젠, 톨루엔, 테트라히드로퓨란, 디에틸 에테르, 아세토니트릴, 디클로로에탄, 디클로로메탄, 1,4-디옥산, 메탄올, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름알데히드, 헥산/에틸아세테이트(9/1 ∼ 5/5) 등이 사용 가능하나, n-헥산이 가장 효율이 좋다. 아실화제로는 비닐아세테이트, 이소프로펜닐아세테이트, 아세트산 무수물, 프로피온산 무수물, 부티르산 무수물 등으로부터 선택 사용이 가능하나, 바람직하게는 비닐아세테이트를 사용하여 실온에서 반응을 수행한다.

예컨대, 상기 화합물 1을 가수분해반응하여 분할하는 경우, 용매로는 pH 7의 유기인 완충용액을 사용하며 pH STAT를 사용하여 가성소다 용액을 넣어 반응에 의해서 유리되는 산을 중화시킨다. 화합물 1에 대한 SY-01 리파제 분할능은 반응의 진전도(conversion)에 따라서 변화하지만 약 10%의 반응진전에서 70%의 이성질체순도(ee)를 나타내었다. 이러한 결과는 어느 정도 만족할 만한 것으로서 반응조건의 변화에 의해서 순도를 높일 수 있는 가능성이 있는 것이며, 기존에 상품화되어 있는 리파제보다 분할능이 상당히 향상된 결과이다. 또한, 상기 화합물 1을 아실화제로서 비닐아세테이트를 사용하여 SY-01 리파제와 트랜스에스테르화반응을 시켰을 때 반응 진전도 10%에서 60%의 ee값을 주었다.

한편, 상기 화합물 2는 아실화제로서 비닐아세테이트를 사용하여 SY-01 리파제와 트랜스에스테르화 반응시켰을 때 반응 진전도 68%에서 단일이성질체를 얻을 수 있다. 이때 생성된 화합물의 입체화학은 (S)-이성질체로 밝혀졌고 SY-01 리파제와 먼저 반응하는 이성질체(fast reacting enantiomer)는 (R)-이성질체이었다. 상기 화합물 5의 경우 29% 반응진전에서 72%의 ee값을 보임으로써 단일이성질체의 합성가능성을 보여주었고, 화합물 4 및 화합물 5에 대한 SY-01 리파제 분할능은 약50%의 ee값을 보여주었다.

따라서, SY-01 리파제는 기존에 상용화된 리파제와 구별된 입체선택성을 갖는 것으로 확인되었고 입체적으로 장애가 많은 화합물의 거울이성질체를 단일이성질체로 합성하는데 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

이와같은 본 발명은 다음의 제조예 및 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 버르콜데리아 코코베네난스 SY-01(KFCC-11111) 균주로부터 리파제 정제

버르콜데리아 코코베네난스 SY-01(KFCC-11111)의 배양액을 원심분리(12000 rpm, 10분)한 후 배양상등액 500 ㎖을 분자량 10000 달톤 포어(pore) 크기의 막(membrane)이 장착된 한외여과 시스템[아미콘 8200 모델]을 이용하여 부피로 약 10배정도 농축하였다. 농축액을 다시 원심분리(12000 rpm, 10분)하여 남아있는 균체를 완전히 제거하였다. 이 농축액을 Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 평형화시킨 세파덱스 G-100 컬럼(150 mm × 30 mm)에 넣고 동일 완충액으로 20 ㎖/hr의 유속으로 용출시켰다. 분획별로 5 ㎖씩 회수하여 SY-01 리파제 활성과 파장 280 nm에서 흡광도를 측정한 결과 5 ∼ 9번 분획에서 효소활성 피크와 단백질 피크가 일치하는 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 정제과정을 다음 표 1에 나타내었다. SY-01 리파제의 비활성도는 2.44 unit/mg이었으며 수율은 34.86%, 정제도(purity)는 39.2배까지 증가되었다. 이 정제 효소액을 SDS-PAGE 전기영동한 결과, SY-01 리파제 효소는 전기영동상에서 단일밴드로 나타나므로 정제되었음이 확인되었다.

정제단계	전체 단백질(mg)	전체활성도(Unit)	특이적활성도(Unit/mg)	수율(%)	정제배수
조효소액	1575.0	98.0	0.062	100	1
한외여과시스템(MW: 10000)	282.8	53.76	0.190	54.85	3.0563
Sephadex G-100	14.0	34.16	2.440	34.86	39.23

제조예 2 : 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥소란-4-메탄올 (화합물 1)의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 2,4-디클로로아세토페논(10.87 g, 57.5 mmol)를 건조된 벤젠(70 ㎖)와 n-부탄올(10 ㎖)에 녹이고, 글리세린(5.36 g, 69.1 mmol)과p-톨루엔술포닉산을 촉매량 넣은 후 24시간 환류하면서 딘-스탁 트랩(Dean-Stack trap)을 이용하여 물을 제거하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 40℃ 에서 브롬(11.0 g, 6.91 mmol)을 적하깔때기를 이용하여 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응혼합물을 1시간 교반한 후, 차가운 포화 탄산수소나트륨(100 ㎖)을 가하여 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 2회 추출하였다. 유기층을 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 조생성물을 23g 얻었다. 조생성물을 실리카 젤 컬럼분리(n-헥산:에틸 아세테이트 = 10:1)하여 순수한 화합물17.3 g(88%)을 얻었다.

가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 11.15 and 11.19, (m/z) 57, 75, 89, 109, 136, 145, 173(100), 191, 214, 247, 281, 311 (M⁺-31[CH₂OH]);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 3.78∼3.96(m, 4H), 4.26∼4.35(m, 3H), 7.29(d, J=8.4Hz, 1H), 7.39(s, 1H), 7.63(d, J=8.4Hz, 1H)

이렇게 합성된 화합물을 이용하여 다음과 같이 벤조일에스테르 화합물을 제조하였다.

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 화합물 1(10.26 g, 30 mmol)을 잘 건조된 피리딘(12 ㎖)에 녹여 넣고, 용액의 온도를 5℃로 하여 적하깔때기를 이용하여 벤조일 클로라이드(4.22 g, 30 mmol)를 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응혼합물을 1시간 교반한 후, 차가운 포화 탄산수소나트륨(100 ㎖)를 가하여 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 2회 추출하였다. 유기층을 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 생성물 시스 및 트랜스 14 g을 얻었다. 오일성 반응생성물에 메탄올(80 ㎖)를 넣어 약 50℃로 가열한 후 상온에서 결정화하여 흰고체 시스 에스테르 화합물(6.5 g, 49%, GC/MSD 95% ee)을 얻었다. 다시 상기에서 얻은 흰 고체 시스-에스테르 화합물에 에탄올(100 ㎖)로 재결정하여 순수한 시스-에스테르 화합물(5.5 g, 41%, GC/MSD >99% ee)를 얻었다.

R_f(n-헥산/에틸 아세테이트, 4:1): 시스-에스테르 0.59 , 트랜스-에스테르 0.52; 가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 14.17(트랜스) and 14.54(시스), (m/z) 51, 77, 105(100), 123, 139, 173, 201, 229, 253, 269, 299, 311, 351 (M⁺-95 [CH₂Br]);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 3.85∼4.15(m, 4H), 4.33∼4.45(m, 1H), 4.56(s, 2H), 7.26∼8.09(m, 8H, aromatic CH)

순수하게 합성된 시스-에스테르 화합물(1.99 g, 4.46 mmol)를 1.2 N 칼륨 하이드록사이드 메탄올용액(30 ㎖)에 녹여 넣고, 상온에서 3시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 용액을 감압 농축하고 에틸 아세테이트(100 ㎖)로 희석하여 물로 수회 세척하였다. 유기층를 포화 탄산수소나트륨, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 반응생성물 1.6 g을 얻었다. 이 화합물을 실리카 젤 컬럼으로 분리(n-헥산 : 에틸 아세테이트 = 4:1)하여 순수한 화합물 시스를 1.47 g(96%) 얻었다.

제조예 3 : (±)-4-시아노-4-시클로헥실-4-페닐부탄-1-올(화합물 2)의 합성

a. (±)-1-시아노-1-시클로헥실-1-페닐메탄의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 소디움 하이드라이드(6.18 g, 51.7 mmol, 60% 오일)를 건조된 디메틸포름아마이드(70 ㎖)에 넣었다. 0 ℃에서 벤질시아나이드(6.18 g, 51.7 mmol)를 디메틸포름아마이드(10 ㎖)에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 현탁액의 온도를 10 ℃로 하고 브로모사이클로헥산(8.15 g, 50.0 mmol)을 조금씩 적가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 반응생성물을 14 g을 얻었다. 이 생성물을 실리카 젤 컬럼으로 분리(n-헥산:에틸 아세테이트 = 10:1)하여 순수한 화합물(8.8 g, 88%)을 얻었다.

가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 6.23, (m/z) 55, 63, 77, 89, 103, 115(100), 129, 142, 158, 175, 199 (M⁺);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 1.03∼1.25(m, 6H), 1.56∼1.70(m, 4H), 2.20∼2.29(m, 1H), 4.03∼4.11(m, 1H), 7.25∼7.35(m, 5H, aromatic CH);¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) 21.2, 26.4, 28.9, 47.2, 122.3, 126.7, 127.7, 129.3, 137.9

b. (±)-4-시아노-4-시클로헥실-4-페닐부탄-1-올의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 소디움 하이드라이드(1.93 g, 48 mmol, 60% 오일)를 건조된 디메틸포름아마이드(50 ㎖)에 넣었다. 0 ℃에서 상기에서 합성된 화합물(8.00 g, 40 mmol)을 디메틸포름아마이드(5 ㎖)에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 현탁액의 온도를 10℃로 하고 3-테트라하이드로피라닐옥시프로필 브로마이드(10.71 g, 48 mmol)를 조금씩 적가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 반응 생성물 15 g을 얻어 다음 반응에 바로 사용하였다.

둥근 바닥 일구 플라스크(100 ㎖)에 상기에서 합성된 화합물 15 g을 넣고, 1N 염화수소 메탄올용액(20 ㎖)를 첨가하여 상온에서 3시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 감압 농축하고 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 잔류물 13 g을 얻어 실리카 젤 컬럼으로 분리(n-헥산:에틸 아세테이트 = 4:1)하여 순수한 화합물 2(7.8 g, 76%)를 얻었다.

가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 11.76, (m/z) 55, 73,89, 103, 115, 129(100), 142, 158, 175, 221, 237, 257 (M⁺);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 1.05∼1.27(m, 6H), 1.56∼1.73(m, 4H), 1.83∼2.25(m, 4H), 2.03(s, 1H, -OH), 3.46∼3.55(m, 2H), 4.07∼4.12(m, 1H), 7.28∼7.37(m, 5H, aromatic CH);¹³C NMR(75 MHz, CDCl₃) 14.5, 21.4, 26.3, 28.9, 29.1, 34.0, 47.5, 53.3, 60.8, 62.5, 122.1, 126.8, 129.1, 138.1; 키랄 HPLC 분석[Column : 키랄 Cel OD(셀룰로오스 카바메이트 유도체), 용출액 : n-헥산:이소프로필알콜 (95:5), 흐름속도 : 1.0 ㎖/min, 검출기 : UV 254 nm], 정체시간(min) 50.64 (S) and 57.39 (R)

제조예 4 : (±)-2-시아노-2-페닐헥산-1-올(화합물 3)의 합성

a. (±)-1-시아노-1-페닐펜탄의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 소디움 하이드라이드(2.26 g, 56.4 mmol, 60% 오일)을 건조된 디메틸포름알데히드(70 ㎖)에 부유시켰다. 0 ℃에서 페닐아세토니트릴(6.06 g, 51.7 mmol)을 디메틸포름알데히드(10 ㎖)에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 현탁액의 온도를 15 ℃로 하고 부틸브로마이드(6.44 g, 47.0 mmol)를 조금씩 적가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 반응 생성물(14 g)을얻었다. 이 반응물을 실리카 젤 컬럼으로 분리(n-헥산:에틸 아세테이트 = 10:1) 하여 순수한 화합물(6.48 g, 80%)을 얻었다.

R_f0.33 (n-헥산:에틸 아세테이트 = 9:1); 가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간 7.24(분), m/e 51, 57, 65, 77, 89, 103, 117(100), 130, 145, 158, 173(M⁺);¹H-NMR(250 MHz, CDCl₃) 0.90(t, J=8.5Hz, 3H), 1.33∼1.47(m, 4H), 1.86∼1.97(m, 2H), 3.76(dd, J=8.0Hz and J=10.1Hz, 1H), 7.28∼7.40(m, 5H, 벤젠 CH);¹³C-NMR(63 MHz, CDCl₃) 14.18, 22.50, 29.53, 36.04, 37.81, 121.37, 127.65, 128.39, 129.45, 136.49

b. (±)-2-시아노-2-페닐헥산-1-올의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 소디움 하이드라이드(1.2 g, 30.0 mmol, 60% 오일)를 잘 건조된 디메틸포름아마이드(50 ㎖)에 분산시켰다. 이어서 0 ℃에서 디메틸포름아마이드(5 ㎖)에 위에서 제조한 1-시아노-1-페닐펜탄(4.33 g, 25 mmol)를 용해시킨 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 현탁액의 온도를 15 ℃로 하고 고체형태의 파라포름알데히드(1.50 g)를 조금씩 나눠 첨가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물(100 ㎖)에 서서히 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 추출한 유기용매층을 포화 탄산수소나트륨용액, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 조생성물 2-시아노-2-페닐-1-헥산올 5.5g을 얻었다. 조생성물을 실리카 젤 컬럼으로 분리(n-헥산:에틸 아세테이트 = 4:1) 하여 순수한 화합물 3을 4.37 g(86%)을 얻었다.

R_f0.56 (n-헥산:에틸 아세테이트 = 2:1); 가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간 8.80(분), m/e 51, 63, 77, 91, 103, 117, 130, 145, 158, 173, (100), 184(M⁺-18);¹H-NMR(250 MHz, CDCl₃) 0.86(t, J=8.6Hz, 3H), 1.10∼1.59(n, 4H), 180∼215(m, 2H), 1.91(br. s, 1H, -OH), 3.89(s, 2H. -CH₂-), 7.34∼7.46(m, 5H, 벤젠 CH);¹³C-NMR(63 MHz, CDCl₃) 14.17, 23.02, 27.44, 35.70, 51.54, 69.83, 122.00, 126.80, 128.69, 129.55, 136.25

제조예 5 : (±)-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-히드록시)프로필아세토니트릴(화합물 4)의 합성

a. (±)-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필아세토니트릴의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 소디움 하이드라이드(2.26 g, 56.4 mmol, 60% 오일)를 건조된 디메틸포름아마이드(70 ㎖)에 넣었다. 0 ℃에서 (3,4-디메톡시페닐)-아세토니트릴(9.16 g, 51.7 mmol)를 디메틸포름아마이드(10 ㎖)에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 현탁액의 온도를 15 ℃로 하고 2-브로모프로판(4.41 ㎖, 47.0 mmol)를 조금씩 적가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨용액, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 반응 생성물(14 g)을 얻었고 실리카 젤 컬럼으로 분리(n-헥산:에틸 아세테이트 = 10:1)하여 순수한 중간 화합물(7.08 g, 69%)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, ppm) 1.04(d, J=6.72Hz, 6H, -CH₃×2), 2.10(m, 1H), 3.89(d, J=6.12Hz, 6H, -OCH₃×2), 6.79∼6.84(m, 3H, 벤젠); 가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 9.15, m/e 51, 63, 76, 90, 103, 115, 131, 146, 162, 176(100), 189, 203, 219 (M⁺)

b. (±)-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-히드록시)프로필아세토니트릴의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 소디움 하이드라이드(1.2 g, 30 mmol, 60% 오일)를 건조된 디메틸포름아마이드(50 ㎖)에 넣었다. 0 ℃에서 (3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필아세토니트릴(5.48 g, 25 mmol)을 디메틸포름아마이드(5 ㎖)에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 현탁액의 온도를 10 ℃로 하고 3-테트라히드로피라닐옥시프로필 브로마이드(5.5 g, 25 mmol)를 조금씩 적가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨용액, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 반응생성물 (±)-(3,4-디메톡시페닐)-2-이소프로필-2-(3-테트라히드로피라닐)-프로필아세토니트릴(11 g)을 얻어 다음 반응에 바로 사용하였다.

둥근바닥 일구 플라스크(100 ㎖)에 위에서 생성된 화합물(11 g)을 넣고, 1 N 염화수소 메탄올용액(20 ㎖)을 첨가하여 상온에서 3시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 감압 농축하고 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨용액, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 생성물(81 g)을 얻어 실리카 젤 컬럼으로 분리(n-헥산:에틸 아세테이트 = 10:1) 하여 순수한 화합물 4(5.8 g, 84%)를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃) 0.81(d, J=6.78Hz, 3H, -CH₃), 1.20(d, J=6.57Hz, 3H, -CH₃), 1.29(m, 1H), 1.32(s, 1H, -OH), 1.63(m, 1H), 1.95(m, 1H), 2.10(m, 1H), 2.45(m, 1H), 3.58(m, 2H), 3.89(d, J=4.38Hz, 6H, -OCH₃×2), 6.84∼6.92(m, 3H, 벤젠); 가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 11.32, m/e 51, 65, 77, 103, 115, 138, 146, 170, 186, 189, 216(100), 234, 277 (M⁺)

제조예 6 : (±)-4-시아노-7-메틸-4-페닐옥탄-1-올(화합물 5)의 합성

a. (±)-1-시아노-4-메틸-1-페닐펜탄의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 소디움 하이드라이드(2.0 g, 50 mmol, 60% 오일)를 건조된 디메틸포름아마이드(50 ㎖)에 넣는다. 0 ℃에서 4-클로로벤질시아나이드(7.81 g, 50 mmol)를 건조된 디메틸포름아마이드(10 ㎖)에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 현탁액의 온도를 15 ℃로 하고 1-브로모부탄(7.54 g , 55 mmol)을 조금씩 적가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨용액, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 반응 생성물(10 g)을 얻었고 실리카 젤 컬럼으로 분리하여(n-헥산:에틸 아세테이트 = 10:1) 순수한 생성물(8.1 g, 92%)을 얻었다. 가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 7.63, (m/z) 51, 55, 71, 77, 89, 103, 117(100), 130, 145, 159, 173, 187 (M⁺); IR (neat) 3124, 2980, 2240, 1456, 1381 cm^-1;¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 0.93(m, 6H), 1.38∼1.43(m, 2H), 1.55∼1.62(m, 1H), 1.88∼1.93(m, 2H), 3.77(t, J=7.4Hz, 1H), 7.31∼7.42(m, 5H, aromatic CH);¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) 22.7, 22.9, 28.0, 34.3, 36.4, 37.9, 121.4, 127.6, 128.4, 129.0, 136.5

b. (±)-4-시아노-7-메틸-4-페닐옥탄-1-올의 합성

둥근 바닥 삼구 플라스크(250 ㎖)에 소디움 하이드라이드(0.6 g, 15 mmol, 60% 오일)를 건조된 디메틸포름아마이드(50 ㎖)에 넣는다. 0 ℃에서 위 반응 생성물(2.52 g, 13.4 mmol)를 디메틸포름아마이드(5 ㎖)에 녹인 용액을 서서히 적가하였다. 30분간 교반한 후, 현탁액의 온도를 10 ℃로 하고 3-테트라히드로피라닐옥시프로필 브로마이드(3.0 g, 13.4 mmol)를 조금씩 적가하여 15시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 얼음물에 부어 반응을 종결하고, 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨용액, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 생성물(7.1 g)을 얻어 다음 반응에 바로 사용하였다. 가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 12.18, (m/z) 57, 67, 85(100), 101, 129, 159, 186, 201, 228, 258, 328 (M⁺).¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 0.81∼1.27(m, 6H), 1.28 ∼1.32(m, 2H), 1.38∼1.57(m, 6H), 1.60∼1.85(m, 3H), 1.90∼2.05(m, 4H), 3.32∼3.36(m, 1H), 3.46∼3.49(m, 1H), 3.65∼3.68(m, 1H), 3.70∼3.78(m, 1H), 4.45∼4.53(m, 1H), 7.28∼7.42(m, 5H, aromatic CH).

둥근 바닥 일구 플라스크(100 ㎖)에 상기에서 생성된 화합물(7.1 g)을 넣고, 1 N 염화수소 메탄올용액(20 ㎖)를 첨가하여 상온에서 3시간 교반하였다. 출발물질이 모두 반응한 후, 감압 농축하고 에틸 에테르(50 ㎖)로 3회 추출하였다. 모은 용액을 포화 탄산수소나트륨용액, 소금물 및 증류수로 세척하고, 무수 마그네슘 황산염으로 건조한 후 감압 하 용매를 제거하여 생성물(4g)을 얻어 실리카 젤 컬럼으로 분리(n-헥산:에틸 아세테이트 = 10:1)하여 순수한 화합물 5(2.62 g, 80%)를 얻었다.

가스크로마토그래피/질량분석검출기 분석 머무름시간(분) 10.27, (m/z) 51, 77, 91, 103, 115, 129(100), 142, 156, 175, 187, 200, 218, 230, 245 (M⁺);¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 0.78∼0.84(m, 6H), 0.93∼1.10(m, 1H), 1.30∼1.35(m, 2H), 1.42∼1.48(m, 1H), 1.78(br, 1H, -OH), 1.88∼2.04(m, 4H), 3.35(t, J=7.1Hz, 2H), 3.50(t, J=6.0Hz, 2H, -CH₂O-), 7.30∼7.37(m, 5H, aromatic CH);¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) 22.6, 22.8, 28.3, 28.8, 34.4, 37.8, 39.4, 48.4, 62.1, 122.9, 126.2, 128.0, 129.3, 138.7; 키랄 HPLC 분석[Column : 키랄 Pak AD(아밀로오즈 유도체), 용출액 : n-헥산:이소프로필알콜 (95:5), 흐름속도 : 1.0 ㎖/min, 검출기 : UV 254 nm], 정체시간(min) 40.72 and 47.34.

실시예 1 : 화합물 1의 트랜스에스테르화 반응에 의한 이성질체 분할

버르콜데리아 코코베네난스 SY-01(KFCC-11111)로부터 생성된 수용액 속의 리파제를 다이알리시스 및 리포필라이즈하여 고체상으로 얻은 후 사용하였다.

화합물 1(15 mg, 44μ㏖)과 비닐 아세테이트(3.8 mg, 44μmol)를 건조된n-헥산(4 ㎖)에 넣고 교반하였다. 이 반응용액에 SY-01 리파제(15 mg)를 넣고 0 ∼ 55 ℃ 바람직하게 20℃에서 교반하면서 반응의 진전도를 박막 크로마토그래프 및 고효율 액상 크로마토그래프로 확인하며 분할능을 측정하여 다음 표 2에 나타내었다.

반응시간(h)	반응진전도(%)	ee(%)
반응시간(h)	반응진전도(%)	알콜화합물(R/S)	에스테르화합물(R/S)
8	14	41/59	86/14
28	35	28/72	84/16
47	47	10/83	83/17
75	75	0/100	73/27

실시예 2: 화합물 2의 트랜스에스테르화 반응에 의한 이성질체 분할

상기 실시예 1에서 반응시킨 방법과 같으며, 화합물 2(21 mg, 82μmol)와 비닐 아세테이트(7 mg, 82μmol)를 건조된 n-헥산(4 ㎖)에 넣고 교반하였다. 이 반응용액에 SY-01 리파제(21 mg)을 넣고 0 ∼ 55 ℃ 바람직하게 20 ℃에서 교반하면서 반응의 진전도를 박막 크로마토그래프 및 고효율 액상 크로마토그래프로 확인하며 분할능을 측정하여 다음 표 3에 나타내었다.

반응시간(h)	반응진전도(%)	ee(%)
반응시간(h)	반응진전도(%)	알콜화합물(R/S)	에스테르화합물(R/S)
4	10	53/47	20/80
7.5	23	54/46	20/80
21.5	34	64/36	23/77
36	40	68/32	24/76
52	72	86/14	36/64

실시예 3 : 화합물 3의 트랜스에스테르화 반응에 의한 이성질체 분할

상기 실시예 1에서 반응시킨 방법과 같으며, 화합물 3(35 mg, 172μmol)과 비닐 아세테이트(14.8 mg, 172μmol)를 건조된 n-헥산(4 ㎖)에 넣고 교반하였다. 이 반응용액에 SY-01 리파제(35 mg)를 넣고 0 ∼ 55 ℃ 바람직하게 20 ℃에서 교반하면서 반응의 진전도를 박막 크로마토그래프 및 고효율 액상 크로마토그래프로 확인하며 분할능을 측정하여 다음 표 4에 나타내었다.

반응시간(h)	반응진전도(%)	ee(%)
반응시간(h)	반응진전도(%)	알콜화합물	에스테르화합물
28	2	46/54	55/45
100	29	49/51	72/28

실시예 4 : 화합물 4의 트랜스에스테르화 반응에 의한 이성질체 분할

상기 실시예 1에서 반응시킨 방법과 같으며, 화합물 4(31 mg, 120μmol)와 비닐 아세테이트(10.3 mg, 120μmol)를 건조된 n-헥산(4 ㎖)에 넣고 교반하였다. 이 반응용액에 SY-01 리파제(31 mg)를 넣고 0 ∼ 55 ℃ 바람직하게 20 ℃에서 교반하면서 반응의 진전도를 박막 크로마토그래프 및 고효율 액상 크로마토그래프로 확인하며 분할능을 측정하여 다음 표 5에 나타내었다.

반응시간(h)	반응진전도(%)	ee(%)
반응시간(h)	반응진전도(%)	알콜화합물(R/S)	에스테르화합물(R/S)
28.5	9	46/54	81/19
47.5	19	45/55	77/23
72.5	39	44/56	65/35

실시예 5 : 화합물 5의 트랜스에스테르화 반응에 의한 이성질체 분할

상기 실시예 1에서 반응시킨 방법과 같으며, 화합물 5(59 mg, 270μmol)와 비닐 아세테이트(23 mg, 270μmol)를 건조된 n-헥산(10 ㎖)에 넣고 교반하였다. 이 반응용액에 SY-01 리파제(31 mg)를 넣고 0 ∼ 55 ℃ 바람직하게 20 ℃에서 교반하면서 반응의 진전도를 박막 크로마토그래프 및 고효율 액상 크로마토그래프로 확인하며 분할능을 측정한 결과 반응물인 에스테르화합물의 이성질체 비율은 48/52(R/S)이었고 미반응물인 알콜의 이성질체 비율은 40/60(R/S)이었다.

실시예 6 : 화합물 1의 가수분해 반응에 의한 이성질체 분할

상기 제조예 1에서 합성된 화합물 1을 일반적인 합성방법을 이용하여 아세틸 에스테르 화합물을 합성하였다. 합성된 에스테르 화합물들은 가수분해반응에 이용하였다. 상기 에스테르 화합물(37 mg, 96μmol)과 SY-01 리파제(8 ㎖)를 인산 완충용액(7 ㎖, pH 7.09)에 넣고 5 ∼ 35 ℃ 바람직하게 20 ℃에서 교반하였다. 상기 반응이 진행되면서 유리된 초산을 가성소다용액(0.05 N)으로 중화시켜 반응의 진전도를 박막 크로마토그래프 및 고효율 액상 크로마토그래프로 확인하며 분할능을 측정한 결과를 다음 표 6에 나타내었다.

반응시간(h)	반응진전도(%)	ee(%)
반응시간(h)	반응진전도(%)	알콜화합물(R/S)	에스테르화합물(R/S)
27.5	9	46/54	52/48
52	17	48/52	50/50
100	32	49/51	52/48

상술한 바와 같이, 본 발명은 버르콜데리아 코코베네난스 SY-01(KFCC-11111)로부터 생성된 리파제를 이용하여 입체적으로 장애가 많은 화합물의 키랄화합물을 단일이성질체로 합성하는데 유용하게 사용되며, 또한 단일이성질체의 의약 및 농약을 제조할 수 있는 효과를 제공한다.

Claims

버르콜데리아 코코베네난스(Burkholderia Cocovenenans) SY-01(KFCC-11111) 균주로부터 생산된 리파제를 사용하여 히드록시기 또는 에스테르기를 포함하는 키랄화합물을 분할하는 것을 특징으로 하는 이성질체 분할방법.
제 1 항에 있어서, 상기 리파제는 다이알리시스 및 리포필라이즈하여 고체상으로 사용하는 것을 특징으로 하는 이성질체 분할방법.
제 1 항에 있어서, 상기 키랄화합물이 다음에 나타낸 화합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이성질체 분할방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 키랄화합물을 pH 7.09의 인산완충용액을 사용하여 5 ∼ 35 ℃에서 가수분해반응하여 분할하는 것을 특징으로 하는 이성질체 분할방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 키랄화합물을 유기용매 및 아실화제를 사용하여 0 ∼ 55 ℃에서 트랜스에스테르화반응하여 분할하는 것을 특징으로 하는 이성질체 분할방법.
제 5 항에 있어서, 상기 유기용매가 n-헥산, 에틸 아세테이트, 벤젠, 톨루엔, 테트라히드로퓨란, 디에틸 에테르, 아세토니트릴, 디클로로에탄, 디클로로메탄, 1,4-디옥산, 메탄올, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름알데히드 및 헥산/에틸아세테이트(9/1 ∼ 5/5) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이성질체 분할방법.
제 5 항에 있어서, 상기 아실화제가 비닐아세테이트, 이소프로펜닐아세테이트, 아세트산 무수물, 프로피온산 무수물 및 부티르산 무수물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이성질체 분리방법.