KR100368290B1

KR100368290B1 - 신규 바실러스속 균주, 그로부터 생산되는 다당류고분자물질 및 이들을 이용한 폐수처리방법

Info

Publication number: KR100368290B1
Application number: KR10-2000-0038384A
Authority: KR
Inventors: 구영환; 김영규; 서현효; 문성훈; 박용일
Original assignee: (주) 엔바이오엔지니어링
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2003-01-24
Also published as: KR20000063394A

Abstract

본 발명은 자연계에서 고분자 다당류물질을 생산하는 신규 미생물 및 이로부터 생산되는 고분자 다당류물질에 관한 것으로, 본 발명에 따른 균주인 바실러스 속 EB-P1(Bacillussp. EB-P1)가 생산하는 고분자 다당류물질을 폐수처리에 사용할 경우, 생물학적 처리시 나타나는 벌킹, 핀 플록과 오니 해체현상을 효과적으로 해소시킬 뿐만 아니라, 폐수처리용 미생물제제 또는 유산균의 균체를 회수하는 응집물질로 사용이 가능하다.

Description

신규 바실러스속 균주, 그로부터 생산되는 다당류 고분자물질 및 이들을 이용한 폐수처리방법{BACILLUS SP., POLY SACCHARIDE PRODUCING THEREFROM AND WASTEWATER TREATMENT METHOD}

본 발명은 다당류 고분자물질을 생산하는 신규 바실러스 균주와 이로부터 생산되는 다당류 고분자에 관한 것이다.

미생물 다당류는 겔 형성능, 유화안정능 및 표면장력의 조절능, 물 흡수능, 점착능 및 필림 형성능의 기능을 가지며 수용액의 물성학적 성질을 크게 변화시켜 식품첨가제, 화장품의 보습제, 대용혈청제, 석유회수증진제, 선박의 난류억제(drag reduction), 살충제, 페인트 및 잉크의 소재로서 각종 산업에서의 중요성이 부각되고 있다. 최근에는 반도체 산업의 대규모 집적회로에서의 광저항성(photoresist) 및 초전도 복합소재(superconducing composite materials), 약물전달계(drug delivery system)에도 응용되고 있으며, 환경정화를 위한 폐수처리 공정에서 중금속제거 또는 미생물 응집제, 그리고 생(bio)의약품 소재로서의 부가가치가 높은 용도로 응용의 범위를 넓혀가고 있다. 이와 같이 미생물 다당류는 기존의 식물 다당류에 비하여 물리화학적으로 균일한 물성을 가지고 그 특성면에서도 매우 뛰어난 장점을 가지고 있어 새로운 미생물에 의한 신규 다당류 또한 계속 개발되고 있다.

이러한 많은 장점을 가진 미생물 다당류를 실용화하기 위한 선결조건은 낮은 가격에 생산하는 것과 신규 응용분야를 개발하는 것이다.

이 중 응집제로서의 활용에 따른 기존의 연구가 활발하게 진행되고 있는 바, 1968년 프리드만(Friedman)등이 하수로부터 분리한 자이모나스 라미게라(Zymomonas ramigera)에서 생성된 다당류가 COD와 BOD를 감소시킨다고 하였으며, 1968년 고렌(Goren)은 크립토코커스 라울렌티 변이주 플라베센스(Cryptococcus laurentii var. flavescens),한세뉼라 캡슐레타(Hansenula capsulata),한세뉼라 호스티(Hansenula hostii),플렉타니아 옥시덴타니아(Plectania occidentali) 및 슈도모나스 메타니카(Pseudomonas methanica)등에서 다당류를 생산한다고 보고한바 있다. 이외에도 응집성이 있는 물질을 생산하는 미생물로는 로드코커스 에리스로포리스(Rhodococcus erythropolis), 코리네박테리윰 속(Corynebacteriumsp.),아스페르질러스 소제(Aspergillus sojae),데만테리윰 속(Demanteriumsp.) 및 페실로마이세스 속(Paceilomycessp.)등이 있다.

이 중 로드코커스 에리스로포리스(Rhodococcus erythropolis)가 생산하는 응집제인 NOC-1은 대장균, 양조효모, 활성오니, 흙탕물(muddy water)과 강저니침전(river bottom sediment)에 효과적인 응집활성을 보이고, 특히 축산폐수의 침강에 효과적라고 보고되고 있다. 이와 같은 결과는 미생물이 생산하는 생물 고분자를 응집제로 사용할 수 있음을 보여주고 있다.

자연계에서 얻는 천연 고분자 화합물은 생산가격이 높고 응집활성도 낮아서 비경제적이고 균일한 제품을 얻을 수 없는 단점이 있으나, 유기합성 고분자 응집제인 PAM의 유도체들은 경제적이고 응집력이 좋아 효과적인 응집제로 널리 쓰이고 있다. 그러나, 이들 유도체들은 자연계내에서 분해가 어렵고 신경계에 치명적인 독성과 강한 발암성 물질로 알려져 있어 실제 사용에 심각한 문제점이 있는 것으로 지적되고 있다.

또한, 기존의 활성오니를 이용한 폐수의 생물학적처리에 있어서는 사상성 세균에 의한 벌킹현상과 고부하 혹은 빈부하시 발생되는 핀 플록현상 및 오니 일령의 증가에 의한 오니 해체현상 등이 있어 또다른 문제가 되어 왔다.

이에 따라, 인체에 무해하며, 자연계에서 쉽게 분해되는 새로운 응집제의 개발이 요청되고 있는 바, 이와 같이 생분해성 응집제의 필요성이 급격히 대두됨에따라 일본을 비롯한 선진국에서는 미생물 유래의 강한 응집성 물질을 탐색, 개발하여 기존 합성고분자 응집제 대용으로 사용하려는 연구가 진행되고 있다. 최근에는 미생물이 생산하는 고분자 응집제가 이러한 요건을 만족시킬 수 있는 것으로 관심이 집중되고 있다.

국내의 경우는 1978년 Xanthan gum(Min, T. I., and K. D. Kim, 1978. Kor. J. Appl. Microbio. Boieng. 11,42) 등을 시초로 다수의 신규 다당류의 탐색과 물성학적 보고(특허공고 제95-4008, 특허공고 제 91-8646)가 있어왔으나, 이들의 응용분야 및 용도의 개발은 거의 전무한 상태이다. 그 중 일부가 폐수처리용 응집제로서 용도(특허공고 제 99-224475, 등록 특허 0171957, 등록 특허 10-0195546, 특허공고 97-3308)로 개발되기도 하였으나, 대부분 신규 다당류의 보고나 단순한 응집효과만으로 부각되어 있으며 다양한 응용분야는 전혀 보고되지 않고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 고분자다당류 물질을 생산하는 신규한 균주, 그로부터 생산되는 고분자다당류 및 이들의 제조방법을 제공하며, 또한 이들을 이용하여 폐수를 처리하는 방법, 핀 플록 및 벌킹현상을 제어하는 데에 효과적인 방법을 제공함에 따라 상기 물질을 응용하여 다양한 산업분야에 활용할 수 있도록 함을 그 목적으로 한다.

도 1은 본 발명에 따른 신규 바실러스 속 EB-P1(Bacillussp. EB-P1; KCTC 18027P)과 이로부터 생산되는 고분자 다당류의 전자현미경사진,

도 2는 본 발명에 따른 고분자 다당류의 구성당 조성의 HPLC 분석결과,

도 3은 본 발명에 따른 고분자다당류의 구성당의 TLC 분석결과,

도 4는 본 발명에 따른 고분자다당류의 분자량의 HPLC분석결과,

도 5는 본 발명에 따른 고분자다당류의 구조를 분석한 IR 스펙트럼을 각각 나타낸다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 고분자 다당류 물질을 생산하는 균주인 바실러스속 EB-P1 및 그로부터 생산되는 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 퓨코오즈(fucose), 글루코로닉산(glucuronic acid) 및 피루베이트(pyruvate)로 구성된, 분자량 500만 달톤(dalton) 이상의 다당류 고분자물질을 제공한다.

본 발명은 또한, 글루코스 3%, 질산나트륨 0.3%, 인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.08%, 황산마그네슘 7수화물 0.05% 및 황산망간 0.05%로 이루어진 배지에서 바실러스 속 EB-P1을 배양하여 상기 다당류 고분자물질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 바실러스 속 EB-P1 또는 그로부터 생산된 다당류 고분자물질을 이용한 폐수처리방법 및 균체회수방법을 제공한다.

이하 본 발명을 좀 더 상세히 설명하기로 한다.

(균주의 분리방법 및 응집능 시험방법)

본 발명의 균주는 충남일원의 토양 및 하천에서 채취된 500 여점의 시료를 증류수를 사용하여 10¹∼10⁴으로 희석한 후, 뉴트리언트 고체 배지(nutrient agar)위에 도말하여 30℃에서 1∼3일 배양한 후 분리된 300여 세균을 분리하였다.

100㎖ 삼각 플라스크에 뉴트리언트 액체배지를 20 ㎖씩 넣어 121℃에서 15 분간 살균하여 각각의 균주를 접종하여 3일동안 배양하여 점질성 다당류 물질을 분리하였고 이물질을 0.5%의 카올린 현탁액을 이용하여 응집능을 시험하였다.

응집능 시험은 먼저 카올린 용액 96 ㎖에 5.0% 칼슘크로라이드 용액 2 ㎖을혼합하고 300 rpm의 교반기에서 1분간 교반한 후, 여기에 배양액 혹은 고분자 용액을 2 ㎖을 첨가하여 다시 300 rpm에서 30초간 교반한다. 이후 다시 150 rpm에서 30초간 다시 교반한 후, 정확히 3분간 정치시킨다. 상등액을 샘플링하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여, 다음식에 따라 응집활성을 계산하였다(Toedo and Kurane, Agricultural and Biological Chemistry 11, 2793, 1991).

응집활성=(1/A-1/B)×배양액의 희석배수

A : 시료의 흡광도

B : 대조구의 흡광도

(균주의 동정)

분리 균주의 동정은 균의 형태학적 특성, 생리화학적 특징, 구조적특징을 조사하여 버지스 매뉴얼(Bergey's Manual)을 기준으로 동정하였다.

(1) 형태학적 특징

하기 도 1 에 본 발명에 따른 신규 바실러스 속 EB-P1(Bacillussp. EB-P1; KCTC 18027P)과 이로부터 생산되는 고분자 다당류의 전자현미경사진을 나타내었다. 분리균주의 형태학적 특징은 제 1 도에서 볼 수 있듯이 그람양성의 운동성이 있는 간균으로 크기는 하기 표 1에서와 같이 0.8∼1.0 ×1.9∼2.2 ㎛이었다.

뉴트리언트 고체배지에서 콜로니는 회색을 띄었고 점성의 정도는 낮았지만, 1.0%의 글루코오스가 함유된 뉴트리언트 고체배지에서는 배양시간이 경과에 따라서 점성상태의 콜로니를 형성하였다.

분리균주의 형태학적 특징

형태학적 특징	결과
세포 모양(cell sharp)세포 크기(cell size)포자 팽윤(sporangium swollen)포자 위치(spore position)	간균(rod)0.8∼1.0 ×1.9∼2.2 ㎛`+T

(2) 생리화학적 특성

분리균주의 생리 및 생화학적 성질을 조사한 결과는 하기 표 2 와 같았다.

분리균주의 생리화학적 성질 및 구조적 특성

생리생화학적 특성

결과

애시드 패스트 염색(acid fastness)그람 반응(Gram reaction)카탈라아제(catalase)혐기성 성장(anaerobic growth)V-P 시험(V-P test)글루코스로부터의 가스생성(gas from glucose)산생성능(acid from)글루코스(D-glucose)아라비노스(L-arabinose)자일로스(D-xylose)만니톨(D-mannitol)가수분해능(hydrolysis of)카제인(casein)젤라틴(gelatin)전분(starch)구연산 이용(citrate utilization)질산 환원(nitrate reduction)인돌형성(indole formation)pH 성장(growth at pH)호염성%(growth in NaCl)성장온도℃(growth temperature)메나퀴논타입(menaquinonebtype)셀루러 지방산(cellular fatty acid)디아미노피멜산(Diaminopimelic acid)(G+C)몰함량

-++___+___+++++_pH 5.0-10.02.015-40MK-715:0 iso,15:0 anteisomeso-DAP39.2%

이상과 같은 형태학적, 생리화학적 및 구조적분석에서 나타난 결과로부터 본균주를 바실러스 속 세균으로 동정하였고, 바실러스 속 EB-P1으로 명명되었다. 본 균주를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 6월 22일에 기탁하였으며 수탁번호는 KCTC 18027 P이다.

(배양조건)

본 발명의 신규 바실러스 속 균주의 배양 조건은 전배양용 액체배지(글로코오스 2.0%, 육즙 추출물 0.15%, 펩톤 0.2%) 50 ㎖이 든 삼각 플라스크에 1백금이를 접종하여 32℃, 125 rpm에서 2일간 진탕배양하였다. 전배양액 2 ㎖을 기초배지(글루코오스 2.0%, 질산나트륨 0.1%, 인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.08%, 황산마그네슘 7수화물 0.01%, 염화나트륨 0.05%) 50 ㎖에 넣어 전배양과 동일한 조건으로 3일간 배양하였으며 그 결과는 아래와 같았다.

(1) 초기 pH의 영향

다당류의 생산의 최적 pH를 조사하기 위하여 배지의 초기 pH를 산, 알칼리를 사용하여 4내지 10으로 조정하고 32℃, 125RPM, 3일간 배양하여 균의 생육과 다당류 생산을 조사하였다. 하기 표 3 에서 보듯이 균체 생산량과 다당류 생산량은 초기 pH가 6.0일 때 가장 높았고 이 범위를 벗어나는 경우에는 균체 생산량과 다당류 생산량이 급격히 감소하는 것으로 나타났다.

초기 pH의 영향

pH	균체성장(OD 660nm)	다당류 생산량(g/l)
4.05.06.07.08.09.010.0	0.1501.5703.8002.9402.3001.6900.265	0.271.805.424.243.602.402.46

(2) 배양온도의 영향

배양온도가 균체 성장 및 다당류 생산에 미치는 영향을 상기의 배양조건으로 조사한 결과 하기 표 4 에서와 같이 32℃에서 균체 성장 및 다당류 생산량이 최대이었고 서로 비례하는 경향을 보였다.

배양온도의 영향

온도(℃)	균체성장(OD 660nm)	응집활성도(1/OD)
252830323840	0.5002.7202.9003.7101.2800.530	0.701.872.914.782.092.10

(배양배지의 조성)

본 발명에서 다당류를 생산하는 바실러스 속 EB-P1 균주를 배양하기 위한 배지 조성은 상기의 배양조건과 동일한 방법으로 실시하였으며 기초배지에서 탄소원, 질소원, 무기염의 종류와 최적농도를 조사하였고, 이 때의 최적활성을 균체 성장 및 응집활성도로 나타내었다. 최적화된 배지로서 그 조성은 글루코스 3.0%,질산나트륨 0.3%, 인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.08%, 황산마그네슘 7수화물 0.05%, 황산망간 0.05% 이고 자세한 내용은 아래와 같다.

(1) 탄소원의 영향

상기의 기초배지에서 글루코스를 제외하고 pH를 6.0으로 조절한 후 각각의 탄소원 농도를 2.0%되게 첨가하여 32℃, 125 rpm에서 3일간 진탕배양하였으며, 그 결과를 아래의 표 5에 나타내었다.

탄소원	균체성장(OD at 660 nm)	응집활성도(1/OD)
대조구글루코오스자일로오스람노오스겔락토오스솔비톨만니톨락토오스슈크로오스인노시톨가용성 전분	0.34.51.41.70.80.41.34.41.61.61.5	1.86.01.51.80.90.51.45.71.71.41.0

탄소원중 2.0%의 글루코오스가 균체성장과 응집활성도가 각각 4.5와 6.0으로 가장 좋았고 공업용으로도 가장 적당한 탄소원이다.

(2) 탄소원농도의 영향

탄소원인 글루코오스의 농도를 조사하기 위해 pH를 6.0으로 조절한 기초배지에 글루코오스를 각각 10내지 50g/L로 농도로 첨가하여, 전배양된 균주 배양액 2.0 ㎖을 접종한후 상기와 같이 동일한 조건에서 배양하였으며 그 결과를 하기 표 6 에 나타내었다.

탄소원의 농도(g/L)	균체 성장(OD at 660nm)	응집활성도(1/OD)
대조구1020304050	0.30.80.94.81.04.0	2.03.56.19.47.86.9

글루코스의 농도는 3.0%일 때 세포성장 및 응집활성도가 가장 좋았다.

(3) 질소원 및 농도의 영향

상기의 기초배지에서 글루코스를 3.0%를 첨가하고 pH를 6.0으로 조절한 후 각각의 질소원 농도를 0.1%되게 첨가하여 32℃, 125 rpm에서 3일간 진탕배양하였다. 그 결과를 하기 표 7 에 나타내었다.

질소원	균체 성장(OD at 660 nm)	응집활성도(1/OD)
대조구말토 엑기스이스트엑기스육즙엑기스트립톤펩톤질산나트륨암모니움아세테이트암모니움 제일인산암모니움클로라이드질산칼슘질산암모늄황산암모늄	0.20.43.63.63.24.53.83.92.91.03.01.01.1	5.96.215.817.013.124.223.219.313.411.820.76.810.0

질소원중 유기성 펩톤이 가장 좋았으나 경제적인 측면을 고려할 때 무기원인 질산나트륨을 선택하였다. 질산나트륨의 최적농도를 조사하기 위하여 상기의 배지에서 그 농도를 0.05%에서 0.4%까지 0.5%차이로 같은 조건에서 조사한 결과 0.3%에서 균체성장과 응집활성도가 각각 5.0과 26.7로 나타났다.

(4) 무기염의 영향

무기염을 조사하기 위하여 글루코스 3.0%, 질산나트륨 0.3%, 암모니움 아세테이트 0.2%, 인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.08% 가 함유된 배지에 무기염을 0.05%의 농도로 첨가하여 조사한 결과 큰 차이는 없었으나 황산마그네슘 7수화물 0.05%, 황산망간 0.05%의 경우가 대조구보다 균체 성장 및 응집활성도가 증가되었다.

(생물고분자의 구성성분 및 성상)

(1) 다당류의 정제

배양액을 증류수로 6배 희석한 후, 균체를 제거하기 위해 원심분리기를 이용하여 20,853×g로 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 3 배의 차가운 95% 에탄올를 첨가하여 다당류를 침전시켜서 얻었다. 침전물을 95% 에탄올로 2∼3 번 정도 세척한 후, 다시 증류수에 녹여서 동결 건조하여 분말상태의 정제된 다당류를 얻었다. 정제된 다당류를 구조분석한 IR 스펙트럼을 도 5 에 나타내었다.

(2) 다당류의 분자량 측정

분말상태의 다당류를 0.2%로 증류수에 녹인 후, 겔 통과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)로 측정하였다. 분자량 측정은 HPLC (LC-10 기기, Shimadzu Co, Japan)를 이용하여 PL-GFC 1000 Å (8μ, 7.5 × 300㎜) 컬럼과 알아이(RI) 검출기로 분석하였으며, 고성능액체크로마토그래피(HPLC)는 사용용매를 물로하고, 속도(flow rate) 1 ㎖/m, 주입(injection) 량 10 ㎕ 조건으로 실험하였다. 다당류의 분자량은 표준물질인 덱스트란(Sigma Co., 분자량: 2,000,000 dalton, 580,000 dalton, 143,000 dalton, 60,000∼90,000 dalton, 10,000∼20,000 dalton)과 비교한 결과 약 5.13 × 10⁶달톤(dalton) 으로 나타났고, 균질한 단일 성분이였다.

하기 도 4에 본 발명에 따른 고분자다당류의 분자량을 gel-permeation HPLC로 측정한 결과를 나타내었다. 도 4에서, Y=aX=b 일 때, a=-1.0906, b=13.7959, r²=0.9976 였다.

(3) 다당류의 구성당 분석

가. HPLC 분석

분말상태의 다당류를 0.2% 되게 20 ㎖ 증류수에 녹인 후, 4 M TFA( trifluoroacetic acid) 20 ㎖를 첨가하여 121℃에서 30분간 산 가수분해 하였다. 가수분해물을 0.45 ㎛ 실린지 필터(sylinger fiter)로 여과한 다음, 진공건조기로 TFA을 완전히 제거한 다음, HPLC(LC-10, Shimadzu Co, Japan)로 분석하였다.

마이크로 스포로겔 카보하이드로레이트(μ-spherogel carbohydrate column, 6.5 × 300㎜, Beckman Co. USA)으로 속도(flow rate) 0.15㎖/m, 온도 80℃, 주입(injection) 량 20㎕ 조건으로 분석하였다. 하기 도 2에 본 발명에 따른 바실러스 속 EB-P1(KCTC 18027P)이 생산하는 고분자 다당류의 구성당 조성을 HPLC로 분석한 결과를 나타내었다. 도 2의 (A)는 표준당의 혼합물 조성을, (B)는 EB-P1 의 고분자 다당류 조성을 나타낸 것이다. 표준당의 혼합물 조성(슈가아민, 피루브산, 글루코닉산, 글루코즈, 갈락토즈, 퓨코오즈)을 기준으로 분석한 결과, 글루코오스(glucose), 겔락토오스(galactose), 퓨코오스(fucose), 글루코로닉산(glucuronic acid), 피루베이트(pyruvate)로 구성된 헤테로다당류(heteropolysaccharide)이었고, 이들 구성성분의 몰비는 2.17 : 2.35 : 1.00 : 1.56 : 2.07 이었다. 세균이 생성하는 세포외 다당류들 중에서 이런 구성성분과 몰비를 가지는 다당류는 이제까지 보고된 바가 없어 상기 다당류는 신규 다당류임이 확인되었다.

나. TLC 분석

다당류의 산 가수분해물의 TLC 분석은 실리카겔(silica gel)로 피막된 유리판을 이용하여 아세토니트릴(acetonitrile) : 증류수 = 85 : 15(v/v)의 용매조건으로 분석하였다. 하기 도 3은 본 발명에 따른 고분자다당류의 구성당을 TLC를 사용하여 분석한 결과를 나타내었다.

도 3에서,

A: 표준당

(갈락토사민, 글루코즈, 갈락토즈, 퓨코즈, 글루콘산, 피루브산)

B: 본 발명에 따른 고분자 다당류의 가수분해물

C: A(표준당)의 가수분해물 이다.

도 3 에 나타난 것과 같이, 다당류의 산 가수분해물(B line)은 표준물질 (A line)과 비교에서 확인되지 않은 점들을 보였으나, 이들의 산 가수분해 유도물질은 표준물질의 산 가수분해물(C line)에서 동일한 Rf치를 갖는 것으로 확인되었다. 그러므로 TLC분석 결과는 HPLC 분석의 결과와 일치함을 알 수 있었다.

이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 좀 더 상세히 살펴보기로 한다.

(실시예 1) 최적 배지조성 및 배양조건

5.0 ℓ의 발효조를 사용하여 최적화된 배지(글루코스 3%, 질산나트륨 0.1%, 인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.08%, 황산마그네슘 7수화물 0.01%, 황산망간 0.01%, 염화나트륨 0.05%)를 121℃에서 30분간 살균하여 냉각한 후 배양 최적온도인 32℃에서 염산 2.0 N을 사용하여 pH 6.5를 자동조절하였다. 통기량은 0.5∼2.0 vvm, 교반속도는 200∼800 rpm의 조건하에서 실시하였다.

배양시간에 따른 균체증식, 다당류 생산 그리고 응집활성을 조사한 결과를 하기 표 8 에 나타내었다. 표 8 에서와 같이 응집활성과 균체 성장은 배양 72시간에서 최대였고, 다당류의 생산도 72시간에 최대였다.

배양시간(hr)	pH	균체성장(OD 660nm)	다당류량(g/l)	환원당(g/l)	응집활성도(1/OD)
012243648607296106118	6.05.65.05.25.35.35.45.55.65.6	0.2201.2351.8102.4203.6154.2045.8135.4304.9004.518	0.00.51.12.03.34.05.54.13.93.8	29.025.019.212.66.03.02.00.50.50.2	2.358.4128.0552.1478.3492.08120.37110.5098.4592.70

이렇게 생산된 다당류를 상기의 다당류 정제과정을 거치거나 또는 배양액을 70℃에서 30분간 살균한 후 직접 아래의 적용실험에 사용하였다.

(실시예 2) 무기성 및 유기성 입자에 대한 응집 침강효율

본 발명균주의 무기성 입자와 유기성 입자에 대한 응집 침강효율은 다음과 같다. 무기성 입자로 카오린(준세이 공업,일본) 5000 ppm을 증류수에 현탁시켜 급속교반하고 본 발명균주의 배양액을 첨가한 후 완속교반하여 플록의 침강성을 측정하였고, 유기성 입자로 하수처리장 폭기조 활성오니를 초음파 마쇄기와 호모게나이즈로 분쇄한 후 현탁성 입자만을 회수하여 2000 ppm으로 조정한 후 무기성입자와 같이 플록의 침강성을 측정하였다. 침강성의 측정은 플록이 형성되어 침강할 때 수면에서 슬럿지 부피가 50% 에 도달되는 시점을 침강속도(㎝/sec)로 환산하여 나타내었다.

본 발명에 따른 다당류의 응용의 우수성을 알아보기 위하여 유기화학 합성 고분자인 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide, PAM)와 생물 고분자 응집제로써 잘 알려진 쥬글란(zooglan)을 비교물질로 사용하여 실험을 수행하였으며 그 결과를 하기 표 9 에 나타내었다.

입자종류	무처리구(㎝/sec)	처리구(㎝/sec)	쥬글란(㎝/sec)	PAM(㎝/sec)
무기성입자유기성입자	0.0180.025	0.1170.125	0.0510.063	0.1220.130

이때 고분자 다당류 및 기타 응집제의 최종농도는 1 ppm으로 조정하였다. 고분자 다당류는 합성 고분자 응집제인 PAM과 비슷한 응집효율을 나타냈으나 생물고분자인 쥬글란보다 50% 높은 응집활성을 보였다.

(실시예3) 고분자다당류를 이용한 벌킹현상의 제거

지속적인 벌킹 현상이 나타나는 제당폐수(경기도 반월소재, S 주식회사)를 선정하여 이를 대상으로, 현미경 검색과 아이켈붐(Eikelboom)의 분류표를 참조하여 분석한 결과, 대상폐수의 벌킹원인으로 스피로틸러스(Sphaerotilus sp.)가 주원인균으로 확인되었으며, COD 1150 mg/ℓ로 연속식 실험을 통한 벌킹 억제 및 처리 효율성을 검토하였다. 실험조건은 반응조 2 ℓ, 체류시간 48시간, pH 6.5, 온도 30±1로 하였으며, 본 발명에 따른 다당류의 초기 투여농도는 200 ppm이었으며, 이후 20 ppm을 투여하였다. 비교 실험구에는 쥬글란을 동일한 방법으로 투여하였다.

하기 표 10과 그림 3에 그 결과를 나타내었다.

시험항	처리전	처리후	쥬글란
COD(㎎/ℓ)생균수(1×10⁷CFU/㎖)SV₃₀(%)	1150898	6210030	1050364

약 3주간의 연속실험을 행한 결과, 유출수의 평균 COD는 62로 유입수에 대한 COD 제거율은 약 90% 였으며, 벌킹현상의 제거능이 우수함을 확인할 수 있었다. 반면에 비교생물 응집제인 쥬글란의 경우는 전혀 효과가 없었다.

연속 실험기간의 슬러지 부피의 변화는 약 7일간은 큰 변화는 없었으나 10일 이후 SV₃₀이 약 50%까지 내려왔고 14일 이후 약 30%의 정상적인 운전조건으로 회복되었다.

(실시예 4) 플록 형성능을 가진 고분자 다당류를 이용한 폐수처리방법

본 발명균주를 실제폐수에 적용시켜 폐수처리능력을 분석하였다. 대상폐수는 도축폐수로 고부하에 의한 플록의 분산이 나타나 SV₃₀이 약 90%이상의 침전조 상태를 나타내었고 따라서 방류수 수질이 기준치 이상으로 악화된 것이었고, 대상폐수를 실험실내에 운반하여 2 ℓ용량의 파이롯트(pilot)를 이용하여 현장의 처리조건과 동일하게 운전하였다. 이때 처리구는 본 발명균주의 배양액을 운전개시일에 200 ppm, 이후 20 ppm을 투여하였고, 실험검정은 운전개시후 5일차에 방류수를 대상으로 실시하였다.

본 발명에 따른 다당류의 폐수처리능력의 우수성을 알아보기 위하여 유기화학 합성 고분자인 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide, PAM)와 생물 고분자 응집제로써 잘 알려진 쥬글란(zooglan)을 비교물질로 사용하여 실험을 수행하였으며 그 결과를 하기 표 11 에 나타내었다.

시험항	무처리구(ppm)	처리구(ppm)	쥬글란(ppm)	PAM(ppm)
COD_Mn(㎎/ℓ)BOD(㎎/ℓ)SS(㎎/ℓ)SV₃₀(%)SVI(㎖/ℓ)	1379010586398	6233301883	110595280239	7540372080

상기 표 11 에 나타난 바와 같이, 고분자 다당류는 합성 고분자 응집제인 PAM과 비슷한 플록형성능을 나타냈고 생물 고분자인 쥬글란보다 매우 높은 플록형성능을 나타내었다.

(실시예 5) 오니해체의 해소능을 가진 고분자 다당류를 이용한 폐수처리방법

본 발명균주를 실제 폐수처리현장에 적용하였다. 대상폐수는 제지폐수로 폭기조 용량은 약 10,000 m³, 수리학적 체류시간 약 24시간의 순산소 폭기시설을 가지고 있었으며, 시운전 기간중 본 발명균주의 효율성을 조사하였다. 본 발명의 다당류의 접종은 실험개시일에 200 ppm, 안정화기간까지 100 ppm, 안정화 이후 10ppm의 조건으로 하였으며 실험검정은 방류수와 폭기조를 처리전 3일간의 평균값과 처리후 10일간의 평균값으로 비교분석하였고 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

시험항	처리전(ppm)	처리후(ppm)	쥬글란(ppm)	PAM(ppm)
CODMn(㎎/ℓ)SS(㎎/ℓ)SV30(%)SVI(㎖/ℓ)	1306688198	67403674	1096775179	62383575

상기 표 9에서 보인 바와같이 고분자 다당류는 합성 고분자 응집제인 PAM과 비슷한 오니해체의 해소능을 보였으며, 생물고분자인 쥬글란은 효과가 전혀 없음을 알 수 있었다.

(실시예 6) 유산균의 응집효과 및 농도실험

MRS 5.0 ℓ의 액체배지(효모추출물 0.5%, 육즙추출물 1.0%, 펩톤 1.0%, 포도당 1.0%, 디포타시움 하이드로겐 포스페이트 0.2%, 암모늄 나이트레이트 0.2%, 소디움 아세테이트 0.5%, 마그네슘 설페이트 0.058%, 망간 설페이트 0.028% 한천 2.0%, pH 7.0)를 사용하여 유산균을 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 균체에 대한 응집여부을 조사하기 위하여 상기 응집능 시험방법에서 카올린 용액 대신에 유산균의 배양액을 이용하여 동일한 조건하에서 실시하였으며 10분간 정치하였다. 상등액 5.0 ㎖을 취하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.

같은 실험조건에서 다당류 2.0 ㎖대신 증류수2.0 ㎖를 넣어 대조구로 실험하였다.

본 발명의 다당류의 수확(harvesting)의 우수성을 알아보기 위하여 유기화학 합성 고분자인 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide, PAM)와 생물 고분자 응집제로써 잘 알려진 쥬글란(zooglan)을 비교물질로 사용하여 실험을 수행하였으며 그 결과는 하기 표 13에 나타내었다.

응집제 종류	KCTC 18027P	쥬글란	PAM	대조구
응집활성도(%)	166	80	90	25

상기 표에서 나타난 바와 같이 대조구에 비하여 본 발명의 다당류는 약 6.6배의 유산균의 응집효과가 있음을 알 수 있었고, 전체 균체량의 약 84%를 응집하는 효과가 있었다.

(실시예 7) 균주배양액의 희석에 따른 효과

본 발명의 균주 배양액을 증류수로 2배, 5배 및 10배 희석하여 실시예 5의 방법에 따라 동일한 조건에서 2회의 반복실험으로 유산균의 응집활성을 조사하였다.

유산균의 응집효율은 2배, 5배, 10배 희석의 경우 각기 180, 169, 152%로 나타나 초기의 희석하지 않은 166%와 비교했을 때 큰 차이가 없었으며, 10배 희석하여 사용하는 것도 가능함을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 신규 바실러스 속 EB-P1 균주와 그로부터 생산되는 다당류고분자를 사용하면 기존의 활성오니를 사용한 경우의 문제점으로 나타나는 사상성 세균에 의한 벌킹현상과 고부하 혹은 빈부하시 발생되는 핀 플록현상 및 오니 일령의 증가에 의한 오니 해체현상 등을 해소하는 데에 효과적인 결과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 신규 바실러스 속 EB-P1 균주 또는 그로부터 생산되는 다당류 고분자를 화학응결제 대신 폭기조에 투입함으로서 지속적이며 고효율의 미생물 기능을 유지시키는 역할을 하며 특히 생물학적 처리시설의 초기 운전시 활성오니의 안정화 기간을 단축하여 운전비용의 절감을 유도할 수 있다.

또한 인체에 무해하며, 자연계에서 쉽게 분해되어 응집제로 인한 2차 환경오염을 방지할 수 있고, 가축의 사료 및 작물의 비료로 재활용하는 등의 부수적인 효과를 거둘 수 있다. 또한 본 발명은 동물사료의 유산균의 균체회수(cell harvesting)하는 응집물질로서도 효과가 있다. 유산균의 경우 이론상의 균체회수율이 10g의 포도당으로 배양가능한 최대 균체량은 1.2 g의 건조균체량으로 매우 낮으며 대부분 원심분리법(centrifugation)이나 막(menbrane)을 이용한 회수방법을 사용하고 있어 고가장비의 구입과 전기비 등 유지관리비 부담으로 유산균의 생산원가의 상승의 원인이 된다. 특히, 동물사료에 첨가하는 유산균의 경우는 낮은 생산 원가를 요구하기 때문에 기존의 균체회수 방법과는 다른 회수 방법을 필요로 하며 국내에서 이와 관련된 다당류에 의한 균체 회수 방법은 이제까지 보고된 적이 없었던 매우 효과적인 방법이다.

Claims

고기능성 다당류물질을 생산하는 바실러스 속 EB-P1(Bacillussp. EB-P1, KCTC 18027P).
제 1 항에서의 바실러스 속 EB-P1 으로부터 생산되는 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 퓨코오즈(fucose), 글루코로닉산(glucuronic acid) 및 피루베이트(pyruvate)로 구성된, 분자량 500만 달톤(dalton) 이상의 고분자물질.
글루코스 3%, 질산나트륨 0.3%, 인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.08%, 황산마그네슘 7수화물 0.05% 및 황산망간 0.05%로 이루어진 배지에서 바실러스 속 EB-P1을 배양하여 제 2 항에 있어서의 고분자물질을 생산하는 방법.
제 2 항의 다당류 고분자물질을 이용한 폐수처리방법.
제 2 항의 다당류 고분자물질을 이용한 균체 회수방법