KR100361480B1

KR100361480B1 - 미크로콕신의 항암제로서의 용도

Info

Publication number: KR100361480B1
Application number: KR1020010034461A
Authority: KR
Inventors: 박미희; 황혜숙; 김규찬; 김성천
Original assignee: 제노프라 주식회사; 김성천
Priority date: 2001-06-18
Filing date: 2001-06-18
Publication date: 2002-11-29
Also published as: KR20010106282A

Abstract

본 발명은 암세포에 대하여 선택적 독성을 나타내는 매크로사이클릭 펩티드(Macrocyclic peptide)계 화합물의 일종인 미크로콕신(micrococcin)의 항암제 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항암제 용도의 미크로콕신은, 포도상구균의 일종인Staphylococcus sciuri를 배양하여 원심분리로 세포를 수확하는 과정, 수확된 세포를 인산염 버퍼(phosphate buffer)로 세척하고 메탄올을 처리하여 미크로콕신을 추출한 다음에 다시 원심분리하여 세포를 제거하는 과정, 메탄올 추출물을 건조한 후에 디클로로메탄과 메탄올의 혼합액에 녹여 실리카겔 클로마토그래피 컬럼에 로딩하는 과정, 및 컬럼에 디클로로메탄과 메탄올의 혼합액을 처리하여 미크로콕신 추출물을 수확하는 일련의 과정을 통하여, 미생물로부터 얻을 수 있고,Bacillus pumilus, Staphylococcus equorum WS2733, Micrococcus varians등 다른 미생물로부터 또는 유기합성으로도 생성할 수도 있다. 본 발명에 따른 미크로콕신을 이용한 항암제는 정상세포들에 대한 독성을 보이지 않으면서도 각종 암세포에 대하여 선택적인 독성을 나타내어 각종 암환자에게 적용할 경우 암세포만의 선택적 사멸을 유도함으로 암치료제로서 유용하다.

Description

미크로콕신의 항암제로서의 용도{Use of Micrococcin as Anticancer Agents}

(기술분야)

본 발명은 항암제에 관한 것이며, 보다 상세하게는 암세포에 대하여 선택적 독성을 나타내는 매크로사이클릭 펩티드(macrocyclic peptide)계 화합물의 일종인미크로콕신(micrococcin)의 항암제 용도에 관한 것이다.

(배경기술)

노년인구의 증가와 환경악화로 인하여 세계 암발생률은 매년 5% 이상 증가하고 있고 1997년 통계에 의하면 암으로 사망한 사람이 600만 명으로 전세계 사망률의 12%에 달하고 있는 것으로 조사되고 있다.

대한민국의 경우에도, 통계에 의하면 매년 10만명 정도의 암환자가 새롭게 발생하고 5만 여명이 사망하며, 1997년 암환자는 12만 명으로서 남자는 위암(21%), 간암(12%), 폐암(11%)의 순서로, 여자는 자궁경부암(20%), 위암(16%), 유방암(13%)의 순서로 암환자가 발생하였고 매년 암환자 증가율이 10% 정도에 이르는 것으로 보고되고 있다.

현대의학의 대표적 암 치료법으로는 외과적 수술요법, 화학요법, 생물학적 요법, 및 방사선요법 등을 들 수 있으며, 이들을 단독 혹은 병용으로 치료에 응용하고 있으나 아직 완벽한 치료법이 없는 상태이다. 따라서 암은 21세기 인간의 수명 연장을 위해 극복해야 할 최우선 과제의 하나로 인식되고 있다.

항암제란 암세포의 각종 대사경로에 작용하여 암세포에 대하여 세포독성(cytotoxicity)이나 성장억제효과(cytostatic effects)를 나타내는 약제를 총칭하는 것으로서, 지금까지 개발된 항암제는 그 작용기전과 화학구조에 따라 대사길항제, 식물성 알칼로이드, 국소이성질화효소 억제제(topoisomerase inhibitor), 알킬화제, 항암성 항생물질, 호르몬제, 기타 약제로 분류된다.

항암제들은 약제에 따라 세포내 표적이 다양한데, 세포의 DNA복제, 전사, 번역과정을 차단하거나 세포생존에 중요한 단백질의 작용을 방해하며, 이러한 세포 내 표적에의 영향은 이후 괴사(necrosis)나 아폽토시스(apoptosis: 자사)의 과정을 통해 암세포를 사멸시키게 된다. 일반적으로 이러한 항암제가 작용하는 대사경로는 암세포에만 특이한 것이 아니고 정상세포에도 동일하기 때문에 항암제 투여시에는 정상조직의 손상(즉, 독성)도 피할 수 없다.

그러나, 암세포와 정상세포의 대사 사이에는 의미 있는 양적인 차이가 존재하고 이런 차이에 근거하여 항암제는 암조직에 보다 큰 독성을 나타내게 되는 것임으로, 이와 같은 항암제의 선택적 독성(selective toxicity)을 이용함으로써 임상적으로 항암화학요법이 가능한 것이다. 따라서 정상조직의 독성은 피하면서 암세포를 없앨 수 있는 특이적 치료효과지수(therapeutic index)가 클수록 보다 안전한 항암제라고 할 수 있다.

암세포는 정상세포보다 높은 단백질 합성능력을 나타냄으로 이를 저해하는 물질은 암세포에 대한 선택적 독성을 갖는 항암효과를 발휘하게 된다.

원핵생물에서 단백질합성을 저해하는 항생제들로는 카나마이신(kanamycin), 테트라사이클린 클로람페니콜(tetracycline chloramphenicol), 에리트로마이신(erythromycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 린코마이신(lincomycin), 실린다마이신(clindamycin), 티오스트렙톤(thiostrepton), 미크로콕신(micrococcin) 등이 있다.

이중에 도1로 대표되는 구조식을 가지는 매크로사이클릭 펩티드계 항생제인미크로콕신(예, C₄₈H₄₉N₁₃O₉S₆·9H₂, C:49.51%, H: 5.97%, N:15.64%, O: 12.36%, S: 16.52%)은Staphylococcus sciuri,Bacillus pumilus, Staphylococcus equorum WS2733, Micrococcus varians등의 미생물에서 분리되었고 유기합성으로도 생성되는 화합물로서(미크로콕신의 유기합성은, Okumura K., Suzuki T., Nakamura Y. , and Shin C. 1999. Total synthesis of a Macrocyclic antibiotic, Micrococcin P1. Bull. Chem. Soc. Jpn., 72, 2483-2490 및 Ciufolini M.A ., and Shen Y.C. 1999. Synthesis of the Bycroft-Gowland structure of micrococcin P1.Org Lett.1(11), 1843-1846 등을 참조할 수 있다), 주로 그람양성 세균류에 대하여 항생작용을 나타내는 것으로 널리 보고되고 있다.

미크로콕신은 원핵 및 진핵세포에서 잘 보전된 GTPase 센터(centre)를 그 작용점으로 한다. 단백질합성 장소인 리보좀(ribosome)은 두 개의 단위체로 구성되어 있고 GTPase 센터는 두 단위체 중 큰 단위체(LSU)의 rRNA에 위치하고 있다. GTPase 센터는 23 S-like rRNA의 domainII 내의 이중헤어핀 구조(double hairpin structure)에 위치하며, 이 곳에 L₁₁단백질 및 L₁₀(L₁₂)₄5위체 단백질 복합체(pentameric protein complex)가 결합하여 생물학적 기능을 수행한다.

미크로콕신은, 원핵생물에서 GTPase 센터에 결합하여 EF-G의 존재 하에서 리보좀에서 일어나는 GTPase 반응을 방해함으로써 단백질 합성을 억제하여 항생제로서 기능을 하고, 또한 말라리아 원충(Plasmodium falciparum)의 유사 색소체 세포기관(plastid-like organelle) 내에서 단백질 합성을 억제하여 원충의 생장을 저해하기도 하지만, 지금까지의 연구성과에 의하면 진핵생물에 대해서는 미크로콕신이 위와 같은 억제작용을 나타내지 못하는 것으로 알려져 있었다.

본 발명자들은 암세포주에서 단백질 합성에 관여하는 리보좀의 기능을 저해하는 매크로사이클릭 펩티드 화합물인 미크로콕신에 대하여 기존의 그람양성균에 대한 항생효과와는 전혀 다른 항암효과를 처음으로 확인하여 기존 화학요법이 갖는 부작용이나 임상 유용성의 문제점을 극복할 목적으로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 매크로사이클릭 펩티드 화합물인 미크로콕신의 항암효과를 확인함에 따라 이들 이용한 항암제를 제공하고자 하는 것이다.

도1은 미크로콕신의 구조식,

도2a 내지 도2k는 미크로콕신이 정상세포(MNC: 도2a) 및 암세포주 AGS(도2b), SNU-638(도2c), SNU-601(도2d), Hep G2(도2e), SNU 368(도2f), SK-Hep1(도2g), KM 1214 및 Lovo(도2h), Jurkat(도2i) 및 NCI-H23(도2j)의 생장에 미치는 효과를 보여주는 그래프 도면,

도3은 미크로콕신에 의한 위암세포주(AGS)의 아폽토시스를 보여주는 사진도면.

본 발명에 따라, 미크로콕신의 항암제로의 용도가 제공되며, 따라서 본 발명에 따라 미크로콕신으로 된 항암제가 제공된다.

본 발명에 따른 항암제 용도의 미크로콕신은 미생물로부터 추출하여 얻을 수 있다. 예를 들어 미크로콕신은, 포도상구균의 일종인Staphylococcus sciuri를 배양하여 원심분리로 세포를 수확하는 과정, 수확된 세포를 인산염 버퍼(phosphate buffer)로 세척하고 메탄올을 처리하여 미크로콕신을 추출한 다음에 다시 원심분리하여 세포를 제거하는 과정, 메탄올 추출물을 건조한 후에 디클로로메탄과 메탄올의 혼합액에 녹여 실리카겔 클로마토그래피 컬럼에 로딩하는 과정, 및 컬럼에 디클로로메탄과 메탄올의 혼합액을 처리하여 미크로콕신 추출물을 수확하는 일련의 과정을 통하여,Staphylococcus sciuri부터 추출할 수 있다. 또한 미크로콕신은Bacillus pumilus, Staphylococcus equorum WS2733, Micrococcus varians등의 미생물을 통해 얻을 수도 있고, 공지된 유기합성을 통해서도 얻을 수 있다.

미크로콕신은 예를 들어 약학적으로 허용되는 용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 암세포주와 정상세포에 처리하면, 암세포주에 대하여 선택적 독성을 나타내어 암세포 사멸을 유도함으로 항암제로서 유용한 약리효과를 나타내게 된다.

지금까지 연구 보고된 정상세포에 미치는 미크로콕신의 독성은, 인간의 혈액에서 분리하여 배양한 단핵세포에 대하여 625nmol이하의 농도에서 독성이 거의 없는 것으로 밝혀져 있다. 본 발명자에 의해 확인된 암세포주들에 대한 미크로콕신의 IC₅₀값은 대략 0.5nmol 내지 5nmol이다.

본 발명에 따른 미크로콕신으로 된 항암제 또는 미크로콕신을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 미크로콕신은 활성성분 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 항암제 조성물로 제조할 수 있다. 본 발명의 미크로콕신 항암제 조성물에는 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 활택제 등을 통상적인 방법으로 포함시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 미크로콕신 항암제는 널리 알려진 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 미크로콕신 항암제의 유효 투여량은 환자중량 1KG당 대략 1일 0.6㎍ 내지 6㎍이며, 바람직하게는 1일당 3 - 6㎍/KG이다.

이하, 실시예와 첨부도면을 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

도1은 미크로콕신의 구조식이고, 도2a 내지 도2k는 미크로콕신이 정상세포(MNC: 도2a) 및 암세포주 AGS(도2b), SNU-638(도2c), SNU-601(도2d), Hep G2(도2e), SNU 368(도2f), SK-Hep1(도2g), KM1214 및 Lovo(도2h), Jurkat(도2i) 및 NCI-H23(도2j)의 생장에 미치는 효과를 보여주는 그래프 도면이며, 도3은 미크로콕신에 의한 위암세포주(AGS)의 아폽토시스를 보여주는 사진도면이다.

실시예1: 미크로콕신의 추출

먼저,Staphylococcus sciuri를 표준화된 공지의 방법으로 배양한 후, 원심분리에 의해 상기 세포를 수확하였다.

다음에, 상기 세포 1 그램을 6ml의 인산염 버퍼(pH 7.0)로 세척하고 3ml의 메탄올을 처리하여 미크로콕신을 추출한 후 원심분리하여 상기 세포를 제거하였다.

다음에, 상기 메탄올 추출물을 Rotavap™을 이용해 건조한 후 디클로로메탄(dichloromethane)과 메탄올(methanol)을 95대5의 비율로 혼합한 혼합액으로 녹여 실리카겔 클로마토그래피 컬럼(건조고형추출물 1그램 당 100g 실리카겔 사용)에 로딩하였다.

마지막으로, 상기 클로마토그래피 컬럼에 디클로로메탄과 메탄올 혼합액(95:5)으로 처리하여 최종 미크로콕신 추출물을 수확하였다.

실시예 2: 미크로콕신이 암세포주의 생장에 미치는 영향

건강한 사람의 혈액에서 분리한 단핵세포(mononuclear cell: MNC), 위암 세포주(AGS, SNU638, SNU 601), 간암 세포주(Hep G2, SNU 368, SK-Hep1), 대장암 세포주(KM 1214, Lovo), 백혈병 세포주(Jurkat) 및 폐암 세포주(NCI-H23)를 대상으로 DMSO(디메틸 술폭사이드)에 녹인 미크로콕신을 도2와 같이 10nmol 이하의 여러 가지 농도로 처리하여 72시간동안 배양하면서 암세포의 생장률을 측정함으로써 미크로콕신이 정상세포 및 암세포주들의 생장에 미치는 효과를 평가하였다.

구체적으로, 먼저 상기 정상세포(MNC)와 암세포주들을 각각 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMED(Hep G2, SK-Hep1)과 RPMI(MNC와 다른 모든 암세포주)에 액체 배양하여 10⁴-10⁵의 양으로 6-웰 플레이트에 깔아준 후에, 24 시간동안 37℃에서 5% CO₂조건 하에 배양하였다.

다음에 이들 각각의 배양배지에 미크로콕신을 도2에 그래프로 표시된 바와 같은 여러 가지 다양한 농도로 처리하여 72시간동안 37℃에서 5% CO₂조건 하에 배양한 후, MTT 분석으로 세포증식을 조사하였다.

MTT 분석은 5mg/ml MTT를 배양 부피의 1/10이 되도록 각 암세포에 처리하여 37℃에서 4 시간동안 방치한 후 배지를 제거하였다. 0.05M HCl의 이소프로판올 용액을 이용하여 살아있는 세포만을 염색하고 있는 보라색의 MTT 색소를 녹인 후, 색소의 흡광도를 570nm에서 읽었다. 이때, 기저치(background) 파장인 630nm에서의 흡광도를 570nm의 값으로부터 빼준 후 데이터를 처리하였다.

이상의 테스트 결과는 도2와 같으며, 도시된 바와 같이 미크로콕신은 다양한 암세포주들(도2b 내지 도2j)에 대해 투여한 농도의 범위에서 대략 농도 비례적으로 독성을 보이지만 건강한 사람의 혈액에서 분리한 단핵세포(MNC: 도2a)에는 별다른 영향이 없음을 알 수 있다.

실시예 3: 미크로콕신이 암세포주의 생장에 미치는 기전

미크로콕신이 암세포의 생장을 저해하는 기전을 아폽토시스 분석방법으로 관찰하였으며, 본 아폽토시스 분석방법은 제조사(Promega사의 Apoptosis Detection System, Fluorescein protocol)에 준해 실시하였다.

구체적으로, 먼저 암세포주 AGS를 10% 우태아혈청이 포함된 RPMI 배지에 액체 배양하여 Lab-Tek 챔버 슬라이드에 깔아준 후에 24 시간동안 37℃에서 5% CO₂조건 하에 배양하였다.

다음에 0.5nmol 미크로콕신을 상기 암세포주에 처리하여 6시간동안 배양하고 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척한 후, 4%의 메탄올-프리 포름알데히드 PBS 용액에 상기 암세포주를 4℃에서 30분 동안 처리하여 고정하고 PBS로 3회 세척하였다.

다음에, 0.2% 트리톤 X-100 PBS 용액을 상기 암세포주에 15분간 상온에서 처리하여 투과화(permeabilization) 시킨 후에, PBS로 3회 세척하고 100㎕ 평형버퍼를 처리하여 10분 동안 상온에 방치하였다.

다음에, TdT 인큐베이션버퍼(45㎕ 평형버퍼, 5㎕ 누클레오티드 믹스 및 1㎕ TdT 효소)를 상기 암세포주에 처리하여 37℃의 가습챔버(humidified chamber)에 1시간 동안 방치하고 슬라이드에 2 ×SSC를 처리하여 상온에서 15분 동안 방치하였다.

마지막으로, PBS로 3회 세척하고 1㎍/ml 프로피디움 이오다이드(propidium iodide)를 처리하여 어두운 곳에서 15분 방치하여 염색하고, 탈이온수로 5분 동안 세척하는 과정을 3회 실시하여 세척한 후에, 형광현미경으로 아폽토시스 세포의 녹색형광을 관찰하였으며, 그 결과는 도3과 같다.

도3에 나타난 바와 같이 미크로콕신은 암세포주에서 아폽토시스를 유도함을 명백하게 알 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명에 따른 미크로콕신을 이용한 항암제는, 정상세포들에 대한 독성을 보이지 않으면서도 각종 암세포에 대하여 선택적인 독성을 보임으로 각종 암환자에게 적용할 경우 암세포만의 선택적 사멸을 유도하며, 따라서 암치료제로서 유용하다.

Claims

미크로콕신을 유효성분으로 포함하는 항암제.
제1항에 있어서, 미크로콕신의 유효량이 환자중량 1KG당 1일 0.6㎍ 내지 6㎍인 것을 특징으로 하는 미크로콕신을 유효성분으로 포함하는 항암제.