KR100332250B1

KR100332250B1 - 2',5'-올리고아데닐레이트2',3'-시클로포스페이트

Info

Publication number: KR100332250B1
Application number: KR1019960701492A
Authority: KR
Inventors: 아이. 부도브스키 에드워드; 이. 가브릴로프 알렉산더; 디. 피바시얀 아만
Original assignee: 이. 가브릴로프 알렉산더; 아이. 부도브스키 에드워드
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 2002-12-05
Also published as: EP0721457B1; US5962431A; DE69324826D1; WO1995008555A1; ES2133412T3; GR3030863T3; US5739013A; DK0721457T3; EP0721457A1; KR960704911A; JPH09509647A

Abstract

본 발명은 하기 일반식(I)로 표시되는 신규의 2',5'-올리고아데닐레이트-2',3'-시를로포스폐이트, 이를 활성 성분으로 함유하는 의약, 및 이의 사용방법에 관한 것이다:

상기 식에서, 0 ≤n ≤10, 특히 n ≥0 내지 10 이고, 바람직하게는 1 또는 2 이다.

Description

2',5'-올리고아데닐레이트 2',3'-시클로포스페이트 {2',5'-OLIGOADENYLATE-2',3'-CYCLOPHOSPHATES}

본 발명은 3'-말단에 시클로포스페이트 기를 가지며 5'-말단에 유리된 OH기를 가지는 2',5'-올리고아데닐레이트류, 이의 제조 방법, 이를 함유하는 약학 제제, 및 이들 화합물을 외부 유두종증의 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 신규의 화합물, 즉, 하기 일반식 (I)로 표시되는 2',5'-올리고아데닐레이트-2',3' 시클로포스페이트에 관한 것이다:

특히, n = 1 또는 2 인 화합물은 의약용으로, 즉, 유두종 바이러스에 의해 유발된 피부 및 상피 손상의 국소 치료용으로 사용하는 데 유리하다.

파포바바이러스과의 유두종 바이러스에 의해 유발된 유두종증은 인체 및 동물에서 자주 발생하는 감염증이다. 현재 60 종 이상의 인체 유두종 바이러스가 알려져 있다.

이러한 바이러스는 모두 유사한 구조를 갖는다. 그 게놈은 8000 개의 염기쌍을 가진 이중 가닥의 공유 폐환형 DNA를 가지며, 그 염기 쌍들은 바이러스의 세포간 성장에 필요한 비리온 단백질 및 기타 단백질을 암호화한다. 유두종 바이러스의 게놈은 수 세대에 걸쳐서 에피솜의 형태로 감염된 세포내에서 반복 복제된다(세포당 수십개의 복제). 성숙한 비리온의 형성은 최종 분화 단계까지는 세포내에서 발생하지 않는다.

안정한 조건하에서, 제1 세대의 유두종 바이러스의 게놈만이 형질 발현된다. 따라서 이들은 세포의 표현형의 변화를 야기하며 이런 식으로 유두종증을 형성시킨다. 바이러스의 유형 및 다른 인자에 따라서, 감염된 세포내에서 세포 게놈에 그 자체가 직접 결합되어 있는 바이러스 게놈의 특정한 부분에 대하여 특이적인 변화가 존재한다. 이어서 이러한 변화는 악성 종양을 일으킬 수 있다. 인체에 있어 상당한 수의 종양이 유두종증의 악성 진행으로 인한 결과라는 사실은 공지된 바이다. 즉, 이것은 지속적이며 잠재적인 바이러스 감염증의 결과라는 것을 시사하는 것이다.

악성 종양과 관련해서 보면, 성적 접촉으로 전염된 항문 성기의 유두종증이 가장 위험하다(참고 문헌 : [M. 스피쪄, Obset. Gynecol. 1989 제73권 3호 303-307; H. 쥐르 하우젠, A. 슈나이더, "The Role of Papillomaviruses in Human Anogenital cancer", The Papovaviridae. (N.P. 알즈만 편집) 1987 제2권 p. 245-263; H. 쥐르 하우젠, "Papillomaviruses as Carcinomaviruses", Adv. in Virus Oneology(G. 클라인 편집) 1989 제8권 p. 1-26]).

유두종증은 쉽게 진단되는 전암성(前癌性) 질병이기 때문에, 양성의 유두종증의 치료에 의해서, 즉, 감염된 세포내에서 악성 종양 상태로의 변태가 발생되기 전에, 많은 종양의 진전을 예방할 수 있다.

현재, 유두종증을 치료하기 위한 가장 중요한 방법은 외과 수술에 의한 유두종의 제거, 및 전기, 저온 또는 레이저에 의한 부식을 이용하는 괴사법이다(참고 문헌 : ["Virus infections: etiology, epidemiology, clinics, pathogenesis and diagnosis", Rep. Col. of Scient. Public,, Sverdlovsk, 1985 (러시아어판)]). 액상 산소, 산 및 이들의 혼합물(초석산, 옥살산 및 락트산 등)이 이러한 목적으로 사용되지만, 이들은 주변의 건강한 조직들까지 괴사시켜서 적응 부위 상에 흉터를 만들며, 이미 제거된 유두종이 있던 부위 근처에서 유두종의 재발과 새로운 유두종의 출현을 일으키는 경우가 빈번하다(참고 문헌 : [S. A. 바시 "Cryotherapy versus podophyllin in the treatment of genital warts", Int. J. Dermatol. 1985 제24권 8호 p. 535-536]).

유두종증을 치료함에 있어서 포도필린 독소 및 인터페론을 사용하는 방법의 효능은 크지 않으며, 또한 치료학적인 유효 용량을 투여한 경우조차도 심각한 부작용과 후유증을 수반한다.

포도필린의 생물학적 활성은 콜히친에 필적하는 포도필린의 항유사 분열 효과에 의해 설명할 수 있다. 포도필린을 사용하는 방법은 국소 반응(감염증, 알레르기성 접촉 피부염, 경우에 따라서는 피부의 부식 등) 뿐만 아니라 바람직하지 못한 후유증, 예를 들면 말초 신경 장애, 호흡 빈삭, 혈뇨 및 자연 유산을 일으키는 경우가 빈번하다(참고 문헌 : [K. R. 보트너 "Podophyllotoxin in the Treatmentof Genital Human Papillomavirus Infections", Seminars in Dermatology 1987 제6권 1호 p, 10-18]).

유두종증의 치료에 인터페론을 사용하는 방법은 제한된 효능만을 가지며 이러한 치료에 사용되는 용량은 면역 시스템의 억제 뿐만 아니라 자기 면역 장애등의 개시를 야기할 수 있다(참고 문헌: [F. G. 브루인스, A. J. C. 본 덴 브룰, R. 뮬리닉, G. M. M. 월부머스, C. J. 메이저, R. 빌렘즈, J. Invest. Dermatol. 1989, 제93권 4호, p, 544-545; M. 폴드반, A. 모어랜드, M. 네제이, 상기 문헌, p. 550: G. 그로스, 루사키, 상기 문헌, p. 553; M. 니이무라, 상기 문헌 p. 567]).

2',5'-올리고아데닐레이트의 합성 유사체(2.5 A)는 면역 억제 활성을 나타내는 것으로 공지되어 있으며, 외과 수술용 이식물로서 이미 추천된 바 있다. 올리고아데닐레이트는 독성이 적고 인터페론에 의해 유발된 효능의 조절제인 면역 억제제보다 특이적 및 보편적으로 더욱 효능이 우수한 것으로 밝혀졌다(A. 킴치등, 미국 특허 제4 378 352호(1983) 참조).

또한 말단에 모르폴린 기를 함유하는 합성 2.5 A를 사용할 경우에도 동일한 효과가 달성된다(R. 토렌스 등, 미국 특허 제4 515 781호 (1985) 참조).

3 개 이상의 아데노신 분절을 가진 2.5 A 유사체는 시험관내 바이러스 단백질 합성의 황성 억제제로서 공지되어 있다(잰 M. 케르 등, 미국 특허 4,21,P,746 (1980) 참조).

2.5 A-올리고-3'-데옥시아데닐레이트 및 그 유도체들의 일부 합성 유사체는 특히 단순 포진 바이러스 및 엡스타인-바르-바이러스에 의한 동물 세포의 감염과형질 전환을 억제하지만, 이미 감염되거나 형질 전환된 세포의 경우에 있어서는 불활성이다(R. I. 수하돌니크 등의 미국 특허 제4 464 359호 (1984): R. I. 수하돌리크 등의 미국 특허 제4 539 313호 (1985); 및 R. I. 수하돌니크 등의 미국 특허 제4 708 935호 (1987) 참조).

사이토메갈로바이러스, B형 간염 바이러스 및 바리셀라 조스터 바이러스에 의해 유발된 감염성 질병을 치료하는 데 2.5 A 를 사용할 수도 있다(EP-B-121 635호(Au, No, J, Dk, Fi, Fi, Es 지정) (1984) 참조).

따라서, 유두종 바이러스에 의해 유발된 피부 및 상피 손상에 대하여 선택적 효능을 가진 유효한 약물을 제공하는 것이 연구 과제이다.

본 발명의 목적은 하기 일반식(I)로 표시되는 2',5'-올리고 아데닐레이트-2',3'-시클로포스페이트를 제조함으로써 달성된다:

또한 본 발명의 목적은 상기 신규의 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 데 있으며, 본 발명의 제조 방법은 폴리(A)를 출발 물질로 하며, 이하에 상세히 설명한다.

상기 화합물은 불규칙한 2',5'- 및 3',5'-누클레오티드간 결합을 가진 폴리(A)를 출발물질로 해서 공지의 절차를 사용하여 2'(3')-아데노신 모노 포스페이트를 화학적으로 중합시킴으로써 허용가능한 방식으로 제조할 수 있다(참고 문헌: A. M. 미켈슨, Chemistry of the Nucleosides and Nucleotides (아카데믹 프레스) 1963, p. 418 및 419]). 이어서, 상기 중합체내의 3',5'- 결합을 B 중간물(EC.3.1.4.23)로부터 얻은 리보누클레아제에 의해 분해함으로써 말단 2',3'-시클로포스페이트 기를 함유하는 혼합물과 함께 다양한 길이를 가진 2',5'-올리고아데닐레이트 및 단량체를 형성시킨다.

다음과 같은 단계들을 포함하는 또 다른 2 단계 절차를 사용하여 동일한 결과를 얻을 수 있다:

1. 폴리(A)를 리보누클레아제 T2(또는 유사한 리보누클레아제)를 사용하여 분해시켜 각각의 올리고머가 2',3'-시클로포스페이트와 3'-모노포스페이트와의 혼합물을 나타내는 일련의 2',5'-올리고아데닐레이트를 형성시키는 단계; 및

2. 상기 혼합물을 완충 수용액 중의 100 배 과량의 BrCN 으로 처리하여 말단 3'-포스페이트 기를 2',3'-시클로포스페이트 기로 전환시키는 단계.

상기한 2 가지 합성 방법은 다음과 같은 도식으로 나타낼 수 있다:

얻은 2',5'-올리고아데닐레이트의 혼합물을 분석하고 상기 일반식(I)에 따른목적하는 올리고누클레오티드를 HPLC를 사용하여 정제한다.

유리된 화합물 형태의 말단 2',3'-시클로포스페이트 기를 가진 2',5'- 올리고아데닐레이트는 종래 개시된 바 없다. 2',5'-올리고아데닐레이트 내의 2'(3')-포스페이트 기 및 2',3'-시클로포스페이트 기는 세포 효소에 의한 상기 화합물의 가수분해를 효과적으로 방지한다. 5'-트리포스페이트 기를 함유한 천연의 2',5'-올리고아데닐레이트와 비교할 때 2',3'-시클로 포스페이트 유사체의 효능은 세포 효소 포스포디에스테라제에 의한 가수분해에 대한 내성 및 저조한 하전량으로 인해 세포 투과에 대한 가능성이 더욱 크다는 사실에 의해 설명될 수 있다.

본 발명에 사용되는 2',5'-올리고아데닐레이트는 물 또는 중성 염류의 수용액에 용해시켜서 2 주 동안 매일 1 회 또는 2 회 피부 병소(예를 들면, 편평 사마귀 및 발바닥 사마귀, 콘딜로마(condyloma)등)에 도포할 수 있다. 유효 성분의 농도는 10^-4내지 10^-7M이다.

이와 같은 콘딜로마의 치료 방법에 의하면 그 성장을 중단시키고 새로운 형성도 존재하지 않으며, 대부분의 경우에, 기존의 콘딜로마는 4 내지 6 주 이내에 감소된다.

통상의 사마귀의 경우에는, 최초 1 주일의 말기에는 점차로 그 돌기가 편평해져서 치료를 시작한지 2 내지 4 주 경과 후에는 완전히 사라진다. 편평 사마귀를 가진 환자는 치료를 시작한지 1 개월 경과 후에는 완전히 치유된다.

유두종을 치료하는 과정에서는, 1.5 내지 2 주 이후에는 새로운 유두종의 형성이 줄어들면서 비교적 작은 유두종은 사라진다. 1 개월 이내에는 피부 손상이 완전히 경감된다. 흉터를 남긴 예는 없다. 또한 치료에 의한 독성 알레르기 반응 또는 기타 부작용은 수반되지 않는다.

치료제 용액 중의 활성 올리고아데닐레이트의 농도는 인터페론 감응된 세포에 대한 경우보다 약 2 배 정도 더 크지만, 도포되는 용액의 총량은 일반적으로 1.0 ml 이하이다. 모든 올리고아데닐레이트가 흡수되는 경우조차도 세포 및 체액(혈액, 뇨 등)내에서 얻어지는 평균 농도는 감응되지 않은 세포내에서의 농도보다 훨씬 낮다. 사용되는 화합물의 농도는 정상 세포내의 그 화합물의 천연 유사체의 농도보다, 그리고 도포 부위에 바로 근접한 주변의 조직에서의 농도보다 일시적으로만 (도포 직후에만) 더 높은 데 불과할 것이다.

2',5'-올리고아데닐레이트는 유기체내의 세포 내외에서 누클레아제 및 포스파타제에 의해 용이하게 분해된다. 최종 생성물은 아데닐산과 아데노신을 포함하며, 이는 세포내 평균 농도가 10^-3M 이하인 정상 세포 대사산물을 나타낸다.

상기 일반식(I)로 표시되는 올리고아데닐레이트와 이들을 함유하는 혼합물은 둘다 유두종 바이러스에 의해 유발된 피부 및 상피 손상을 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 2',5'-올리고아데닐레이트를 저 용량으로 국소 도포하여 유두종증을 치료하는 방법은 크게 효과적이며, 유해한 피부 반응이나 전신 부작용은 관찰되지 않았다. 손상의 치료 결과 환자의 80% 이상이 완전한 손상의 치유를 나타내었다. 3 개월의 관찰 기간 말기에 재발의 증거는 전혀 없었다.

본 발명에 의한 제제는 국소 투여에 적합한 다양한 형태로 투여될 수 있다. 제제는 활성 화합물 또는 그들의 혼합물을 표준 기법을 사용하여 약학적 혀용 담체와 충분하게 혼합하거나 용해시킴으로써 제조된다. 도포(외피, 점막 조직 등) 제제의 목적하는 형태에 따라 담체의 종류는 크게 달라질 수 있다. 각종 약학적 매체를 사용하여 제제를 제조할 수 있으며, 예컨대 알코올, 글리콜 등을 함유하거나 함유하지 않은 디메틸 설폭사이드, 물 등의 액상 담체, 또는 포마드, 연고 및 석고 형태의 매체를 들 수 있다. 편의상, 이러한 제제를 단일 투여 단위로 만드는 것이 특히 유용하다. "단일 투여 단위"라는 용어는 소정의 약학적 담체와 배합된 경우 목적하는 치료 효능을 달성하기 위해 계산된 특정한 양의 활성 성분을 각기 함유하는 물리적으로 분할된 단위를 말하는 것이다. 유두종증을 치료함에 있어 단일 투여에 사용되는 대응하는 용량은 돌기 하나 당(직경 3∼5 mm) 활성 성분(n= 1 및/또는 2) 10^-9내지 10^-8M 이어야 한다. 치료의 총 지속 기간은 매일 도포할 경우 30 일 이하이다.

이하에서는 실시예에 의거하여 올리고누클레오티드 혼합물 및 각각의 2',5'-올리고아데닐레이트의 제조 방법을 예시하고자 한다.

2',5'-올리고아데닐레이트의 화학 효소 합성, 정제 및 분석

모든 반응은 실온에서 수행하였다.

a) 폴리(A)의 합성

H⁺형태의 아데노신-2'(3')-모노포스페이트 0.9 g(2.5 mMol) 및 트리-n-옥틸아민 1.2 ml(2.6 mMol)을 30m1의 메탄올/에탄올(1:1)에 용해시키고 그 용액을 수 시간 동안 교반시켰다. 이어서 용해되지 않은 부분을 유리 필터를 사하여 여과제게하고 그 여과액을 회전식 증발기를 사용하여 건조될 때까지 증발시켰다. 이어서 얻은 고형물을 10ml의 무수 디옥산에 용해시키고 회전식 증발기를 사용하여 증발 건조시켰다. 양 절차를 2 회 반복하였다. 이어서 얻은 고형물을 5ml의 무수 디옥산에 용해시키고, 그 용액에 0.77 ml(3.75 mMol)의 디페닐포스포릴클로라이드를 적가하면서 자기 교반기를 사용하여 혼합물을 교반시켰다. 이어서 트리-n-옥틸아민 3.3 ml(7.5 mMol)을 첨가하였다. 얻은 흔합물을 1 시간 동안 교반시킨후에 0.77 ml의 디페닐포스포릴 클로라이드 및 3.2 ml의 트리-n-옥틸아민을 첨가하고, 그 혼합물을 4 시간 동안 더 교반시켰다. 이어서 교반하에 반응 혼합물을 5 배 부피의 헥산/에테르 (4:6)에 주입하였다. 그 후에 글래스 필터를 사용하여 침전물을 여과하고, 동일한 혼합물과 이어서 에테르로 세척한 후 진공 건조시켰다. 그 결과 불규칙한 2',5'- 및 3',5'-누클레오티드간 결합을 가진 폴리아데닐레이트의 백색 분말을 얻었다. 그 혼합물의 일반식은 (A2'(3')p-)_nA〉p이고, 이 때 n=10이다.

이어서 무수 중합체 혼합물을 물 12 ml에 용해시키고 진한 암모니아 용액을 첨가하여 pH 9.3으로 조정하였다. 이어서 3 배 부피의 에탄올을 첨가하고 5 MHCl을 첨가하여 pH를 3.0으로 조정하였다. 그 혼합물을 -18℃의 온도에 보관했을 때 형성된 침전물을 원심 분리 시키고 75% 에탄올로 세척한 후에 기류중에서 건조시켰다. 상당한 분량의 단량체가 잔류하였다.

b) 바이나제를 사용한 분해에 의한 3',5'-누클레오티드간 결합의 선택적 분해

상기 절차 a)로부터 얻은 침전물을 40 ml의 H2O에 용해시키고 트리스-염기 3 M 용액을 사용하여 pH를 7.0으로 조정한 후, 이어서 바실루스 중간물 RN아제(바이나제, E.C.3.1.4.23) (150 E/mg)을 첨가한 후에, 10 내지 12 시간 동안 교반시켰다. 이어서 효소를 동일한 부피의 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)을 사용하여 추출하였다. 얻은 수성 상은 2',5'-올리고 아데닐레이트 및 아데노신의 2',3'-시클로포스페이트의 혼합물을 함유하였다.

c) 각각의 화합물의 분리

각각의 성분들을 분리시키기 위한 절차는 HCO₃형태의 DEAE 스페론 1000 (16×600 mm, 120 ml)를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 근거한 것이다. 폴리(A)의 효소 분해 생성물을 탈단백질화시킨 후에 회전식 증발기에서 8 내지 10 회 농축시켰다. 10 배 부피의 에탄올을 첨가하고 그 흔합물을 18℃ 하에 12 시간 동안 방치하였다. 원심 분리한 후에(3000 rpm하에 10 내지 20 분) 침전물을 물에 용해시키고 상기 컬럼에 부하하였다(광학적 농도: 260 nm에서 25,000 내지 50,000 E). 컬럼을 물과 0.05 M 트리에틸암모늄 중탄산염(pH 8.0)으로 세척한 후에 생성물을 상기 염의 직선 기울기하에(0.1 내지 0.8 M, 총 부피 1 L)용출하였다. 이와 같이 하여 분리된 각각의 화합물을 함유하는 분류물을 회전식 증발기에서 건조될때까지 증발시키고 동결 건조시켜 완충제 성분을 완전히 제거하였다.

후술하는 바와 같은 각각의 화합물(반-조제용 컬럼상의 광학적 농도가 약 2000 E인 코팅)을 최종적으로 세정하기 위해 HPLC를 사용하였다. HPLC를 사용하는 용액의 탈염수화는 수세 단계 이후에 소형 DEAE 컬럼상에서 10 내지 20 배 희석된 용액을 수착시킴으로써 수행하였다. 이어 소량의 1 M 트리에틸 암모늄 중탄산염으로 용출시키고 용액을 동결 건조시켰다.

d) HPLC 크로마토그래피에 의한 2',5'-올리고아데닐레이트의 세정 및 분석

NH₃수착 컬럼(분석용 컬럼 8 μm 4×150 mm, 및 최종 조제용 세정 컬럼 10 μm, 9.2×250 mm)을 사용하여 이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 컬럼 용출제는 다음과 같다: 직선 기울기 용출; 용출제 A - 20% MeOH; B - 2M AmAc, 20% MeOH, 혼합물당 2% B; 유동 속도(시간당 유속) - 분석용 컬럼의 경우 0.7 m1/분, 조제용 컬럼의 경우 4m1/분(제1 - 2도). 검출은 260 nm 하에 UV 모니터에 의해 수행하였다.

260 nm의 광학적 농도를 기준으로 하여, 혼합물은 40% 내지 50%의 단량체, 약 20% 내지 30%의 디아데닐레이트, 약 5% 내지 15%의 트리아데닐레이트, 2% 내지 8%의 테트라아데닐레이트 및 2% 내지 7%의 고급 올리고 아데닐레이트를 함유한다. 평균 몰 소멸 계수는 아데노신 잔기당 15×10³이었고 삼합체의 경우에는 36.8×10³이었으며, 사합체의 경우에는 45.8×10³이 었다.

e) 각각의 화합물의 조성의 결정

시클로포스페이트 기를 개환시키기 위해 각각의 화합물을 pH 1.0의 조건하에 (37℃ 에서 1 시간) 방치한 후에, 박테리아 알칼리성 포스페이트를 사용하여 탈 포스포릴화하고, 누클레오티드간 결합의 알칼리 가수 분해를 수행하였다 (0.3M NaOH, 20℃에서 48 시간) 최종 생성물(아데노신-아데노신-2'(3')- 포스페이트)의 분석은 HPLC에 의해 수행하였다. 목적하는 결과는 상기 제시한 것과 거의 일치하였다. 이합체의 경우 Ado:AMP=1:1, 삼합체의 경우에는 1:2, 그리고 사합체의 경우에는 1:3이었다. 표준 편차는 5% 이하였다.

2',3'-시클로포스페이트 기의 개환에 의해 생성된 화합물은, 그들의 HPLC 이동성 및 NMR 스펙트럼(³¹P 및¹H) 확인 결과 상응하는 올리고아데닐레이트의 유사한 2'(3')-포스페이트와 동일하였다. 한편 얻은 2'(3')-포스페이트를 BrCN(100 배 몰 과량)의 작용에 의해 실온하에 수용액 중에서 상응하는 올리고 아데닐레이트의 2',3'-시클로포스페이트 생성물로 정량적으로 전환시켰다.

f) 누클레오티드간 결합 유형의 결정

각각의 2',5'-올리고아데닐레이트의 2',3'-시클로포스페이트를 깨끗한 바이나제로 처리하는 단계는 폴리아데닐산 아데노신-2',3'-시클로포스페이트로 완전히 분리시킬 수 있는 조건하에서 실시하였으며, HPLC 분리 양상과³¹P NMR 스펙트럼에는 전혀 변화가 없었다.

말단 시클로포스페이트 기(20 내지 21 ppm) 및 2',5'-누클레오티드간 포스페이트(0.02 내지 0.4 ppm)에 상응하는 피이크만이, 이합체의 경우에는 1:1 의 관계로, 삼합체의 경우에는 1:2, 그리고 사합체의 경우에는 1:3으로³¹P NMR에서 측정되었다. 표준 편차는 2% 이하였다.

3',5'-결합(1% 이하의 누클레오티드간 결합)은 사합체에 대해서만 입증되었다.

올리고아데닐레이트는 물(10^-2M 이하), 디메틸설폭사이드, 수성 에탄을 또는 글리세롤에 쉽게 용해될 수 있는 무색 화합물이다. 이 화합물은 수개월 동안 4℃에서 중성의 수용액으로, 그리고 동결된(-20℃) 용액 또는 무한히 동결 건조된 상태로 용해된 상태를 유지한다.

제1도:

혼합물 A(2',5'-올리고아데닐레이트-2',3'-시클로포스페이트)의 HPLC 분석. 컬럼 : NH₂수착 컬럼, 4×150 mm. 이동상 : A - 20% CH₃OH; B -20% CH₃0H 중의 2M AcONH₄; 유속 : 0.7 ml/분; 0'-2'- 1% B, 2'-14' 0.5% B/분, 14'-50'- 2% B/분. 260 nm에서 검출. 260 nm 에서의 흡수에 대응하는 혼합물의 조성 : 23% 단량체(8.7 분), 22.5% 이합체(17.5 분), 14% 삼합체(23 분), 6.8% 사합체(26.8 분).

제2도:

정제된 2',5'-삼합체(A) 및 사합체(B)-2',3'-시클로포스페이트의 HPLC 분석.컬럼, 이동상의 조성 및 유속은 제1도의 분석과 같음. 기울기 - 2% B/분.

약리학적 실시예

본 발명의 약학 제제의 임상학적 연구를 유두종증 환자에 대하여 수행하였다. 0.1 ml의 NaCl을 사용하여 소정의 농도로 희석시킨, 상응하는 화합물의 Na- 또는 트리에틸암모늄 염을 사용하여 치료하였다. 최종 용액중의 활성 화합물의 농도는 전술한 바와 같은 몰 소멸 계수 절차에 따라 260 nm에서의 광학 농도를 사용하여 얻었다. 그 결과를 이하에 제시하였다. 이하에서는 또한 실시예에 의거하여 본 발명을 예시하고자 하나, 후술하는 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1

2',5'-트리아데닐레이트-2',3'-시클로포스페이트(n=1, AIII)의 임상시험

- 여성 환자 M. (1958)의 진단 : 피부 색깔을 띠며 따끔따끔하고 탄성이 있으며 때로는 통증이 있는 4 개의 첨형 콘딜로마가 회음부에 위치함(d= 1 내지 2 mm, h= 2 내지 8 mm). 부수적인 질병 : 질염.

콘딜로마 하나당 약 50 μm AIII(10^-4M)을 매일 도포하였다. 4 일째 모든 콘딜로마가 주름진 표면을 나타내었으며, 8 일째 이들은 완전히 사라졌다. 8주 후에도 재발은 전혀 관찰되지 않았다.

- 여성 환자 P. (1950)의 진단 : 탄성이 있고 피부 색깔을 띠며 종종 통증을일으키는 14 개의 콘딜로마가 회음부에 위치함(d= 2 내지 8 mm, h= 2 내지 5 mm).

2 주 동안 콘딜로마 하나당 50 μm의 AIII(10^-4M)을 매일 도포하였다. 6 일째 모든 콘딜로마가 1/2 내지 1/3 크기로 수축되었다. 10 일째 8 개의 콘딜로마가 피부상에 어떠한 흔적도 남기지 않고 완전히 사라졌다. 나머지 6 개의 콘딜로마는 여전히 존재하였으며 치료한지 3 내지 4 주 후에는 그들의 원래 크기로 복귀하였다. 더이상 치료하지 않았다. 치료를 종료한지 10주후에 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(재발도 없고 새로운 콘딜로마도 형성되지 않음).

- 여성 환자 C. (1958)의 진단 : 엄지 발가락의 하측면상에 작고 단단한 형태로서 주변 조직과 동일한 색깔을 띠고 그 외면은 거칠거칠하며 도보시 심한 통증을 일으키는 발바닥 사마귀가 있음(d= 5 mm, h= 3 mm).

사마귀에 50 μm의 AIII(10^-4M)을 매일 도포하였다. 6 일째 사마귀는 부드러워졌고 사마귀의 표면은 기계적으로 마찰 제거되었다. 10 일째 사마귀는 완전히 사라졌으며, 도포시 전혀 통증을 일으키치 않았다. 12 주 후에 재검한 결과 사마귀의 재발은 전혀 관찰되지 않았다. 사마귀가 있었던 피부 표면은 주변 조직으로부터 구별할 수 없었다.

- 여성 환자 C. (1926)의 진단 : 인후의 앞쪽과 우측에서 7 개의 유두종이 발견되었다. 2 개는 크고(d= 3 및 2 mm, h= 0.8 내지 1.5 mm, 암갈색), 5개는 작았다(d= 0.8 내지 1.5 mm, h= 0.8 내지 1.5 mm, 피부색). 유두종은 폐경기 동안인 1982년에 나타났다.

2 주 동안 유두종에 약 50 μm의 AIII(10^-4M)을 매일 도포하였다. 5 일째 작은 유두종들은 희미하게 되었고 수축 및 평면화되었다. 더이상의 변화는 관찰되지 않았다. 치료를 종료한지 2 내지 3 주 후에 유두종은 원래의 형태와 크기로 복귀 하였다.

실시예 2

2',5'-데트라아데닐레이트-2',3'-시클로포스페이트(n=2, AIV)의 임상데스트

- 여성 환자 S (27 세)의 진단 : 복부 배꼽아래 3cm 지점에 직경 2 내지 3 mm인 돌출형의 회색 보통 사마귀가 있음. 환자의 사마귀를 매일 AIV(10^-5M) 1 내지 3 방울을 사용하여 치료하였다. 치료를 시작한지 7 내지 10 일 경과한 후에 모든 사마귀는 수축되었고 편평해졌다. 치료를 종료한지 3 주 후에 사마귀 한개가 완전히 사라졌고 치료를 종료한지 4 주 후에는 모든 사마귀가 사라졌다. 피부에 흉터와 같은 변화는 없었다.

많은 사마귀, 콘딜로마(환자 6 인), 보통 사마귀(환자 3 인) 및 불명 사마귀(환자 4 인)을 가진 7 명의 다른 환자들을 2 주 동안 매일 AIV의 수용액(10^-5M)으로 치료하였다. 콘딜로마는 외생식기 및 흉부에서 발견되었고, 사마귀는 손목과 몸, 그리고 다리에서 발견되었다.

대부분의 경우에, 콘딜로마와 사마귀(특히 콘딜로마)는 치료한지 6 내지 9 주후에 수축되었다. 치료를 종료한지 1 내지 2 주 후에, 또는 치료 도중에 3 인의환자에 있어서는 콘딜로마가 이미 완전히 사라졌고 2 인의 환자는 더이상 보통 사마귀가 보이지 않았다. 한명의 환자는 치료를 종료한지 약 6 주 후에 겨드랑이 아래의 6 개의 콘딜로마가 완전히 사라지게 되었다. 이와 같은 2 가지 경우에, 외생 식기상의 작은 콘딜로마(d〈3mm, 총 11 개)는 치료 도중이나 치료 후에 사라진 반면, 동일한 부위의 보다 큰 콘딜로마(d〉5mm, 첫번째 경우에는 2 개, 두번재 경우 에는 3 개)는 치료한지 2 내지 6 주 후에는 그들의 원래 크기와 형태로 복귀하였다. 불명 사마귀 6 개중 2 개는 치료한지 2 내지 3 주 후에 사라졌지만, 다른 것들은 전혀 반응을 나타내지 않았다. 치료하는 동안 또는 치료한지 8 내지 12 주 경과한 후에 유해한 반응, 피부상의 흔적 또는 재발이 관찰된 것은 한 경우도 없었다.

실시예 3

혼합물 A(2',5'-올리고아데닐레이트-2',3'-시클로포스페이트(N〉0)의 혼합물)의 임상 시험

2 명의 환자를 시험하였다. 한명의 환자는 목에 3 개의 보통 사마귀 (3 내지 4 mm)가 있었고, 다른 한명의 환자는 다리 안쪽에 2 개의 첨형 콘딜로마가 있었다. 각각의 사마귀를 혼합물 A 의 10^-4M 수용액 1 내지 2 방울로 습윤시켰다. 치료한지 9 일째 보통 사마귀는 모두 사라졌다. 작은 콘딜로마 하나가 치료한지 7 일 후에 사라졌으며, 다른 하나의 콘딜로마는 치료를 종료한지 3 주 후에, 즉 치료를 시작한지 5 주후에 사라졌다.

이와 같은 결과는 본 발명의 피검 화합물과 인체 유두종 바이러스에 의해 유발된 피부 및 상피 손상을 치료하기 위한 방법이 대단히 유효한 것임을 명백히 입증해 주는 것이다. 2',5'-올리고아데닐레이트를 사용하여 유두종 바이러스를 처치한 경우, 통증을 일으키거나 감염성이 있는 반응 및 증상의 주관적 또는 객관적인 악화를 수반하는 경우는 한 예도 없었다.

매우 낮은 용량하의 2',5'-올리고아데닐레이트의 높은 임상학적 효능과 국부적인 반응 및 전신 부작용의 부재, 뿐만 아니라 재발성이 없음은 유두종증을 치료함에 있어서의 본 발명 화합물의 장점을 입증해 주는 것이다.

공지의 화합물, 즉, 중성 아데노신 잔기 및 2'(3')-포스페이트 기를 가진 2',5'-올리고아데닐레이트(시리즈 B) 또는 3-말단 아데노신 잔기상에 유리된 2'- 및 3'-히드록시기를 가진 2',5'-올리고아데닐레이트(시리즈 C)를 사용한 경우에도 유두종증을 치료함에 있어서 유사한 결과를 얻었다. 이 경우에는 유리된 화합물, 예를 들면 삼합체 및 사합체 또는 이들과 다른 올리고머와의 혼합물(삼합체 B 및 C, 사합체 B 및 C, 혼합물 B 및 C)은 외부 유두종증의 치료에 있어 크게 효과적인 것으로 입증되었다.

Claims

하기 일반식(I)로 표시되는 2',5'-올리고아데닐레이트 2',3'-시클로포스페이트:

상기 식에서, n은 0 ≤n ≤10 범위의 수이다.
불규칙한 3',5' - 및 2',5'- 누클레오티드간 결합을 가진 폴리(A)를 리보누클레아제로 처리하는 것이 특징인 제1항에서 정의한 화합물의 제조 방법.
제2항에 있어서,

상기 리보누클레아제가 B 중간물(E.C.3.1.4.23)로부터 얻은 바이나제(binase)인 것이 특징인 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서,

폴리(A)가 아데노신 2'(3') 포스페이트를 중합시켜서 제조한 것이 특징인 방법.
폴리(A)를 리보누클레아제를 사용하여 분해하고, 반응 혼합물을 과량의 BrCN으로 처리하여 2'또는 3'모노포스페이트 기를 2',3'시클로포스페이트 기로 전환시키는 것이 특징인 제1항에서 정의한 화합물의 제조 방법.
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 용매와의 혼합물 형태로 제1항에서 정의한 화합물을 하나 이상 함유하는 유두종 바이러스에 의해 유발된 질환 치료용 약학 제제.
제6항에 있어서,

활성 성분인 화합물을 10^-4내지 10^-7M 함유하는 것이 특징인 약학 제제.
제6항에 있어서,

상기 질환이 양성 또는 전암성 피부 및 점막 손상인 것이 특징인 약학 제제.
제6항에 있어서,

상기 질환이 유두종증인 것이 특징인 약학 제제.
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 용매와의 흔합물 형태로 하나 이상의 2',5'-올리고아데닐레이트를 함유하는 유두종 바이러스에 의해 유발된 질환치료용 약학 제제.