KR100305197B1 - 사이드로포어 생산 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 ｇｌ7과 그 유전육종 및 형광단백 유전자 도입에 의한 모니터링 방법 - Google Patents
사이드로포어 생산 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 ｇｌ7과 그 유전육종 및 형광단백 유전자 도입에 의한 모니터링 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 사이드로포어 생산 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7(Pseudomonas fluorescensGL7)과 그 유전육종 및 형광단백 유전자 도입에 의한 모니터링 방법에 관한 것으로 저병해 경작지 토양으로부터 사이드로포어를 생산하는 강력한 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 분자량이 989dalton이고 alanine, lysine, threonine이 2:1:1의 비율로 구성된 슈도박틴GL7(pseudobactinGL7) 사이드로포어를 최대로 생산하는 뛰어난 효과가 있고 그의 돌연변이주 슈도모나스 플루오레센스 GL7-PM1은 사이드로포어를 모균주보다 더 많이 생산하는 뛰어난 효과가 있으며 또 상기 본 발명 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 염색체에 GFP 유전자를 도입하여 실제토양에서 생물방제균의 증식정도나 전파양식을 추적(monitering)함으로써 생물방제력을 확인할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 신규한 사이드로포어 생산 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7(Pseudomonas fluorescensGL7)과 그 유전육종 및 형광단백 유전자 도입에 의한 모니터링 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 저병해 경작지 토양으로부터 분리한 사이드로포어를 생산하는 신규한 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7과 그 돌연변이주 및 형광단백 유전자의 도입에 의한 생물방제균의 증식정도나 전파양식의 추적(monitering)에 관한 것이다.
농작물의 병충해 방지를 위해 무분별하게 사용되고 있는 화학농약은 환경생태계의 보호를 위해 그 용도와 용량의 규제가 필요하다. 따라서 향 후 농작물의 병충해 방제를 위해서는 환경보전적인 생물학적 방제법이 요구되어 질 것이다. 길항미생물을 이용하는 생물학적 방제는 생태계내에서 서로 다른 두 종류의 미생물간에 일어나는 경쟁현상(competition), 기생 또는 포식관계(parasitism, predation)나 항생작용(antagonism) 등의 상호작용을 인위적으로 조절, 활용함으로써 가능하게 된다.
1970년대 저병해 경작지의 질병억제토양(suppressive soil)이 토양 내 미생물들의 길항작용에 의한 것으로 보고된 이후 종합적 병해충 방제방법의 일환으로 생물학적 방제법이 활발히 연구되어져 왔으며, 많은 종류의 토양세균, 방선균 및 진균류에 속하는 길항미생물들을 분리하여 생물학적 방제에 활용하기 위해 연구, 개발하여 왔다.
식물근부병균 등 식물병원성 진균에 대한 길항미생물을 이용한 생태학적 생물방제방법에는 다음과 같이 크게 3가지 형태로 구분될 수 있다. 첫째는 스트렙토마이세스 속(Streptomycessp.), 아쓰로박터 속(Arthrobactersp.), 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 하마툼(Trichoderma hamatum), 마이로쎄시움 벨루사리아(Myrothecium verrucari), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 슈도모나스 스튜트제리(Pseudomonas stutzeri), 바실러스 시르쿠란스(Bacillus circulans) 등이 분비하는 외막가수분해효소인 키틴나아제(chitinase), β-1,3-글루카나아제(β-1,3-glucanase)에 의해 식물병원균의 세포벽을 분해시키는 용균작용, 둘째로는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스블라스트마이세스(Streptomyces blastmyces), 스트렙토마이세스 카수가엔시스(Streptomyces kasugaensis), 페니실리움 니그리칸스(Penicillium nigricans), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) 등이 생산하는 항생물질에 의해 직접 식물병원균의 생육을 저해시키는 항생작용(antibiosis), 셋째는 PGPR(plant growth-promoting rhizobacteria) 즉, 대부분 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 등이 분비하는 철(Fe3+)성분 특이 결합물질인 사이드로포어(siderophore)에 의해 식물병원균의 생육을 저해하는 경쟁적 길항작용(competition)을 이용한 방제방법이다.
사이드로포어는 가용성인 저분자량의 철이온 특이 결합(ferric iron-chelating)화합물이며 일반적으로 펩타이드 사슬로 연결된 황록색(yellow-green)의 색소를 띄는 형광성 발색단(fluorescent chromophore)이다. 이는 펩타이드 사슬의 구성과 크기에 따라 크게 2가지의 구조적 형태로 나누어지는데. 카테콜(ο-디하이드록시벤젠){catechol(ο-dihydroxybenzene}의 유도체로 카테콜아마이드 {catecholamides(phenolates, catecholates)}형태와 하이드록사민산{hydroxamic acid(R.CO.NHOH)}의 유도체로 하이드록사메이트(hydroxamates) 형태이다. 카테콜(catechol) 형태의 사이드로포어는 엔테로박틴(enterobactin), 파라박틴(parabactin), 아그로박틴(agrobactin), 안구이박틴(anguibactin), 비브리오박틴(vibriobactin), 아조토케린(azotochelin) 등이 있으며, 하이드로자메이트(hydrozamate) 형태의 사이드로포어는 페리크롬(ferrichrome), 페리옥사민(ferrioxamine), 코프로겐(coprogen), 노카다민(nocardamine) 등이 있다. 또한 최근에 시트레이트-하이드록사메이트(citrate-hydroxamate) 형태의 사이드로포어로 아쓰로박틴(arthrobactin), 에어로박틴(aerobactin), 시조키넨 (schizokinen) 등이, 그리고 퀴놀린(quinoline) 형태의 사이드로포어로 슈도박틴(pseudobactin)이나 파요베르딘(pyoverdin) 등이 밝혀져 있다.
자연환경에서 미생물이 필요로 하는 철의 양은 그람양성균과 곰팡이의 경우 0.4~4.0μM정도, 그람 음성균의 경우 0.3~1.8μM 정도이다. 이러한 대부분의 철은 호기적인 환경하에서 중성이나 알카리 pH에서 용해상수(solubility constant)가 10-38.7정도로 불용성의 페릭-옥시하이드로사이드 폴리머(ferric-oxyhydroxide polymer[Fe(OH3)])로 존재하며, 그 자유 페릭 아이언(free ferric iron) 농도는 반적으로 pH 7에서 용해상수 10-18정도로 매우 낮다고 볼 수 있다.
비록 토양에서 철성분이 1~6로 풍부하다 할지라도 미생물들이 필요로 하는 철이온의 양은 자신의 생육유지에 충분하지 않으며 모든 토양미생물들간의 경쟁적 요인이 될 수 밖에 없다. 따라서 이러한 철이 부족된 환경(low-iron stress)을 극복하기 위해 호기성 및 통성혐기성 미생물들은 생육에 필요한 충분한 양의 철을 효과적으로 얻기 위해 특수한 IROMP(iron regulated outer membrane protein)에 의한 고친화성 철 전이 시스템{high affinity iron transport system(도 1)}을 가지고 있어, 철이온(Fe3+)과 친화성이 높고 형광색을 나타내는 저분자량(주로 400~2,000daltons)의 가용성인 사이드로포어를 분비하여 철이온(Fe3+)과 복합체를 형성한 다음, 외막에 있는 인식-특이적 수용체(recognate-specific receptor)에 결합되어 에너지 의존성 과정(energy-dependent process)에 의해 순차적으로 세포질막을 통해 세포내로 받아들이게 된다. 이러한 고친화성 철 전이 시스템과 관련된 사이드로포어의 생합성과 외막단백질(outer membrane protein)은 철이온(Fe3+)에 의해 조절되게 된다.
철은 일반적으로 식물병원균의 포자발아(spore germination)와 발아관신장(germ tube elongation)에 필수적인 요인이며, 그로 인한 병원균의 식물뿌리 침투 및 감염에 원인이 된다. 따라서 토양의 근권(rhizoshpere)에서 PGPR은 식물뿌리 표면에 군집을 이루어 식물병원균의 생육을 억제시키는데, 이는 대부분 플루오레센트 슈도모나스(fluorescent pseudomonas)가 분비하는 사이드로포어(siderophore)에 의해 뿌리 주변의 철(Fe3+)을 결합(chelating)하여 식물병원균의 포자발아와 발아관 신장을 억제하게 된다. 이러한 경쟁적 길항작용은 토양전염병을 감소시키며, 기주식물의 근권정착능력을 촉진함으로써 작물의 성장을 양호하게 하여 수확량을 증대할 수 있는 가장 효과적인 생물학적 방제방법이라 할 수 있다.
따라서, 생물방제에 있어서 사이드로포어의 중요성을 확인하고 그 능력을 식물병원성 진균의 생물학적 방제에 활용하고자 본 발명자들은 환경 보존형 생물학적 방제에 활용할 다기능의 생물방제균을 유전학적으로 육종하고자 하였으며, 이를 위해 첫째, 저병해 경작지 토양으로부터 가장 길항력이 우수한 사이드로포어 생산성 길항균주를 분리, 선발, 동정하였고, 선발된 사이드로포어 생산균주에 의한 식물병원균의 생육억제능을 식물근부병균 푸사리움 솔라니(Fusarim solani)를 대상으로 조사하였다. 둘째, 선발된 생물방제균으로부터 생산된 사이드로포어에 의한 식물병원균의 생육억제기작을 규명하기 위해 푸사리움 솔라니의 포자발아(spore germination) 및 발아관 신장(germ tube elongation)의 억제현상을 광학현미경, 위상차 현미경(phase-contrast microscope)으로 조사하였다. 셋째, 철이온이 결여된 최소배지를 대상으로 사이드로포어 생산배지의 선정과 최적 배양시간, 온도, pH의 결정, 그리고 Fe(Ⅲ) 이온, 합성 철이온 등의 결합물질(synthetic iron chelator)인 EDDHA(ethylenediamine di-ο-hydroxyphenyl acetic acid)의 영향과 함께 사이드로포어 생합성의 최적 생산조건을 조사하여 대량생산의 기초자료를 마련하였다. 넷째, 선발된 생물방제균이 생산하는 사이드로포어 물질의 추출 및 정제법 그리고 정량화 방법을 확립하였으며, 정제된 사이드로포어에 대한 물리화학적 특성을 여러 측면에서 조사하여 기존에 알려진 사이드로포어들과 비교 분석하여 구체적 물질 특성을 규명하였다. 다섯째, 강력한 생물방제균을 유전적으로 육종함으로써 식물병원성 진균에 의한 토양유래 식물병해를 효율적으로 방지할 수 있을 것으로 기대하여 사이드로포어의 생산능력을 NTG(N-methyl-N'-nitrosoguanidine)로 돌연변이시켜 길항력이 증강된 생물방제균을 육종하였다. 여섯째, 선발된 사이드로포어 생산성 길항균주에 토양내 생태학적 동태를 추적(monitoring)하기 위하여 바이오-리포터(bio-report) 유전자인 녹색 형광 단백질{green fluorescenceprotein(GFP)} 유전자를 선발된 생물방제균주내 유전공학적으로 도입 발현시킴으로서 새로운 토양내 검증법을 개발하여 첨단적 생물방제법을 시도하였다. 마지막으로 선발된 생물방제균주 및 육종된 균주를 대상으로 토양내에서 그 길항능력이 발휘되어 식물생육도와 근부병 억제에 미치는 영향을 조사하여 생물방제균으로서의 실용성 여부를 확인함으로서 실제 경작지 토양에서 길항력을 발휘할 수 있는 실현성 있는 생물방제균을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 저병해 경작지 토양으로부터 분리한 사이드로포어 생산균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7에 GFP 유전자를 도입하여 실제 토양에서 생물방제력을 확인할 수 있는 재조합 균주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 상기 재조합 균주를 이용하여 실제 토양에서 생물방제력을 모니터링하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 저병해 경작지 토양으로부터 사이드로포어 생산균주를 선발하고 동정한 다음 이들 균주에 의한 식물병원균의 생육억제능과 생육 억제기작을 조사하고 타균주가 생산하는 사이드로포어의 이용능도 조사한 다음 상기 사이드로포어 생산균주가 사이드로포어를 생합성하는 최적의 배지, 시간, 온도, pH, 철이온과 EDDH의 농도 등을 조사하였다. 이어서, 상기 균주가 생산한 사이드로포어를 추출 및 정제하여 구조 및 물질을 동정하고 사이드로포어를 다량 생산할 수 있도록 돌연변이 균주를 만든 후, 본 발명 모균주와 돌연변이 균주의 생물방제력을식물실험을 통해 조사하고 사이드로포어 생산균주에 GFP 유전자를 도입하여 토양내에서 상기 균주의 생물방제력을 확인하는 추적(monitoring)하는 재조합 균주를 개발하므로써 달성하였다.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 고친화성 철 운반 시스템을 도식화한 개략도이다.
도 2는 본 발명 저병해 경작지 토양으로부터 분리한 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7(Pseudomos fluorescensGL7)의 지방산 분석을 나타낸다.
도 3은 본 발명 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7을 포스포텅스텐산(phophotungstic acid)으로 염색한 후 투사형 전자현미경으로 관찰한 사진도이다.
도 4는 철-제한 액체 배양액내 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)에 대항하는 사이드로포어(siderophore) 생산균주의 항진균성 활성을 나타낸다.
도 5는 액체 배양액내 푸사리움 솔라니의 포자발아에 있어서 사이드로포어 생산균주의 항진균성 활성을 나타낸다.
도 6은 액체 배양액내 푸사리움 솔라니의 균사체 성장에 있어서 사이드로포어 생산균주의 항진균성 활성을 나타낸다.
도 7은 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 사이드로포어 생산을 시간경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 8은 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 사이드로포어 생산에 있어서 온도영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 사이드로포어 생산에 있어서 pH 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 성장과 사이드로포어 생산에 있어서 철이온 농도의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 성장과 사이드로포어 생산에 있어서 EDDHA 농도의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 슈도모나스 플루오레센스 GL7로부터 얻은 슈도박틴GL7의 정제과정을 나타낸다.
도 13은 슈도모나스 플루오레센스 GL7로부터 얻은 추출물을 세파덱스 G-25 컬럼에 로딩하여 정제한 슈도박틴GL7의 용출도이다.
도 14는 pH 6.5 수용액내 슈도모나스 플루오레센스 GL7로부터 얻은 슈도박틴과 이들의 페릭 복합체의 흡광스펙트럼이다.
도 15는 슈도박틴GL7가수분해물로부터 얻은 아미노산의 크로마토그라피이다.
도 16은 페릭 슈도박틴GL7의 분자량을 나타낸다.
도 17은 CAS 아가상에 슈도모나스 플로오레센스 GL7과 이들 돌연변이의 사이드로포어 다량 생산을 나타낸 사진도이다.
도 18은 푸사리움 솔라니에 의해 강낭콩에 발병한 뿌리썩음병에 대항하는 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 영향을 조사한 식물실험 결과 사진도이다.
도 19는 푸사리움 솔라니에 의해 강낭콩에 발병한 뿌리썩음병에 대항하는 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 억제영항을 나타낸 사진도이다.
도 20은 GFP 유전자의 Mini Tn5의 구축 모식도이다.
도 21은 pUT mini Tn5-GFP가 도입된 슈도모나스 플루오레센스 GL7에 의해 발현된 GFP의 형광 현미경 사진도이다.
본 발명은 경상북도 일대의 저병해 경작지 토양으로부터 채취한 균들을 사이드로포어 생산균주 선발배지에서 배양하여 사이드로포어 생산성 길항균주 GL7을 선발하는 단계; 버기스의 미생물학 분류법과 일반세균학 분류법에 기준하여 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주를 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로 동정하는 단계; 식물의 뿌리썩음병을 유발시키는 식물근부병균인 푸사리움 솔라니를 배지에 접종하고 반대측에 본 발명 슈도모나스 플루오레센스 GL7를 비롯한 길항균주들을 접종하여 대치배양시키면서 두 균주 서로간의 증식선단 거리를 측정, 조사하는 방법과 길항균주들을 접종하여 배양한 배지에 푸사리움 솔라니의 포자체를 첨가하고 배양한 후 균체 중량을 측정하여 비교하는 방법으로 사이드로포어 생산균주에 의한 식물병원균의 생육억제능을 조사하는 단계; 푸사리움 솔라니 균사체로부터 포자체를 회수한 후 사이드로포어 생산성 길항균주를 접종하여 배양한 배양액에 상기 푸사리움 솔라니의 포자 현탁액을 첨가하고 배양한 후 균체 중량을 측정하고 또 푸사리움 솔라니 포자현탁액을 길항균주 배양액으로 처리한 후 포자발아율 및 발아관 길이를 위상차 현미경으로 관찰하여 푸사리움 솔라니의포자발아 및 균사신장 억제기작을 조사하는 단계; 사이드로포어 생산성 길항균주가 다른 종류의 사이드로포어 생산균주가 생산한 페릭 사이드로포어 복합체를 이용할 수 있는지 여부를 크로스-피딩(cross-feeding) 실험으로 확인하는 단계; 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주를 여러배지에서 배양시킨 후 사이드로포어 생산성을 CAS 액체분석(CAS liquid assay), 아노우 페놀 분석(Arnow phenolic assay)과 사키 하이드록사메이트 분석(Csaky hydroxamate assay)에 의해 조사하는 단계; 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시킨 KB 액체배지에 길항균주를 접종하여 배양하면서 시간별 균의 성장 및 배양 상등액에서의 사이드로포어 생산성을 사키 하이드록사메이트 분석(Csaky hydroxamate assay)에 의해 조사하는 단계; 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시킨 KB 액체배지에 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주를 접종하여 배양하면서 시간별 균의 성장 및 배양 상등액에서의 사이드로포어 생산성을 사키 하이드록사메이트 분석(Csaky hydroxamate assay)에 의해 조사하는 단계; 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시킨 KB 액체배지에 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주를 접종하고 5 ~ 35℃의 온도별로 배양한 후 균의 성장 및 배양 상등액에서의 사이드로포어 생산성을 사키 하이드록사메이트 분석에 의해 조사하는 단계; 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시키고 pH를 5.0 ~ 10.0으로 만든 KB 액체배지에 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7을 접종하고 배양한 후 사이드로포어 생산성을 CAS 액체 분석(CAS liquid assay)에 의해 조사하는 단계; 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시킨 KB액체배지에 EDDHA를 각 농도별로 첨가한 다음 본 발명 선발한 사이드로포어 생산상 길항균주를 접종하고 배양하여 사이드로포어생산성을 사키 하이드로사메이트 분석에 의해 조사하는 단계; 본 발명 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7를 사이드로포어 생산용 배지에 접종하고 배양한 후 배양액으로부터 사이드로포어를 추출 정제하는 단계; 상기 추출 정제한 사이드로포어를 아미노산 분석기와 질량분석기를 이용하여 구조분석하는 단계; 본 발명 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7를 돌연변이 처리하여 사이드로포어의 생산 증강 변이주를 얻는 단계; 상기 돌연변이 처리하여 얻은 사이드로포어 생산 증강 변이주와 모균주인 본 발명 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 IROMP를 비교하는 단계; 강낭콩 종자를 발병기주식물로 사용하여 식물근부병균이 접종된 플라스틱 포트의 버무클리트(bermuculite)와 토양을 섞은 혼합토양에 심고 방제균을 주입한 후 식물생육도를 조사하는 단계; 상기 식물생육도 조사를 마친 발병기주식물을 뽑아 뿌리의 발육 및 부패 상태 등 근부병 발생정도를 관찰하는 단계 및; GFP 유전자를 함유하는 E.coli S-17을 본 발명 길항균주에 접합시킨 후 이들 접합체 중에서 GFP 발현력이 좋은 균주를 선별하는 단계로 구성된다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 사이드로포어 생산성 길항균주의 선발 및 동정
제 1공정: 사이드로포어 생산 길항균주의 선발
경북 일원의 저병해 경작지의 토양에서 채취한 균들을 사이드로포어 생산균주의 선발배지인 CAS(chrome azurol S) 블루 아가 평판배지에 접종하여 28℃에서배양시키면서 오렌지 할로 존(orange halo zone)의 생성에 의한 사이드로포어 생산균을 일차적으로 분리하고, 이를 다시 아노우 페놀 분석(Arnow phenolic assay)과 사키 하이드록사메이트 분석(Csaky hydroxamate assay), CAS 액체 분석(CAS liquid assay)에 의해 사이드로포어 활성에 따른 CAS의 탈색율에 의한 사이드로포어 활성도 측정법을 이용하여 사이드로포어 생산능이 가장 우수한 균주를 선발하였다. 실험결과, 근권토양의 현탁액을 사이드로포어 생산균주의 선발배지인 CAS(chrome azurol S) 블루 아가 평판배지에서 오렌지 할로 존이 1cm 이상인 4개 균주 GL7, SH14, GL17, GL19를 일차적으로 우선 선발하였고(표 1) 사이드로포어 활성에 따른 CAS 액체 분석(CAS liquid assay)과 사키 하이드록사메이트 분석 및 아노우 페놀 분석에 의해 사이드로포어 생산능이 가장 우수한 GL7을 최종선발하였다(표 2).
| 균주 | CAS 액체 분석a | 카테콜 분석b | 하이드록사메이트 분석c |
| GL7 | 0.092 | 0 | 26.49 |
| SH14 | 0.110 | 26.22 | 0 |
| GL17 | 0.093 | 0 | 22.75 |
| GL19 | 0.098 | 0 | 7.88 |
| 참조 | 1.000 | 0 | 0 |
| [주] a: Schwyn과 Neilands의 방법에 따라 630nm에서 흡광도 감소를 측정하여사이드로포어 산물을 결정하였다.b: Arnow의 방법에 따라 510nm에서 카테콜 페놀 타입의 사이드로포어 존재를검출하였다.c: Csaky의 방법에 따라 543nm에서 하이드록사메이트 타입의 사이드로포어의존재를 검출하였다. |
| 균주 | 전체 사이드로포어 활성(TSA;U)a | 전체 사이드로포어의 특이적 활성(TSSA:U)b | 종말점(min)c |
| GL7 | 15.8 | 17.6 | 15 ~ 20 |
| SH14 | 13.8 | 12.5 | 15 ~ 20 |
| GL17 | 15.2 | 15.9 | 15 ~ 20 |
| GL19 | 14.5 | 14.2 | 15 ~ 20 |
| [주] a: 0.001S-1의 A630에서 활성이 감소하는 것을 1유니트로 할 때 탈색의초기속도로부터 전체 사이드로포어의 활성을 계산하였다.b: 전체 사이드로포어 특이적 활성은 배양액 1mL내에 존재하는 TSA 유니트로계산하였다.c: 반응의 종말점은 CAS 복합체 탈색이 더 이상 관찰되지 않을 때이다. |
제 2공정: 사이드로포어 생산균주의 동정
선발된 사이드로포어 생산균주의 분류학적 동정을 위해서는 버기스의 미생물분류법(Bergey's manual of systematic bacteriology)와 일반 세균 분류법(Manual of methods for general bacteriology) 등의 세균분류동정 지침서의 시험항목을 기준으로 해서 각종 분류 동정 시험방법에 따라 배양학적, 형태학적 특성 및 생리학적 특성을 조사하였고, API system의 분석 카드(analytical card) 및 지방산 분석(fatty acid analysis)로도 확인, 동정하였다. 또한 투사형 전자현미경(TEM, transmittance electron microscope)에 의한 미세구조도 관찰하여 선발된 사이드로포어 생산균주의 크기, 편모 등의 특징도 조사하여 위의 동정결과를 확인하였다. 실험결과, 최종 선발된 GL7 균주를 API 시스템의 20NE 분석 카드(analytical card)로 분석한 결과 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)와 99.5의 유사성을 나타내었다(표 3). 균체 지방산 분석(fatty acid analysis) 결과 슈도모나스 플루오레센스 바이오타입 A(Pseudomonas fluorescensbiotype A)의 90.6의 유사성을 보여주었고(도 2), 그리고 전자현미경(TEM, transmittance electron microscope)으로 그 형태학적 특성을 관찰한 결과 1개 이상의 극성 편모(polar flagella)를 가진 간균으로 확인되었다(도 3). 이상의 결과를 토대로 각종 동정에 필요한 배양학적, 형태학적 그리고 생화학적 특성을 표 4에 나타났으며 따라서 사이드로포어를 생산균주 GL7은 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)로 확인, 동정되었다.
| 시험 | 시험 | ||
| 포타슘 나이트레이트 | - | 마니톨 | + |
| 트립토판 | - | N-아세틸 글루코사민 | + |
| 글루코스 | - | 말토스 | - |
| 알기닌 | + | 글루코네이트 | + |
| 우레아 | - | 캐프레이트 | + |
| 에스컬린 | - | 아디페이트 | - |
| 젤라틴 | - | 말레이트 | + |
| p-니트로-페닐-β-D-갈락토피라노사이드 | - | 시트레이트 | + |
| 글루코스 | + | 페닐-아세테이트 | - |
| 아라비노스 | + | 테트라메틸-p-페닐렌디아민 | + |
| 만노스 | + |
| 특 성 | 분리한 GL7 | P.fluorescens |
| 그람 염색 | 그람(-),간균 | 그람(-),간균 |
| 세포직경(㎛) | 0.7 ~ 0.8 | 0.7 ~ 0.8 |
| 세포길이(㎛) | 2.0 ~ 2.8 | 2.0 ~ 3.0 |
| 편모 숫자 | 1 | 1 |
| 편모 배치 | 극성 | 극성 |
| 호기성4℃에서 성장41℃에서 성장pH 3.6에서 성장 | ++-- | ++-- |
| 성장에 필요한 최소한 12 ~ 15aCl 필요. | - | - |
| 성장인자의 요구 | - | - |
| 수용성 형광색소 형성 | + | D |
| 산화제 반응 | + | D |
| 촉매제 반응 | + | + |
| 피오시아닌 생산 | - | - |
| 슈도박틴 생산 | + | D |
| 페나진 모노카복실레이트 생산 | - | - |
| 전분 가수분해 | - | - |
| 젤라틴 가수분해 | + | + |
| 리파제(Tween 80 가수분해) | + | D |
| 아르기닌 디하이드로라아제 | + | + |
| 소르비톨 이용능 | - | D |
| 크실로우스 이용능 | + | D |
| 항생물질 민감성카나마이신, 스트렙토마이신, 네오마이신, 리팜피신, 테트라사이클린:민감성암피실린, 나리딕산: 저항성 | ||
| +; 양성, -; 음성, D; 불분명 |
제 3 공정: 사이드로포어 생산균주에 의한 식물병원균의 생육억제능 조사
상기 제 1 및 제 2공정에서 선발하여 동정한 슈도모나스 플루오레센스 GL7에 의한 식물병원균의 생육억제능을 조사하기 위해 각종 주요 경작작물의 뿌리 썩음병을 유발시키는 식물근부병균인 푸사리움 솔라니(Fusarium solani)를 대상으로 사이드로포어 생산용 배지인 석시네이트 최소 아가(succinate minimal agar) 평판배지의 우측에 먼저, 푸사리움 솔라니(F. solani)를 접종하여 28℃에서 24시간 배양시킨 후, 좌측 2cm의 간격에 분리한 길항균주를 획선 접종하여 대치배양(point culture)시키면서 두 균주 서로간의 증식선단까지의 거리를 측정, 조사하였다. 그리고 정확한 억제능을 확인하기 위해서는 탈철화된 King's B 액체배지와 100μM FeCl3가 첨가된 KB 배지에 길항균을 각각 접종하여 28℃에서 24시간 배양한 다음 푸사리움 솔라니의 포자체를 첨가하여 다시 4일간 배양시킨 후, Toyo filter paper No. 2로 여과, 90℃에서 건조하여 그 균체중량(cell mass)을 측정, 비교하였다. 또한 타 억제기작의 원인물질인 항생물질에 의한 식물병원균의 생육억제 가능성을 조사하기 위해 PDNA(potato dextrose-nutrient agar) 평판배지를 사용하여 우측에 먼저 푸사리움 솔라니를 접종하여 28℃에서 24시간 배양시킨 후 좌측 2cm의 간격에 길항균을 획선 접종하여 대치배양시키면서 서로간의 증식선단까지의 거리를 측정하였다. 실험결과, 슈도모나스 플루오레센스 GL7(Pseudomonas fluorescensGL7)이 가장 강한 억제력을 보였다. 그리고 Toyo filter paper No. 2로 여과, 90℃에서 건조하여 그 균체중량(cell mass)을 측정, 비교한 결과는 탈철화시킨 KB 액체배지에서 성장한 사이드로포어 생산균주들의 경우 푸사리움 솔라니에 모두 70이상의 높은 생육억제능을 나타내었으며 그중 GL7 균주의 경우 푸사리움 솔라니의 생육은 거의 보이지 않았다(도 4). 따라서 상기 결과로부터 슈도모나스 플루오레센스 GL7을 비롯하여 선발한 사이드로포어 생산균주들은 Fe(Ⅲ) 이온이 결핍된 환경에서 분비하는 철이온 특이 결합물질인 사이드로포어에 의해 식물근부병균 푸사리움 솔라니의 생육을 강하게 억제한다고 할 수 있다.
실시예 2: 사이드로포어 생산성 길항균주의 식물병원균 생육에 대한 억제기작
실험예 1: 푸사리움 솔라니의 포자발아 및 균사신장 억제기작
실시예 1에서 선발한 슈도모나스 플루오레센스 GL7을 비롯한 사이드로포어 생산성 길항균주가 어떻게 식물근부병균인 푸사리움 솔라니의 포자발아(spore germination)를 억제하는가를 조사하기 위해 우선 PDA(potato dextrose agar) 배지를 이용하여 푸사리움 솔라니를 28℃에서 5 ~ 8일간 배양시키고, 그 플레이트에 5mL의 멸균수를 부은 후 멸균한 브러쉬(brush)를 이용해 포자체를 모아서 원심분리 시키고 원심침전물을 멸균수로 3회 씻어낸 후 10겹의 멸균된 가아제(guaze)로 여과하여 균사체로부터 포자체를 회수하였다. KB액체배지에 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주를 접종하여 28℃에서 24시간 배양한 다음 푸사리움 솔라니의 포자현탁액(spore suspension)을 첨가하여 5일간 배양시킨 후 Toyo filter paper No.2로 여과, 90℃에서 건조하여 그 균체중량을 측정, 비교하였다. 또한 회수된 푸사리움 솔라니의 포자현탁액 50㎕를 산-세척된 디프레션 슬라이드(acid-washed depression slide) 위에서 길항균주의 배양액 50㎕와 함께 처리한 후 시간별로 포자 발아율 및 발아관(germ tube)길이를 위상차 현미경(phase-contrast microscope)으로 관찰하였다. 식물병원균의 균사신장 억제를 조사하기 위해서는 KB 액체배지에 푸사리움 솔라니의 포자체를 첨가하여 3일간 배양한 다음 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주를 접종하여 28℃에서 3 ~ 4일간 배양시킨 후 Toyo filter paper No.2로 여과, 90℃에서 건조하여 그 균체 중량을 측정, 비교하였다. 실험결과, 선발한 길항균주 모두 푸사리움 솔라니의 포자발아를 상당히 억제하였으며 균사신장 억제율도 60 이상으로 높게 나타내었다. 그 중 슈도모나스 플루오레센스 GL7 균주의 경우 포자발아 억제율이 97정도, 균사신장 억제율이 75정도로 타 균주의 경우보다 가장 강한 억제능을 나타냈다(도 5, 6). 또한 회수된 푸사리움 솔라니의 포자현탁액 50㎕를 산-세척된 디프레션 슬라이드 위에서 길항균주의 배양액 50㎕와 함께 처리한 후 시간별로 포자발아율 및 발아관(germ tube) 길이를 위상차 현미경(phase-contrast microscope)으로 관찰한 결과 푸사리움 솔라니의 포자발아는 전혀 나타나지 않았으며 발아관 신장(germ tube elongation) 또한 관찰되지 않았다. 따라서 상기 결과로 미루어 보아 선발한 사이드로포아 생산균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 푸사리움 솔라니의 포자발아 및 균사신장을 동시에 억제할 수 있었다. 이는 그 생육억제기작이 사이드로포어의 분비에 의해 식물근부병균 푸사리움 솔라니의 포자발아(spore germination) 및 발아관 신장(germ tube elongation)에 필수적인 요인이 되는 철이온의 결핍으로 그 생육이 저해되는 경쟁적 길항작용(competition)에 의한 것을 입증할 수 있었다.
실험예 2: 다른 균주가 생산한 사이드로포어의 이용능
일부 미생물들은 생육환경내에서 자신이 생합성하지 않는 다른 종류의 사이드로포어에 철이온이 결합된 페릭 사이드로포어(ferric siderophore) 복합체를 이용할 수 있는 능력을 가진다. 그러므로 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주들과 비교균주로서 사이드로포어 생산균주인 슈도모나스 푸티다 KCTC 11036(Pseudomonas putidaKCTC 11036), 슈도모나스 아에루기노사 ATCC 15692(Pseudomonas aeruginosaATCC 15692)가 생산한 각종 페릭 사이드로포어(ferric siderophore) 복합체를 균주 서로간에 이용할 수 있는지의 여부를 크로스-피딩 시스템에 의해 확인하였다. 필터 페이터 디스크(filter paper disc) 방법을 이용하여 선발된 사이드로포어 생산성 길항균주가 성장이 어려운 한계농도의 EDDHA(ethylenediamine di-ο-hydroxyphenyl acetic acid, 20mM)가 첨가된 KB 한천 평판배지의 전면에 길항균을 접종(106cfu/mL)하여 28℃에서 24시간 배양한 후, 미리 마련된 사이드로포어 생산성 길항균주들의 배양상등액 50㎕를 Whatman No. 1 여과 종이에 흡착시켜 배양시키면서 여과 종이 주변의 성장상태를 조사하였다. 실험결과, 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 경우 슈도모나스 푸티다 KCTC 11036 균주가 생산하는 사이드로포어들만 이용을 못하였고 나머지 균주 SH4, GL19, GL17, 슈도모나스 아에루기노사 ATCC 15692 등이 생산하는 사이드로포어들은 이용을 하였다(표 5). 이는 토양내에서 자신이 생합성하지 않은 외부의 다른 미생물로부터 생산된 페릭 사이드로포어 복합체를 얻음으로써 효과적인 생물방제균주로서의 가능성을 더욱 높이는 것으로 판단되었다.
| 아가내 포함된 균주 | 철이 제한된 균주의 배양상청액에 의한 성장촉진 | |||||
| GL7 | GL14 | GL17 | GL19 | P.putida | P.aeruginosa | |
| GL7 | + | + | + | + | - | + |
| GL14 | - | + | - | - | - | - |
| GL17 | - | + | + | - | - | + |
| GL19 | - | - | - | - | - | + |
실시예 3: 사이드로포어 생산성 길항균주의 사이드로포어 생합성 최적조건
실험예 1: 사이드로포어 생산의 최적 배지 선정
실시예 1에서 선발한 길항균주의 사이드로포어 생합성에 미치는 각종 영향 요인 및 최적의 사이드로포어 생산용 배지를 선정하기 위해 기존의 철이 결여된 최소배지(iron-deficient medium)인 KBM(King's B medium), SMM(succinate minimal medium) 그리고 변형 알렉산더 배지(0.2glucose, 0.2manitol, 0.1NH4Cl, 0.05NaCl, 0.03KH2PO4, 0.05MgSO4·7H2O, 0.3casamino acids)를 이용하여 선발한 길항균주를 배양시킨 후, 사이드로포어 생산성을 CAS 액체 분석, 아노우 페놀 분석과 사키 하이드록사메이트 분석에 의해 조사하였다. 실험결과, 선발한 길항균주 대부분 변형된 알렉산더 배지에서 가장 높은 생산성을 보였으며 그 중, 슈도모나스 플루오레센스 GL7 균주의 경우 가장 높은 생산성을 나타내었다(표 6).
| (a) (b) SMM(석시네이트-최소 배지) | ||||||
| 균주 | 세포 단백질(㎍/㎖) | CAS | 하이드록사메이트 | 카테콜 | ||
| A630내에서 환원a | A543 b | [㎍(mg cell)-1]c | A510 b | [㎍(mg cell)-1]d | ||
| GL7 | 722 | NA | 1.004 | 17.250 | 0 | 0 |
| SH14 | 180 | NA | 0 | 0 | 0.443 | 0.823 |
| GL17 | 611 | NA | 0.930 | 16.890 | 0 | 0 |
| GL19 | 543 | NA | 0.653 | 12.531 | 0 | 0 |
| (b) KBM(King's B 배지) | ||||||
| GL7 | 900 | 89.2 | 0.332 | 8.896 | 0 | 0 |
| SH14 | 289 | 79.6 | 0 | 0 | 0.256 | 0.414 |
| GL17 | 957 | 86.6 | 0.285 | 7.576 | 0 | 0 |
| GL19 | 905 | 83.2 | 0.236 | 7.320 | 0 | 0 |
| (C) 알렉산더 배지 | ||||||
| GL7 | 296 | 88.4 | 1.048 | 18.240 | 0 | 0 |
| SH14 | 211 | 88.6 | 0 | 0 | 0.451 | 0.832 |
| GL17 | 291 | 88.6 | 1.025 | 17.250 | 0 | 0 |
| GL19 | 663 | 87.1 | 0.755 | 13.542 | 0 | 0 |
| [주] a: 630nm에서 1-상등액내 흡광도/배지내 흡광도의 퍼센트값b: 배양액 mL당 존재하는 세포 단백질 mg 당 상등액내 흡광도값c: mL당 하이드록사민㎍ 등가값d: mL당 2,3-디하이드록시벤조산 ㎍ 등가값NA; 적용안됨모든 값은 두 번 반복한 평균값이다. |
실험예 2: 사이드로포어 생산의 최적 배양시간
실시예 1에서 선발한 길항균주의 사이드로포어 생합성에 미치는 최적의 배양시간을 조사하기 위하여 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시킨 KB 액체배지에 선발균을 접종하여 28℃에서 60시간까지 배양하면서 시간별로 균의 성장 및 배양 상등액에서의 사이드로포어 생산성을 사키 하이드록사메이트 분석(Csaky hydroxamate assay)에 의해 조사하였다. 실험결과, 대부분 슈도모나스 속들이 생산하는 사이드로포어와 같이 대수증식기 후반 이후 40시간에서 최대의 생산성을 나타내었다(도7).
실험예 3: 사이드로포어 생산의 최적 배양온도
실시예 1에서 선발한 길항균주의 사이드로포어 생합성에 미치는 최적의 배양온도를 결정하기 위하여 미리 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시킨 KB액체배지에 선발균을 접종하여 5℃에서 35℃까지 각 온도별로 40시간 배양시킨 후 균의 성장 및 그 배양 상등액에서의 사이드로포어 생산성과의 관계를 사키 하이드록사메이트 분석(Csaky hydroxamate assay)에 의해 조사하였다. 실험결과, 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 5℃에서도 생육이 가능한 저온성 세균으로써 균 생육의 최적온도인 28℃에서 최대의 사이드로포어를 생산하였으며 사이드로포어의 생산성도 고온보다는 저온에서 높게 나타났다(도 8).
실험예 4: 사이드로포어 생산의 최적 pH
상시 실시예 1에서 선발한 길항균주의 사이드로포어 생합성에 미치는 pH의 영향을 조사하기 위하여 미리 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시킨 각각의 pH(5.0 ~ 10.0)별 KB 액체배지에 선발균을 접종하여 28℃에서 배양시킨 후 배양 상등액을 분리해서 pH를 7.0으로 재조정한 후 사이드로포어 생산성을 CAS 액체 분석에 의해 조사하였다. 실험결과, 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 pH 6.5 ~ 9.0까지 50이상의 다소 높은 사이드로포어 생산성을 보였으며 pH 7.0일 때 최대의 생산능을 나타내었다(도 9). 이 결과로 부터 선발한 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 산성 pH에서 보다 중성 pH 또는 약알칼리성 pH에서 대부분 사이드로포어를 생산하였다. 이는 식물병원균과 경쟁적 요인이 될 수 있는 중성 및 알카리성 토양에서 사이드로포어를 분비한다는 이론에 부합되어 생물방제균으로서의 역할에 좋은 특성을 가지는 결과라 할 수 있다.
실험예 5: 사이드로포어 생산에 미치는 Fe(Ⅲ) 이온의 영향
상기 실시예 1에서 선발한 길항균주의 성장 및 사이드로포어 생합성에 미치는 Fe(Ⅲ) 이온의 영향을 조사하기 위해 미리 38-하이드록시퀴놀린에 의해 탈철화시킨 KB 액체배지에 FeCl3를 50㎍/mL까지 각 농도별로 첨가한 다음 선발균을 접종하여 28℃에서 배양시킨 후 균의 성장 및 그 배양상등액에서의 사이드로포어 생산성을 CAS 액체 분석에 의해 조사하였다. 실험결과, 선발한 슈도모나스 플루오레센스 GL7 균주는 Fe가 20㎍/mL까지 첨가된 배지에서 사이드로포어를 생산하였으며 0.1㎍/mL일 때 최대의 사이드로포어 생산능을 나타내었다(도 10). 이 결과로부터 선발한 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 Fe 이온이 거의 결핍된 환경에서 사이드로포어를 분비하는 것을 볼 수 있었다. 이는 Fe 이온이 부족한 토양에서 선발된 미생물에 의한 사이드로포어의 분비는 식물병원균의 성장을 억제시키고 작물의 수확을 양호하게 하여 수확량을 증대할 수 있는 가장 효과적인 생물방제를 가능케 할 수 있다.
실험예 6: 사이드로포어의 생산에 미치는 EDDHA의 영향
강력한 합성 철이온 특이 결합물질(sythetic iron chelator)인 EDDHA(ethylenediamine di-ο-hydroxyphenyl acetic acid)가 선발된 사이드로포어 생산성 길항균주의 성장 및 사이드로포어 생합성에 어떠한 영향을 미치는가를 조사하기 위해 미리 38-하이드록시퀴놀린으로 탈철화시킨 KB액체배지에 EDDHA를 10mM까지 각 농도별로 첨가한 다음 선발균을 접종하여 28℃에서 배양시킨 후, 균의 성장 및 그 배양상등액에서의 사이드로포어 생산성을 사키 하이드록사메이트 분석(Csaky hydroxamate assay)에 의해 조사하였다. 실험결과, 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 5mM의 EDDHA가 첨가된 농도에서도 성장하였으며 0.5mM이 첨가될 때 최대의 사이드로포어 생산능을 보여주었다(도 11). 따라서 상기 결과로부터 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 합성 철이온 특이 결합물질(synthetic iron chelator)인 EDDHA의 높은 농도에서도 Fe(Ⅲ) 이온을 이용하여 성장을 가능케 하였다. 상기와 같이 선발한 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 Fe(Ⅲ) 이온의 결합능력이 강한 것으로 보아 실제 토양에서 식물병원균과 경쟁적 요인이 될 수 있어 생물방제균으로서의 능력을 짐작할 수 있었다.
실시예 4: 사이드로포어 정제 및 구조분석
제 1공정: 사이드로포어의 추출 및 정제
선발한 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7이 생산하는 사이드로포어의 종류와 구조를 규명하기 위해 사이드로포어 생산용 배지로 선정한 변형 알렉산더배지를 이용하여 사이드로포어 생산성 길항균주를 40시간 배양한 후, 50㎎/L의 FeCl3를 첨가하여 1시간 동안 교반한 다음 12,000 × g에서 20분간 원심분리하였다. 그 배양상등액을 취해 30℃에서 1/20용량으로 감압농축하여 NaCl로 완전히 포화시켜 단백질을 침전시킨 다음 12,000 × g에서 다시 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 동일한 양의 CHCl3/페놀(1:1, v/w)을 첨가하여 약 1시간 동안 교반한 다음 수층을 제거하고 두배 량의 디에틸 에테르(diethyl ether)를 첨가하여 교반을 한 후 소량의 물을 첨가하여 용액중의 사이드로포어(siderophore)를 수층으로 용출시켰다. 그리고 동일량의 디에틸 에테르(diethyl ether)를 4회 첨가하여 페놀을 완전히 제거한 다음 30℃에서 감압농축하여 잔류 에테르를 제거하였다. 조정제된 페릭 사이드로포어(ferric siderophore)를 0.05M 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer;pH6.5)로 평형화시킨 CM 세파덱스 C-25 양이온-교환 컬럼(CM Sephadex C-25 cation-exchange column;2.5×90cm)에 두 번 로딩하고 동일 버퍼로 용출하여 진한 적갈색(reddish-brown)을 나타내는 단일 피크를 얻은 다음, 동결건조하여 -20℃에서 저장하였다. 두 번의 CM 세파덱스 C-25 컬럼 크로마토그라피(CM Sephadex C-25 column chromatography)에서 얻어진 각 시료를 실리카겔 G-60(silica gel G-60)에 10㎕씩 스팟팅(spotting)하여 에탄올:물(ethanol:water)(7:3)용매계로 분리하여 요오드 증기(iodine vapor), 닌히드린(ninhydrin) 용액으로 단일 밴드를 확인하였다. 동결건조된 페릭-사이드로포어(ferric-siderophore)를 동일량의 38-하이드록시퀴놀린(hydroxyquinoline)을 크로로포름(chloroform)에 용해시킨 혼합물을 첨가하여 1시간 동안 강하게 교반하여 3차례 탈철화시킨 후, 다시 형광색(yellow-green fluorescent)을 띄는 것을 확인하고 농축하였다. 이어 3차 증류수로 평형화시킨 세파덱스 G-25 컬럼(2.5×90cm)에 로딩하여 3차 증류수로 겔 여과하여 진한 형광색을 나타내는 단일 피크를 얻은 다음, 동결건조하여 -20℃에서 저장하였다. 두 번의 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그라피에서 얻어진 각 시료를 실리카겔 G-60에 10㎕씩 스팟팅하여 클로로포름:아세트산:에탄올(95:5:5)용매계로 분리하여 UV조사, 페릭 크로라이드(ferric chloride) 용액(0.1M FeCl3in 0.1M HCl), 요오드 증기(iodine vapor), 닌히드린(ninhydrin) 용액으로 단일 밴드를 확인하였다. 실험결과, 선발한 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7이 생산한 사이드로포어는 구조적으로 페릭 사이드로포어보다 불안정하고 정제 효율이 떨어지므로 페릭 사이드로포어의 정제를 먼제 행한 후 탈철화를 시켜 사이드로포어를 정제하였다(도 12). 선정한 철이온이 제한된 사이드로포어 생산용 배지인 알렉산더 배지를 이용하여 48시간 진탕배양된 원침상등액에 FeCl3(100mg/L)를 첨가한 다음 진한 적갈색(reddish-brown)을 나타내는 것을 확인하고 CHCl3/페놀(1:1, v/w)을 이용하여 추출을 행한 후 에틸 에테르로 페놀을 제거하였다. 이때 조추출물 Fe(Ⅲ)-사이드로포어 복합체는 철이 결합되지 않은 조추출물 사이드로포어보다 추출효율이 증대하였다. 이는 Fe(Ⅲ)-사이드로포어 복합체의 CHCl3/페놀에 대한 용해도를 증가시킴을 알 수 있었다. 상기 추출물은 CM 세파덱스 C-25 양이온 교환 컬럼에 로딩하여 크로마토그라피하였는데 그 결과 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 경우 1개의 고피크와 1개의 저피크가 나타났으며 그 중 분획 첫 번째 피크는 적갈색의 페릭 사이드로포어 복합체이었으며 두 번째 피크는 같은 색을 가졌으나 첫 번째 분해산물로서 비활성 부분으로 확인되었다. 슈도모나스 플루오레센스 GL7로부터 첫 번째 피크를 2차례의 CM 세파덱스 C-25 양이온 교환 컬럼 크로마토그라피를 수행하여 진한 적갈색 밴드를 확인할 수 있었으며 용출된 단일 피크를 얻은 다음, 각 시료를 실리카겔의 G-60에 10㎕씩 스팟팅하여 에탄올:물(7:3) 용매계로 분리하여 요오드 증기, 닌히드린 용액으로 단일스팟을 확인하고 동결건조하여 -20℃에서 저장하였다. 동결건조된 조추출물 Fe(Ⅲ)-사이드로포어 복합체를 58-하이드록시퀴놀린으로 pH 4.0에서 탈철화시켰다. 탈철화 후 다시 형광색을 띄는 것을 확인하고 두차례의 세파덱스 G-25 겔 여과 컬럼 크로마토그라피를 행하여 단일 피크를 얻은 다음(도 13), 각 시료를 실리카겔 G-60에 10㎕ 스팟팅하여 클로로포름:아세트산:에탄올(95:5:2.5) 용매계로 분리하여 UV 투사, 페릭 크로라이드 용액(ferric chloride solution), 요오드 증기(iodine vapor), 닌히드린 용액(ninhydrin solution)으로 단일 스팟을 확인하고 동결건조하여 -20℃에서 저장하였다(표 7). 따라서 본 정제과정을 통하여 슈도모나스 플루오레센스 GL7이 생산하는 사이드로포어는 거의 단일 물질로 정제되었다. 본 발명자들은 상기와 같이 슈도모나스 플루오레센스 GL7로부터 분리정제한 사이드로포어를 슈도박틴GL7(pseudobactinGL7)으로 명명하였다.
| 검출시약 | 화합물 검출 | 색깔 | 슈도박틴 | 페릭 슈도박틴 |
| 일광 | 색깔을 띄는 성분 | 다양함 | - | 붉은 갈색 |
| UV 광 | 많은 유기물질 | 검은 배경상에 형광점 | 황록색 형광 | - |
| 요오드 증기 | 대부분 유기물질 | 노란색 배경상에 갈색점 | + | + |
| 닌히드린 | 아미노산, 아민 및 다른 물질 | 흰색 배경상에 분홍보다 진한 자주색점 | + | + |
| 페릭크로라이드a | 대부분 페놀화합물 | 붉은 보라색 | + | - |
| [주] a: 0.1N HCl내 0.1M FeCl3·6H2O |
제 2공정: 사이드로포어의 구조분석 및 물질 동정
상기 제 1공정에서 정제한 사이드로포어 슈도박틴GL7(pseudobactinGL7)를 아미노산 분석기(Biochrom 20 amino acids analyzer)와 질량분석기(JMS-AX505H mass spectrometer)를 이용하여 구조분석을 행하였다. 아미노산 분석은 정제된 사이드로포어 슈도박틴GL7(pseudobactinGL7)(1.0㎎/mL)를 6N HCl 또는 47HI(hydriodic acid)에 녹여 밀봉한 후 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 분석기기로는 Biochrom 20 아미노산 분석기(amino acid anayser)(Pharmacia, LKB)를 사용하여 분석하였다. 매스 스펙트럼(Mass spectrum)은 JMS-AX505 매스 스펙트로메터(Mass spectrometer;Jeol)를 사용하여 positive Fab mass 방법으로 분자량을 측정하였다. 시료의 매트릭스로는 치오글리세롤(thioglycerol)과 글리세롤(glycerol)(1:1)혼합액을 사용하였다. 실험결과, 슈도박틴GL7(PseudobactinGL7)은 395 ~ 405nm에서 최대의 흡수 스펙트럼(pH7.0)을 나타내었으며(도 14), 정제된 페릭(ferric) 사이드로포어 복합체는 사이드로포어와 비슷한 399.8 ~ 401.2nm에서 최대의 흡수 스펙트럼을 나타내었다(도 14). 이 결과는 지금까지 알려진 대부분 슈도모나스 속(pseudomonas spp.)들이 생산하는 사이드로포어들과 거의 일치하는 흡수 파장을 보여주었다. 정제된 슈도박틴GL7을 6N HCl로 가수분해하여 구성 아미노산을 분석한 결과 쓰레오닌, 알라닌, 라이신이 확인되었으며, 이들의 구성비는 1:2:1로 나타났다(도 15, 표 8). 이들의 아미노산은 슈도모나스 플루오레센스 B10이 생산하는 슈도박틴(pseudobactin)과 동일하였다. 그리고 상기의 분석에서 모르는 2개의 아미노산이 검출되었다. 그 중 아스파르트산(aspartic acid) 이전의 피크는 Teintze의 보고에서와 같이 β-쓰에오-하이드록시아스파르트산(β-thero-hydroxyaspartic acid)로 추정할 수 있었으며 표준으로DL-쓰에오-β-하이드록시아스파르트산(DL-thero-β-hydroxyaspartic acid)과 동일 머무룸시간(retention time)을 얻을 수 있었다. 또 다른 피크는 표준으로서 로도토루산(rodotoruric acid)([cyclo Nδ-hydroxyl-L-ornitine]2)를 사용하여 47HI 하이드로라이사이트(hydrolysate)로 분석한 결과 슈도박틴(pseudobactin)의 구조상 필수인 1mole의 Nδ-하이드록시오르니틴(Nδ-hydroxyornitine)으로 확인되었다. 슈도박틴(pseudobactin)은 분자량이 989Da으로 2,3-디아미노-6,7-디하이드록시 퀴놀린(2,3-diamino-6,7-dihydroxy quinoline) 형태의 황록색 형광색소단(yellow-green fluorescent chromophore)으로 구성되며 그N-터미날(N-terminal)의 6개의 아미노산이 직쇄상의 올리고펩타이드(oligopeptide)로 연결되어 있다. 또한 Nδ-하이드록시오르니틴(Nδ-hydroxyornitine)으로 유도된 하이드록사메이트 그룹(hyrdoxamate group)과 β-하이드록시아스파르트산(β-hydroxyaspartic acid)으로 유도된 σ-디하이드록시 아로메틱 그룹(σ-dihydroxy aromatic group)을 포함한다. 이들 두 개의 그룹과 색소단 카테콜 유니트(chromophore catechol unit) 6개의 산소 원자와 페릭 이온(ferric ion)이 결합하고 있다. 페릭-사이드로포어(ferric-siderophore)의 positive Fab Mass를 측정한 결과 분자량이 1050으로 밝혀졌다(도 16). 이 결과에서 지금까지 알려진 슈도모나스 속이 생산하는 사이드로포어 가운데 피오케린(pyochelin)이나 페리박틴(ferribactin)과는 달리 슈도박틴(pseudobactin)과 동일한 최대흡수 스펙트럼(spectrum)을 나타내었으며 아미노산 분석에서 슈도박틴은 기존에 밝혀진 슈도박틴 형태의 물질로 확인되었으며 아미노산 구성면에서 동일하다고 확인되었다.
| 아미노산 | 몰 | 구성비율() |
| 쓰레오닌 | 4.96 | 1 |
| 알라닌 | 11.07 | 2 |
| 라이신 | 5.20 | 1 |
| 슈도박틴GL7샘플을 6N HCl에서 11시간동안 0℃에서 24시간 진공감압하에 가수분해하였다. |
실시예 5: 돌연변이에 의한 사이드로포어 생산능 증강변이주의 유전적 육종
제 1공정: 증강변이주의 선발
사이드로포어 생산성 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7을 돌연변이원 N-메틸-N'-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitrosoguanidine;NTG)으로 Miller의 방법에 의해 돌연변이시켜서 탈철화된 King'B(KB)배지와 CAS배지로 1차 선별하여 사키Csaky법을 이용하여 증강 생산된 하이드록사메이트 타입의 사이드로포어의 량을 재확인하였다. 실험결과, 모균주보다 형광이 많이 보이는 30여 돌연변이주를 1차 선발하였다. 선발된 균주들을 대상으로 사이드로포어 선별배지인 CAS(chrome azurol S)배지를 이용하여 할로존(halo zone)이 가장 큰 돌연변이주 1종을 최종 선별하였다. NTG 돌연변이유발제에 의해 돌연변이주를 얻은 후 사이드로포어의 생산성 및 식물근부균 푸사리움 솔라니에 대한 길항능을 무균주와 비교, 확인하였다. 사이드로포어 생산성 증강변이주 슈도모나스 플루오레센스 GL-7PMI(sid+)은 모균주에 비해 1.3배 가량의 사이드로포어 생산능이 증강되었고(표 9), 형광색 색소(fluorescent pigment) 또한 모균주에 비해 많이 관찰되었다(도 17). 그리고 사이드로포어 결핍 돌연변이{siderophore deficient mutant(P. fluorescens GL7-NM1)}를 상기와 같은 방법으로 NTG 돌연변이유발제에 의해 선별하여 사이드로포어 생산 증강변이주와 비교를 용이하게 하였다.
| 균주 | 세포 단백질(㎍/mL) | CAS | 하이드록사메이트 | |
| A630에서 환원a | A543 b[㎍(mg cell)-1]c | |||
| GL7 | 661 | 95.2 | 1.150 | 18.77 |
| GL7-NM1 | 626 | 5.7 | 0.065 | 1.36 |
| GL7-PM1 | 663 | 97.3 | 1.525 | 28.45 |
| [주] a; 630nm에서 1-상등액내 흡광도/배지내 흡광도의 퍼센트 값b; 배양액 mL 당 존재하는 세포 단백질 mg당 상등액내에서의 흡광도값c: mL당 하이드록실아민 ㎍ 평형값모든 값은 3번 반복한 평균값이다. |
제 2공정: 사이드로포어 증강변이주의 검증
모균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7 및 육종 선발된 사이드로포어 생산성 증강 돌연변이주 슈도모나스 플루오레센스 GL7-PM1(sid+), 슈도모나스 플루오레센스 GL7-NM1(sid-), 그리고 충분한 Fe 이온(100μM)를 넣어준 배지에서 자란 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 외막단백질을 분리하여 SDS-PAGE에 의해 철-조절 외막 단백질{iron-regulated outer membrane protein(IROMP)}을 비교, 분석하였다. 아울러 모균주 및 돌연변이주의 식물근부균 푸사리움 솔라니에 대한 길항능을 조사하였다. 실험결과, 모균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7에서 나타나는 90,000dalton 부근의 외막 단백질 밴드(outer membrane protein band)가 철이 풍부한 배지에서 성장한 모균주에서는 나타나지 않았다. 이로부터 사이드로포어의 생합성 및 수송에 관여하는 90,000dalton 부근의 IROMP를 확인할 수 있었다. 그리고 사이드로포어 생산성 증강 돌연변이주 슈도모나스 플루오레센스 GL7-PMI의 경우 IROMP가 모균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7에서 보다 더 많이 생산되었으며, 사이드로포어 생산 결핍주 슈도모나스 플루오레센스 GL7-NM1에서는 전혀 생산하지 않았다. 또한 사이드로포어 생산성 증강 돌연변이주 슈도모나스 플루오레센스 GL7-PM1의 식물근부균 푸사리움 솔라니에 대한 길항능을 조사한 결과 모균주에 비해 생육저해능력이 증강되었음을 확인할 수 있었다. 이들 결과로부터 NTG 돌연변이유발제에 의해 육종된 슈도모나스 플루오레센스 GL7-PM1은 사이드로포어 생산능과 더블어 식물근부균에 대한 생육억제능이 모균주에서 보다 더 증강되었다는 것을 입증할 수 있었다.
실시예 6: 식물실험을 통한 생물방제력 검증
실시예 1에서 선발한 사이드로포어 생산성 길항균주가 토양내에서 실제로 근부방제력이 있는가를 알아보기 위해 발병 기주식물로는 그 생육도가 빠른 강낭콩 종자(Phaseolus vulgarisL.)를 사용하여 28℃ 항온기에서 발아시킨 후, 그 크기와 생육이 비슷한 종묘만 골라 식물근부병균 푸사리움 솔라니가 미리 접종된 프라스틱 포트의 멸균된 버무컬리트(bermuculite)와 경작지 토양을 섞은 혼합토양에 심고 방제균을 주입하여 식물생장 기간별로 그 잎수, 신장, 잎면적, 줄기상태 등 식물의 생육도를 20일간 단계별로 조사하였다. 또한 선발된 생물방제균의 모균주 그리고 돌연변이로 육종된 사이드로포어 생산능 증강변이주를 대상으로 식물실험을 통한 방제효과도 상기와 같은 방법으로 확인하였다. 또 선발한 길항균주가 푸사리움 솔라니에 의해 발병되는 식물뿌리의 근부현상을 어느 정도 방제할 수 있는가를 조사하기 위해 상기 식물생육도 시험에서 생육 기간별로 각 처리구의 식물을 뽑아 뿌리의 발육 및 부패상태 등 근부병 발생정도를 관찰하였다. 실험결과, 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 경우 타 균주에 비해 푸사리움 솔라니에 의한 질병율(disease incidence)이 가장 낮았으며 방제효과도 크게 나타났다. 즉, 푸사리움 솔라니만 처리한 경우는 20의 성장률을, 슈도모나스 플루오레센스 GL7 균주와 푸사리움 솔라니와 함께 처리한 경우는 95정도의 성장률을 보여 약 65정도의 질병율을 줄일 수 있었다(도 18). 그리고 무처리구에 비해 전체 식물 무게가 132정도의 증가와 함께 식물의 생육도 및 뿌리의 발육상태가 양호하였으며 근부병 발생정도도 거의 볼 수 없었다(도 19, 표 10). 또한 선발된 슈도모나스 플루오레센스 GL7, 돌연변이에 의해 육종된 슈도모나스 플루오레센스 GL7-PM1(sid+), 슈도모나스 플루오레센스 GL7-NM1(sid-) 대상으로 상기와 같은 방법에 의해 생물방제력을 조사한 결과 슈도모나스 플루오레센스 GL7-NM1(sid-)의 경우 질병율이 무처리구의 74에 비해 63정도로 푸사리움 솔라니에 대한 방제효과가 거의 없어졌으며, 그 외 육종된 균주들은 모균주에 비해 방제효과가 조금 더 상승된 결과를 보여주었다. 따라서 선발된 슈도모나스 플루오레센스 GL7과 육종된 균주들은 식물근부병균 푸사리움 솔라니에 의한 근부병을 보다 더 효과적으로 방제할 수 있었으며, 또한, 슈도모나스 플루오레센스 GL7이 생산하는 사이드로포어에 의해 철이온을 식물에 공급함으로써 식물의 성장을 촉진시킬 수 있었다.
| 처리물 | 식물당 평균무게 | 대조군과 증가 비교() |
| 대조군 | 6.5 | 100 |
| GL7 | 9.3* | 145 |
| SH14 | 7.2 | 110 |
| GL17 | 8.8* | 135 |
| GL19 | 7.5* | 116 |
| [주] *: 대조군과 비교해 유의하게 증가한 것을 나타낸다. |
실시예 7: 슈도모나스 플루오레센스 GL7내 리포터 유전자의 유전적 도입
실시예 1에서 선발한 생물방제균주 및 유전공학적으로 육종된 생물방제균을 토양내에 투입하였을 때 그 증식정도나 전파양식을 추적(monitoring)함으로써 생물방제균의 토양내 실제 방제력을 확인하기 위한 방법의 일환으로 생물방제균에 추적용 리포터 유전자(report gene)를 도입하고자 하였다. 따라서, 본 실시예에서는 사이드로포어를 강력히 생산하는 본 발명 균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7에 바이오리포터 유전자(bioreport gene)인 GFP(green fluorescence protein) 유전자를 도입하였다. 즉, pUT mini Tn5-GFP(도 20)를 함유하는 E. coli S-17과 슈도모나스 플루오레센스 GL7을 시간별로 교배(mating)시킨 균체를 다시 LB 브로스에 현탁시킨 후 농도별로 희석하여 테트라사이클린(15㎍/mL)이 함유된 M9 최소 아가(minimal agar)에 배양시킨 후 3.1 × 103개의 접합(conjugation)된 콜로니를 획득하였다(표 11). pUT mini Tn5-GFP에 포함된 GFP는 자체 포로모터가 없으므로 융합될 때 염색체의 프로모터 바로 뒤에 삽입이 되어야만이 이 GFP가 발현되기 때문에 450 ~490nm의 형광 현미경으로 발현력이 좋은 슈도모나스 플루오레센스 GL7을 선별하였다(도 21). 또 GFP가 염색체 DNA에 삽입이 되었기 때문에 세균의 영양요구가 변하거나 사이드로포어 생산능이 감퇴되었는지를 확인한 결과 원균과 다름없는 안정성을 가지고 있다는 것이 확인되었다. 따라서 선발한 생물방제균주 및 유전공학적으로 육종된 생물방제균을 실제 토양내에 투입하였을 때 그 증식정도나 전파양식을 추적(monitoring)함으로써 생물방제균의 토양내 실제 방제력을 확인할 수 있는 성과를 얻었다.
본 발명자들은 분리 동정한 상기 슈도모나스 플루오레센스 GL7-GFP를 생명공학연구소내 유전자은행에 1999년 6월 11일에 KCTC 8947P로 기탁하였다.
| 교배시간(h) | 접 합 | 발현빈도 |
| 1 | 2.0 × 10 | 1.5 × 10-1 |
| 2 | 2.3 × 10 | 1.5 × 10-1 |
| 3 | 2.2 × 10 | 1.0 × 10-1 |
| 4 | 5.7 × 10 | 2.5 × 10-1 |
| 5 | 9.8 × 10 | 3.0 × 10-1 |
| 6 | 1.1 × 102 | 2.5 × 10-1 |
| 7 | 5.8 × 102 | 2.0 × 10-1 |
| 8 | 9.3 × 102 | 4.5 × 10-1 |
| 9 | 3.1 × 103 | 7.0 × 10-1 |
| 10 | 2.0 × 103 | 5.0 × 10-1 |
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 저병해 경작지 토양으로부터사이드로포어를 생산하며 슈도모나스 플루오레센스로 동정한 본 발명의 강력한 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7은 분자량이 989dalton이며 알라닌, 라이신, 쓰레오닌이 2:1:1의 아미노산 비율로 구성된 슈도바틴계 사이드로포어인 슈도박틴GL7(pseudobactinGL7)을 최대로 생산하는 뛰어난 효과가 있다. 또 상기 본 발명 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7을 돌연변이처리하여 얻은 변이주 슈도모나스 플루오레센스 GL7-PM1은 사이드로포어를 모균주보다 더 많이 생산하는 뛰어난 효과가 있으며 본 발명 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7의 염색체에 GFP 유전자를 도입하여 실제 토양에서 생물방제균의 생물방제력을 확인할 수 있는 효과가 있으므로 생물농약상 및 생물방제균주 육종산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (2)
- 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7에 GFP 유전자를 도입하여 얻은 생물방제력 추적용 재조합 균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7-GFP(기탁번호:KCTC 8947P).
- 제 1항 기재의 생물방제력 추적용 재조합 균주 슈도모나스 플루오레센스 GL7-GFP를 토양에 투입한 후 그 증식정도 또는 전파양식을 추적하여 생물방제균의 토양내 실제 방제력을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 생물방제력 모니터링 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019990033710A KR100305197B1 (ko) | 1999-08-16 | 1999-08-16 | 사이드로포어 생산 길항균주 슈도모나스 플루오레센스 ｇｌ7과 그 유전육종 및 형광단백 유전자 도입에 의한 모니터링 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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ID=19607364
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|---|---|
| KR (1) | KR100305197B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100862310B1 (ko) * | 2006-10-17 | 2008-10-13 | 영남대학교 산학협력단 | 토양으로부터 옥신, 사이드로포어, 셀룰라아제 생산유전자를 가진 길항 미생물의 유전학적 모니터링 방법 |
| KR20210086993A (ko) | 2019-12-30 | 2021-07-09 | 경희대학교 산학협력단 | 인삼에서 중금속에 의한 산화 스트레스 및 적변 경감에 도움을 주는 식물생장촉진 근권세균 Mesorhizobium panacihumi DCY119T 및 이의 용도 |
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|---|---|---|---|---|
| CN115005219B (zh) * | 2022-05-23 | 2024-04-16 | 广东省科学院生物与医学工程研究所 | 一种双向传导的荧光纳米杀菌剂及其制备方法 |
| CN116836878B (zh) * | 2023-07-19 | 2024-03-19 | 西南交通大学 | 一种荧光假单胞菌和含有荧光假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用 |
-
1999
- 1999-08-16 KR KR1019990033710A patent/KR100305197B1/ko not_active IP Right Cessation
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