KR100302024B1 - 혈중콜레스테롤저하용홍화씨추출물및그제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 홍화씨로부터 분리한 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 홍화씨추출물및 그 제조방법에 관한 것으로 홍화씨 열수추출물과 에탄올추출물을 콜레스테롤 식이와 함께 급여하여 사육한 흰쥐의 혈장 지질양을 측정하고 혈장내 GOT, GPT의 활성도와 간조직의 HMG-CoA 환원효소 및 ACAT(Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase)의 활성도를 측정하며 장기 조직의 콜레스테롤과 트리글리세라이드를 측정한 후 사육한 흰쥐의 분변내 주요 중성스테롤을 측정하여 홍화씨추출물의 동물 체내 콜레스테롤 조절능을 조사한 결과, 홍화씨 에탄올추출물과 열수추출물은 혈장지질 농도 및 간 조직의 지질을 저하시키고 생체내 콜레스테롤 생합성 과정의 중요한 율속효소로써 콜레스테롤 합성저해제의 중요한 지표로 이용되고 있는 HMG-CoA 환원효소의 활성도를 높히며 간조직 내에서 콜레스테롤 저장에 관여하는 ACAT 활성도를 낮추므로 체내로 흡수되는 외인성 콜레스테롤의 이용도를 높여 분변으로 중성스테롤의 배설을 감소시키는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 천연추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 홍화씨로부터 분리한 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 홍화씨추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
사람이 섭취하는 음식에 포함된 지방의 95%는 중성지방(trigriceride)이며, 나머지는 콜레스테롤과 인지질이다. 콜레스테롤은 세포막과 지단백질의 주요 구성성분이며 담즙산과 스테로이드 호르몬 및 비타민 D3의 전구체 등으로서, 뇌조직을 제외한 대부분의 조직에서 합성되며 그중 간에서 가장 활발하게 일어난다. 성인에 있어 하루 체내에서 생합성되는 콜레스테롤량은 체중 Kg당 9 ~ 11mg정도로, 식사로 공급되는 양보다 휠씬 많아 일반적으로 정상인의 체내 콜레스테롤은 식사로부터 유래하는 외인성보다 체내에서 생합성되는 내인성 콜레스테롤 공급에 의해 좌우된다(Turley et al., 1982, Beil et al., 1982). 콜레스테롤 대사와 관련되는 질환은 주로 혈액과 조직의 콜레스테롤 축적에 의해 발생하며 음식을 통하여 섭취된 지방은 십이지장과 공장에서 주로 흡수되며, 흡수되기 전 이들 지방은 간에서 분비된 담즙염의 유화작용에 의해 점차 크기가 적은 지방점적으로 변하게 된다. 이후 이들은 췌장에서 분비된 리파제(lipase)의 작용을 유리 지방산(free fatty acid), 모노아실글리세롤 또는 디아실글리세롤 , 유리콜레스테롤 및 라이소포스파티딜 콜린 등의 형태로 분해된다. 이들 중 수용성인 글리세롤과 라이소포스파티딜 콜린은 쉽게 흡수되나 나머지는 소수성으로 친수성인 혼합성 교질입자(mixed micelle)내로 용해된 후 흡수되게 한다. 이러한 교질입자는 주로 모노아실글리세롤, 지방산, 담즙염 및 소량의 콜레스테롤로 구성되어 있으며, 그 형성에는 담즙산의 역할이 필수적이다. 교질입자의 형태로 흡수된 지질은 장세포내에서 에스테르화되어 트리글리세라이드(triglyceride), 에스테르화 콜레스테롤(esterifide cholesterol) 형태로 전환된 후 아포리포프로테인(apolipoprotein)과 합쳐져 유리지립(chylomicron)를 형성하게 된다. 이러한 과정에서 교질입자내로 용해되지 못한 콜레스테롤은 장을 통하여 배설된다.
한편 간에 존재하는 내인성 및 외인성 콜레스테롤은 그 일부가 혈중 지단백 입자의 구성성분으로 분비되고 나머지는 담즙산(Chollic acid 및 chenodeoxycholic acid)으로 전환되어 소량의 인지질 및 콜레스테롤과 함께 소장으로 분비된다. 담즙산은 소장에서 지방질의 교질입자 형성에 이용된 후 95% 이상은 간으로 재순환되며 나머지는 대변으로 배설된다. 이때 체내에서 이용 또는 배설되지 못한 과다의 혈장 콜레스테롤은 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화를 초래하는 등 심장순환기 계통의 질병에 대한 위험인자(risk factor)로 알려져 있다(Levy, 181, Gurr, 1988, Gordon et al., 1981). 장에서 재흡수되거나 조직내에서 합성되는 콜레스테롤의 양은 HMG-CoA 환원효소(reductase)가 관여하는 음성 되먹이 기전(negative feedback)에 의해 조절이 가능하다(Gordon et al., 1987). 즉, 세포내로 유입되는 콜레스테롤 양이 많은 경우 HMG-CoA 환원효소 활성도와 LDL(low density lipoprotein)-수용체 합성이 억제되고 세포내로 유입되는 콜레스테롤 양이 적은 경우는 HMG-CoA 환원효소의 활성도가 촉진되고 LDL-수용체 합성이 증가되는 과정을 통하여 세포내 콜레스테롤 항상성이 적절히 유지될 수 있다. 혈중 콜레스테롤은 리포프로테인이라는 거대분자의 형태로 움직이며 이중 약3/4는 LDL에 포함되어 있고 혈중 LDL 콜레스테롤 농도는 동맥경화증 유발 위험성에 비례한다고 알려져 있다(Golden et al., 1981, Frostegard et al., 1990). 과잉으로 섭취된 콜레스테롤은 결국 세포의 요구를 충족시키고도 남게 되어 이는 곧 혈액 내, 주로 LDL입자에 포함되어 떠돌다가 모노사이트, 마이크로파지 등과 함께 혈관내막에 흡착되어 거품세포(form cell)로 전환하게 되고 이 거품세균이 결국 동맥을 막아버림으로써 심장마비에 이르게 된다(Frostegard et al., 1990). 이에 반해 콜레스테롤 대사에서 콜레스테롤 역수송에 관여하는 혈중 HDL(high density lipoprotein) 농도는 동맥경화증 발병빈도와 역비례관계가 있다(Brown et al.,1986).
고콜레스테롤혈증은 관상동맥 질환의 위험인자로 잘 알려져 있다(Wald ＆ Law, 1994, 1995). 고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료의 목적은 체내의 정상적인 지질대사를 통해 잉여의 콜레스테롤을 제거하는 것이다. 선진국의 조사보고에 의하면 전체 사망률의 30%를 상회하고 있는 뇌혈관 및 심장질환은 뇌출혈, 뇌혈전, 심부전, 심근경색 등으로 대표되는 혈관계 질환으로서 현재 의학적 또는 영양학적으로 많은 관심과 함께 관련연구가 활발히 진행되고 있다.
콜레스테롤 대사 조절에 있어 두가지 중요한 효소로 간조적에 존해하면서 콜레스테롤 합성과 그 저장량에 영향을 주는 효소로는 각각 HMG-CoA 환원효소(3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A, EC 1.1.1.34)와 ACAT(acyl ccoenzyme A: cholesterol acyltransferase, EC 2.3.1.26)을 들 수 있다. HMG-CoA 환원효소는 간의 콜레스테롤 합성을 조절하는 중요한 율속효소이며, ACAT은 소장, 간 및 타 조직의 유리 콜레스테롤을 에스테르화하는 효소로서 식이 콜레스테롤의 장내 흡수와 간장에서 VLDL(very low density lipoprotein)-콜레스테롤의 분비 및 동맥혈관의 콜레스테롤 축적에 관여한다(Helgerud, 1981, sucking ＆stange, 1985). 지금까지의 보고에 의하면 이들 두 효소의 저해제들은 사람을 포함한 다양한 실험동물에서 콜레스테롤 저하 효과를 나타내었을 뿐만 아니라 항동액경화 효과를 발휘하였다(Alberts et al., 1980, Amin et al., 1993, Alberts, 1988, Fujioka et al., 1995, Schnizer-polokoff et al., 1991, Largis et al., 1989, Heidner et al., 1983, William et al., 1989, Roth et al., 1992, Sugiyami et al., 1995). 이와 관련하여 그 효과가 기대되어지는 많은 신약들이 합성 또는 개발되고 있는데 현재까지 개발되어 시판되는 고지혈증 치료제를 살펴보면 먼저 콜레스테롤의 흡수를 억제하고 이의 이화 및 배설을 촉진하는 효과가 있는 것으로 LDL-콜레스테롤을 혈중에서 낮출 수 있는 콜레스티라민(Cholestyramine)과 콜레스티폴(Cholestipol), 클로피브레이트(Clofibrate), 겜피브로질(Gemfibrozil)(Stein, 1994)과 같은 콜레스테롤 유도체들이 있다. 그리고, 콜레스테롤 생합성에 관여하는 HMG-CoA 환원효소의 저해제인 로바스타틴(Lovastatin; Havel, 1987), 심바스타틴(Simvastatin; Illingworth et al, 1987), 프라바스타틴(Pravastatin; Kajinami et al. 1986) 등이 개발되어 시중에 판매되고 있다. 그러나 지금까지 개발된 이들 약제들은 콜레스테롤 농도를 낮출 수 있는 장점은 가지고 있으나 심각한 부작용을 수반하고 있어서 이상적인 약물요법으로는 적합하지 못한 것으로 알려져 있으며(Illingworth, 1988) 또 니코틴산 등을 사용하여 간의 LDL이나 VLDL의 생합성을 저하시킴(Grundy et al., 1981)으로써 동맥경화와 같은 심질환의 발생빈도를 낮추려고 시도하고 있으나 이 또한 부작용이 심각하여 일부 국가에서는 사용을 금지하고 있는 실정이다. 따라서 콜레스테롤 저하 물질의 개발에 있어서 인체에 부작용을 일으키지 않는 천연물 검색에 대한 연구는 필수적이라 할 수 있다. 이에 관한 보고들을 살펴보면 임 등(1997)은 고들빼기의 잎과 분말이 고지혈증 흰쥐의 지질대사를 개선시키며 고지혈증에 수반될 수 있는 지방간으로 인간 간세포의 손상을 지연시킨다고 보고하였고 김 등(1997)은 진피와 두충이 고지혈증 흰쥐에 있어 우수한 지질대사 개선효과가 있음을 보고하였으며 옥(1995)은 오미자 추출물이 고콜레스테롤혈증이나 고중성지방혈증에 대한 치료 및 예방효과가 있음을 밝힌 바 있다. 이밖에도 버섯류(김 등, 1992), 차전자 수침액(조 등, 1995), 매밀 채소(최 등, 1994), 도라지 및 더덕(김 등, 1993), 콩제품(최 등, 1993), 갈대(최 등, 1995) 등의 지질저하 효과가 보고된 바 있다.
따라서 본 발명자들은 생리활성 신물질을 얻기 위해 상용할 수 있는 식품중 홍화씨추출물을 이용하여 이들 추출성분들이 실험동물에서 지질대사 개선효과를 나타내는지를 확인하고자 하였다. 즉, 홍화씨추출물을 고콜레스테롤 식이와 함께 보충하여 급여함으로써 이들 홍화씨 성분의 보충효과를 혈장, 조직 및 분변에 나타나는 지단백질과 콜레스테롤 대사 전반의 변화(혈장과 조직의 지질함량, 간의 ACAT 활성도, 간의 HMG-CoA 환원효소 활성도, 분변 피칼 스테롤(Fecal sterol 함량 등)를 조사하여 평가하였고 그 작용 기작을 유추하였다.
본 발명의 목적은 홍화씨로부터 분리한 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 홍화씨추출물을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 홍화씨로부터 분리한 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 홍화씨추출물의 제조방법을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 홍화씨로부터 분리한 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 홍화씨추출물의 고콜레스테롤혈증을 예방 및 개선시키는 건강식품으로써의 용도를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 홍화씨 열수추출물과 에탄올추출물을 콜레스테롤 식이와 함께 급여하여 사육한 흰쥐의 혈장 지질양을 측정하고 혈장내 GOT, GPT의 활성도와 간조직의 HMG-CoA 환원효소 및 ACAT의 활성도를 측정하며 장기 조직의 콜레스테롤과 트리글리세라이드를 측정한 후 사육한 흰쥐의 분변내 주요 중성스테롤을 측정하여 홍화씨추출물의 동물 체내 콜레스테롤 조절능을 조사하므로써 달성하였다.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 홍화씨추출물의 효능을 조사하기위해 디자인한 동물실험을 나타낸다.
도 2는 홍화씨 실험식이 투여가 혈중 콜레스테롤, 중성지질 함량에 미치는 영향 및 동맥경화지수를 나타낸 그래프이다.
도 3은 고콜레스테롤과 각기 다른 홍화씨추출물을 공급하여 사육한 후 흰쥐의 간조직내 HMG-CoA 환원효소의 활성도를 나타낸다.
도 4는 고콜레스테롤과 각기 다른 홍화씨추출물을 공급하여 사육한 흰쥐의 간조직내 ACAT(Hepatic Acyl-CoA: Cholesterol Acyltransferase)의 활성도를 나타낸다.
도 5는 고콜레스테롤과 각기 다른 홍화씨추출물을 공급하여 사육한 흰쥐의 간조직내 지질(트리글리세라이드와 콜레스테롤) 수준을 나타낸 그래프이다.
도 6은 고콜레스테롤과 각기 다른 홍화씨추출물을 공급하여 사육한 흰쥐의 분변내 주요 중성스테롤(neutel sterol) 함량을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 홍화씨 열수추출물과 에탄올추출물을 각각 제조하는 단계; 콜레스테롤과 상기 홍화씨 열수추출물과 에탄올추출물 및 홍화씨 분말을 흰쥐에 공급하여 사육하고 사육한 흰쥐의 혈장과 분변을 채취하는 단계; 상기 채취한 혈장내 중성지질과 혈장 총 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤을 각각 측정하는 단계; 홍화씨추출물과 콜레스테롤 식이요법으로 사육한 상기 흰쥐의 간조직으로부터 마이크로좀을 분리하고 이를 효소원으로 하여 간조직의 콜레스테롤 생합성 조절효소인 HMG-CoA 환원효소 활성을 측정하는 단계; 콜레스테롤과 Triton WR-1339를 아세톤에 녹인 후 아세톤을 휘발시켜 얻은 콜레스테롤 용액을 준비한 후 수정한 Gillies 등의 방법에 따라 간조직의 ACAT(Hepatic Acyl-CoA: Cholesterol Acyltransferase)의 활성도를 측정하는 단계; 혈장 GOT에는 L-아스파라긴과 α-케토글루탄산을 첨가하고 GPT의 경우는 DL-알라닌과 α-케토글루탈산을 첨가하여 혈장효소에 의한 기질의 변화로 혈장 GOT와 GPT 활성도를 측정하는 단계; 장기조직의 지질을 Folch 등의 방법으로 추출한 후 Sale 등의 방법을 수정하여 지질추출액에서 조직지질을 정량하는 단계 및; 홍화씨추출물과 콜레스테롤 식이요법으로 사육한 상기 흰쥐의 분변내 주요 중성스테롤을 Czubayko 등의 방법에 따라 측정하는 단계로 구성된다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 단계별로 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 증류수 및 에탄올로 홍화씨추출물 제조
실험에 사용된 토종 홍화씨는 경북 의성군 소재 우리 홍화인 영농조합으로부터 제공된 시료를 사용하였다. 수확된 홍화씨는 정선, 선발하여 세척하고 180℃에서 15 ~ 20분간 로스팅(roasting)한 후 20메쉬 이하로 분쇄한 것을 사용하였으며, 본 실시예에서 분석된 홍화씨 분말의 일반성분 조성은 수분 5.2%, 회분 2.9%, 조단백질 18.4%, 조지방 22.9%, 당질 25.2%, 섬유소 25.4%로 확인되었다. 열수추출물은 볶음 홍화씨 분말 600g에 증류수 5배량(3000mL)을 가하여 90℃에서 6시간 동안 1회 추출한 후 와트만 No. 2 여과지를 이용하여 감압여과하고, 남은 잔류물에 다시 증류수 3000mL를 가하여 반복추출한 후 와트만 N0.2 여과지로 감압여과한 추출액을 40℃에서 다시 감압농축하여 용매를 제거하였다. 이러한 절차에 의해 얻어진 추출물은 -50℃에서 공업용 동결건조기를 사용하여 동결건조하여 분말화하였으며 동결건조된 열수추출물의 수율은 10.1%로 계산되었다. 에탄올추출물의 제조시에는 볶음 홍화씨 분말 600g에 80% 에탄올 5배량(3000mL)을 가하여 85℃에서 6시간동안 1회추출한 후 와트만 No. 2 여과지로 감압여과하고 남은 잔류물에 다시 80% 에탄올 3000mL을 가하여 반복추출한 후 와트만 No. 2 여과지로 감압여과한 추출액을 40℃에서 다시 감압농축하여 용매를 제거하였다. 이러한 절차에 의해 얻어진 추출물은 -50℃에서 동결견조하여 분말화하였으며 동결건조된 에탄올추출물의 수율은 4%로 계산되었다.
실시예 2: 홍화씨추출물의 콜레스테롤 저하효능조사
제 1단계: 실험동물사육 및 시료수집
홍화씨추출물의 효능을 체계적으로 조사하고 재확인하기 위해 도 1과 같은 동물실험을 디자인하였다. 건강한 수컷 흰쥐(Sprague Dawley, 3주령)를 대한실험동물센터로부터 구입하여 Lab-chow 식이를 제공하면서 11일간 안정시킨 후 무작위로 4그룹으로 나누어 표 1과 같이 1% 콜레스테롤, 홍화씨추출물 및 홍화씨 분말이 혼합된 식이를 5주간 급여하였다. 식이에 첨가된 홍화씨 성분의 절대량은 다르나 홍화씨 분말 형태로 환산하였을 때 모두 5% 수준이 되도록 하였다. 동물들은 동물실험실에 설치된 개개의 스테인레스 케이지에서 사육하였고, 사료는 자유식(ad libitum)으로 먹게 하였으며 식수는 증류수를 각 병에 담아 제한없이 섭취하도록 하였다. 또한 모든 사료는 4℃로 냉장보관하여 신선하게 공급하였다. 총 47일의 사육기간동안 사육실의 온도는 20℃, 상대습도는 55%를 유지하였으며 7:00에서 19:00까지의 12시간 간격으로 라이트 사이클(light cycle)을 유지하였다. 식이 섭취량은 매일 기록하였고 체중은 일주일마다 측정하였으며 사육기간 중 마지막 3일 동안 분변을 수집하여 건조시켰다. 동물희생전 12시간 동안 공복시킨 후 케타민-HCl(ketamin-HCl;유한양행)으로 마취시키고 복대정맥으로부터 채혈하였다. 채취한 혈액은 3000rpm에서 20분간 원심분리하여 혈장을 분리하고 분석시까지 -60℃에 보관하였다.
| 구성성분 | 대조군 | 홍화씨-분말(SS-powder) | 홍화씨 에탄올추출(SS-EtOH) | 홍화씨 열수추출(SS-H2O) | |
| 카제인 | 20.0 | 19.06 | 19.97 | 19.82 | |
| 분말화된 홍화씨 | 씨분말 | - | 5 | - | - |
| 에탄올 추출물 | - | - | 0.15 | - | |
| 열수추출물 | - | - | - | 0.5 | |
| D,L-메티오닌 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | |
| 옥수수전분 | 15.0 | 14.64 | 14.99 | 14.98 | |
| 슈크로스 | 49 | 47.79 | 48.99 | 48.93 | |
| 셀루로스 | 5.0 | 3.43 | 4.98 | 4.90 | |
| 옥수수 오일 | 5.0 | 4.27 | 4.93 | 4.95 | |
| 미네랄 복합체a | 3.5 | 3.31 | 3.49 | 3.42 | |
| 비타민 복합체b | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | |
| 콜레스테롤 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| 콜린 비타트레이트(choline bitartrate) | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |
| [주] a:미네랄 복합체 76(미국 영양 연구소. 영양 연구에 대한 표준에 근거한 AIN Ad Hoc Committee의 보고. J. Nutr. 107:1340-1348, 1977)b:AIN 비타민 복합체 76-A로 하기 성분을 함유한다(단위 g/kg)티아민 HCl 0.6, 리보플라빈 0.6, 피리독신 HCl 0.7, 니코틴산 0.003, D-칼슘 탄토텐에이트 0.0016, 폴에이트 0.2, D-비오틴 0.02, 시아노코 발라민(비타민 B-12) 0.001, 레티날 팔미테이트 프리믹스 0.8, DL-알파 토코페린 아세테이트 프리믹스 20, 콜레칼시페롤(비타민 D3) 0.0025, 메타퀸논(비타민 K) 0.05, 안티옥시던트 0.01, 슈크로스 미세 분말 972.8 |
제 2단계: 혈장지질분석
상기 1단계에서 분리, 보관한 혈장은 중성지질(triglyceride;TG), 혈장 총 콜레스테롤(Total-C), HDL-콜레스테롤(HDL-C) 농도측정에 사용되었다. 혈장 리포프로테인(Lipoprotein) 중 HDL은 덱스트란 설페이트-MnCl2(dextran sulfate-MnCl2) 침전법(Warnick et al., 1982)으로 분리하였고, 혈장 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤 농도는 Allian 등(1974)의 효소 방법에 준한 총 콜레스테롤 측정용 시액(아산제약 kit)의 효소시약과 반응시킨 후 Beckman 650 스펙트로포토메터를 사용하여 500nm에서 그 흡광도를 측정하여 각각 농도를 계산하였다. 그리고 중성지방 농도는 McGowan 등(1983)의 리파제-글리세롤 포스페이트 옥시다아제(lipase-glycerol phophate oxidase)를 사용한 착색법의 원리를 이용하여 중성지방 측정용 시액의 효소시약(아산제약 kit)과 반응시켜 550nm에서 그 흡광도를 측정하여 총 혈장 중성지방 농도를 측정하였다. 실험결과, 홍화씨 실험식이 투여가 혈중 콜레스테롤, 중성지질 함량에 미치는 영향 및 동맥경화지수는 도 2 및 표 2와 같다. 혈장 총 콜레스테롤 농도는 대조군(167.22mg/dL)에 비해 나머지 홍화씨군들이 유의적으로 낮았다. 특히 홍화씨 성분 첨가 식이군들 중 SS-H2O군(113.01mg/dL)은 SS-powder군(142.98mg/mL) 보다는 유의적으로 낮았고 SS-EtOH군(87.39mg/dL)보다는 유의적으로 높게 나타나 홍화씨 가공형태에 따른 다양한 총 콜레스테롤 농도를 보였다. HDL-콜레스테롤 수준에서는 식이군간 차이가 없었으나 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율은 SS-EtOH군(75%)이 나머지 군들에 비해 높았으며, SS-H2O군(47%)는 대조군(31%)이나 SS-powder(37%)에 비해 높은 경향이었다.
혈장 중성지질 수준은 SS-EtOH 군(33.65mg/dL)과 SS-H2O군(41.42mg/dL)이 대조군(62.93mg/dL)과, SS-powder(61.68mmg/dL)에 비해 유의적으로 감소된 것으로 나타나, 홍화씨 에탄올추출물과 열수추출물이 혈장 지질저하 효과면에서 가강 우수한 것으로 나타났다. 홍화씨 분말은 혈중 콜레스테롤 저하효과는 유의적으로 관찰되었지만 중성지질 저하 작용은 나타나지 않았다.
동맥경화지수인 atherogenic index도 역시 SS-EtOH군(0.89)이 대조군(2.45)이나 SS-powder군(2.07)에 비해 유의적으로 낮고 SS-H2O(1.24)와는 차이가 없어 중성지질과 비슷한 대조를 이루었으나 SS-H2O군에 비해 유의적으로 낮았다. 이상의 혈장 분석결과에서와 같이 홍화씨의 혈장 지질저하효과는 SS-EtoH군, SS-H2O군, SS-powder 군의 순서로 우수한 작용을 보였다.
| 대조군 | SS-powder | SS-EtOH | SS-H2O | |
| 전체-C2(mg/dL) | 167.22±32.57a1) | 142.98±15.19b | 87.39±23.35 | 113.01±10.99 |
| HDL-C3(mg/dL) | 50.24±8.67 | 49.45±17.12 | 58.65±15.32 | 52.92±10.82 |
| HDL-C/전체-C(%) | 31±14a | 37±15a | 75±34b | 471±1a |
| TG4(mg/dL) | 62.93±17.55a | 61.68±17.33a | 33.65±11.23b | 41.42±15.46b |
| AtheroIndex5 | 2.45±1.00a | 2.07±1.01ab | 0.89±0.76 | 1.24±0.59bc |
| 1) 평균± S.E2 전체 콜레스테롤 3 HDL-콜레스테롤 4 트리글리세라이드5 Athergenic index: [(전체 콜레스테롤)-(HDL-콜레스테롤)]/HDL콜레스테롤abc 같은 열의 첨자 평균은 유의적 차이가 없다(p<0.05) |
제 3단계: HMG-CoA 환원효소 활성도의 측정
홍화씨추출물의 투여가 간조직의 콜레스테롤 생합성 조절효소인 HMG-CoA 환원효소 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하 간조직으로부터 마이크로좀(microsome)을 분리하여 효소원으로 사용하였다. 효소원으로 사용되는 간 마이크로좀 분획 분리는 Hulcher 등(1973)의 방법을 약간 수정하여 실시했다. 구체적으로 사육 실험이 종료된 흰쥐로부터 적출된 간을 2g 취하여 6mL의 0.1M 트리에탄올아민, 0.02M 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)(pH 7.4), 2mM 디티쓰레이톨(DTT) 완충용액에서 분쇄한 후, 10,000 × g 와 12,000 ×g에서 10분간 차례로 원심분리하여 세포핵과 미토콘드리아를 제거하였다. 상층액을 취하여 100,000 × g에서 초원심분리한 후 상층액을 버리고, 현탁·세척하여 다시 100,000 × g에서 초원심분리한 후 상층액을 버리고 현탁·세척하여 다시 100,000 × g에서 초원심분리하였다. 그 후 침전물을 1mL 완충액에 녹여 브래드포드(1976) 방법을 이용한 마이크로좀 단백질 정량을 실시하였으며 효소분석시까지 액체 질소에 보관하였다. [14C]HMG-CoA를 이용한 HMG-CoA 환원효소 활성도 측정은 Shapiro 등의 방법(1974)을 따랐으며 그 절차는 다음과 같이 간단히 요약된다. 액체질소에 보관된 마이크로좀 펠렛(100 ~ 500㎍ 프로테인)을 NADPH 500nmol 그리고 [14C]HMG-CoA 50nmol(specific activity; 2,400cpm/nmol)과 혼합하여 전체반응부피를 60㎕로 하였으며 37℃에서 15분간 교반시키면서 반응시켰다. 반응과정 중 HMG-CoA는 메발노네이트(mevalonate)로 전환되며 반응종료시 반응부피의 1/6에 해당하는 10N HCl을 가하여 37℃에서 15분간 반응시킴으로써 마이크로좀 프로테인이 변성됨과 동시에 이때 메발로네이트 락톤(mevalonate lactone)이 생성된다. 반응종료된 혼합액을 10,000 × g에서 5분간 원심분리하여 그 상등액을 실리카겔 60F254TLC 플레이트에 점적한 후 벤젠-아세톤(1:1, v/v) 용매에서 전개시켰다. 건조시킨 TLC 플레이트에서 Rf 0.3 ~ 0.6의 메발로네이트 스팟(mevalonate spot)을 Image Analyger(MacBas 1000, Fuji)를 사용하여 확인한 후 밴드를 잘라 신터레이션 카운터(Packard Tricab 1600 TR, Packard Austrailia)로 계측하였다. 마지막으로 효소활성도 단위는 반응시간 1분당 마이크로좀 단백질 1mg이 생성하는 메발로네이트의 양을 pmole로 나타냈다(picomoles mevalonate/min/mg. microsomal protein). 실험결과, 조직의 콜레스테롤 대사에 있어서, 그 합성과 저장에 관여하는 효소인 HMG-CoA 환원효소 활성도를 도 3에 나타냈다. 생체내 콜레스테롤 생합성 과정의 중요한 율속효소로서 콜레스테롤 합성 제해제 개발의 주요한 지료로 이용되고 있는 HMG-CoA 환원효소의 활성도를 보면 SS-EtOH군(1204.11pmole/min/mg protein)과 SS-H2O군(450.81pmol/min/mg protein)이 대조군(179.47pmole/min/mg protein)과 SS-powder군(61.04pmole/min/mg protein)에 비해 유의적으로 높았으며 특히 SS-EtOH군은 SS-H2O군보다 높게 나타나 SS-EtOH 군의 간장 콜레스테롤 합성이 훨씬 활발한 것으로 평가된다. SS-EtOH군에서는 혈장 콜레스테롤 수준이 가장 낮아 간으로의 콜레스테롤 운반량이 절대적으로 적은 관계로 이들 동물들은 콜레스테롤 항상성 기전에 의해 간의 콜레스테롤 합성이 증가된 것이다.
제 4단계: 간장 Acyl-CoA:Cholesterol Acyltransferase(ACAT)의 활성도 측정.
ACAT 활성도 측정을 위해서는 Gillies 등(1986)의 방법을 수정하여 사용하였다. ACAT 활성도 측정에 사용될 콜레스테롤과 Triton WR-1339은 600mg씩을 취하여 각각 6mL의 아세톤에 녹인 후, 이 두 용액을 잘 섞어 N2gas하에서 아세톤을 모두 휘발시켰다. 이를 20mL의 물에 녹여 교반함으로써 콜레스테롤 용액(300ug/mL)을 준비하였다. 즉, Triton WR-1339에 녹인 콜레스테롤 6㎍(20㎕), 1M 포타슘 포스페이트(pH 7.4) 20㎕, 0.6mM BSA 5㎕와 50 ~ 100㎕ 마이크로좀을 잘 섞은 후 물로 180㎕가 되게 채운 후 37℃에서 30분간 전반응시킨다. 이 반응용액에 5.62nmole[14C]-Oleoyl-CoA(specific activity; 15,000cpm/nmole)를 추가하여 전체 부피가 200㎕가 되게한 후 다시 37℃에서 30분간 반응시켰다. 효소반응은 500㎕의 이소프로판올: 헵탄(4:1) 혼합용액, 300㎕의 헵탄 그리고 200㎕의 0.1M 포타슘 포스페이트(pH 7.4)를 추가하여 잘 섞은 후 종결시켰고, 실온에서 2분간 방치하면서 층분리를 시도하였다. 반응 생성물 중 콜레스테릴[14C]-올레이트가 존재하는 상등액 400㎕ 중 200㎕를 취하여 신털레이션(Scintillation) 용액과 함께 신털레이션 카운터로 그 동위원소 활성을 측정하여 나온 값을 2배로 하여 동위원소 활성도를 보정하였다. ACAT 활성도는 1mg의 마이크로솜 단백질이 1분간 생성해내는 콜레스테릴 올레이트(cholessteryl oleate)의 pmole수(pmole of cholesteryl oleate formed/min/mg microsomal protein)로 나타냈다. 실험결과, SS-EtOH군의 경우 간조직에서 합성된 상당량의 콜레스테롤은 조직에 저장되기 보다는 혈장으로 분비되거나 bile acid 합성에 사용되는 것으로 보이는데 이는 SS-EtOH군의 간장 ACAT 활성도가 타 식이군에 비해 유의적으로 낮고(도 4) 또한 간장 콜레스테롤 수준 대조군에 비해 낮다는 사실(도 5)에 의해 뒷받침된다. 혈장 콜레스테롤 수준이 두 번째로 낮은 SS-H2O군의 HMG-CoA 환원효소 활성도는 SS-EtOH군보다 유의적으로 낮지만 대조군이나 SS-powder군에 비해 높게 나타나 이들 비교 결과에서도 전체 식이군에서 콜레스테롤 항상성 조절이 정상적으로 이루어지고 있음을 알 수 있었다.
제 5단계: 혈장 GOT· GPT 활성도 측정
혈장에 GOT의 경우 L- 아스파라긴산과 α-케토글루탈산을, GPT의 경우 DL-알라닌과 α-케토글루탄산을 넣으면 혈장의 효소에 의해 기질이 피루빈산으로 바뀌며 이 피루빈산이 2,4-디니트로 페닐 히드라진과 반응하여 0.4N NaOH를 처리하면 비색으로 발색 반응이 나타나고 이를 490nm ~ 530nm에서 흡광도를 측정하여 피루빈산 리튬의 표준에 비교하여 활성도를 측정하였으며 이 방법을 기초로하여 상품화된 아산제약회사 키트를 사용하였다. GOT와 GPT의 경우 간세포에만 존재하는 효소로서 간조직이 손상되면 혈중으로 방출되는 특징을 가지고 있다. 따라서 GOT 및 GPT의 효소역가가 혈장에서 높으면 손상이 높다는 것을 알 수 있다. 사람의 경우 GOT 및 GPT의 효소역가가 혈장에서 높으면 간의 손상이 높다는 것을 알 수 있다. 사람의 경우 GOT는 8 ~ 40karmen 단위, GPT는 5 ~ 30Karmen 단위정도이면 정상이다. 실험결과, 간의 기능진단 지표로 사용되는 혈장 GOT 및 GPT 활성도는 표 3와 같다. GOT 활성도는 SS-EtOH군(57.70karmen)과 SS-H2O군(60.19karmen)이 대조군(77.96karmen0과 SS-powder(75.37karmen)에 비해 유의적으로 낮았으며, GPT 활성도에서는 SS-powder군(34.63karmen), SS-EtOH군(29.20karmen) 및 SS-H2O(32.19karmen)이 대조군(41.11karmen)에 비해 유의적으로 낮게 측정되었다.
| 그룹 | GOT(Karmen) | GPT(Karmen) |
| 대조군 | 77.96±2.77a) | 41.11±3.54a |
| SS-powder | 75.37±2.82ab) | 34.63±2.15b |
| SS-EtOH | 57.70±3.22c | 29.20±1.78b |
| SS-H2O | 60.19±4.07b | 32.19±4.43b |
| [주] abc 첨자는 같은 열내 평균은 유의적 차이가 없었다(P<0.05) |
제 6단계: 장기조직의 콜레스테롤과 트리글리세라이드의 측정
장기조직의 지질은 Folch 등(1957)의 방법에 의해 추출하였고, 조직지질 정량은 Sale 등(1983)에 의해 수정된 방법을 사용하였다. 간 조직 0.5g을 취하여 칼로 잘게 자른 후 5mL 클로로포름; 메탄올(2:1) 용액을 더하여 균질화하였다. 균질액을 와트만 #1 여과지로 걸러내고 다시 동량의 용액으로 3번 더 추출하였다. 지질 추출액을 60℃에서 질소가스로 말린 후 1mL 클로로포름:메탄올(2:1)에 녹인 후 100㎕을 취하여 이 중 200㎕를 취하여 500㎕ 증류수에 녹여 혈장 지질 정량에 사용된 것과 같은 효소반응 방법의 시료로 사용하였다. 이때 효소시액에 유화제로서 0.5% Triton X-100과 3mM 소듐 초레이트(sodium cholate)를 혼합하여 에탄올에 용해된 조직지질이 발색할 때 일어나는 탁도(turbidity)를 제거함으로써 조직의 콜레스테롤과 중성지질을 정량적으로 측정하였다. 실험결과, 홍화씨 분말 및 용매 추출물의 투여가 간조직의 지질 수준에 미치는 영항은 도 5에 나타냈다. 총 콜레스테롤은 대조군(155.53mg/g)에 비해 SS-powder군(124.59mg/g), SS-EtOH군(110.91mg/g) 및 SS-H2O(96.99mg/g)이 유의적으로 낮게 나타나 이들 홍화씨 분말 및 추출성분은 모두 간장의 콜레스테롤 저하작용에 기여한 것으로 나타났다. 간장의 중성지질(트리글리세라이드) 수준은 콜레스테롤과는 달리 대조군(102.47mg/g)과 SS-powder군(75.46mg/g)이 SS-EtOH군(37.52mg/g)과 SS-H2O(22.46mg/g)에 비해 유의적으로 높게 나타나 홍화씨 용매 추출물만이 간장 중성지질 저하에 효과가 있는 것으로 나타났다. 이들 간장 지질수준은 제 2단계의 표 2의 혈장 지질순준과 거의 동일한 변화를 보여 혈장과 간장의 지질대사에서 홍화씨 분말 및 홍화씨 용매추출물의 효능이 일치된 것으로 평가된다.
제 7단계: 분변의 주요 중성 스테롤 측정
분변의 주요 중성스테롤(neutel sterol), 즉 코프로스타놀(coprostanol), 코프로스탄온(coprostanone), 콜레스테롤(cholesterol) 양은 Czubayko 등(1992)에 의한 방법에 따라 건조된 분변을 막자사발에 갈아서 1g을 취한 후 internal standard로서 1mg 5α-콜레스탄(cholesstane)을 첨가하였다. 여기에 1N NaOH(in 90% 에탄올) 10mL을 가하여 67℃ 워터배스에서 1시간 동안 마일드 알카라인 가수분해시킨 후 실온에서 식힌 다음 물 5mL를 가하고 7mL 사이클로헥산으로 3번 추출하였다. 추출된 용액은 질소 가스하에서 건조시킨 후 사이클로헥산 600㎕로 용해시켜 GC로 정량하였다. 이 방법은 TLC(thinlayer chromatography) 단계와 시료의 메틸화과정을 생략할 수 있는 간단한 방법이며, GC의 분석 조건은 표 4에 나타낸 바와 같다. 실험결과, 분변 중성스테롤 중 대장 미생물의 콜레스테롤과 대사산물인 코프로스타놀(coprostanol)과 코프로스타논(coprostanone)을 더한 양이 중성스테롤이 대부분을 차지하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이 역시 홍화씨 실험군들이 대조군에 비해 분변 중성스테롤 배설량이 감소된 것으로 나타났으며 특히 그 차이는 코프로스타놀과 코프로스타논을 더한 양에서 나타났다. SS-powder군과 SS-H2O군의 분변스테롤 수준비교에서는, 분변 콜레스테롤의 수준은 SS-H2O군에서 낮았지만 코프로스타놀과 코프로스타논을 더한 양은 SS-powder군에서 낮게 나타나 총 중성스테롤의 배설은 대조군에 비해 모든 홍화씨 식이군에서 낮게 나타났다.
| 항 목 | 조 건 |
| 컬 럼 | Supelco SACIM-5 모세 컬럼 |
| 검출기 | 불꽃 이온화 검출기(FID) |
| 칼럼 온도 | 285℃ |
| 검출기 온도 | 300℃ |
| 주입기 온도 | 300℃ |
| 운반 가스 | N228mL/min |
| 용출속도 | 1min/cm |
| 희석도 | 32 |
본 발명은 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 홍화씨 에탄올추출물과 열수추출물은 혈장지질 농도 및 간 조직의 지질을 저하시키는 뛰어난 효과가 있고 생체내 콜레스테롤 생합성 과정의 중요한 율속효소로써 콜레스테롤 합성저해제의 중요한 지표로 이용되고 있는 HMG-CoA 환원효소의 활성도를 높히고 간조직 내에서 콜레스테롤 저장에 관여하는 ACAT 활성도를 낮추므로 체내로 흡수되는 외인성 콜레스테롤의 이용도를 높여 분변으로 중성스테롤의 배설을 감소시키는 뛰어난 효과가 있으므로 관상동맥질환, 심장병, 뇌졸중 등의 성인병을 유도하는 고콜레스테롤혈증의 예방 및 개선을 위한 건강식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (3)
- 로스팅(roasting)한 홍화씨를 분쇄한 다음 5배량의 증류수를 가하여 90℃에서 홍화씨 유효성분을 추출하고 여과지를 이용하여 감압여과한 후, 남은 잔류물에 다시 5배량의 증류수를 가하여 반복 추출하고 여과지로 감압여과한 추출액을 다시 감압농축하여 용매를 제거한 다음 -50℃에서 동결건조하여 분말화함을 특징으로 하는 홍화씨 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 홍화씨의 분쇄물로부터 유효성분을 추출하는 추출용매가 에탄올임을 특징으로 하는 홍화씨추출물 제조방법.
- 제1항 또는 제2항의 어느 하나의 방법으로 제조된 열수 또는 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 혈중 콜레스테롤 저하용 홍화씨 추출 조성물.
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| KR1019980053170A KR100302024B1 (ko) | 1998-12-04 | 1998-12-04 | 혈중콜레스테롤저하용홍화씨추출물및그제조방법 |
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