KR100300104B1 - 도다리 혈액의 생화학성분을 이용한 해양오염의 측정법 - Google Patents

도다리 혈액의 생화학성분을 이용한 해양오염의 측정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 넙치의 생화학적 분석기법을 이용한 해양오염 측정법에 관한 것으로 해양오염의 진단을 위하여, 오염이 심각한 황해산 넙치(Paralichthys olivaceus)의 혈액을 분리하여 오염이 원인으로 증가되는 활성산소에 의하여 생성되는 말론디알데히드(malondialdehyde:MAD)와 이들 활성산소의 제거효소로서 수피옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase:S0D)의 활성을 측정하고, 또 여러 가지 질병에 따라 분비량이 증가되는 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase:LDH)의 활성을 측정한다. 또한 생체내의 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine:ACh)의 분해효소로서 환경오염에 의하여 파괴되는 것으로 알려진 아세틸콜린 에스테라아제(acetyl cholinesterase:AChE)의 활성을 측정하여 그 비(MDA/SOD, LDH/AChE)로
써 해양오염의 지표로 하는것이다.

Description

넙치의 생화학적 분석기법을 이용한 해양오염 측정법
본 발명은 넙치의 생화학적 분석기법을 이용한 해양오염 측정법에 관한 것이다.
최근, 급속한 공업화에 따른 산업발전으로 인한 공업단지의 조성, 도시의 육상의 오폐수의 유입, 농약의 과다 사용, 양축 및 양식 등에 의한 육상의 환경오염이 심화됨에 따라 해양오염은 필연적이고 이에 따른 연안어장의 오염문제가 심각하게 대두되고 있다.
이들 오염물질로서는 중금속이나 PCB 등의 유기염소계 농약 및 방사능 물질 등은 수산생물에 영향을 미치거나 체내에 농축될 가능성이 점증되고 있다. 최근 연안어장의 적조현상으로 인한 넙치의 떼죽음과 유류의 유출사고로 심각한 피해를 입고 있고 특히 서해안은 연안 주변국의 공업화에 따른 산업 오폐수는의 유입 때문에 자정능력이 약한 황해의 특성으로 인하여 해양의 오염상태가 심각한 실정이다.
따라서 연안 어장이 황폐화 및 해양 생태계의 파괴 등은 연안어장이나 양식장의 폐사로 어패류 등 수산물의 공급 뿐만 아니라 국민의 건강까지 위협하고 있다.
종래 바다물을 떠서 성분을 분석하는 오염측정법은 여러가지 있으나 그것만으로는 그 바다물이 어류에 어떤 영향을 줄 정도로 오염되어 있는지 파악할 수 없다.
본 발명의 목적은, 해양 생태계의 파괴에 대한 오염의 방지대책 수립을 위한 기초자료로 사용할 수 있고 연안어장과 양식어장의 오염을 방지하여 오염되지 않는 수산물의 안정적 공급을 위한 해양오염의 측정법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 생선회감으로 연안어장 및 양식을 통하여 수요가 급증하고 있는 넙치를 오염지표 어류로 선정하여 생화학적 기법을 사용하여 혈액 및 체성분 분석을 통하여 해양의 오염을 신속하게 진단할 수 있는 해양오염 측정법을 제공하는데 있다.
본 발명은 해양오염의 진단수단으로서, 오염이 심각한 황해산 넙치(Paralichthys olivaceus)의 혈액을 분리하여 오염이 원인이 되어 증가되는 활성산소에 의하여 생성되는 말론디알데히드(malondialdehyde:MDA)와 이들 활성산소의 제거효소로서 수펴옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase:SOD)의 활성을 측정하고 아울러 여러 가지 질병에 따라 분비량이 증가되는 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase:DH)의 활성을 측정한다.
또한 생체내에서 가장 중요한 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylchdine:ACh)의 분해효소로서 환경오염에 의하여 파괴되는 것으로 알려진 아세틸콜린에스테라아제(aoety chdinesterase:AChE)의 활성을 측정하여 그 비(MDA/SOD, LDH/AChE)로써 해양오염의 지표로 삼는다.
본 발명에서 사용한 황해의 양식산 및 자연산 넙치의 재료와 실험방법 및 실험결과는 다음과 같다
1. 실험 방법
(1) 동물실험
본 발명에 사용한 양식산 및 자연산 넙치 시료(Paralichthys olivaceus)는 서해안의 부안과 서산의 양식장에서의 양식산 넙치(체장 25∼31.0cm 체중 350∼550g) 및 영광과 격포에서 채집한 자연산 넙치(체장 32.5∼36.5cm, 체중 600 ∼800g), 그리고 대조군은 오염도가 비교적 적은 동해안의 포항에서 채집한 자연산 넙치(체장 24.5∼32.0cm, 체중 370∼650g)를 각각 7∼10마리씩 구입하여 사용하였다.
(2) 사용시약
본 발명의 해양 오염의 지표 어류로서 넙치의 오염 진단을 위하여 사용한 생화학실험용 분석시약으로는 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 및 아세틸콜린에스테라아제(AChE)등의 효소 및 분석시약으로 모두 시그마제 특급 내지 1급시약을 구입하여 사용하였다.
2. 실험방법
(1) 혈역의 채취 및 분리
혈액은 채취하기전 12시간 절식시킨 상태에서 마취제(benzocaine: 4-aminobenzoic acid ethyester)를 에탄올에 용해하여 마취시킨 다음, 넙치의 꼬리부분(尾部)에서 5cm지점의 등뼈 밑 동맥에서 일회용 주사기로 채혈하였다.
채혈한 혈액은 실온에 일정시간 방치한 후 700×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 항응고제(sodum heparin, 100,O0Ounits)를 혈액 1.Oml당 0.05ml 처리한 CBC병(complete blood cell count, 녹십자사)에 넣어 -70℃에 동결·보존하면서 분석에 사용하였다.
(2) 신경 조직세포의 분획
뇌조직 일정량을 분취하여 완충용액(1.15% KCl/10mM phosphae buffer + 5mM EDTA, pH 7.4)에 넣어 -70℃에 동결·보존하였다. 조직 획분은 조직 1.0g씩을 분취한 다음, 인산완충용액이(0.1M TRIS buffer, pH 8.0)에 2배량의 완충용액으로 1분간 균질화한 다음, 10,000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 사용하였다
(3) 단백칠 함량의 측정
혈청 및 뇌조직획분의 단백질 함량은 Lowry 등 (1951)의 방법에 따라 표준 단백질로서 BSA(bovine serum albumin)를 사용하여 분광광도계를 사용하여 525nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 의하여 단백질의 함량을 정량하였다.
(4) 말론디알데히드 함량의 측정
혈청중의 말론디알데히드(malondialdehyde:MDA)의 함량은 TBA법에 따라 다음과 같이 측정하였다.
혈청 20ul에 증류수 180ul을 흔합한 것을 각 시험관에 취하고 8.1% SDS (sodum dodecylsulfate)용액 200ul를 가하여 약 5초간 혼합한 다음, 20% 초산 1.5ml 넣어 다시 5초간 혼합하여 12% TBA(thiobarbituric acid)시약 1.0ml을 첨가하여 개끗한 구슬로 마개하여 수조상(95℃)에서 30분간 가열하었다. 이 반응액을 800×g서 10분간 원심분리하여 상층액을 분광광도계를 사용하여 532nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 의거 말론디알데히드(MDA)의 함량을 정량하였다
(5) 수퍼옥시드 디스무타아제의 활성 측정
혈청을 인산완충용액(pH 8.2)으로 3O배로 희석하여 그 O.1ml에 증류수 O.5ml, A시약(52.125mg of hydoxylamine+102.1mg of hypoxanthine/250ml D.W) 0.2ml, B시약(20ul of xanthine oxidase+0.9939mg ethylenediaminetetraacetic acid/26.7ml phosphate buffer, pH 8.2) 0.2ml를 첨가 혼합하여 37℃항온수조에서 40분간 정지하였다. 여기에 C시약 (300㎎ of sulfanilic acid + N-1-naphthylethyene diamine acid/500ml of 16.7% acetic acid) 20ml 첨가·혼합하여 실온에서 20분간 정치한 후 분광광도계를 사용, 550nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 의거하여, 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase:SOD)
(6) 젖산탈수소효소의 활성 측정
혈청중의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase:LDH)의 활성측정은 킷트시약(Sigma Co., No. 1340-UV)을 사용하여 측정하였다. LDH A 효소시약 25ml에 혈청 1O0ul를 첨가하여 잘 혼합한 후 1분간 방치한 다음, LDH B 효소시약 0.1ml를 넣고 물을 대조로 하여 340nm에서 흡광도를 1,2 및 3분씩 측정하여 다음 식에 따라 LDH의 활성을 정량하였다.
LDH activity(U/L)=(OD/min)×Total volume(ml×1000*/6.22**×Sample volume(ml)
*10000=unit/ml를 Unit/L로 전환:**6.22=340 nm에서 NADH n mole의 흡수력
(7) 아세틸콜린에스테라아제의 활성 측정
뇌획분중의 아세틸콜린에스테라아제(alcety1ddinesterase:AChE)의 활성 측정은 마이크로플레이트에 0.1M Tris buffer, pH 8.0(Trizma HCl + Trizma base)을 300ul, 0.01M 디치오니트로벤조산(dithionitrobenzoic acid:DTNB)20ul, 뇌 및 근육획분 10ul을 연속적으로 첨가한다. 그리고 흡광도를 측정하기 직전에 기질시약인 0.1M 아세틸콜린클로라이드(acetylthiocholine chloride) 10ul을 첨가한다. 마이크로플렛 리더(ELISA reader)를 이용하여 405nm에서 흡광도의 변화를 3분동안 측정하여 다음 식에 따라 아세틸콜린에스테라아제(AChE)의 활성을 정량하였다.
AChE activity(unit/min/mg protein)=(Final Abs-lnitial Abs)×2*×1000**/min/mg protein
*Enzyme suspension의 희석배수
**1unit=0.001Abs
3. 실험결과의 평가
(1) LDH/AChE 비에 의한 오염도 평가
혈청증의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase:LDH)는 간장이나 심장, 그리고 골격 등의 체내의 병변이 생길 때 혈액중에 방출되는 것으로 알려져 있다. 표 1에서 LDH를 비교하여보면 대조군으로 사용한 동해안 포항의 자연산 넙치(0.113)에 비해 서해안의 영광과 격포의 자연산 넙치는 0.137∼0.142로서 대조군 대비 20∼25%정도 높은 반면 서산과 부안의 양식산넙치는 0.169∼0.175로서 50∼55%로 휠씬 높았다. 이러한 사실은 서해안의 양식산 넙치의 오염이 훨씬 심하다는 사실을 알 수 있었다. 또한 생체내에서 가장 중요한 신경전달물질인 아세틸콜린(AChE)의 분해효소로 사용되는 아세틸콜린에스테라아제(AChE)의 활성이 오염에 의하여 현저히 저해되는 것으로 밝혀져 있다. 표 1에서 보는 바와 같이 뇌의 신경세포중의 AChE의 활성은 서해안의 넙치는 양식산이나 자연산의 구분없이 AChE의 활성이 3.8823∼6,523.5로서 동해안 포항산 넙치의 대조군(7,435.9)에 대비 15∼50%까지 현저히 저해됨을 알 수 있었다.
이들 넙치의 LDH/AChE의 비를 비교하여 보면 대조군으로서 동해안의 포항산 넙치(1.52)에 비해 서해안의 넙치(2.10∼4.35)는 38%에서 186%까지 현저히 높다는 사실을 알 수 있었다.
같은 서해안의 넙치중에서도 영광의 자연산 넙치를 제외한다면 양식산 넙치의 LDH/AChE의 비가 자연산 넙치의 LDH/AChE의 비에 비해 현저히 높다는 사실을 알 수 있었다. 그런데 자연산중에서 영광의 자연산 넙치의 LDH/AChE의 비가 같은 자연산인 격포의 자연산 넙치의 LDA/AChE의 비에 비해 현저히 높다는 사실은 화력 발전소와 육상 오폐수의 유입이 심각하다는 사실과 무관하지 않음을 보여준다.
[표 1]
Figure kpo00001
(2) MDA/SOD비에 의한 오염도 평가
한편 환경오염에 의해서 생성되는 활성산소(free radicals)에 의하여 혈청의 말론디알데히드(malondialdehyde:MDA)의 생성량 및 활성산소의 제거효소로 알려진 수퍼옥시드 디스무타아제(superoxide dismutase:SOD)의 활성을 비교하여 보면 표 2와 같다. 표 2에서 오염이 심각한 것으로 알려진 서해안의 넙치중의 MDA의 생성량은 10.92∼18.43으로서 대조군인 동해안의 포항산 넙치의 MDA의 생성량(7.54)에 대비 서해안의 양식산 넙치(10.92∼13.55)는 40∼80%로 증가한 반면 자연산 넙치(17.04∼18.43)는 120∼140%로서 훨씬 높았서 자연산도 안심 할 수 없다는 사실을 알 수 있었다.
또한 표 2에서 서해안의 넙치중의 SOD의 활성은 대조군인 동해안의 포항산 넙치의 SOD(3.22)에 비해 서해안의 양식산 넙치(2.01∼2.5O)는 20∼30%나 감소한 반면 자연산 넙치(3.7∼4.35)는 거의 변화가 없거나 오히려 35% 정도 SOD의 활성이 증가한 것으로 나타나서 자연산 넙치가 양식산 넙치보다 SOD의 활성을 저해하는 오염성분이 적은 것으로 나타났다.
이들 넙치의 MDA/SOD의 비를 비교하여 보면 대조군으로서 동해안의 포항산 넙치(235)에 비해 서해안의 넙치는 4.24-5.55로서 80%에서 130%까지 현저히 높다는 사실을 알 수 있었다. 같은 서해안의 넙치중에서도 영광의 자연산 넙치를 제외한다면 양식산의 MDA/SOD의 비가 자연산 넙치의 MDA/S0D의 비에 비해 현저히 높다는 사실을 알 수 있었다. 그런데 자연산중에서 영광의 자연산 넙치의 MDA/SOD의 비가 같은 자연산인 격포의 MDA/SOD의 비에 비해 현저히 높다는 사실은 앞에서 지적한 LDH/AChE의 비에서 본 바와 같이 활력 발전소와 육상 오폐수의 유입이 심각하다는 사실과 무관하지 않은것으로 판단된다.
[표 2]
Figure kpo00002
Figure kpo00003
이상의 시험결과를 종합·평가해 볼 때 저서류로서 이동이 비교적 적은 양식 및 자연산 넙치의 아세틸콜린에스테라아제(AChE, 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD) 및 젖산탈수소효소(LDH)의 활성, 말론디알데히드(MDA)의 함량 분석하여 그 비(LDH/AChE, MDA/SOD)를 활용하여 해양의 오염도를 신속·정확하게 평가할 수 있다
[실시예 1]
넙치의 체성분의 분석방법의 간소화 및 재현성이 높여야 한다. 혈청중의 말론디알데히드(malondialdehyde:MDA)의 함량은 TBA법에 따라 시험판에 혈청 20ul과 증류수 180u1, 8.1% SDS용액 200ul과 20% 초산 1.5ml를 넣어 1.2% TBA(thiobarbituric acid)시약 1.0ml을 첨가·혼합하여 수조상(95℃)에서 30분간 가열한 다음, 원심분리하여 상층액을 532nm에서 흡광도를 측정하여 정량한다. MDA의 함량 측정은 킷트화하여 간소화한다
넙치의 혈정중의 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD)의 활성은 인산완충용액(pH 8.2)으로 30배로 희석한 혈청 0.1ml에 증류수 O.5ml, A시약 0.2ml, B시약 0.2ml를 첨가·혼합하여 37℃ 항온수조에서 40분간 정치한 다음, C시약 2.0ml를 첨가·혼합하여 20분간 정치한 후 550nm에서 흡광도로써 SOD의 활성을 분석한다. SOD의 활성 측정은 킷트화하여 간소화한다.
혈청중의 젖산탈수소효소(LDH)의 활성측정은 LDH A 효소시약 2.5ml에 혈청 1OOul를 첨가한 다음, LDH B 효소시약 0.1ml를 넣고 물을 대조로 하여 340nm에서 흡광도를 1,2 및 3분씩 측정하여 LDH의 활썽을 정량한다. LDH의 활성 측정은 킷트화하여 간소화한다
[실시예 2]
뇌세포중의 아세틸콜린에스테라아제(AChE)의 활성은 마이크로플레이트에 O.1M Tris buffer 3000ul, 0.01M DTNB 2oul, 뇌세포획분 10u1을 첨가하고, 측정하기 직전에 기질시약인 0.1M 아세틸치오콜린클로라이드 1Oul을 첨가하여 ELISA reader를 이용하여 405nm에서 흡광도의 변화를 3분동안 측정하여 측정한다. AChE의 활성 측정은 킷트화하여 간소화 한다.
본 발명은 생선회의 수요가 급증한 넙치를 자연산과 앙식산으로 구분하여 각각의 넙치에서 채취한 혈청에서 생화학적 기법으로 말론디알데히드(MDA)와 수퍼옥시드 디스무타아제(SOD), 젖산탈수소효소(LDH) 및 아세틸콜린에스테리아(AChE)의 활성을 측정하여 이들 비를 지표로 활용하여 넙치와 관련한 바다의 오염도를 측정하였기 때문에 어류가 살고 있는 그 바다의 실제적인 오염도를 보다 정확하게 측정할 수 있다.
또 측정에 의한 바다의 오염자료에 의하여 신속하게 해양오염에 대처 하여서 수산자원의 증식으로 수익성을 높힐 수 있는 동시 수요자에게는 양질의 회감생선을 공급할수 있는 등의 여러 가지 효과가 있다

Claims (2)

  1. (정정) 피측정 넙치에서 취한 혈청과 뇌회분으로 부터 통상의 생화학 분석법을 이용하여 말론디알데히드(ma1ondia1dehyde:MDA)와, 디스무타아제(SOD) 및 젖산탈수소효소(LDH)를 추출하여 MDA의 함량, SOD 및 LDH의 활성, 및 뇌회분의 AChE의 활성을 측정하고 이들의 비(LDH/AChE, MDA/SOD)의 값을 해양오염의 생화학적 지표로 하는 것을 특징으로 하는 넙치의 생화학적 분석기법을 이용한 해양오염 측정법.
  2. 제1항에 있어서, 넙치의 체성분중 MDA의 함랑, SOD 및 U)H의 활성, 및 뇌획분의 AChE의 활성측정을 킷트화 하여 측정하는 것을 특징으로 하는 넙치의 생화학적 분석기법을 이용한 해양오염의 측정법.
KR1019970051849A 1997-10-09 1997-10-09 도다리 혈액의 생화학성분을 이용한 해양오염의 측정법 KR100300104B1 (ko)

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MD4200C1 (ro) * 2012-07-05 2013-09-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Procedeu de apreciere a toxicităţii nanoparticulelor cu ajutorul microalgei roşii Porphyridium cruentum

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WO1997013148A1 (en) * 1995-10-02 1997-04-10 Staninger Hildegarde L A Method for measuring free radical cytotoxic degradation

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