KR100300103B1 - 넙치의 생화학적 분석기법을 이용한 해양오염의 측정법 - Google Patents

넙치의 생화학적 분석기법을 이용한 해양오염의 측정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 도다리 혈액의 생화학분석법을 이용한 해양 오염측정법에 관한 것으로 해양오염의 진단을 위하여 오염이 심각한 서해안의 자연산 도다리(Pleuronichthys cornutus)의 혈청을 분리하여 성인병의 발병의 원인물질로 사용되는 저밀도리포단백(low density lipoprotein: LDL) 콜레스테롤의 생성량과 오염 때문에 증가되는 말론디알데히드(malondialdehyde:MDA)의 함량을 분석하고, 오염으로 인하여 파괴되는 혈액중의 헤모글로빈(hemoglobin:Hb)의 함량과 활성산소(free mdicals)의 제거효소로서 글루타치온 퍼옥시다아제(gluathione peroxidase: GSHPx)의 활성 저하를 분석하여 그 비(LDL-Chl/Hb, MDA/GSHPx)로써 해양오염의 지표로 하는 것이다.

Description

도다리 혈액의 생화학분석을 이용한 해양오염의 측정법.
본 발명은 도다리 혈액의 생화학적 분석법을 이용한 해양 오염측정법에 관한 것이다.
본 발명은 급속한 공업화에 따른 산업발전으로 인한 공업단지의 조성, 도시의 육상의 오폐수의 유입, 농약의 과다 사용, 양축 및 양식 등에 의한 해양 환경오염으로 종국적으로 해양오염에 이르렀다. 이에 따른 수산생물의 오염문제가 심각하게 대두되면서 연안의 생태계 파괴 뿐만 아니라 연안 어장의 오염의 문제가 심각하게 대두되고 있다. 해수중의 오염물질로서 유해 중금속이나 PCB 등의 유기염소계 농약 및 방사능 물질 등은 어패류 등의 수산생물에 영향을 미치거나 체내에 농축될 가능성이 점증되고 있다. 최근 연안 어장의 적조현상으로 인한 연안 양식장의 폐사와 유류의 유출사고로 심각한 피해를 입고 있는 실정이다. 특히 서해안에서는 중국과 남북한 등 주변국의 공업화에 따른 육상의 오폐수의 유입으로 인하여 이미 자정능력에 한계점을 넘어서 해양의 오염상태가 크게 우려되고 있다. 따라서 연안 어장의 황폐화 및 해양 생태계의 파괴 가능성이 높아져서 어패류 등 수산물의 안정적 확보가 크게 위협을 받고 있다.
종래 바다물을 떠서 성분을 분석하는 오염측정법은 여러 가지 있으나 그것만으로는 그 바다물이 어류에 어떤 영향을 줄 정도로 오염되어 있는지는 파악 할 수 없었다.
본 특허의 목적은, 해양 생태계의 파괴에 대한 오염의 방지대책 수립을 위한 기초자료로 사용할 수 있고 연안어장이나 양식산 어패류를 포함한 오염되지 않는 깨끗한 수산물의 안정적공급을 수립하기 위한 해양오염의 신속한 진단법을 제공하는데 있다.
본발명의 또 다른목적은 생선횟감으로 수요가 급증하고 있는 자연산 도다리를 오염지표 어류로 선정하여 혈액의 생화학분석을 통하여 해양오염을 신속하게 진단 할 수 있는 새로운 측정법을 제공하려는데 있다.
본 발명은 해양오염의 진단수단으로서 오염이 심각한 서해안의 자연산 도다리(Pleuronichthys cornutus)의 혈청을 분리하여 성인병의 발병의 원인물질로 사용되는 저밀도리포단맥(low density lipoprdein:LDL) 콜레스테롤의 생성량과 오염 때문에 증가되는 말론디알데히드(malondialdehyde:MDA)의 함량을 분석하고, 오염으로 인하여 파괴되는 혈액중의 헤모글로빈(hemoglobin:Hb)의 함량과 활성산소(free mdicals)의 제거효소로서 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase: GSHPx)의 활성 저하를 분석하여 그 비(LDL-Chol/Hb, MDA/GSHPx)로써 해양오염의 지표로 삼는다.
본 발명에 사용한 서해안의 자연산 도다리의 재료와 실험방법 및 실험결과는 다음과 같다.
1. 실험방법
(1) 동물실험
본 본 발명 사용한 도다리 시료(Pleuronichthys cornutus)는 시험군으로서 서해안의 보령(Porpung), 아산(Asan), 격포(Kyougpo), 서산(Sousan)에서 채집한(체장 25∼36.5cm, 체중600∼800g) 자연산 도다리를 사용하였과 대조군은 오염도가 비교적 적은 동해안 포항(Pohang)에서 채집한 자연산 도다리(체장 31.2∼35.8cm, 체중 580-790g)을 각각 7∼10마리씩 구입하여 사용하였다.
(2) 사용시약
해양 오염의 지표어류로서 도다리를 사용하여 해양오염의 신속 측정법의 개발을 위하여 사용한 생화학 실험용 분석시약으로서 글루타치온 퍼옥시다아제(GSHPx) 및 헤모글로빈(Hb)등의 효소 및 분석시약은 모두 시그마제 특급 내지 1급시약을 구입하여 사용하였다.
2. 실험방법
(1) 혈액의 체취 및 분리
혈액은 채취하기전 12시간 절식시킨 상태에서 마취제(benzocaine: 4-aminobenzoic acidethylester)를 에탄올에 용해하여 마취시킨 다음, 넙치의 꼬리부분(尾部)에서 5cm지점의 등뼈밑 동맥에서 일회용 주사기로 채혈하였다.
채혈한 혈액은 실온에 일정시간 방치한 후 70O×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 항응고제(sodium hepahn,100,000units)를 혈액 1.0ml당 0.05ml 처리한 CBC병(complete blood cell count, 녹십자사)에 넣어 -70℃에 동결보존하면서 분석에 사용하였다.
(2) 단백질 함량의 측정
혈청의 단백질 함령은 상기 기법에 따라 표준 단백질로서 BSA(bwine serum albumin)를 사용하여 분광광도계를 사용하여 525nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 의하여 단백질의 함량을 정량하였다.
(3) 말론디알데히드의 함량 분석
혈청중의 말론디알데히드(malondialdehyde:MDA)의 함량은 TBA법에 따라 다음과 같이 측정하였다.
혈청 20ul에 증류수 180ul을 혼합한 것을 각 시험관에 취하고 8.1% SDS (sodum dodecylsulfate) 용액 200ul를 가하여 약 5초간 혼합한 다음, 20% 초산 1.5ml를 넣어 다시 5초간 혼합하여 1.2% TBA(thiobarbituric acid) 시약 1.0ml을 첨가하여 깨끗한 구슬로 마개하여 수조상(95℃)에서 30분간 가열하였다. 이 반응액을 800×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 분광광도계를 사용하여 532nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 의거 말론디알데히드(MDA)의 함량을 정량하였다.
(4) 헤모글로빈(Hb) 함량의 측정
혈액중의 헤모글로빈의 함량은 헤모글로빈 측정용 키트시약 (Sigma,Co.)을 사용하여 CMG법(cyammethemoglobin)에 의해 측정하였다.
먼저 시험관에 Drabkin`s용액을 각 시험판에 5ml씩 넣은 다음, 탈이온수 및 혈액 20ul을 각각 첨가한 후, 15분간 실온에서 방치하였다. 헤모글로빈 킷트시약의 표준용액은 CMG 표준용액을 0,2,4,6ml을 각각 시험관에 넣고 Darbkin's용액을 반대로 6,4,2 0ml을 첨가한 후, 혈액과 같이 15분간 실온에 방치하였다. 이 때 혈액 헤모글로빈의 함량은 0,6,12 18(g/dl)가 된다·그 후 헤모글로빈 킷트시약의 표준용액과 혈액을 Drabkn`s용액을 대조군으로 하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 표준 검량선에 의하여 헤모글로빈의 함량을 정량하였다.
(5) LDL-콜레스테롤의 함량 분석
혈청중의 저밀도리포단백(low density lipoprotein: LDL)-콜레스테롤의 함량 측정은 LDL-콜레스테롤(BLF Eiken Co.) 측정용 키트시약을 사용하여 측정하였다. LDL-콜레스테롤의 함량은 혈청 O.1ml, 표준혈청 O.1ml를 시험판에 넣고, 여기에 BLF킷트시약 I,II,III을 각각 4.0ml씩 넣어 5초간 잘 혼합한 다음, 실온에서 25분간 방치후 10분 이내에 증류수를 대조로 하여 650nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식에 따라 LDL-클레스테롤의 함량을 정량하였다.
LDL-콜레스테롤(mg/dl)=O.Dl-O.Dll/O.D A-O.D B*×표준 혈청농도(LDL+VLDL)"
표준혈청에 BLF킷트시약 I ,II을 섞은 후 흡광도를 측정후 나타난 O.D치를 표시함,**I=O.D A, III=O.D B의 수치를 사용, 표준 검량 곡선에 의거 계산.
(6) 글루타치온 퍼옥시다아제의 활성 측정
시험관에 인산완충용액(0.3 M phosphate buffer/4.0mM EDTA, pH 7.2)0.1ml, 증류수 1.295ml, 26.56mM NaN3용액(86.33mg NaN3/50ml, D.W) 0.5ml, 294.37mM GSH용액(452..34mg glutathione/5.0ml of 0.3M phospate buffer/4.0mM EDTA) 60ul, 8.4mM NADPH(35.0mg NADPH/5.0ml 0.3M phosphate buffer/4.0mM EDTA) 5ul, 1mM hydroperoxide 320ul와 희석된 상층액 30ul를 첨가하여 5초간 잘 혼합한 후 즉시 분광광도계를 사용하여 340nm에서 흡광도를 15초 간격으로 2분간 측정하여 표준검량선에 의해 GSHPx의 활성을 정량하였다.
3. 실험결과의 평가
(1) LDL=Chol/Hb비에 의한 오염도 평가
오염 등의 환경적 요인에 의하여 저밀도리포단백(low density lipoprotein:LDL)콜레스테롤이 혈관벽에 침착하여 여러가지 질병 등의 병변을 일으키는 것으로 알려져 있다. 표 1에서 혈청중의 LDL-콜레스테롤의 함량을 비교하여 보면 대조군으로 사용한 동해안 포항의 자연산 도다리(121.9)에 비해 서해안의 자연산 도다리는 141.3∼165.4로서 대조군 대비 16∼36%정도의 높은 LDL-콜레스테롤(LDL-Chol)의 침착을 알 수 있었다. 또한 생체내에서 혈판을 통해 영양소의 공급과 산소운반을 담당하는 혈청중의 헤모글로빈(Hb)의 함량도 농약이나
육상의 오폐수에 의해 파괴되는 것으로 알려져 있다. 표 1에서 보는 바와 같이 혈청중의 헤모글로빈의 함량을 비교하여 보면 서해안의 자연산 도다리의 함량은 2.44∼2.9O으로서 대조군으로 사용한 동해안 포항의 자연산 도다리(3.35)대비 15∼30% 정도나 파괴되었다는 사실을 알 수 있었다.
이들 도다리의 LDL-Chol/Hb의 비를 비교하여 보면 대조군으로 사용한 동해안의 포항산 도다리(36.4)에 비해 서해안의 자연산 도다리는 49.6∼59.5로서 35%에서 65%까지 현저히 높다는 사실을 알 수 있었다. 이와 같이 오염이 심각한 서해안의 자연산 도다리의 LDL-Chol/Hb의 비가 매우 높다는 사실은 해양 오염의 지표로서 LDL-Chol/Hb의 비를 측정하면 그 오염의 정도를 신속·정확하게 평가할 수 있다.
[표 1]
Figure kpo00001
Figure kpo00002
(2) MDA/GSHPx비에 의한 오염도 평가
한편 환경오염에 의해서 생성되는 활성산소(free radicals)에 의하여 혈청의 말론디알데히드(malondialdehyde: MDA)의 생성량 및 활성산소의 제거효소로 알려진 글루타치온 피옥시다아제(glutathione peroxidase:GSHPx)의 활성을 비교하여 보면 표 2와 같다. 표 2에서 오염이 심각한 것으로 알려진 서해안의 자연산 도다리중의 MDA의 생성량은 7.62∼9.54로서 대조군으로 사용한 동해안의 포항산 자연산 도다리의 MDA의 생성량(5.72) 대비 35∼65%로 현저히 증가하여 서해안의 자연산 도다리의 오염도 심각한 것으로 나타났다. 표 2에서 서해안의 자연산 도다리의 GHHPx의 활성은 92.79∼142.17로서 대조군으로 사용한 동해안의 포항산 자연산 도다리의 GSHPx의 활성(159.25) 대비 10∼60%나 감소한 것으로 나타났다.
또한 이들 도다리의 MDA/GSHPx의 비는 53.6∼102.1로서 대조군으로 사용한 동해안의 포항산 자연산 도다리의 MDA/GSHPx의 비(29.3) 대비 80∼350%까지 현저히 증가함을 알 수 있었다. 따라서 이들 서해안의 자연산 도다리의 MDA/GSHPx의 비가 대조군으로 사용한 동해안의 포한산 자연산 도다리의 MDA/GSHPx의 비에 비해 유의적으로 높다는 사실은 도다리의 혈청의 생화학적 분석에 의한 MDA/GSHPX의 비를 측정함으로써 해양오염의 정도를 신속·정확하게 평가할 수 있을 것으로 판단된다.
[표 2]
Figure kpo00003
이상의 연구결과를 종합·평가해 볼 때 저서류로서 이동이 비교적 적은 자연산 도다리의 혈액중의 LDL콜레스테롤(LDL-Chol), 헤모글로빈(Hb) 말론디알데히드(MDA)의 함량과 글루타치온 퍼옥시다아제(GSHPx)의 활성을 분석하여 그 비(LDL-Chol/Hb, MDA/GSHPx)를 지표로 하여 해양의 오염도를 신속·정확하게 측정할 수 있다.
[실시예 1]
도다리 혈액의 생화학적 분석방법의 간소화 및 재현성을 높여야 한다. 혈청중의 말론디알데히드(malondialdehyde: MDA)의 함량은 TBA법에 따라 시험판에 혈청 20ul과 증류수 180u1, 8.1% SDS용액 200ul과 20% 초산 1.5ml를 넣어 1.2% TBA(thiobarbituric acid) 시약 1.0ml을 첨가 혼합하여 수조상(95℃)에서 30분간 가열한 다음, 원심분리하여 상층액을 532nm에서 흡광도를 측정하여 정량한다. MDA의 함량 측정은 킷트화히여 간소화한다
혈액중의 헤모글로빈(Hb)의 함량은 시험판에 Drabkn`s용액을 각 시험판에 5m1, 탈이온 20ul을 첨가, 15분간 정치한 다음, CMG 표준용액을 0, 2, 4, 6ml DarbHn`s용액을 6,4,2 0ml을 첨가, 15분간 정치한다. 킷트시약의 표준용액과 혈액을 Drabkin、s용액을 대조군으로 하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 Hb의 함량을 정량한다. Hb의 함량 측정은 킷트화하여 간소화 한다.
혈청중의 LDL-콜레스테롤의 함량은 혈청 0.1ml, 표준혈청 0.1ml를 시험판에 넣고, 여기에 BLF킷트시약 I,II,III을 각각 4.0ml씩 넣어 5초간 잘 혼합한 다음, 실온에서 25분간 방치후 10분내에 증류수를 대조로 하여 650nm에서 흡광도를 측정하여 LDL-Chol을 정량한다. LDL-Chol 함량 측정은 킷트화하여 간소화 한다.
[실시예 2]
GSHPx의 활성 측정은 시험관에 인산완충용액 0.1ml, 증류수 1.295ml, 26.56mM NaN3용액 0.5ml, 294.7mM GSH용액 60ul, 8.4mM NADPH용액 110ul, GSH-Re용액 5ul, 1.0mM 하이드로퍼옥시드용액 320ul와 희석된 상충액 30ul를 첨가하여 340nm에서 흡광도를 측정하여 GSHPx의 활성을 정량한다. GSHR의 활성 측정은 킷트화하여 간소화 한다
본 발명은 생선회가 급증하는 해양별 도다리를 채집하여 도다리에서 체혈한 혈청을 생화학적 기법으로 분석하여 LDL-콜레스테론(LDL-Chol), 헤모그로빈(Hb), 말로알데히드(MDA)의 함량과 글루타치온 퍼옥시다아제(GSHPx)의 활성을 분석하여 이들의 비를 지표로 활용하여 바다의 오염도를 측정하였기 때문에 그 바다에서 사는 어류와 직접 관련되는 실제적 바다의 오염도를 보다 정확하게 측정할 수 있는 효과가 있다.

Claims (2)

  1. (정정)도다리에서 체취한 혈청에서 통상의 생화학적 분석법을 이용하여 말론알데히드(MDA), LDL-콜레스테롤(LDL-Chol) 및 헤모그로빈(Hb)의 함량과 글루타치온 퍼옥시다아제(GSHPx)의 활성을 측정하고 이들의 비(LDL-Chol/Hb, MDA/GSHPx)의 값을 해양오염의 생화학적 지표로하는 것을 특징으로 하는 도다리 혈청의 생화학분석을 이용한 해양오염의 측정법.
  2. 제1항에 있어서, 도다리의 혈액성분에서 MDA, LDL-Chol 및 Hb의 함량 및 GSHPx의 활성의 측정을 킷트화로 측정하는 것을 특징으로 하는 도다리 혈액의 생화학분석을 이용한 해양오염의 측정법.
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MD4200C1 (ro) * 2012-07-05 2013-09-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Procedeu de apreciere a toxicităţii nanoparticulelor cu ajutorul microalgei roşii Porphyridium cruentum

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1997013148A1 (en) * 1995-10-02 1997-04-10 Staninger Hildegarde L A Method for measuring free radical cytotoxic degradation

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