KR100290224B1 - Cxc 인터크린 분자의 펩타이드 억제제 - Google Patents

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신이치로 하야시
케이. 쿠르도브스카 안나
알. 투틀 로날드
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파라비 레이
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Abstract

본 발명은 CXC 인터크린 분자의 작용을 억제하고 조절하는 방법 및 펩타이드를 기본으로 하는 조성물에 관한 것이다. 기술된 항류키네이트 펩타이드는 호중구에 대한 IL-8, GRO 및 MIP2β 결합 및 호중구 활성화를 억제한다. 이 펩타이드는 화학주성을 억제하는데 필요한 농도보다 25배 낮은 농도에서 Il-8-유도된 효소 방출을 억제하므로 특히 유용하며, 이러한 특성은 상기 펩타이드가 다른 질병중에서, 성인 호흡성 고통 증후군(Adult Respiratory Distress Syndrome: ARDS), 낭포성 섬유증 및 만성 기관지염을 포함하는 각종 염증 질병 및 질환을 치료하는데 이상적이 되도록 한다.

Description

[발명의 명칭]
CXC 인터크린 분자의 펩타이드 억제제
[발명의 상세한 설명]
[발명의 배경]
미합중국 정부는 NHLBI로부터의 승인 번호 제ROI-HL 403650호에 따른 본 발명의 권리를 소유한다.
[발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 사이토킨 작용 분야 및 더욱 특히 CXC 인터크린(intercrine) 분자의 작용을 억제 및 조절하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 본원에는 인터류킨 8(IL-8)을 억제하는 펩타이드 조성물 및, 더욱 특히 호중구에 의한 분해 효소의 IL-8-유도된 방출을 우선적으로 억제하는 펩타이드 조성물에 관한 것이다. 이들 조성물은 성인 호흡 곤란 증후군(Adult Respiratory Destress Syndrome; ARDS) 및 낭포성 섬유증을 포함하는 다양한 염증 질병 및 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
[관련 기술의 설명]
IL-8은 이의 N-말단 서열의 성분에 따라서 명명된, 사이토킨의 CXC 인터크린 부류의 구성원이다. 이 부류는 또한 그 중에서, 성장과 관련된 온코진(GRO, 또는 GRO/MGSA) 및 대식세포 염증성 단백질 2β(MIP2β)로서 공지된 펩타이드 분자를 포함한다. IL-8은 대략 8kD의 펩타이드이며, 길이는 약 72 아미노산이고, 이 길이는 상이한 세포 타입에서 해독후 프로세싱에 따라 변한다[참조: Yoshimura et al., 1989; Hebert et al., 1990; Strieter et al., 1989]. IL-8 유전자는 스타필로코커스 장독소 A로 자극된 사람 혈액 단핵세포에 의해 전사된 유전자를 분석함으로써 최초로 동정되었다[참조: Schmid and Weissman, 1987]. IL-8 생산은 종양 괴사 인자 및 인티류킨 1에 의해 유도되는 것으로 공지되어 있다[참조: Strieter et al., 1990].
IL-8은 호중구 상에서 2개 이상의 뚜렷한 수용체와 상호작용한다[참조: Holmes et al., 1991; Murphy and Tiffany, 1991]. 수용체는 GTP-결합 단백질에 커플링됨으로써, IL-8 시그날이 세포내로 전달되도록 한다[참조: Wu et al., 1993]. GRO 및 MIP2β와 같은 인터크린 부류의 구성원 대부분은 수용체들중 하나에 결합하는 반면, IL-8은 IL-8 수용체들 모두에 결합한다[참조: LaRosa et al., 1992; Cerretti et al., 1993]. IL-8의 삼차원적 구조는 NMR[참조: Clore et al., 1990] 및 X-선 결정학[참조: Clore and Gronenborn, 1992; Baldwin et al., 1991]에 의해 유추되었다. 자유로이 이동가능한 아미노 말단에는 3개의 β 주름의 쉬이트가 위치하며, α 나선형은 카복시-말단에 위치한다[참조: Oppenheim et al., 1991]. 몇가지 증거는 아미노-말단 및 카복시-말단 모두가 이의 수용체에 대한 결합에 관여함을 제시하고 있다[참조: Clore et al., 1990; Clark-Lewis et al., 1991; Moser et al., 1993].
CXC 인터크린의 특정한 작용은 몇몇 연구실에 의해 유추되었다[참조: Yoshimura et al., 1989; Schroder et al., 1988; Peveri et al., 1988]. 예를 들어, IL-8 펩타이드의 주요 작용은 호중구 화학주성 및 활성화를 자극하는 이의 능력[참조: Larsen et al., 1989; Schroder et al., 1988; Peveri et al., 1988; Yoshimura et al., 1987] 및 맥관 형성을 자극하는 이의 능력[참조: Koch et al., 1992]과 관련된 것으로 여겨진다. 호중구가 예를 들어 표면 부착 또는 이. 콜라이 내독소(또한 리포폴리사카라이드 또는 LPS로 공지되어 있다)와 같은 제제에 의해 ‘프라임’되는 경우, IL-8은 또한 엘라스타제 및 마이엘로퍼옥시다제와 같은 호중구 효소의 방출을 자극한다.
비록 호중구 염증 반응이 신체를 침입하는 세균을 파괴하는데 필수적이라고 해도, 부적절한 호중구 활성화는 몇가지 문제점을 야기시킨다. 예를 들어, 폐에 침입할 때 호중구가 적절히 프라임되는 경우, 이들은 폐 조직내로 파괴 효소를 방출한다. 이것은 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)으로의 진행을 야기시킬 수 있다[참조: Weiland et al., 1986; Idell et al., 1985]. ARDS는 매년 150,000 내지 200,000명의 미국인에게 발생하며, 최상의 임상적 시설하에서도 치사율이 50 내지 80%가 된다[참조: Balk and Bone. 1983]. ARDS는 세균 감염, 혈압의 갑작스런 심각한 강하(쑈크), 및 신체에 대한 많은 다른 상해로 개시된다. 최근 연구에서는 IL-8이 ARDS 환자의 폐내에서 주요한 호중구 활성화제인 것으로 입증되었으며[참조: Miller et al., 1992], 내독소 쑈크의 일차 모델은 또한 IL-8이 유발제임을 암시하고 있다[참조: Van Zee et al., 1991].
고농도의 IL-8은 IL-8이 중요한 병원체성 역할을 담당하는 것으로 사료되는 다른 질병 및 병원성 상태의 염증 삼출액 중에서 발견되었다[참조: Brennan et al., 1990; Miller & Idell, 1993; Miller et al., 1992]. 예를 들어, IL-8은 또한 류마티스 관절염에 있어서 염증의 가능한 중재자[참조: Brennan et al., 1990; Seitz et al., 1991] 및 의통풍(pseudogout)에 있어서 염증의 가능한 중재자[참조: Miller & Brelsford, 1993]로서 연관되어 있으며, 낭포성 섬유증에 있어서 역할을 지닌다[참조: McElvaney et al., 1992; Nakamura et al., 1992; Bedard et al., 1993]. 따라서, IL-8 작용의 조절은 다양한 변원성 상태를 제어하는 우수한 방법인 것으로 여겨진다.
최근에 IL-8 합성을 감소시킬 수 있는 화합물의 동정이 상당히 진척되었다. 이와 같은 화합물은 IL-4, 산소 라디칼 스캐빈저, 분비성 류코프로테아제 억제제 및 인터페론 γ를 포함하나[참조: Standiford et al., 1990; DeFroge et al., 1992; McElvaney et al., 1992; Cassatella et al., 1993a; 1993b], 이와 같은 연구는 IL-8 억제제에 관한 것이 아니다. 단백질 키나제 C 억제제, IL-4 및 항-IL-8 항체를 포함하는 기타 다양한 조성물이 또한 IL-8 작용을 조절하는 것으로 보고되었다[참조: Lam et al., 1990; Standiford et al., 1992; Mulligna et al., 1993]. 불행히도, 이들 화합물들은 임상적 환경에서 IL-8 억제제로서 사용하기 위한 이상적인 물질이 아니다.
펩타이드 IL-8 억제제의 동정이 일부 진척되어 왔으나, 이와 같은 작업의 대부분은 IL-8 분자 자체의 부분에만 촛점이 맞추어져 있다[참조: Mller et al., 1990; Gayle et al., 1993]. 예를 들어, 본 발명자들은 합성 펩타이드 및, 특히 IL-8 아미노 말단 펩타이드가 호중구에 대한 IL-8 결합 및 호중구 화학주성을 억제함을 밝혔다[참조: Miller et al., 1990; Miller et al., 1993]. N-말단 펜타펩타이드 IL-8 억제제가 또한 보고되었다[찹조: Goodman et al., 1991]. 불행히도, 현재까지 IL-8 기원한 펩타이드의 억제 작용은 불완전하고 불충분하게 입증되어 있다.
IL-8과 같은 CXC 인터크린의 특히 효과적인 펩타이드 억제제가 아직 동정되지 않았으므로, 현재 IL-8 분자 자체 이외의 조성물이 연구될 필요성이 명백한 것으로 여겨진다. 화학주성과의 비교시 호중구 효소 방출을 우선적으로 억제할 수 있는 펩타이드 억제제의 동정이 특히 유리한 발견이 될 수 있는데, 이는 호중구가 폐로 도입되어 세균 칩입을 방어하면서 조직 손상을 유발하지 않기 때문이다.
[발명의 요약]
본 발명은 IL-8, GRO(GRO/MGSA) 및 MIP2β와 같은 CXC 인터크린 분자의 작용을 조절 및 억제하는 신규한 방법 및 이를 위한 신규한 조성물을 제공함으로써 선행 분야에서의 단점을 극복하고자 하였다. 기술된 펩타이드 및 약리학적 조성물은 호중구에 대한 IL-8, GRO 및 MIP2β 결합을 감소시키고, IL-8 유도된 호중구 활성화를 억제한다. 이들 펩타이드 제형은 호중구 화학주성을 억제하는데 필요한 농도보다도 현저히 낮은 농도에서 IL-8-유도된 효소 방출을 억제할 수 있기 때문에 특히 유리하다. 또한, 본원에서는 CXC 인터크린의 비제한된 작용이 중요한 역할을 담당하는 다양한 질병 및 질환, 특히 염증성 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Xaa1(RRWWCX; 서열확인번호: 23)(여기서, Xaa1은 특정한 아미노산 잔기이다)를 포함하는 비교적 작은 펩타이드가 IL-8과 같은 CXC 인터크린 분자의 강력한 억제제라는 본 발명자들의 놀라운 발견을 기초로 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “CXC 인터크린 부류 분자” 및 “CXC 인터크린”은 N-말단 영역내에 CXC 서열 모티프(motif)를 포함하는 펩타이드 인터크린의 그룹을 언급하는데 포괄적으로 사용한다. CXC 인터크린은 IL-8, GRO, MIP2α, MIP2β 및 ENA78을 포함하는 것으로 공지되어 있으며, 이들 분자 모두 및 CXC 모티프를 포함하는 특정한 다른 인터크린 폴리펩타이드를 본 출원에 사용된 이 용어내에 포함되는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 억제성 펩타이드는 “항류키네이트”로 명명될 수 있다. 서열 RRWWCX(서열확인번호: 23)의 특정한 헥사머 펩타이드는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcal aureus)에 대해 항-세균 활성을 지니는 것으로 이미 밝혀져 있다[참조: Houghten et al., 1991]. 그러나, 이와 같은 펩타이드가 본원에서 기술한 유리한 항-사이토킨/인터크린, 항-호중구 및 항-염증 활성을 지님을 제시하는 정보는 보고되어 있지 않다.
따라서, 특정 양태로서, 본 발명은 GRO 및 MIP2α 또는 MIP2β와 같은 CXC 인터크린을 억제하는 방법 및 더욱 특히, IL-8을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “CXC 인터크린을 억제하는”은 CXC 인터크린의 생물학적 작용을 감소시키는 공정을 말한다. 이는, CXC 인터크린 억제를 측정하는 특정한 유형이 사용될 수 있으나, 호중구와 같은 이의 표적 세포상에서 IL-8 수용체 중 하나에 대한 이의 결합을 억제함으로써 특히 평가될 수 있다.
용어 IL-8은 호중구-활성화 인자, 단핵세포-기원한 호중구-활성화 펩타이드, 단핵세포-기원한 호중구-화학주성 인자 및 호중구-활성화 펩타이드-1으로서 이미 공지된 사이토킨 조성물을 언급하는데 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “IL-8을 억제하는”은 일반적으로 IL-8의 생물학적 작용을 감소시키거나 약화시키는 공정을 언급한다. 이것은 IL-8의 특정한 또는 모든 공지된 작용의 억제를 포함한다. 이 작용은 수용체 결합 또는 사이토졸성 칼슘 농도의 변화와 같은 아-세포성 효과의 조절; 과립구 점증 보충 및 활성화와 같은 세포 효과의 조절 및 또한 염증 및 맥관형성과 같은 생리학적 효과에 대한 영향을 포함한다.
바람직한 양태로서, 본 출원에서 언급된 IL-8 작용의 억제는 호중구(다형핵의 호중구, PMN)와 같은 과립구에 대한 IL-8 작용의 억제이다. 이는 본원에 기술된 바와 같이, 많은 세포적 방법 및 생리학적 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 정제된 수용체 조성물 또는 호중구에 대한 IL-8 결합의 억제를 측정하거나; IL-8 유도된 호중구 화학주성 또는 1L-8 유도된 호중구 삼출의 억제를 측정하거나; 1L-8-자극된 호중구 효소 방출(예: 마이엘로퍼옥시다제, β-글루쿠로니다제 또는 엘라스타제 방출) 또는 슈퍼옥사이드 생산의 억제를 측정하거나; 생체내, 예를 들어 경피성 염증의 토끼 모델을 사용하여 항-염증 작용을 검정한다.
IL-8 억제 또는 더우기 GRO 또는 MIP2β 억제를 측정하는 바람직한 방식은 호중구에 대한 인터크린 결합의 감소를 검정하는 것이며, 이는 가장 간단하고 직접적인 방법이다. 또한, 이의 수용체에 대한 특정한 인터크린의 결합은 호중구 또는 다른 세포 유형에서 일어나는 어떠한 다른 작용보다 선행되어야 한다. 호중구에 대한 IL-8, GRO 또는 MIP2α 또는 MIP2β 결합의 억제에 의해 예시되는 바와 같은 인터크린의 “억제”는 인터크린 결합을 모든 검출가능한 수준으로 억제하는, 즉 펩타이드 또는 조성물의 부재하에서 관찰되는 수준 이하로 결합을 감소시키는 주어진 펩타이드 또는 조성물의 능력을 언급한다.
호중구에 대한 CXC 인터크린 결합의 억제는 결합 억제 %값으로 나타낼 수 있으며, 수치가 클수록 더욱 효과적인 억제제를 나타낸다. 바람직한 펩타이드일수록 일반적으로 결합 억제 %수치가 높을 것이다. 물론, 계산된 결합 억제 %는 CXC 인터크린의 농도 및 주어진 펩타이드 또는 조성물의 농도와 같은 정확한 검정 조건에 따라 달라질 것이다. 표 1A, 1B, 5A 및 5B의 데이타를 산출하는데 사용된 것과 같은 조건들은 주어진 펩타이드에 특정한 억제 활성이 있는지의 여부를 측정하는데 사용될 수 있다. 그러나, 특별히 정확한 양 또는 비교 데이타를 수득하여야 하는 경우, 저농도의 펩타이드를 사용하는 조건, 예를 들어 약 20μM의 노도(제1도 및 제9도의 데이타를 산출하는데 사용된 농도)와 같은 더욱 명확한 조건을 사용할 수 있다. 어쨌든, 펩타이드 또는 동족체가 IL-8과 같은 CXC 인터크린을 억제할 수 있는지의 여부를 측정하는 것은 본원에 기술된 검정을 사용하여 쉽게 달성되는 직접적인 대상이다.
비록 CXC 인터크린 억제제의 작용 메카니즘을 이해하는 것이 이의 실제적인 용도의 측면에서 관계가 없다해도, 본 발명의 펩타이드 억제제가 낮은 농도에서 IL-8-유도된 화학주성보다 IL-8-유도된 호중구 효소 방출을 우선적으로 억제할 수 있다는 사실에 특히 주목해야 한다. 이러한 의미에서, 본 발명과 관련되어 사용할 경우, 용어 “억제 ”는 또한 특정한 호중구 작용이 다른것 보다도 더욱 현저하게 억제된다는 점에서 “조절”을 의미한다.
IL-8-유도된 호중구 화학주성을 억제하는데, 필요한 농도보다 약 25배 낮은 농도에서 IL-8-유도된 호중구 분해성 효소 방출을 억제하는 펩타이드의 능력은 선행 연구에서 예견될 수 없었던 중요한 발견이다. 이는 호중구가 상해 부위로 여전히 보충될 수 있으나, 이들이 일반적으로 방출하는 효소의 유해한 효과는 현저히 감소될 수 있음을 의미한다. 이들의 작은 크기와 결합된 이러한 특성은 이들 펩타이드 유형이 다양한 치료 프로토콜 및 특히 폐 상해의 치료에 사용하기에 이상적임을 나타낸다.
IL-8, GRO 또는 MIP2 억제와 같은 CXC 인터크린을 억제하거나, 호중구 화학주성과 비교하여 호중구 효소 방출을 우선적으로 감소시키기 위해, 본 발명에 따라 일반적으로 과립구 또는 호중구와 같은 인터크린 표적 세포 또는 CXC 인터크린 부류 분자를 본원에 기술된 펩타이드 부류를 함유하는 생물학적 유효량의 조성물과 접촉시킨다. “접촉” 공정은 조성물 중에서 활성 펩타이드 또는 펩타이드들을 CXC 인터크린 펩타이드 또는 표적 세포상에 존재하는 이들 수용체 중 하나 또는 이들 모두에 접촉시켜 이의 작용적 상호작용을 감소시키거나 억제시키는 공정이다. 과학적으로 흥미있다 해도, 주어진 세포로 전달된 CXC 인터크린 시그날이 감소되는 메카니즘은 본 발명의 실행과 관련되지 않는다.
CXC 인터크린 또는 인터크린 표적 세포에 펩타이드-함유 조성물을 접촉시키기 위해서는 단순히 펩타이드 또는 조성물을 호중구와 같은 표적 세포 및 실험관내에서 인터크린에 가할 수 있다. 달리는, 약리학적으로 허용되는 형태의 펩타이드 또는 조성물의 생물학적 유효량을 동물에게 투여할 수 있는데, 이 경우 당해 펩타이드 또는 조성물을 예를 들어 생체내에서 생물학적 유액 중의 호중구 또는 대식세포 및 인터크린과 접촉시킬 것이다. 이와 관련하여, “접촉”은 단순히 조성물을 동물에게 투여함으로써 달성시킬 수 있다. 정맥내, 근육내 및 피하내 투여와 같은 비경구 투여용 제형; 흡입, 에어로졸 및 분무 제형; 크림제, 연고제 및 겔제와 같은 국소용 펩타이드 제형; 및 지질 테일의 펩타이드, 미셀 또는 리포좀내에 캡슐화 된 펩타이드 및 서-방출용으로 고안된 생적합성 피복물내에 혼입된 활성 펩타이드를 포함하는 약물 방출성 캡슐제와 같은 기타 제형을 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 효과적인 약제학적 펩타이드 제형이 사용될 수 있다.
증가된 농도의 IL-8은 ARDS 환자의 폐 부종액내[참조: Miller et al., 1992] 및 낭포성 섬유증 환자의 타액내[참조: Richman-Eisenstat et al., 1993]; 흉막 삼출액 환자의 흉막 공간내[참조: Miller & Idell, 1993]; 몇 종류의 관절 질병 환자의 관절액내[참조; Brennan et al., 1990; Miller & Brelsford, 1993], 관절염 환자로부터의 건선반내 및 활액내[참조: Lam et al., 1990]에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 부적절한 호중구 활성화는 이와 같은 모든 질병과 허혈 및 재관류 상해와 연관되어 있다[참조: DeForge et al., 1992]. IL-8 호중구 보충의 억제는 생체내에서 폐 염증을 감소시키는 것으로 밝혀졌으며[참조: Mulligan et al., 1993], 본원에 사용된 시험관내 연구의 유형은 생체내 활성의 척도로서 혀용되므로[참조: 본원에서 참조로 인용한 미합중국 특허 제5,079,228호], 본 출원에 기술된 IL-8-유도된 호중구 활성화의 매우 성공적인 억제는 이들 펩타이드의 다양한 임상적 용도를 지지한다.
따라서, 본 발명은 CXC 인터크린, 특히 IL-8의 중요한 역할을 담당하는, 염증 성분을 지닌 다양한 질병 및 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 이것은 만성 기관지염, 낭포성 섬유증, 흉막 삼출액, 천식 및 ARDS와 같은 기관지염을 포함하는 폐 상해 및 질병; 건선 및 피부염과 같은 피부 질병; 류마티스 관절염을 포함하는 관절 질병이 있는 환자를 치료하고; 일반적으로 의통풍, 염증성 장 질병 또는 심근 경색증후의 재관류 심장 손상과 같은 기타 임상적 상태에서 염증을 감소시킴을 포함한다. 더우기, 이 펩타이드는 예를 들면, 암 및 기타 질병 및 증가된 세포 증식과 연관된 질병의 치료시 임파구 증식을 하향 조절하기 위한 항-증식성 제제로서 사용될 수 있다.
상기 상태중 어느 하나, 또는 호중구 활성에 영향받거나 염증이 특징인 기타 모든 질병을 치료하기 위해, 특정한 염증 또는 IL-8-결합된 질병이 있는 환자를 확인한 후 환자에게, 바람직하게는 비경구적으로 본원에서 기술한 펩타이드 부류 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물의 생물학적 유효량을 투여한다.
물론, 치료하는 질병 또는 질환에 따라 특수한 약제학적 제형을 일반적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 피부 질병을 치료하기 위한 방법에는 국소용 크림 제형 또는 겔 제형이 사용될 수 있는 반면, 폐 질병을 치료하기 위한 방법에는 주사용 제형, 또는 심지어 분무, 에어로졸 또는 흡입 제형을 사용할 수 있다. 신체의 다른 부위의 염증을 감소시키기 위한 방법에는 비경구 투여용으로 제형화된 펩타이드 또는 서-방출용으로 고안된 생적합성 피복물내에 혼입된 펩타이드를 사용할 수 있다. 리포좀-캡슐화가 사용될 수 있으며, 이는 투여된 화합물, 특히 본원에 기술된 펩타이드와 같은 저분자량의 펩타이드의 반감기를 현저히 연장시키고 효능을 증진시키는 것으로 공지되어 있다. 이와 같은 약제학적 제형 모두를 제조하기 위한 다양한 조성물 및 기술은 일반적으로 본 기술의 관점에서 당해 분야의 숙련가도 알 수 있을 것이다. 적합한 약리학적 조성물 및 연관된 투여 기술의 상세한 목록은 본원에서 참조로 인용한 문형[참조: Remington′s Pharmaceutical Science, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.]을 참조할 수 있다.
IL-8 또는 CXC 인터크린은 생물학적 유효량의 억제성 펩타이드 또는 펩타이드들을 사용하여 억제시킨다. 본원에 사용된 바와 같이, 펩타이드 또는 조성물의 “생물학적 유효량”은 IL-8 또는 특정한 인터크린의 작용을 억제하는 유효량을 말한다. 예를 들어, IL-8 억제와 관련하여, 적절한 양은, 특히 화학주성과 비교하여 호중구 효소 방출을 감소시키는데 효과적인 양이다. 본원에 기술된 바와 같이, 약 100μM 내지 약20 μM의 농도와 같은 각종 상이한 펩타이드 농도가 시험관내에서 매우 효과적이다. 따라서, 펩타이드의 국소 농도와 유사한 임상적 용량이 특히 중요한 것으로 고려된다.
물론, 임상적 측면에서, 투여된 펩타이드 조성물의 양 및 용적은 숙주 동물 및 치료되는 상태 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 투여하는데 필요한 활성 펩타이드의 정확한 양은 주치의의 판단에 따를 것이며, 각각의 개인에 따라 특수할 수 있다. 그러나, 본원에 나타낸 데이타의 측면에서, 사람에게 사용하기에 적합한 용량 범위를 측정함이 직접적인 방법이 될 것이다. 예를 들어, ARDS 또는 낭포성 섬유증의 치료에는 개인당 약 0.83mg/체중 kg/시간(mg/kg/hr) 내지 약 16.56mg/kg/hr, 바람직하게는 약 0.83mg/kg/hr 내지 약 4.14mg/kg/hr, 및 더욱 바람직하게는 약 1.66mg/kg/hr의 활성 성분 펩타이드가 고려된다.
본 발명에 따라서, IL-8, GRO 및 MIP2α 또는 MIPβ와 같은 CXC 인터크린을 억제하는데 사용하기 위한 조성물은 서열중에 아미노산 서열 RRWWCX(서열확인번호: 23)를 포함하는, 일반적으로 길이가 6 내지 약 14 잔기인 비교적 작은 펩타이드를 함유하는 조성물일 것이다. 이러한 의미로서 용어 “펩타이드”는 하나 이상의 펩타이드를 의미하며, 서열식 RRWWCX(서열확인번호: 23)에 부합하는 서열을 포함하는 펩타이드 하나 이상을 언급할 수 있다.
본 발명에 포함된 비교적 작은 펩타이드는 길이가 6개 잔기 내지 약 14 또는 15개의 잔기인 어떠한 길이일 수 있으며, 정확한 길이가 본 발명의 중요한 특징이 되지는 않는다. 예를 들어, 비용 및 비교적 용이한 대규모 합성, 및 조직을 침투할 수 있는 용이함 및 이의 낮은 면역원성과 같은 개선된 약리학적 특성 등으로 인해 작은 펩타이드를 사용하는 것이 매우 유리하다.
서열 RRWWCX(서열확인번호: 23)에 따른 아미노 서열을 포함하는 것외에, 펩타이드는 각종 아미노산의 다른 짧은 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 양태로서, 펩타이드는 서열 RRWWCX(서열확인번호: 23) 또는 RRWWCXX(서열확인번호: 57)의 반복 단위를 포함할 수 있다. 이들은 또한 예를 들어, 짧은 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키는 것으로 생각되는 아미노산, 또는 더우기 서열이 여전히 IL-8과 같은 인터크린을 억제하는데 작용하는 한(이는 본원에 기술된 검정과 같은 단순한 검정으로 용이하게 측정할 수 있다), 특정 목적으로 고안된 추가의 어떠한 잔기도 포함하는 추가의 서열을 포함한다.
펩타이드내로 혼입될 수 있는 아미노산은 일반적으로 존재하는 아미노산 모두를 포함한다. 당해 분야에서 일반적으로 시행되는 것으로서, 아미노산에 대한 2가지의 표시 방법이 본 출원에서 교대로 사용된다: 알라닌=Ala(A); 아르기닌=Arg(R); 아스파트산-Asp(D); 아스파라긴=Asn(N); 시스테인=Cys(C); 글루탐산=Glu(E); 글루타민=Gln(Q); 글라이신=Gly(G); 히스티딘=His(H); 이소루이신=Ile(I); 루이신=Leu(L); 라이신=Lys(K); 메티오닌=Met(M); 페닐알라닌=Phe(F); 프롤린=Pro(P); 세린=Ser(S); 트레오닌=Thr(T); 트립토판=Trp(W); 티로신=Tyr(Y); 발린=Val(V).
소위 드물거나 변형된 아미노산 어느것도 본 발명의 펩타이드내에 혼입될 수 있으며, 이는 다음을 포함한다: 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, β-알라닌(β-아미노프로피온산), 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산(피페리딘산), 6-아미노카프로산, 2-아미노헵타노산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 데스모신, 2,2′-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글라이신, N-에틸아스파라긴, 하이드록시라이신, 알로-하이드록시라이신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소루이신, N-메틸글라이신(사르코신), N-메틸이소루이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르루이신 및 오르니틴.
본 발명의 억제 조성물은 생물학적으로 보호되도록 변형된 펩타이드를 포함할 수 있다. 생물학적으로 보호된 펩타이드는 사람 환자에게 투여될 경우 보호되지 않은 펩타이드보다 특정한 장점을 지니며, 미합중국 특허 제5,028,592호(본원에서 참조로 인용)에 기술된 바와 같이, 보호된 펩타이드는 본 발명에서 사실로써 밝혀진 바와 같이 증가된 약리학적 활성을 종종 나타낸다.
따라서, 본 발명은 아실화된 펩타이드(들) 및 바람직하게는 N-말단에서 아실화된 펩타이드를 함유하는 조성물을 포함한다. 비록 본 발명에 특정의 아실 그룹이 사용될 수 있으나, 본 발명자들은 주어진 펩타이드의 N-말단에 아세틸 그룹의 부가가 또한 IL-8과 같은 인터크린을 억제하는데 있어서 수득된 펩타이드를 현저히 효과적인 것이 되도록 함을 발견하였다. 억제 펩타이드 조성물은 또한 C-말단에서 아미드화된, 즉 NH2그룹이 가해진 펩타이드를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 양태로서, 아실화된 N-말단 및 아미드화된 C-말단 잔기 모두를 갖는 펩타이드가 바람직한데, 이는 천연의 펩타이드 및 펩타이드 구조와 가장 유사한 것으로 여겨지기 때문이다.
본 발명에 사용하기 위한 조성물은 또한 모든 L-아미노산, 모든 D-아미노산 또는 이의 혼합물을 포함하는 펩타이드를 함유할 수 있다. 완전히 D-아미노산으로 구성된 펩타이드가 강력한 억제 활성을 지닌다는 발견이 특히 중요한데, 이는 이러한 펩타이드가 사람 체내에서 천연적으로 발견되는 프로테아제에 내성이며 면역원성이 거의 없는 것으로 공지되어 있어 생물학적 반감기가 보다 길 것으로 예상되기 때문이다.
본 발명의 항-인터크린 및 항-IL-8 조성물은 일반적으로 서열확인번호: 1 또는 서열확인번호: 24 내지 42에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 하나 이상을 함유할 것이다. 특정 양태로서, 짧은 헥사머 펩타이드가 바람직할 수 있다. 이와 같은 경우, 억제 조성물은 일반적으로 하기 나타낸 서열확인번호: 1 또는 서열확인번호: 24 내지 42에 기재된 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 하나 이상을 함유할 것이다:
Arg Arg Trp Trp Cys Arg(서열확인 번호: 1)
Arg Arg Trp Trp Cys Aℓa(서열확인 번호: 24)
Arg Arg Trp Trp Cys Cys(서열확인 번호: 25)
Arg Arg Trp Trp Cys Asp(서열확인 번호: 26)
Arg Arg Trp Trp Cys Glu(서열확인 번호: 27)
Arg Arg Trp Trp Cys Phe(서열확인 번호: 28)
Arg Arg Trp Trp Cys Gly(서열확인 번호: 29)
Arg Arg Trp Trp Cys His(서열확인 번호: 30)
Arg Arg Trp Trp Cys Ile(서열확인 번호: 31)
Arg Arg Trp Trp Cys Lys(서열확인 번호: 32)
Arg Arg Trp Trp Cys Leu(서열확인 번호: 33)
Arg Arg Trp Trp Cys Met(서열확인 번호: 34)
Arg Arg Trp Trp Cys Asn(서열확인 번호: 35)
Arg Arg Trp Trp Cys Pro(서열확인 번호: 36)
Arg Arg Trp Trp Cys Gln(서열확인 번호: 37)
Arg Arg Trp Trp Cys Ser(서열확인 번호: 38)
Arg Arg Trp Trp Cys Thr(서열확인 번호: 39)
Arg Arg Trp Trp Cys Val(서열확인 번호: 40)
Arg Arg Trp Trp Cys Trp(서열확인 번호: 41)
Arg Arg Trp Trp Cys Tyr(서열확인 번호: 42)
다른 양태로서, 본 발명의 억제 조성물은 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Arg Xaa2(서열확인 번호: 2)에 따른 서열을 포함하는 펩타이드 하나 이상을 함유 할 수 있다. 이 경우 다양한 위치중의 하나가 아르기닌으로 정의되며, 나머지 Xaa2는 특정한 아미노산일 수 있다. 따라서, 이와 같은 서열은 서열확인번호: 3 내지 22에 기재된 것으로써 예시된다. 짧은 헵타머 펩타이드가 바람직한 경우, 조성물은 일반적으로 하기 기재된 아미노산 서열에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 하나 이상을 함유할 것이다:
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Ala(서열확인 번호: 3)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Cys(서열확인 번호: 4)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Asp(서열확인 번호: 5)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Glu(서열확인 번호: 6)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Phe(서열확인 번호: 7)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Gly(서열확인 번호: 8)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg His(서열확인 번호: 9)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Ile(서열확인 번호: 10)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Lys(서열확인 번호: 11)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Leu(서열확인 번호: 12)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Met(서열확인 번호: 13)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Asn(서열확인 번호: 14)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Pro(서열확인 번호: 15)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Gln(서열확인 번호: 16)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Arg(서열확인 번호: 17)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Ser(서열확인 번호: 18)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Thr(서열확인 번호: 19)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Val(서열확인 번호: 20)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Trp(서열확인 번호: 21)
Arg Arg Trp Trp Cys Arg Tyr(서열확인 번호: 22)
본 발명은 또한 단독 또는 더욱 바람직하게는 하나 이상의 상술한 다른 펩타이드와 배합된 아미노산 서열 Gln Ile Pro Arg Arg Ser Trp Cys Arg Phe Leu Phe(서열확인번호: 52)을 갖는 펩타이드의 사용을 포함한다. 이러한 도데카머의 사용은 더욱 긴 펩타이드가 성공적으로 사용되고 특정의 생물학적으로 작용성인 등가물 펩타이드가 활성이라는 사실 모두를 나타낸다. 이와 같은 활성 등가물 모두는 본 발명의 영역내에 속한다.
본원에 기술된 억제 방법에 사용하기 위한 조성물은 단일의 활성 펩티딜 계열만을 함유할 수 있다. 달리는, 이들은 하나 이상의 펩타이드, 약 40 또는 45개의 뚜렷한 펩타이드를 포함할 수 있다. 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30 또는 45개의 뚜렷한 펩타이드를 함유하는 조성물과 같은 특정의 모든 다양한 조성물이 고려된다.
비록 본 발명이 어떠한 방식으로든 하기 펩타이드에 한정되지 않는다 해도, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Arg(서열확인번호: 1) 및/또는 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Arg Cys(서열확인 번호: 4)를 갖는 펩타이드를 함유하는 조성물이 특히 유용한 것으로 고려된다. 이와 관련하여, 시험관내 활성 이외에, 혈장 반감기 및 안정성을 고려하는 것이 궁극적으로 임상적인 양태에 바람직한 펩타이드를 선택하는데 고려될 수 있음에 주목하는 것이 중요하다. 이들 매개변수에 있어서 상이한 아미노산 치환의 효과는 쉽게 측정되며, 이 결과를 생체내에서 사용하기 위한 최적의 펩타이드 또는 펩타이드 배합물을 설계하는데 사용된다.
RRWWCX(서열확인번호: 23) 서열 성분은 본 발명의 펩타이드의 중요한 특징이다. 그러나, 이것은 본 발명의 영역내에 속하는 특정한 생물학적 작용성 등가물을 배제하지 않는다. 예를 들어, 본 발명자들은 RRWWCX(서열확인번호: 23)에서 첫번째 트립토판이, 단지 활성화가 적절하게 상실되면서, 예를 들면 세린으로 치환됨으로써 교환될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 포함된 등가물의 예는 서열 RRXWCX(서열확인번호: 58)의 펩타이드이다. “등가물 아미노산”은 친수성 또는 소수성 지표가 각각 서로 ±2 이내, 더욱 바람직하게는 ±1 이내, 및 가장 바람직하게는 ±0.5 이내인 아미노산으로서 정의될 수 있다. 물론, “작용성 등가물”일 경우, 펩타이드는, 본원에 기술된 것과 같은 검정을 사용하여 쉽게 측정할 수 있는 바와 같이, 자체의 인터크린 또는 IL-8 억제 활성을 여전히 보유하여야 한다.
본원에 기술된 펩티딜 화합물외에, 본 발명자들은 또한 펩티도미메틱(peptidomimetic)이라 칭해지는 다른 구조적으로 유사한 화합물이 펩타이드 구조의 주요 부위를 모사하도록 제형화될 수 있음을 고려하였다. 이와 같은 화합물은 본 발명의 펩타이드와 동일한 방식으로 사용될 수 있음으로 또한 작용성 등가물이다. 구조적인 작용성 등가물의 생성은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 모델화 기술 및 화학적 설계 기술로 달성할 수 있다. 이와 같은 입체적으로 유사한 구조물 모두는 본 발명의 영역내에 포함되는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 사용하기 위한 펩타이드 및 조성물은 각종 상이한 방법중 하나로 제조할 수 있다. 본 발명에 따라서 펩타이드를 제조하기 위한 한가지 바람직한 방법은 자동화 펩타이드 합성법에 의한 것으로 고려된다. 합성 펩타이드는 자동화 펩타이드 합성기를 사용하여 직접 제조할 수 있으며, 이의 작동 기술은 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이 방법은 예를 들어 특정한 펩타이드가 치료 용도로 선택되는 경우, 주어진 펩타이드를 다량 제조하는데 일반적으로 바람직한 방법중 하나이다.
억제 펩타이드, 및 이의 생물학적 작용성 등가물을 제조하기 위한 다른 바람직한 방법은 전체 내용을 본원에서 참조로 특수하게 도입한 문헌[참조: Houghten et al.(1991) 및 국제 특허출원 제PCT WO 92/09300호]에 기술된 바와 같은 복합적인 펩타이드 라이브러리 방법을 사용하는 것이다. 이 방법은 하나 이상의 위치에 각종 상이한 아미노산이 존재하는 RRWWC와 같은, 실질적으로 예정된 서열을 갖는 다수의 펩타이드를 제조 및 분석하는 데 특히 유용하다. 이들 방법은 본 발명에 따라서 조성물의 제형에 직접 사용하기 위한 펩타이드 혼합물을 합성하거나 연속적인 개개 합성을 위해 특별히 활성적인 펩타이드를 동정하는데 사용될 수 있다.
경우에 따라, 펩타이드는 또한 분자 생물학적 수단 및 펩타이드를 발현하는 재조합 숙주 세포로부터 수득된 “재조합체” 펩타이드에 의해 제조될 수 있다. 이를 달성하기 위해, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 목적한 펩타이드 서열을 기본으로 하는 특정한 올리고뉴클레오타이드를 제조한 후, 이 올리고뉴클레오타이드를 현재 시판되는 많은 발현 벡터 중 어느 하나와 같은 발현 벡터내에 삽입시킨다. 이어서, 이 벡터를 사용하여 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포를 형질전환시키는데, 이 경우 숙주 세포는 소위 재조합체 펩타이드 버젼의 발현을 직접 유도할 것이고, 이후 재조합 숙주 세포로부터 펩타이드가 정제될 수 있다. 이 방법은 당해 분야의 표준 기술이다[참조: Sambrook et al., 1989].
[도면의 간단한 설명]
하기 기술하는 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며, 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함되었다. 본 발명은 본원에 나타낸 특수한 양태의 상세한 기술과 함께 하기의 도면 하나 이상을 참조함으로써 더욱 잘 이해될 것이다.
제1도는 Ac-RRWWCX(서열확인번호: 23) 계열에 의한 결합 억제를 도시한 것이다. Ac-RRWWC(서열확인번호: 56)의 구조와 6번째 위치내에 20개의 표준 단백질 아미노산중 하나를 갖는 20개의 펩타이드를 시험하였다. x축 상에서의 표시는 카복시-말단 위치(서열확인번호: 1 및 24 내지 42)에서의 잔기를 나타낸다. 이 연구에서, 호중구는 1pM의125I-표지된 IL-8 및 각각의 20μM 펩타이드와 함께 항온처리한다.
제2도는 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)에 의한 IL-8 결합 억제를 도시한 것이다. 여기서는 0.1%의 BSA를 함유하는 0.2ml의 PBS중의 호중구(1 × 106)를 1nM의125I-표지된 IL-8 및 증가하는 농도의 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)과 함께 4℃에서 90분 동안 항온처리한다. 이 데이타는 4 회연구의 대표적인 값이다.
제3(a)도는 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 존재하에서 포화 연구, 런던 I을 사용하여 계산한 최상의 곡선(Best Fit Curve Calculated Using London I)을 갖는 결합 등온식을 도시한 것이다. 결합 검정은 펩타이드(○)의 부재 및 10μM(●), 20μM(▽), 또는 40μM(▼)의 펩타이드의 존재하에서125I-표지된 IL-8의 농도를 증가시키면서 수행한다. 각각의 데이타 점은 표지되지 않은 과량의 IL-8의 존재하에서 비특이적 결합을 전체 결합으로부터 감하여 계산한 특이적 결합을 나타낸다.
제3(b)도는 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 존재하에서 포화 연구, 스캐차드 플롯(Scatchard Plot)을 도시한 것이다. 결합 검정은 펩타이드(○)의 부재 및 10μM(●), 20μM(▽), 또는 40μM(▼)의 펩타이드의 존재하에서125I-표지된 IL-8의 농도를 증가시키면서 수행한다.
제4도는 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 존재하에서 포화 연구를 도시한 것이다. 여기서, 호중구는 1nM의125I-표지된 IL-8 및 증가하는 농도의 표지되지 않은 IL-8과 함께 10μM의 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 존재(●) 또는 부재(○)하에서 항온처리한다.
제5도는 호중구에 대한 IL-8, C5a, 및 류코트리엔 B4의 결합에 미치는 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 효과를 도시한 것이다. 결합검정은 1nM의125I-표지된 IL-8 (●), 0.25nM의125I-표지된 C5a(▽), 또는 0.4nM의3H-표지된 류코트리엔 B4(▼) 및 증가하는 농도의 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)를 사용하여 수행한다. 다수의 비교를 위해 표준편차를 분석한다. 현저한 차이가 있을 경우, 펩타이드의 부재하에서의 결합과 펩타이드의 존재하에서의 결합 차이를 셰페 시험(Sheffes test)을 사용하여 시험한다; ★★★, p ＜ 0.001.
제6도는 세포독성 시험을 도시한 것이다. 크롬-표지된 호중구를 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 농도를 증가시키면서 4℃에서 90분 동안(●) 또는 1%의 BSA를 함유하는 RPMI-1640 매질 중에서 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 농도를 증가시키면서 37℃에서 30분 동안(○) 항온처리한다. 다수의 비교를 위해 표준편차를 분석한다. 현저한 차이가 있을 경우, 펩타이드의 부재하에서의 분석(%)과 펩타이드의 존재하에서의 분석(%)간의 차이를 셰페 시험(Sheffes test)을 사용하여 시험한다; ★★★, p ＜ 0.001.
제7도는 호중구 화학주성에 미치는 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 효과를 도시한 것이다. 화학주성은 상부 및 하부 챔버 모두에서 증가하는 농도의 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 존재하에서 수행한다. 하부 챔버에 가해진 자극제는 10nM의 IL-8(●), 10nM의 fMLP(■), 또는 대조군으로서의 매질 단독(○)이다. 다수의 비교를 위해 표준편차를 분석한다. 현저한 차이가 있을 경우, 펩타이드의 부재하에서 이동한 거리와 펩타이드의 존재하에서 이동한 거리의 차이를 셰페 시험(Sheffes test)을 사용하여 시험한다; ★, 0.01 ＜ P ＜ 0.05, ★★★, p ＜ 0.001.
제8도는 β-글루쿠로니다제 방출에 미치는 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 효과를 도시한 것이다. 사이토칼라신(cytochalasin) B로 전처리한 호중구를 100nM의 IL-8(●), 100nM의 fMLP(■), 100nM의 C5a(▽) 또는 100nM의 류코트리엔 B4(▼)와 함께 증가하는 농도의 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 존재하에서 어떠한 자극제(○)도 없이 37℃에서 30분동안 항온처리한다. 상층액의 β-글루쿠로니다제 활성은 기질로서 페놀프탈레인-글루쿠론산을 사용하여 측정한다. 다수의 비교를 위해 표준편차를 분석한다. 현저한 차이가 있을 경우, 펩타이드의 부재하에서 이동한 거리와 펩타이드의 존재하에서 이동한 거리 차이를 셰페 시험(Sheffes test)을 사용하여 시험한다; ★, P ＜ 0.05, ★★, P ＜ 0.01, ★★★, p ＜ 0.001.
제9도는 모든 D-아미노산 Ac-RRWWCRX-NH2(서열확인번호: 2) 계열에 의한 결합 억제를 도시한 것이다. Ac-RRWWCR(서열확인번호: 1)은 D-아미노산을 사용하여 합성하고, 가해진 각각의 20개의 표준 단백질 D-아미노산을 7번째 위치(서열확인번호: 3 내지 22)에 부가한다. x 축에서의 표시는 카복시 말단 위치에서의 잔기를 나타낸다. 결합 연구는 10μM의 각각의 펩타이드를 사용하여 수행한다. L-아미노산으로 제조한 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)은 대조군으로서 사용한다.
제10도는 사람 호중구에 대한 GRO 및 MIP2β의 결합을 억제하는 Ac-RRWWCX(서열확인번호: 23)을 도시한 것이다. 방사선 표지된 MIP2β 및 GRO/MGSA를 다양한 농도의 Ac-RRWWCR-NH2와 혼합하고, 실온에서 15분 동안 항온처리한다. 호중구 현탁액(0.1%의 BSA를 함유하는 160㎕의 PBS중 1 x 106세포)을 40㎕의 혼합물에 가하고, 빙상에서 90분 동안 항온처리한다. 세포에 결합된 방사활성은 오일 층을 통한 원심분리에 의해 유리 방사활성으로부터 분리한다. 결합 억제(%)는 하기 식으로부터 계산한다:
상기식에서,
B는 펩타이드 존재하에서의 결합 방사활성이고,
T는 펩타이드 부재하에서의 결합 방사활성이며,
NSP는 과량의 표지되지 않은 리간드의 존재하에서의 결합 방사활성이다.
[바람직한 양태의 상세한 설명]
[CXC 인터크린, IL-8 작용 및 억제 펩타이드]
IL-8은 호중구 활성화 분자로서 동정되었다[참조: Schroder et al., 1988; Preveri et al., 1988; Yoshimura et al., 1987]. 이것은 세균 리포폴리사카라이드(LPS), 종양 괴사 인자 또는 인터류킨 1과 같은 자극제에 의해 단핵세포-대식세포 및 내피세포에 의해 주로 생산되며, fMLP, C5a 또는 류코트리엔 B4와 같은 화학주성 효능제와 함께 일반적인 호중구 활성화 특성을 공유한다.[참조: Baggiolini et al., 1992]. IL-8은 호중구의 화학주성 및 효소 방출과 호흡성 파열(respiratory burst)을 자극할 수 있다. IL-8은 모두 자체의 N-말단 영역내에 CXC 서열 모티프를 갖는 CXC 인터크린으로 명명된 펩타이드 분자 부류의 한 구성원이다. CXC 인터크린은 또는 GRO, MIP2α 또는 MIP2β 및 더욱 최근에는 ENA78을 포함한다.
IL-8의 작용은 호중구 표면 막 상의 IL-8 수용체에 의해 중재된다. 최근의 연구에서는 IL-8의 2개 이상의 뚜렷한 수용체에 결합하는 반면, 인터크린 부류의 다른 구성원 대부분, 예를 들어 GRO 및 MIP2β는 고 친화성으로 수용체중 하나에 결합함이 밝혀졌다[참조: Holmes et al., 1991; Murphy Tiffany, 1991; LaRosa et al., 1992; Cerretti et al., 1993]. 이들 수용체는 다른 화학주성의 효능제에 대한 수용체와는 상이하다[참조: Dohlman et al., 1987].
IL-8은 몇몇 종류의 관절 질병 환자로부터의 관절액에서[참조: Brennan et al., 1990], 흉막 삼출액 환자의 흉막 영역내에서[참조: Miller & Idell, 1993], 및 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 환자로부터의 폐 부종액에서[참조: Miller et al., 1992] 고 농도로 발견되었다. 증가된 IL-8 농도는 또한 낭포성 섬유증 환자에 대한 각종 최근 연구에서 명백하게 입증되었다[참조: Richman-Eisenstat et al., 1993; McElvaney et al., 1992; Nakamura et al., 1992; Bedard et al., 1993].
IL-8은 호중구를 활성화시키며, 비록 호중구가 강력한 항미생물성 세포일지라도, 호중구는 또한 특정 효소의 방출을 통해 상당한 조직 손상을 유발시킬 수 있다. 따라서, IL-8은 상기 및 다른 염증 질병의 발병에 중요한 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명자들은 Il-8은 상기 다른 염증 질병의 발병에 중요한 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명자들은 Il-8 작용의 조절이 다양한 질병 및 발병 상태, 특히 ARDS 및 낭포성 섬유증을 제어하기 위한 우수한 방법이라고 가정하였다.
최근에, IL-8 작용을 변형시키기 위해 시도한 각종 연구 결과가 보고되었다. 이것은 IL-8 합성의 억제에 있어서 일부의 성공을 나타내는 연구를 포함한다[참조: Standiford et al., 1992; Lam et al., 1990]. 또한, 항-사람 IL-8이 면역학적 손상을 겪는 쥐에 있어서 폐 염증을 완화시키는 것으로 보고되었다[참조: Mulligan et al., 1993]. 낭포성 섬유증 환자의 기도내에서 IL-8 분비는 호중구 엘라스타제의 분비 류코프로테아제 억제제에 의해 감소된다[참조: McElvaney et al., 1992]. 또한, Il-8 생산은 LPS-자극된 사람 전혈내에서 산소 라디칼 스캐빈저에 의해 억제됨이 밝혀졌다[참조: DeForge et al., 1992]. 최종적으로, 2개의 사이토킨, 즉 인터페론 γ[참조: Cassatella et al., 1993a; 1993b] 및 인터류킨 4[참조: Standiford et al., 1990]은 IL-8의 합성을 억제한다. 그러나, 이와 같은 작업은 특히 효과적인 IL-8 억제제 또는 다른 것보다도 특정의 호중구 반응을 우선적으로 억제할 수 있는 억제제를 생산할 수 없다.
연구는 또한 IL-8과 이의 수용체의 상호작용에 대해 수행되었다. 이것은 IL-8 분자의 부위에 상응하는 구조를 갖는 특정한 펩타이드 억제제를 동정할 수 있게 하였다. 예를 들어, 가일(Gayle) 및 연구원들은 토끼 IL-8 수용체의 아미노-말단에서 44개의 아미노산이 IL-8 결합 및 작용의 적절히 우수한 억제제임을 밝혔다[참조: Gayle et al., 1993]. 본 발명자들은 합성 펩타이드 특히, IL-8 아미노 말단 펩타이드가 호중구 및 호중구 화학주성에 대한 IL-8의 결합을 억제함을 밝혔다[참조: Miller et al., 1990; Miller et al., 1993]. N-말단 펜타펩타이드 IL-8 억제제가 또한 보고되었다[참조: Goodman et al., 1991].
그럼에도 불구하고, IL-8 분자의 구조에 대한 지식으로부터 효과적인 펩타이드 억제제는 아직 개발되지 않았다. 따라서, 이 목적을 이루기 위해, 본 발명자들은 400개 그룹의 헥사펩타이드의 라이브러리를 선별함으로써 IL-8 억제 활성을 위한 각종의 다른 펩타이드 조성물을 검정하였다. 이 선별 검정에서,125I-표지된 인터류킨-8(10-12M)을 100μM의 펩타이드와 혼합한 후, 호중구에 가하여 4℃에서 90분동안 항온처리하였다. 결합된 방사활성은 파라핀과 실리콘 오일 혼합물의 밀도 쿠션(dense cushion)을 통해 원심분리하여 결합되지 않은 것으로부터 분리하고, 호중구에 결합된125I를 γ 조사 분광계내에서 계수하였으며, 그 결과는 억제된 IL-8 결합의 %로써 나타냈다.
이 연구에서, 서열 RRWWCX(서열확인번호: 23)(여기서, 말단 위치는 특정한 아미노산일 수 있다)의 헥사머는 효과적인 IL-8 억제제임이 밝혀졌다. 비록 특정한 RRWWCX-유형의 펩타이드가 이미 항-스타필로코커스 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다해도[참조: Houghten et al., 1991], 이들 펩타이드가 항-사이토킨 또는 항-염증성 활성을 지닌다고 제시하는 다른 작용성 특성은 보고되어 있지 않다. 본 발명자는 또한 RRWWCR이 사람 호중구에 대한 GRO 및 MIP2β의 결합을 감소시킴으로써 입증되는 바와 같이, GRO 및 MIP2와 같은 다른 CXC 인터크린을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.
비록 모든 RRWWCX(서열확인번호: 23) 계열의 펩타이드가 항-IL-8 활성을 지닌다해도(표 1A 및 1B), 펩타이드 RRWWCR(서열확인번호: 1)이 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 아미노-말단 아세틸 그룹 및 카복시-말단 아미노 그룹을 갖는 이러한 형태의 펩타이드(Ac-RRWWCR-NH2: 서열확인번호: 1)는, 본 연구의 논점중 하나가 되는, 보다 긴 단백질 서열중에 존재하는 펩타이드와 유사하도록 변형된다.
Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)는 외견상 KI값이 대략 10μM로써 호중구에 대한125I-표지된 IL-8의 특이적 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 동일한 펩타이드의 아세틸화되지 않은 유형보다 거의 2배 효과적인 것으로 밝혀졌다. 정확한 KI값은 양성적 협동성의 존재에 따라 수득될 수 없다. 컴퓨터 프로그램 런던 I으로 분석할 경우, 펩타이드의 부재하에서 IL-8의 결합 등온은 1-부위 모델에 가장 일치한다. 스캐차드 플롯에서 더욱 낮은 IL-8 농도 데이타의 한가지 가능한 해석은 저농도의 IL-8에서 고 친화성 결합이 협동적으로 차단된다는 것이다. 그러나, 최근 연구에서는 IL-8이 친화성이 거의 유사한 2개의 뚜렷한 부류의 IL-8 수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다[참조: Lee et al., 1982; Schumacher et al., 1992]. 따라서, 1-부위 모델로서 이 결합 부위의 평가된 Bmax는 2개 부류의 수용체의 총 Bmax를 나타내며 평가된 Kd는 이들 수용체에 일반적인 것으로 여겨진다.
펩타이드의 존재하에서 결합 등온은 2-부위 모델에 가장 일치한다. Ac-RRWWCR-NH2의 존재하에서 결합 등온의 분석은 이 펩타이드가 2개 부류의 수용체에 대한 IL-8의 결합을 상이하게 억제한다는 것을 나타낸다. 결합 매개변수의 평가된 값은 수용체중 한 부류의 친화성이 10μM의 펩타이드에 의해 억제됨을 나타내며, 이는 경쟁적 억제임을 제시한다. 고 농도의 펩타이드는 다른 부류의 수용체를 비-경쟁적으로 억제하는데 필요하다.
본 발명의 억제 펩타이드의 활성은 IL-8에 대해 특이적이다. Ac-RRWWCR-NH2는 호중구에 대한 C5a 또는 류코트리엔 B4의 결합, 포르밀-L-Met-L-Leu-L-Phe(fMLP)에 의해 유도된 화학주성, 또는 fMCP, C5a 또는 류코트린엔 B4에 의해 유도된 β-글루쿠로니다제 방출을 억제하지 않는다. 이것은 또한 호중구 화학주성 또는 효소 방출을 유발하는 고유 능력을 갖지 않는다. 이러한 관찰은 Ac-RRWWCR-NH2와 같은 펩타이드가 이의 수용체 결합을 조절한 결과 IL-8에 의해 유도된 사람 호중구 활성을 강력하게 억제할 수 있음을 제시한다.
또한, Ac-RRWWCR-NH2구조에 기초한 헥사머 및 헵타머 펩타이드는 화학주성보다 효소 방출을 우선적으로 억제하는 것으로 고려된다. 더우기, 본원에서 Ac-RRWWCR-NH2는 50μM의 농도에서 10nM의 IL-8에 의해 유도된 호중구 화학주성 및, 비록 10배 이상의 IL-8이 효소 방출을 유발시키는데 요구된다해도, 2μM에서 β-글루쿠로니다제 방출을 현저히 억제하는 것으로 밝혀졌다. 화학주성보다 저 농도에서 효소 방출의 우선적인 억제는 이러한 유형의 펩타이드가 성인 호흡 곤란 증후군 환자의 폐 손상 치료에 이상적임을 밝히는 특히 중요하고도 놀라운 발견이다.
상기 발견은 또한 뚜렷한 호중구 작용이 상이한 부류의 수용체에 대한 IL-8의 결합을 필요로 할 수 있음을 나타낸다. 비록 본 발명의 용도로는 그 자체로서 중요하지 않다해도, 이것은 또한 본 발명의 펩타이드가 IL-8 수용체 및 호중구 작용을 추가로 설명하기 위한 시험적 도구로서 사용하기에 적합하도록 한다.
이어서, 본 발명자들은 모두 D-아미노산을 갖는, Ac-RRWWCRX-NH2(서열확인번호: 2)를 포함하는 펩타이드의 제2 셋트의 억제 활동을 시험하였다. 또한, 모든 RRWWCRX(서열확인번호: 2) 계열의 펩타이드는 항-IL-8 활성을 지니는 것으로 밝혀졌다(표 5A 및 5B). 그러나, 펩타이드 Ac-RRWWCRC-NH2(서열확인번호: 4)는 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)과 같은 억제제보다 효능이 거의 4배인 가장 우수한 억제제인 것으로 밝혀졌다. 이러한 관찰은 포유동물 프로테아제가 D-아미노산 펩타이드 및 단백질을 분해할 수 없기 때문에 매우 중요하다[참조: Togo et al., 1989]. 따라서, D-아미노산 펩타이드 억제제는 생체내에서 더욱 긴 반감기를 지니는 것으로 예측된다.
각종 다른 합성 펩타이드가 또한 표준 검정에서 호중구에 대한 IL-8의 결합을 억제하는 능력에 대해 시험되었다. 이들 펩타이드는 IL-8의 아미노-말단과 상동성이거나, RRWWCR(서열확인번호: 2)내의 6개 잔기중 5개 잔기를 지닌, 단백질 데이타베이스(PIR 또는 Swiss-Prot)내에서 발견된 단백질 서열이다. 후자의 펩타이드는 텍사스의 오스틴 소재의 고성능 계산을 위한 기관에서 CRAY 컴퓨터상에 존재하는 데이타베이스 검색용 IGSUITE 프로그램을 사용하여, RRWWCR(서열확인번호: 1)에 대해 PIR 및 Swiss-Prot 데이타베이스를 검색함으로써 동정되었다. 이 데이타베이스내에는 6개의 아미노산 모두를 포함하는 어떠한 단백질도 존재하지 않는다.
선행 연구에서는 IL-8의 72개 아미노산의 4, 5 및 6 위치에 있는 잔기 Glu, Leu 및 Arg가 호중구에 대한 결합에 중요함이 밝혀졌으며[참조: Clore et al., 1992; Clark-Lewis et al., 1991], IL-8의 아미노 말단 펩타이드가 호중구 및 화학주성에 대한 IL-8의 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌다[참조: Miller et al., 1993]. 따라서, 본 발명자들은 이의 2개의 비-Cys-함유 동족체인, ELRSQSKTY(서열확인번호: 50) 및 ELRMQMKTY(서열확인번호: 51)과 함께 IL-8 동족체 Ac-KELRCQ-NH2(서열확인번호: 54) 및 ELRCQCIKTY(서열확인번호: 49, 인터크린 펩타이드의 특징적인 C-X-C 모티프를 포함)를 시험하였다. 이들 펩타이드는 호중구에 대한 IL-8의 결합을 억제하는 능력을 지니지 않는다.
이어서, 본 발명자들은 단백질 데이타베이스를 검색함으로써 RRWWCR(서열확인번호: 1)가 IL-8과 관련하여 연관된 생리학적 작용을 지닐 수 있는 다른 펩타이드내에서 생성될 수 있는지의 여부를 측정하였다. 2개의 펩타이드가 동정되었고, 이들이 RRWWCR(서열확인번호: 1)내의 6개 잔기중 5개를 함유하고 공지된 단백질 중에 포함되므로 시험용으로 선택되었다. 이들은 GWRRWWCDAVLY(서열확인번호: 53) 및 QIPRRSWCRFLF(서열확인번호: 52)이다. 전자의 펩타이드는 “세포 표면 당단백질 CD11c 전구체-사람 백혈구 부착 수용체 p150, 95 α 쇄”내에 포함되며[참조: Corbi et al., 1990; 수탁번호, A36534/A35543/S00864], 후자는 3′,5′-사이클릭 GMP 포스포디에스테라제 β쇄-소이다[참조: Ovchinnikov et al., 1987; 수탁번호, S00251].
비록 이들 동족체중 하나, 즉 QIPRRSWCRFLF(서열확인번호: 52)가 호중구에 대한 IL-8의 결합을 약 60% 억제한다해도, 이 활성은 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)보다 작다. 이 서열로부터 추출된 단백질, 즉 소 망막의 3′,5′-사이클릭 GMP 포스포디에스테라제는 IL-8 작용에 있어 생리학적 역할을 담당하는 것으로 사료되지 않으나, 이것이 전체적으로 제외될 수는 없다. 이 연구로부터의 가장 중요한 데이타는 RRWWCR(서열확인번호: 1)내의 첫번째 트립토판이 단지 활성화가 적절히 상실되면서 변형될 수 있음을 나타낸다. 다른 펩타이드, GRRWWCDAVLY(서열확인번호: 53)의 활성 상실은 RRWWCR(서열확인번호: 1)내의 마지막 Arg가 Asp로 변화됨으로써, Ac-RRWWCD(서열확인번호: 26)이 단지 최소한으로 활성적이라는 관찰에 의해 입증되는 바와 같이, 호중구에 대한 IL-8의 결합을 억제하는 능력을 현저히 감소시킴을 시사한다.
따라서, 본원에 기재된 실시예는 호중구에 대한 Iℓ-8의 결합을 억제할 수 있는 신규 펩타이드 계열의 동정 및 호중구 활성화를 상세히 나타낸다. RRWWCX(서열확인번호: 23) 및 RRWWCRX(서열확인번호: 2) 유형의 펩타이드 억제제는 이들의 길이가 단지 6개 또는 7개 잔기이고 D-아미노산 동족체가 또한 활성적이라는 점에서 이미 기술된 억제제보다 특히 유리하다. 이러한 부류의 억제제가 성인 호흡 곤란 증후군과 같이 IL-8의 비제한적인 작용에 의해 유발된 질병의 치료에 유용할 것이라는 사실이 고려된다. 이들 억제제는 용이하게 억제되지 않는 화학주성을 통해 호중구를 폐내로 도입시킬 것이나, 이후 이들은 유해한 효소 방출을 우선적으로 억제할 것이라는 뚜렷한 잇점을 가진다[참조: McGuire et al., 1982].
이들의 다수의 다양한 치료학적 용도외에, 본 발명의 펩타이드 및 조성물은 다른 양태로서의 용도를 지닌다. 이들은 예를 들면, 각종 생검정시의 용도, 예를 들어 IL-8 억제제 또는 호중구 억제제의 검정시 양성 대조군으로서의 용도; IL-8 수용체 상호작용 및 작용을 추가로 설명하는데 있어서의 용도; 항체 생성 등을 포함한다.
[생물학적 작용성 등가물]
RRWWCXX-유형 펩타이드의 특정한 생물학적 작용성 등가물은 본 발명의 영역내에 포함된다. 생물학적 작용성 등가물 아미노산의 개념은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며, 단백질 또는 펩타이드 구조내에서 변형 및 변화가 수행될 수 있고 유사하거나 바람직한 특성을 갖는 분자를 수득할 수 있다는 인식으로 구현된다.
그러나, 생물학적 작용성 등가물 단백질 또는 펩타이드의 정의에 있어서, 분자의 정의된 부위내에서 이루어질 수 있는 변화의 수가 한정되어 있고 또한 허용가능한 수준의 동일한 생물학적 활성을 지닌 분자가 수득되며 주요 활성 부위 또는 구조적 활성 잔기가 변할 수 없다는 한계 개념은 고유한 것이라는 사실을 당해 분야의 숙련가들은 잘 이해한다. 따라서, 생물학적 작용성 등가물 펩타이드는 본원에서 거의 또는 전부의 아미노산이 아닌, 일부 아미노산이 치환될 수 있는 펩타이드로서 정의된다. 특히, 헥사머 또는 헵타머 펩타이드가 관련되는 경우, 약 2개 또는 더욱 바람직하게는 1개의 아미노산 변화만이 주어진 펩타이드내에서 일어날 수 있는 것으로 고려된다. 물론, 상이한 치환체를 갖는 다수의 뚜렷한 펩타이드가 쉽게 제조되어 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
펩타이드내에서 제한된 수의 잔기 변화와 관련하여, 수용체 및 세포와 같은 구조물에 대한 상호작용성 결합 능력 또는 이들 부위에 결합하기 위해 다른 분자와 경쟁하는 능력으로 측정될 수 있는 바와 같이, 특정한 아미노산이 명백한 작용의 상실없이 다른 아미노산으로 치환될 수 있음은 공지되어 있다. 이것은 자체의 생물학적 작용성 활성을 정의하는 단백질 또는 펩타이드의 상호작용적 및 경쟁적 능력이므로, 특정한 아미노산 치환이 펩타이드 서열(또는, 물론, 이의 주요한 DNA 암호화 서열)에서 일어날 수 있으며, 또한 유사한 또는 심지어 개선된 특성을 갖는 펩타이드가 수득된다.
아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적인 유사성, 예를 들면 이의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 한다. 아미노산 측쇄 치환체의 크기, 형태 및 유형의 분석은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 모두 양성적으로 하전된 잔기이고; 알라닌, 글라이신 및 세린이 모두 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신이 모두 일반적으로 유사한 형태를 지님을 나타낸다. 따라서, 이러한 고려를 기준으로 할때, 본원에서는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글라이신 및 세린; 및 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 생물학적 작용성 등가물로서 정의한다.
더욱 정량적인 변화를 수행하기 위해, 아미노산의 수치법적 지표를 고려할 수 있다. 개개의 아미노산은 자체의 소수성 및 전하 특성을 기준으로 하여 수치법적 지표가 지정되어 있으며 이는 다음과 같다:
이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(글루탐산)(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(아스파르트산)(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질상에서 상호작용성 생물학적 작용을 부여하는데 있어서 아미노산의 수치법적 지표의 중요성은 일반적으로 당해 분야에서 인식되어 있다[참조: Kyte & Doolittle, 1982, 본원에서 참조로 인용]. 특정한 아미노산은 유사한 수치법적 지표 또는 지수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 공지되어 있다. 수치법적 지표를 기준으로 변화시키는데 있어서, 수치법적 지표가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 수치법적 지표가 ±1 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, 수치법적 지표가 ±0.5 이내인 아미노산 치환이 더욱 특히 바람직하다.
유사한 아미노산의 치환이 또한 본원에서 참조로 인용한 미합중국 특허 제 4,554,101호에 기술된 바와 같이 친수성을 기준으로 하여 이루어질 수 있다. 미합중국 특허 제4,554,101호에는 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 대해 지정되었다:
아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(아스파르트산)(+3.0 ± 1); 글루타메이트(글루탐산)(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 프롤린(-0.5 ± 1); 트레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-0.1); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
아미노산이 유사한 친수성 값을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 또한 생물학적 작용성 등가물 단백질 또는 펩타이드가 수득됨은 잘 이해된다. 유사한 친수성 값을 기준으로 변화시키는데 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, 친수성 값이 ±1 이내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하며, 친수성 값이 ±0.5 이내인 아미노산의 치환이 더욱 특히 바람직하다.
[약제학적 제형]
본 발명의 펩타이드 및 조성물은 IL-8과 같은 CXC 인터크린 또는 호중구가 관여된 각종 질병 및 질환 또는 적절하지 않거나 증가된 염증 반응이 있는 각종 질병 및 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 특히 천식, 기관지염, 낭포성 섬유증 및 ARDS와 관련된 질병과 같은 폐 염증의 치료에 특히 적합하다. ARDS 및 낭포성 섬유증과 같은 질병을 치료하기 위해, 에어로졸제 또는 흡입제를 또한 사용할 수 있으나, 정맥내, 근육내 또는 피하내 주사와 같은 비경구 투여가 가장 바람직한 투여 경로인 것으로 고려된다. 스프레이제, 에어로졸제 및 흡입제는 소적이 충분히 미세하고 크기가 균일하여 합제가 세기관지에 이르는 경우에만 효과적이다. 입자 크기는 치료제를 에어로졸 또는 스프레이에 의해 투여하는 경우에 매우 중요하다. 폐강내로 침투시키기 위한 최적 입자 크기는 0.5 내지 7㎛이다. 미세한 합제는 가압된 에어로졸에 의해서 제조되므로, 이의 사용은 매우 유리하다. 이와 같은 치료법 및 치료 제형은 하기 실시예 VIII에 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 각종 임상적 환경에서 염증을 치료하는데 사용될 수 있으므로, 다양한 형태의 약제학적 펩타이드 제형이 고려된다. 본 발명의 치료학적 또는 약리학적 조성물은, 폐의 치료 또는 기타 치료에 상관없이, 일반적으로 약제학적으로 허용되는 매질중에 용해되거나 분산된 유효량의 비교적 작은 인터크린- 또는 IL-8-억제 펩타이드 또는 펩타이드들을 함유한다. 어구 “약제학적으로 허용되는”은 사람에게 투여하는 경우 알레르기, 독성 또는 기타 부작용을 일으키지 않는 분자 자체 및 조성물을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 매질 또는 담체는 특정의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항세균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이와 같은 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 특정의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 부적합성이지 않는 한, 치료학적 조성물에서의 이의 용도가 고려된다.
보충적인 활성 성분이 또한 본 발명의 치료학적 조성물내에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 인터크린-, IL-8- 및 호중구-억제 펩타이드를 또한 IL-8-유도된 N-말단 펩타이드, IFN-γ, 산소 라디칼 스캐빈저 등과 같은 기타 제제와 배합하여 치료용의 펩타이드 콕테일을 제조할 수 있다.
활성 성분으로서 인터크린-, IL-8- 및 우선 펩타이드(dextrorotatorypeptide)를 포함하는 호중구-억제 펩타이드(들)을 함유하는 약제학적 조성물 제제 또는 약리학적 조성물 제제는 본 발명의 관점에서 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이다. 경우에 따라, 이와 같은 조성물은 주사가능한 형태로서, 액체 용액 또는 현탁제; 주입전 액체 중의 액제 또는 현탁제용으로 적합한 고체형; 경구 투여용의 정제 또는 기타 고체; 시간 방출형 캡슐제; 또는 크림제, 로션제 및 구강세척제를 포함하는, 현재 사용되는 특정한 다른 형태 및 실시예 VIII의 흡입제 및 에어로졸제로 제조될 수 있다.
유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 펩타이드 및 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로즈와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 수중에서 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 및 오일중에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 포함한다.
주사용으로 적합한 멸균 액제는 각종 질병의 치료에 유용한 것으로 고려되며, 혈류내 또는 염증의 정확한 부위내에 투여될 수 있다. 주사 용도로 적합한 약제학적 형태는 주사가능한 멸균 액제 또는 분산제의 즉시 사용형 제제를 위한 멸균산제 및 멸균 수성 액제 또는 분산제를 포함한다. 모든 경우에 있어서, 상기 형태는 멸균되어야 하며 주사하기가 용이할 정도의 유액이어야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건하에서 적합해야 하며 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야만 한다.
펩타이드(들)은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가염(펩타이드의 유리 아미노 그룹에 의해 형성됨)을 포함하며, 이는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산에 의해 형성된다. 유리 카복실 그룹에 의해 형성된 염은 또한 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 기원한다.
담체는 또한 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 포함하는 용매 또는 분산 매질, 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물의 사용에 의해, 분산제의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용은 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 각종 항세균제 및 항진균제에 의해 방지할 수 있다. 많은 경우에, 예를 들면 슈가 또는 염화나트륨과 같은 등장성 제제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물 중에서 사용함으로써 달성시킬 수 있다.
멸균 주사가능한 액제는 필요량의 활성 화합물을 적절한 용매 중에, 필요한 경우 상기 열거한 다양한 다른 성분과 함께 혼입시킨 후, 멸균 여과함으로써 제조한다. 일반적으로, 분산제는 각종 멸균된 활성 성분을 상기 열거한 성분으로부터 필요한 다른 성분과 염기성 분산 매질을 함유하는 멸균 비히클내에 혼입함으로써 제조한다. 주사가능한 멸균 액제 제조용의 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균-여과된 이의 액제로부터 활성 성분과 추가의 바람직한 성분의 산제를 수득하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
근육내 주사용의 더욱 또는 고도로 농축된 액제의 제조도 또한 고려된다. 이와 관련하여, 용매로서 DMSO의 사용은 고농도의 활성 펩타이드(들) 또는 제제를 작은 면적으로 전달하면서 매우 빠르게 침투시키기 때문에 바람직하다.
크림제, 연고제 및 겔제와 같은 국소용의 펩타이드 제형이 또한 고려된다. 유성 또는 수-용성 연고 기재의 제조도 역시 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 이러한 조성물은 식물성 오일, 동물 지방 및 더욱 바람직하게는, 석유로부터 수득된 반고체 탄화수소를 포함할 수 있다. 사용된 특정 성분은 백색 연고제, 황색 연고제, 세틸 에스테르 왁스, 올레산, 올리브 오일, 파라핀, 석유, 백색 석유, 경랍, 전분 글리세라이트, 백색 왁스, 황색 왁스, 라놀린, 무수 라놀린 및 글리세릴 모노스테아레이트를 포함할 수 있다. 글리콜 에테르 및 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥실 40 스테아레이트 및 폴리소르베이트를 포함하는 각종 수-용성 연고 기재를 또한 사용할 수 있다. 경우에 따라, 경피 패치, 이온 전기도입 또는 전기 전달을 사용함으로써 피부를 통한 전달도 이용할 수 있다.
완충된 안과용 액제가 또한 본 발명의 영역내에 포함된다. 이것은 증가된 망막 맥관형성과 관련된 질병으로 고생하는 환자와 관련하여 사용될 수 있다. 완충화는 펩타이드가 유발할 수 있는 pH 변화에 기인하여 필요하다. 안과 제제는 통상적인 약제학적 시행에 따라서 제조될 수 있다[참조: “Remington′s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, 1488 내지 1501 페이지(Mack Publishing Co., Easton, PA)].
적합한 안과 제제는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 액제, 현탁제 또는 연고제중에 본원에 기술된 신규한 디펩타이드, 펩타이드 또는 제제를 약 0.01 내지 약 1중량%, 및 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.5중량%의 농도로 함유한다. 안과제제는 바람직하게는 경우에 따라, 추가 성분(예: 방부제, 완충제, 강장제, 산화방지제 및 멸균제, 비음이온성 습윤제 또는 청정제, 점도-증가제 등)을 함유하는 멸균 완충 액제의 형태일 것이다.
이와 같은 액제중에 사용하기 위한 적합한 방부제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로부탄올 및 디메로살 등을 포함한다. 적합한 완충제는 붕산, 중탄산나트륨 및 중탄산칼륨, 붕산나트륨 및 붕산 칼륨, 탄산나트륨 및 탄산칼륨, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 비포스페이트 등을 약 pH 6 내지 pH 8 및 바람직하게는 약 pH 7 내지 pH 7.5를 유지시키기에 충분한 양으로 포함한다. 적합한 강장제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 덱스트로즈, 글리세린, 염화칼륨, 프로필렌 글리콜 및 염화나트륨 등이며, 안과 액제의 염화나트륨 등량제는 0.9 ± 0.2% 범위내이다. 적합한 산화방지제 및 안정화제는 아황산나트륨, 나트륨 메타설파이트, 나트륨 티오설페이트 및 티오우레아 등을 포함한다. 적합한 습윤제 및 청정제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 282 및 티록사폴을 포함한다. 적합한 점도-증가제는 덱스트란 40, 덱스트란 70, 젤라틴, 글리세린, 하이드록시에틸 셀룰로즈, 하이드록시메틸프로필셀룰로즈, 라놀린, 메틸셀룰로즈, 석유, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈 및 카복시메틸셀룰로즈 등을 포함한다.
제형화시, 치료제는 용량 제형과 적합한 방식으로, 약리학적으로 효과적인 양으로서 투여될 것이다. 제형은 상술한 주사가능한 액제형과 같은 다양한 용량형으로 용이하게 투여되나, 약물 방출 캡슐제 등을 또한 사용할 수 있다.
펩타이드를 분산시키는데 필요한 최소 용적의 조성물이 전형적으로 사용된다. 투여용의 적합한 양생법은 또한 가변적이나, 초기에 화합물을 투여하여 결과를 모니터한 후 추가의 간격으로 조절된 용량을 추가로 주입하는 것이 대표적이다. 예를 들어, 비경구 투여에는 적합하게 완충된 및 경우에 따라, 등장성 수성 액제를 제조하여 정맥내, 근육내, 피하내 또는 심지어 복강내 투여에 사용한다. 1회 용량을 1mL의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000mL의 피하 주입액에 가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다[참조: “Remigton′s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition, 1035-1038 및 1570-1580 페이지].
특정 양태에서, 활성 화합물은 경구 투여될 수 있다. 이것은 일반적으로 분해성 효소에 의한 단백질 분해에 대해 내성이거나 내성이 된 제제용으로 고려된다. 이와 같은 화합물은 우선 펩타이드; 화학적으로 고안되거나 변형된 제제; 및 펩티다제와 리파제 분해를 방지하기 위한 시간 방출형 캡슐제로서의 펩타이드 및 리포좀 제형을 포함하는 것으로 고려된다.
경구 제형은 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 배합된 화합물; 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐제내에 봉입된 화합물; 정제내에 압착된 화합물; 또는 식이 식품에 직접 혼입된 화합물을 포함할 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되어 섭취가능한 정제, 부컬 정제(Buccal table), 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁제, 시럽제 및 와이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다. 이와 같은 조성물 및 제제는 일반적으로 활성 화합물 0.1% 이상을 함유하여야 한다. 조성물 및 제제의 %는 물론 가변적일 수 있으며, 통상적으로 단위당 약 2 내지 약 60중량%일 수 있다. 이와 같이 치료학적으로 유용한 조성물중 활성 화합물의 양은 적합한 용량이 수득되는 양이다.
정제, 트로키제, 환제 및 캡슐제 등은 또한 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 및 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 및 가할 수 있는 슈크로즈, 락토즈 또는 사카린과 같은 감미제 도는 페퍼민트, 동록유 또는 체리 풍미와 같은 풍미제를 함유할 수 있다. 용량 단위형이 캡슐제인 경우, 이는 상기 유형의 물질외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 각종 다른 물질이 피복물로서 또는 용량 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐제는 쉘락, 슈가 또는 이들 모두로 피복시킬 수 있다. 엘릭시르 시럽제는 감미제로서 활성 화합물 슈크로즈, 방부제로서 메틸 및 프로필 파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 풍미와 같은 풍미제를 함유한다. 물론, 특정한 용량 단위형을 제조하는데 사용된 어떠한 물질도 약제학적으로 순수하고 사용된 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 제제 및 제형내에 혼입될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함된다. 당해 분야의 숙련가들은 수반된 실시예에 기술된 기술이 본 발명자에 의해 개발된 기술을 나타내어 본 발명을 시행하는데 있어 잘 작용하도록 하기 위함이라는 사실을 인지해야 하며, 따라서 이의 실행을 위한 바람직한 형식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들에게는, 본 기술의 측면에서, 기술된 특정한 양태내에 많은 변화가 이루어질 수 있고 또한 본 발명의 취지 및 영역을 벗어남이 없이 동일하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음이 명백하다.
[실시예 1]
[IL-8의 헥사머 펩타이드 억제제]
서열식 RRWWCX(서열확인번호: 23)(여기서, X는 특정한 아미노산이다)의 헥사머 펩타이드가 IL-8의 억제제로서 작용하는지의 여부를 측정하기 위해 우선 일련의 연구를 수행한다. 초기 선별의 검정은 사람 호중구에 대한 IL-8의 결합을 억제하는 주어진 펩타이드의 능력을 측정하는 것을 기본으로 한다.
[A. 사람 호중구의 제조]
호중구 획득을 위한 사람 대상의 사용은 기관(Institutional Review Board for human experimentation)에 의해 인증되었다. 호중구의 제조를 위해, 사람 혈액을 효소 방출 연구용의 헤파린 및 기타 연구용의 0.33% 시트르산나트륨으로 항응고시킨다. 화학주성 및 효소 방출 연구를 위해 호중구를 덱스트란 침강에 의해 분리하고, 보윰(Boyum)의 방법[참조: Kohler & Milstein, 1975]으로 적혈구를 용해한다. 결합 연구 및 화학주성 연구를 위해, 호중구를 퍼콜(Percoll)(Pharmacia Fine Chemicals 제조원, Piscataway, NJ 소재) 구배로써 90 내지 93%의 순도로 추가로 정제한다[참조: Kohler & Milstein, 1975].
[B. IL-8 결합 검정]
재조합 사람 IL-8(72개 아미노산; Pepro Tech Inc. 제조원, Rocky Hill, NJ 소재)을 헌턴 및 그린우드의 클로르아민 T 방법[참조: Hunter & Greenwood, 1962]에 의해125I로 방사선 표지시킨다. 결합 연구는 문헌[참조: Besemer et al. (1989)]에 따라 하기와 같이 수행한다: 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 인산염 완충된 염수(PBS: pH 7.4)중의 호중구를 4℃에서 90분간 평형에 이르도록 시험 펩타이드의 존재 또는 부재하에 표지된 리간드와 함께 항온처리한 후 파라핀 오일(Fisher Scientific 제조원, Fair Lawn, NJ 소재) 및 실리콘 오일(Serva Co. 제조원, N.Y., NY 소재)의 혼합물로 이루어진 쿠션을 통해 베크만 B 원심분리기(Beckman Instruments 제조원, Fullerton, CA 소재) 내에서 12,000xg로 3분간 원심 분리한다. 이어서, 펠렛 및 상층액을 γ 방사 분광계내에서 계수한다. 비-특이적 결합을 평가하여 표지되지 않은 리간드의 100배 과량의 존재하에서 결합을 측정한다. 결합 상수를 컴퓨터 프로그램 런던 I 및 런던 II로 계산한다.
[C. 펩타이드]
RRWWCR-유형의 펩타이드는 α-아미노 그룹 보호용의 tBOC를 사용하여 샌 디에고 소재의 업자(Houghten Pharmaceutical Company)가 합성하였다. 모든 합성 펩타이드를 예비 C18 역상 컬럼(Waters Co. 제조원, New Bedford, MA 소재)을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 상에서 정제한다. 펩타이드를 0.1 트리플루오로 아세트산(TFA) 내지 0.1% TFA중 80% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 용출시킨다. 펩타이드의 조성물은 아미노산 분석 및 서열분석으로 확인한다.
[D. 통계치]
본 실시예 및 하기 실시예 모두에서, 데이타는 평균 및 표준편차(S.D.)로서의 변수로 나타낸다. 표준편차가 동일한 경우 쉐페 시험으로 차이점을 측정하고, 집단을 일반적으로 분포시켜 2개의 그룹만을 비교한다. 다수의 비교는 표준편차의 분석 및 쉐페 시험의 분석으로 수행한다.
[E. 결과]
본 연구에서, 억제용 선별은 100μM 농도의 시험 펩타이드에서 10-12M 농도의 IL-8을 사용하여 수행한다. 일련의 제1 연구에서, 각각의 표준 단백질 아미노산으로 차례로 변화되는 RRWWCX(서열확인번호: 23)의 카복실-말단 잔기를 사용하여 합성한다. 제1 셋트의 연구에서, 표 1A 및 표 1B에 나타난 바와 같이 다수의 펩타이드는 IL-8 결합을 완전히 억제하였다. 표 1A 및 표 1B에 제시된 정보는 동일한 데이타이며, 표 1A는 억제 %의 순으로 나타내고 표 1B는 서열확인번호 순으로 나타내어, 직접적인 비교가 가능하도록 하였다. RRWWCD(서열확인번호: 26); RRWWCE(서열확인번호: 27); RRWWCN(서열확인번호: 35) 및 RRWWCQ(서열확인번호: 37)외에 모든 헥사머 펩타이드는 매우 현저한 억제 활성을 갖는 것으로 명확히 나타낼 수 있다. 또한, 표 1에서의 예비 데이타가 억제 활성을 갖지 않는 RRWWCN(서열확인번호: 35)을 나타낸다 해도, 연속적인 연구에서 이 펩타이드는 특정한 억제 효과를 실질적으로 나타냄이 밝혀졌다(제1도).
[표 1A]
[표 1B]
표 1A 및 표 1B에서 나타낸 바와 같이, 제1 연구에서 일부 펩타이드는 IL-8 결합을 완전히 억제한다. 상대적인 효능을 평가하기 위해, 그룹을 저농도의 펩타이드로 재평가한다. 이 연구에서, Ac-RRWWCR-NH2(서열확인 번호: 1)이 호중구에 대한 IL-8 결합의 가장 강력한 억제제임이 밝혀졌다(제1도). 제1도에 나타낸 데이타는 상기 조건하에서 RRWWCR(서열확인번호: 1)이 다른 펩타이드보다 현저히 우수함을 나타낸다.
다른 초기 연구에서, RRWWCR의 아세틸화된 유도체(서열확인 번호: 1; Ac-RRWWCR-NH2)는 호중구에 대한 IL-8의 결합을 억제하는데 있어서 아세틸화되지 않은 펩타이드보다 거의 2배 효과적인 것으로 나타났다.
[실시예 II}
[RRWWCR IL-8 결합 억제의 역학]
본 실시예에 기술된 연구에서는 실시예 I에 상세히 기술한 바와 동일한 방법을 사용한다. 평균 EC50은 다수의 복제물의 결합 억제 곡선(이 검정에서의 대표적인 곡선은 제2도에 나타낸다)으로부터 측정한 결과 13.7 ± 0.6 μM이었다. 억제 메카니즘이 단일 부위 모델과 순수하게 경쟁적인 경우, 평가된 K1는 대략 10μM이다. 그러나, 메카니즘은 더욱 복잡하다. 단위 부위 모델보다 더욱 경사진 결합 억제 곡선과 높은 힐 계수치(high Hill coefficient value: 1.5 내지 1.7)는 양성적인 협동성의 존재를 제시한다. 이 곡선은, 비록 IL-8이 호중구 상에서 2개 이상의 뚜렷한 수용체와 반응하는 것으로 공지되어 있다해도, 런던 II 컴퓨터 프로그램으로 분석하는 경우 1-, 2- 또는 3-부위 모델과 잘 일치하지 않는다. 따라서, 각 부류의 수용체에 대한 개개의 K1값을 평가하기란 어렵다.
RRWWCR(서열확인번호: 1)에 의한 IL-8 결합 억제의 역학을 측정한다. Ac-RRWWCR-NH2의 부재하 및 3개 농도의 펩타이드의 존재하에서 IL-8의 결합 등온식은 제3(a)도에 나타낸다. 펩타이드의 부재하에서 스캐차드 플롯은 2개의 뚜렷한 수용체에 대한 IL-8의 결합을 나타내지 못한다(제3(b)도). Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 존재하에서 플롯은 비-선형이며, 런던 I 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석하는 경우 2 부위 모델과 조화된다. Kd 및 Bmax의 평가된 변화는 표 2에 나타낸다. 이 데이타는 IL-8 수용체의 한 그룹이 10μM의 펩타이드에서 자체의 친화성이 감소되며 다른 그룹은 증가하는 농도의 펩타이드에서 Bmax가 감소함을 나타낸다.
결합 역학을 더욱 특성화하기 위해, 10μM의 Ac-RRWWCR(서열확인번호: 1)의 존재하에서 표지되지 않은 IL-8을 사용하여 결합 억제 검정을 수행한다(제4도). Ac-RRWWCR(서열확인번호: 1)의 존재 및 부재하에서 결합 억제 곡선 모두는 런던 II를 사용하여 분석하며, 2-부위 모델에 가장 일치함을 나타낸다. 수용체의 저 친화성 상태의 출현에 대해서는 입증되지 않았다. Kd 및 Bmax의 평가된 변화는 고 친화성 부위만이 10μM 펩타이드의 존재하에서 자체의 친화성 및 Bmax 모두를 감소시킴을 나타낸다(표 3).
[표 2]
[표 3]
[실시예 III]
[IL-8 결합 억제에 대한 RRWWCR의 특이성]
리간드-수용체 결합에 대한 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 특이성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 펩타이드가 사람 호중구에 대한 사람125I-C5a 또는3H-류코트리엔 B4의 결합을 감소시키는지의 여부를 시험하였다.
보체의 재조합 사람 제5 성분(C5a)(Sigma Chemical Co. 제조원, St. Louis, MO 소재)을 엔지모비드(Enzymobead; Bio Rad 제조원, Richmond, CA 소재)를 사용하여 효소적으로 방사요오드화한다. 적정된 류코트리엔 B4는 듀퐁 코포레이션(DuPont Co., Wilmington, DE 소재)에서 시판된다. C5a 및 류코트리엔 B4에 대한 결합검정은 실시예 I에서 IL-8의 결합에 대해 기술된 바와 같이 수행하나, 단 사용된 완충액이 이미 기술된 바와 같이[참조: Braunwalder et al., 1992; Sherman et al., 1988] 1mM의 CaCl2, 0.5mM의 MgCl2, 0.5% BSA를 함유하는 PBS, 및 0.1%의 오브알브민 및 10mM의 HEPES(pH 7.3)을 각각 함유하는 HBSS라는 점이 예외이다. 방사활성은 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 류코트리엔 B4검정에 대해 측정한다. 리간드 모두의 결합은 포화가능하며, 용량 의존적 방식으로 표지되지 않은 효능제에 의해 억제된다.
이 연구에서, 100μM의 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)은 C5a의 결합 또는 류코트리엔 B4의 결합에 영향을 미치지 않으나, 100nM의 농도에서 IL-8의 결합을 현저하게 억제시키는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 IV]
[호중구에 대한 RRWWCR의 세포독성]
이어서, 본 발명자들은 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)의 세포독성 능력을 시험하였다. 이는 하기와 같이 호중구로부터 방출된51Cr의 양을 측정함으로써 수행한다: 10%의 공여자 혈장을 포함하는 RPMI-1640 매질중 호중구 제제(2 × 107/ml)를 500μCi의 Na2 51CrO4(Du Pont Co. 제조원)와 함께 37℃에서 60분간 항온처리한다. 이 세포를 3회 세척하고 1 × 107/ml의 농도로 매질 중에 재현탁시킨후, 37℃에서 30분간 항온처리하여 약간의 생존성 세포를 자발적으로 분해시킨다. 2회 세척후,51Cr-표지된 호중구(5 × 106/ml)의 100㎕ 분취량을 실리콘 처리의 원심분리 튜브내에서 100㎕의 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)과 혼합한다. 완충액 및 항온처리 조건은 결합 검정 또는 화학주성 검정을 모의실험한다. 항온처리 후, 튜브를 300xg로 4℃에서 7분간 원심분리하고, 상층액중 방사활성을 γ조사 분광계로 계수한다. 완충액 단독 또는 2% SDS를 포함하는 삼중 튜브를 사용하여 자발적인 방출 및 최대 방출을 각각 측정한다. 용해(%)는 하기 식으로 계산한다:
크롬-표지된 세포를 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 4℃로 90분간 항온처리하는 경우, 용해된 세포의 %는 500μM의 펩타이드까지는 대조군 수준과 거의 일치하는 것으로 밝혀졌다(제6도). 화학주성에서 사용된 조건하에서, 100μM의 펩타이드는 효과가 없었으나, 500μM의 펩타이드는 거의 25%의 세포를 손상시켰다.
[실시예 V]
[호중구 작용에 미치는 RRWWCR의 효과]
호중구 화학주성 및 효소 방출에 미치는 RRWWCR의 효과를 다음에 시험한다.
[A. 화학주성]
화학주성은 지그몬드 및 히쉬[참조: Zigmond & Hirsh, 1973]가 기술한 선행 방법을 사용하여 수행한다. IL-8 또는 대조군을 보이덴 챔버(Boyden chamber)의 하부벽에 둔다. 5μ 공극 크기의, 두께가 100㎛인 셀룰로즈 니트레이트 여과기(Sartorius Filter, Inc. 제조원, San Francisco, CA 소재)를 표면상에 두고 챔버를 조립한다. 1% BSA를 함유하는 RPMI-1640 매질중의 호중구 제제(1 × 106세포/ml)의 200㎕ 분취량을 여과기 상부에 가하여 37℃에서 30분간 항온처리한다. 여과기를 고정시키고, 염색하여 현미경 유리 슬라이드상에 둔다. 주요한 2개의 세포의 위치에 의해 주요한 정면을 측정한다. 필터를 통해 이동한 주요한 2개 세포의 거리를 각각의 여과기 상에서 6개 영역에 대해 측정한다. 각각의 조건을 4개의 여과기로 측정한다.
[B. 호중구 효소 방출]
호중구 효소 방출은 골드스타인 등의 방법[참조: Goldstein et al., 1973]을 변형시켜 연구한다. 사이토칼라신 B(Sigma Chemical Co. 제조원)를 디메틸 설폭사이드중에 5mg/ml의 농도로 저장하고, 사용 직전에 핸크스 평형된 염 용액(Hank′s Balanced Salt Soulution; HBSS) 중에 50㎍/ml의 농도로 희석시킨다. 사이토칼라신 B 200㎕를 HBSS 중 6.25 x 106세포/ml의 호중구 현탁액 1ml에 가하여 최종 사이토칼라신 B 농도가 10㎍/ml가 되도록 한다. 이어서, 이 용액을 실온에서 10분간 96웰플레이트내에서 항온처리한다. 자극제 100㎕를 가하고, 이 세포 현탁액을 37℃에서 30분간 항온처리한다. 플레이트를 원심분리하고, 상층액 100㎕를 제거한다. 상층액 40㎕의 분취량을 0.01M 페놀프탈레인-글루쿠론산(Sigma Chemical Co. 제조원) 10㎕및 0.1M 인산나트륨(pH 4.6) 40㎕와 96-웰 플레이트내에서 혼합하여 β-글루쿠로니다제를 측정한다. 37℃에서 16시간 동안 항온처리한 후, 0.2M NaCl 중 0.2M 글라이신(pH 10.4) 200㎕를 각 웰에 가하고, 효소 활성으로서 OD540을 측정한다.
[C. 결과]
Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)은 호중구 화학주성 또는 효소 방출에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 세포 이동의 장기판 분석(checkerboard analysis)은 호중구에 대한 화학주성이 없음을 나타낸다(표 4). 제7도 및 제8도에 나타낸 대조군 연구에서, 펩타이드는 호중구의 화학운동성에 영향을 미치지 않으며 세포로부터 β-글루쿠로니다제 방출을 자극하지 않는다.
Ac-RRWWCR-NH2에 의한 IL-8 결합의 억제가 IL-8에 의한 호중구 활성화의 억제와 관련되어 있는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 화학주성 및 β-글루쿠로니다제 방출에 미치는 펩타이드 효과를 시험하였다. Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)은 50μM의 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)농도에서 10nM의 IL-8로 자극된 호중구의 화학주성을 현저히 억제한 반면, 포르밀-L-메티오닐-L-루이실-L-페닐알라닌(fMLP)에 의해 유도된 화학주성에 대한 효과는 없었다(제7도). Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)는 화학주성의 억제에 요구되는 것보다 낮은 농도인 2μM의 농도에서 100μM의 IL-8로 자극된 β-그루쿠로니다제 방출을 억제하였으나, fMLP, C5a 또는 류코트리엔 B4에 의해 자극된 효소 방출에 영향을 미치지 않았다(제8도).
[표 4]
괄호가 없는 숫자는 4개 여과기상의 20개의 상이한 영역내의 시험적 관측의 평균 ±SD를 나타낸다. 괄호내 숫자는 세포가 절대 농도에 상응하고 구배에 상응하지 않은 경우에 예상되는 이동 계산치를 나타낸다.
[실시예 VI]
[IL-8의 추가의 펩타이드 억제제]
Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)과 관련된 다른 펩타이드가 IL-8의 억제제로서 작용하는지의 여부를 측정하고 이들의 상대적인 효능성을 측정하기 위해 또다른 일련의 연구를 수행한다. 본 실시예에 기술된 연구에서는 실시예 I에 상세히 설명된 것과 동일한 방법을 사용한다.
[A. 헵타머 펩타이드]
일련의 본 연구에서, 본 발명자들은 부가된 7번째 아미노산을 사용하여 RRWWCR(서열확인번호: 1)의 D-아미노산 동족체를 시험하였다. 이러한 헵타머 연구에서는 각각의 표준 단백질 아미노산으로 차례로 변화하는 RRWWCRX(서열확인번호: 2)의 카복시-말단 잔기를 사용하여 20개의 펩타이드를 합성한다. 제1 세트의 헵타머 연구에서, 몇몇 펩타이드는 표 5A 및 표 5B에 나타낸 바와 같이, IL-8 결합의 매우 강력한 억제를 나타냈다. 표 5A 및 표 5B에 나타낸 정보는 억제(%)의 순서로 나타낸 표 5A 및 서열확인번호의 순서로 나타낸 표 5B와 동일한 데이타로서, 직접적인 비교가 가능하다. 모든 헵타머 펩타이드(서열확인번호: 3 내지 22)는 상기 조건하에서 현저한 억제 활성을 지님을 명백히 알 수 있다(표 5A).
[표 5A]
[표 5B]
헵타머의 상대적 효능을 측정하기 위해, 보다 낮은 농도에서 이의 억제 효과를 측정한다. 카복실-말단에 존재하는 D-시스테인을 갖는 펩타이드(RRWWCRC; 서열확인번호: 4)는 이 그룹중 다음의 우수한 펩타이드보다 거의 56% 더 효과적이며 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호 1: 제9도)보다 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다. Ac-RRWWCRC-NH2(서열확인번호: 4)는 10μM에서 L-아미노산 펩타이드 Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1)가 20% 억제하는 것과 비교할때 호중구에 대한 IL-8의 결합을 80% 방지한다.
[B. 기타 펩타이드]
본 발명자들은 또한 IL-8의 아미노 말단 부위와 관련되거나 다른 단백질중에서 발견되고 RRWWCR(서열확인번호: 1)내 6개 잔기중 5개 잔기를 갖는 추가의 펩타이드를 시험하였다. 펩타이드 ELRCQCIKTY, ELRSQSIKTY, ELRMQMIKTY, QIPRRSWCRFLF 및 GWRRWWCDAVLY(각각 서열확인번호 49 내지 53)은 택사스 대학 보건 센터(The University of Texas Health Center)에서 431 펩타이드 합성기를 이용하는 타일러(Applied Biosystems 제조원, Foster City, CA)에서 마인호퍼 등의 문헌[참조: Meienhofer et al., 1979] 및 문헌[참조: Arshady et al. (1979)]에서 기술한 바와 같이 α-아미노 그룹을 보호하기 위해 9-플루오레닐메톡시카보닐(fMOC)을 사용하여 합성한다. 모든 합성 펩타이드는 예비 C18 역상 컬럼(Waters Co. 제조원, New Bedford, MA 소재)을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)상에서 정제한다. 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 내지 0.1% TFA중 80% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 펩타이드를 용출시킨다. 펩타이드 조성물은 아미노산 분석 및 UTHC에서 단백질 코어 설비(Protein Core facility)에 의한 서열분석으로 확인한다.
상기 일련의 연구에서, Ac-RRWWCR-NH2(서열확인번호: 1) 및 QIPRRSWCRFLF(서열확인번호: 52)만이 호중구에 대한 IL-8의 결합을 억제하였다(표 6).
[표 6]
[실시예 VII]
[GRO 및 MIP2β 호중구 결합의 억제)
Ac-RRWWCX-NH2(서열확인번호: 23)를 또한 다른 CXC 인터크린을 억제하는 능력에 대해 시험한다. 본 실시예는 IL-8의 억제외에, Ac-RRWWCX-NH2(서열확인번호: 23)이 사람 호중구에 대한 GRO 및 MIP2β를 효과적으로 억제함을 입증한다.
MIP2β 및 GRO/MGSA를 볼튼 헌터 시약(Bolten Hunter reagent)을 사용하여 방사요오드화한다. 방사요오드화된 성분은 다양한 농도의 Ac-RRWWCX-NH2(서열확인번호: 23) 펩타이드와 혼합하고, 실온에서 15분간 항온처리한다. 호중구 현탁액(0.1% BSA를 함유하는 PBS 160㎕중 1 x 106세포)을 40㎕의 혼합물에 가하고, 빙상에서 90분간 항온처리한다. 세포에 결합된 방사활성을 오일층을 통한 원심분리에 의해 유리 방사활성으로부터 분리한다. 결합된 방사활성은 결합된 CXC 인터크린 펩타이드를 나타낸다. Ac-RRWWCX-NH2(서열확인번호: 23)의 존재하에서 결합 억제%는 하기와 같이 계산한다:
상기식에서,
B는 펩타이드 존재하에서 결합 방사활성이고,
T는 펩타이드 부재하에서의 결합 방사활성이며,
NSP는 과량의 표지되지 않은 리간드 존재하에서의 결합 방사활성이다.
이 연구에서, Ac-RRWWCX-NH2(서열확인번호: 23)이 호중구에 대한 1nM IL-8의 결합을 EC50이 대략 25μM인 용량 의존 방식으로 억제함이 입증되었다(제10도). Ac-RRWWCX-NH2(서열확인번호: 23)도 역시 제10도에 나타낸 바와 같이 유사한 방식으로 호중구에 대한 1nM GRO 및 1nM MIP2β의 결합을 효과적으로 억제함이 밝혀졌다.
[실시예 VIII]
[치료학적 제형 및 치료 프로토콜]
본 실시예는 IL-8 억제제의 생체내 작용 및 동물 또는 사람 치료 프로토콜에 있어서의 용도를 더욱 특성화하는데 사용하기 위해 본 발명자들이 고려한 기술에 관한 것이다.
[A. 생체내 염증에 미치는 IL-8 억제제의 효과]
동물 모델 연구 이전에, 예를 들어 사람 혈청 및 혈장내 예비-항온처리, 다양한 프로테아제를 사용한 처리 : 및 또한 온도- 및 pH-안정성 분석을 포함하는 시험관내 안정성 시험을 펩타이드에 대해 수행할 수 있다. D-아미노산 펩타이드가 활성적이며 생체내에서 안정성을 증가시킨다는 것은 이미 공지되어 있다.
본 발명자들은 임상적 시도전에 동물 모델에서 IL-8 펩타이드 억제제의 생체내 특성 및 효과의 시험을 제안한다. 펩타이드의 가장 적합한 형태, 용량 및 모든 가능한 독성은 당해 분야에서 통상 사용되는 바와 같이, 동물 연구에서 측정된다. 예를 들어, 다양한 방법으로 투여된 펩타이드의 생-이용성 및 반감기는 방사활성적으로 표지된 펩타이드를 사용하여 이의 지속성과 조직 분포를 시험함으로써 측정할 수 있다. 추가의 안정성 증가가 바람직한 경우, 펩타이드는 또한 지질-테일의 펩타이드, 계면활성제-유형의 미셀, 펩타이드 다량체 또는 반-투과성 약물 방출 캡슐제의 형태로 투여할 수 있다.
펩타이드의 생물학적 효과는 사람 질병의 다양한 모델에서 측정할 수 있다. 예를 들어, IL-8은 토끼 표피내 호중구 축적 및 부종을 유발시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Rampart et al., 1989]. 따라서, 토끼 표피 염증 모델을 사용하여 호중구 축적 및 부종을 효과적으로 억제할 수 있는 펩타이드의 용량을 측정할 수 있다. 이 모델은 염증에 대한 평가의 용이성으로 인해 유용하다. 펩타이드의 가장 적합한 투여 경로는 생체내 시험으로 비교함으로써 용이하게 결정할 수 있다.
하나의 특수 실시예로서, 뉴질랜드 알비노 래빗에게 측위의 귀 동맥을 통해125I-표지된 사람 혈청 알부민을 주사할 수 있다. 이어서, 특정 부위에 시험 화합물, 즉 호중구 및 IL-8 억제제 펩타이드를 유도하기 위한 효능제; 효능제 및 대조군 펩타이드; 및 효능제 단독을 경피 주사할 수 있다. 약 2시간 후, 직경이 1cm인 충분히 두꺼운 표피 샘플을 펀칭하고, 라이트-김사(Wright-Giemsa)로 또는 마이엘로퍼옥시다제에 대해 고정 및 염색시켜 호중구 축적 및 부종 또는 조직 손상에 대해 조직학을 시험한다. 다른 피부 생검을 γ계수기로 계수하여 주사한 피부내로의 알부민 유량을 평가한다. 이어서, 억제제 투여후 피부 염증을 동일한 동물에서 이상적으로 수행된, 시간-일치한 대조군과 비교한다. 각 실험에 대해 4회 이상의 반복실험이 추천된다.
[B. ARDS의 IL-8 억제제 처리]
성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)의 최상의 사람 모델은 미니피그(minipig)의 혈행내에 그람음성 세균을 도입시키는 것이다. 이 모델은 남성에게서 수행된 것과 유사한 연구를 사용하여, 사람 ARDS에서와 같이 ARDS의 상기 모델중에서 IL-8이 주요 호중구 활성화제인지를 측정하는데 사용될 것이다. 미니피그내에서 정맥내 또는 폐내 경로를 통한 IL-8의 투여 효과를 추정한다.
제1단계에서, 미니피그를 가장 적절한 경로를 통해 IL-8로 처리하여 상기 추정된 바와 같이 폐내로의 호중구 유입 및 효소 방출을 유발시킨다. 관심있는 펩타이드를 투여하여, 호중구 작용의 저지에 사용하기 위한 적절한 용량, 특히 펩타이드가 효소 방출은 억제하나 호중구 유입은 억제하지 않는 용량을 측정한다.
다음 단계에서, 혈행내에서 그람 음성 세균에 의해 유발된 미니피그의 급성 폐 손상 모델을 사용한다. 관심있는 펩타이드를 동물에게 투여하여 폐 손상의 방지에 미치는 펩타이드의 효과를 추정한다. 기관지폐포성 유액내 호중구의 수, 폐 실질내로 방출된 효소의 양 및 혈행으로부터 폐로의 단백질 누출 정도를 본 연구의 지표로 사용한다.
IL-8이, 예상된 바와 같이, 호중구 유입, 폐로의 효소 방출 및/또는 폐에 대한 ARDS-형 조직 손상을 유발시키는 경우, 관심있는 펩타이드를 투여하여 이들 호중구 작용의 저지에 사용하기 위한 적절한 용량을 측정한다. 이 연구에서, 방사활성 표지된 펩타이드의 다양한 정맥내 용량을 우선 투여한다. 이어서 , 혈장 농도 및 방사활성 형태를 측정한다. 이 데이타로부터, 혈장 정화치, 반감기 및 분포의 정체 상태 용적을 측정하여 가장 효과적인 용량 범위를 측정하는데 사용한다.
[C. 치료 프로토콜]
신규한 모든 약제에 대한 필수적으로 수행되는 예방책에 따라, 본 발명의 IL-8 펩타이드 억제제 및 조성물은 사람 환자내 임상적 상태에서 시험되지 않았다. 그러나, 허용된 모델에서 이들의 명백한 시험관내 활성은 본 발명의 항-염증제로서의 용도를 입증하는 것으로 여겨진다. 임상적인 시도는 정식으로 수행될 것이며, 일반적으로 FDA 방법에 따를 것이다. 하기 양태는 다양한 임상적 상태에서 본 발명을 시행하기 위해 본 발명자들이 현재 고려하는 가장 우수한 모델을 나타낸다.
IL-8의 펩타이드 억제제를 함유하는 약제학적 조성물은 기관지 염증, 낭포성 섬유증, 흉박 삼출액, 천식, 기관지염 및 ARDS와 같은 폐 질병; 건선 및 피부염과 같은 피부 질병; 류마티스 관절염을 포함하는 관절 지병을 포함하는 각종 상태의 치료 및 의통풍, 염증성 장 질병, 재관류 심장 손상의 치료 또는 심지어 암 및 기타 질병의 치료 및 증가된 세포 증식과 연관된 질병의 치료에 유용한 것으로 입증될 것이다.
상기 펩타이드는 ARDS, 만성 기관지염 및 낭포성 섬유증과 같은 폐 염증의 억제에 특히 적합한 것으로 사료되므로, 이러한 질병에 대한 적합한 치료 방법이 기술될 것이다. ARDS 또는 낭포성 섬유증의 치료를 위해, 바람직하게는 정맥내, 근육내 또는 피하내 주사를 사용하는 것과 같은 비경구 투여를 사용함이 바람직하다. 그러나, 또한 에어로졸제 또는 흡입제를 사용할 수 있다. 비경구 투여용의 펩타이드 제형의 제조, 특히 주사가능한 것으로써 제형회된 것들의 제조는 본 출원의 바람직한 양태 단락에 상세히 기술되어 있다. 하기에는 특정의 흡입 제형을 기술하며, 이 제형은 본 발명과 관련된 방법을 사용하는데 바람직한 것이어야 한다.
흡입액 및 흡입제는 환자의 호흡수내로 약물 또는 화합물을 전달하기 위해 고안된 약제학적 제제이다. 증기 및 합제가 투여되어 이들이 영향받은 부위에 이르면 기관지 및 비내 울혈 증상이 완화된다. 흡입은 비내 또는 구강 호흡경로로 투여될 수 있다. 흡입액의 투여는 소적이 충분히 미세하고 크기가 균일하여 합제가 기관지에 도달하는 경우에만 효과적이다.
흡입액으로 또한 공지되고 때때로 통기법으로도 불리는 또다른 그룹의 제품은 액화 가스 추진제내에 약물의 용액 또는 현탁액을 유지시키는, 약제학적 에어로졸과 같은, 특수한 전달 시스템을 사용함으로써 호흡기에 함유되는 미분의 약물 또는 액체 약물로 이루어진다. 적합한 밸브 및 경구 연접기를 통해 방출시킬 경우, 흡입액의 계량된 용량이 환자의 기도내로 추진된다.
입자 크기는 상기 유형의 제제의 투여시 매우 중요하다. 폐강내로 침투시키기 위한 최적의 입자 크기는 0.5 내지 7㎛인 것으로 보고되어 있다. 미세한 합제는 가압된 에어로졸에 의해 제조되어 이의 사용은 매우 유리하다.
본 출원에 기술된 항-IL-8 펩타이드중 하나 또는 배합물의 정맥내 투여는 ARDS 및 낭포성 섬유증의 염증을 약화시킬 수 있는 것으로 고려된다. 투여되는 용량 범위는 약 500 내지 약 1000mg/일 또는 약 0.83mg/체중 kg/시간(mg/kg/hr) 내지 약 16.56mg/kg/hr 범위인 것으로 추정된다.
물론, IL-8 억제제의 각종 다른 약제학적 제형이 제조될 수 있고 호중구 활성화 및 염증과 관련된 많은 다른 질병의 치료에 사용될 수 있다는 사실을 주지하여야 한다.
본원에서 기술되고 청구된 조성물 및 방법 모두는 본 기술 내용의 견지에서 과다한 실험없이도 제조 및 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 측면에서 기술되었으나, 당해 분야의 숙련가에게는, 조성물, 방법 및 단계 또는 본원에 기술된 방법 단계들의 순서에 대해 본 발명의 개념, 취지 및 영역에 벗어남이 없이 변형시킬 수 있음이 명백할 것이다. 더욱 특히, 화학적으로 및 물리적으로 모두 관련된 특정 제제는 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기술된 제제로 치환시킬 수 있음이 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명백한 이와 같은 유사한 대용 및 변형은 청구된 특허청구 범위에서 정의된 바와같이 본 발명의 취지, 영역 및 개념내에 속하는 것으로 간주된다.
[참조문헌]
하기 참조문헌은 본원에 설정된 것을 보충하는 다른 세부사항 또는 예시적 방법을 제공하는 정도로써 본원에서 참조로써 특이적으로 도입되었다.
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(D) 위상: 선형
(ii) 분자형: 펩타이드
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Arg Arg Trp Trp Cys Met
1 5
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(i) 서열 특성:
(A) 길이: 6개 아미노산
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Arg Arg Trp Trp Cys Asn
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Arg Arg Trp Trp Cys Pro
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Arg Arg Trp Trp Cys Gln
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(A) 길이: 10개 아미노산
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Glu Leu Arg Met Gln Met Ile Lys Thr Tyr
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(i) 서열 특성:
(A) 길이: 12개 아미노산
(B) 유형: 아미노산
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(ii) 분자형: 펩타이드
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Glu Ile Pro Arg Arg Ser Trp Cys Arg Phe Leu Phe
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(i) 서열 특성:
(A) 길이: 12개 아미노산
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Gly Trp Arg Arg Trp Trp Cys Asp Ala Val Leu Tyr
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Lys Glu Leu Arg Cys Gln
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(i) 서열 특성:
(A) 길이: 13개 아미노산
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Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val
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(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5개 아미노산
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Arg Arg Trp Trp Cys
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(i) 서열 특성:
(A) 길이: 7개 아미노산
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Arg Arg Trp Trp Cys Xaa Xaa
1 5
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Arg Arg Xaa Trp Cys Xaa
1 5

Claims (52)

  1. 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Xaa1(서열확인번호: 23)(여기서, Xaa1는 특정한 아미노산 잔기이다)을 포함하는, 6 내지 약 14개 잔기 길이의 펩타이드를 약리학적으로 허용되는 제형으로 함유하는, CXC 인터크린 부류 분자 억제용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, IL-8(Interleukin 8)을 억제할 수 있는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, GRO(Growth Related Oncogene)을 억제할 수 있는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, MIP2β(Macrophage Inflammatory Protein 2β)을 억제할 수 있는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, N-말단에서 아세틸화된 펩타이드 또는 C-말단에서 아미드화된 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, N-말단에서 아세틸화되고 C-말단에서 아미드화된 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Arg Xaa2(서열확인번호: 2)(여기서, Xaa2는 특정한 아미노산 잔기이다)를 포함하는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 서열확인번호: 3 내지 서열확인번호: 22에 기재된 아미노산 서열중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 서열확인번호 3 내지 서열확인번호 22에 기재된 아미노산 서열중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 2개 내지 20개의 상이한 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 조성물이 주사제, 비내 스프레이제, 흡입제, 에어로졸제, 크림제, 겔제, 미셀제 또는 리포좀 캡슐화 형태로 제형화되거나 생적합성 약물 방출 캡슐제내에 혼입되는 약제학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 아실화된 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, D-아미노산의 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, L-아미노산의 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, L-아미노산의 펩타이드 및 D-아미노산의 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, L-아미노산 및 D-아미노산 모두를 포함하는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Arg(서열확인 번호: 1)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Ala(서열확인 번호: 24)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Cys(서열확인 번호: 25)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Asp(서열확인 번호: 26)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Glu(서열확인 번호: 27)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Phe(서열확인 번호: 28)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Gly(서열확인 번호: 29)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys His(서열확인 번호: 30)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Ile(서열확인 번호: 31)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Lys(서열확인 번호: 32)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Leu(서열확인 번호: 33)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Met(서열확인 번호: 34)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Asn(서열확인 번호: 35)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Pro(서열확인 번호: 36)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  30. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Gln(서열확인 번호: 37)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  31. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Ser(서열확인 번호: 38)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  32. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Thr(서열확인 번호: 39)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  33. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Val(서열확인 번호: 40)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  34. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Trp(서열확인 번호: 41)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  35. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Tyr(서열확인 번호: 42)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  36. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 Gln Ile Pro Arg Arg Ser Trp Cys Arg Phe Leu Phe(서열확인 번호: 52)을 갖는 펩타이드를 추가로 함유하는 약제학적 조성물.
  37. 제1항에 있어서, 서열확인번호: 1, 서열확인번호: 3 내지 서열확인번호: 22, 서열확인번호: 24 내지 서열확인번호: 42 또는 서열확인번호: 52에 기재된 아미노산 서열중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 2개 내지 41개의 상이한 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 2개의 상이한 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 5개의 상이한 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  40. 제37항에 있어서, 10개의 상이한 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  41. 제37항에 있어서, 20개의 상이한 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  42. 제37항에 있어서, 30개의 상이한 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  43. 제37항에 있어서, 41개의 상이한 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  44. 제37항에 있어서, 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Arg(서열확인번호: 1)을 갖는 펩타이드 및 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Arg Cys(서열확인번호: 4)을 갖는 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물.
  45. 제1항에 있어서, 약리학적으로 허용되는 형태의 약제학적 조성물.
  46. 제10항에 있어서, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여용의 주사제로 제형화되는 약제학적 조성물.
  47. 제10항에 있어서, 비내 스프레이제, 흡입제 또는 에어로졸제로서 제형화되는 약제학적 조성물.
  48. 제45항에 있어서, 유효량의 약제학적 조성물이 CXC 인터크린 부류 분자 또는 인터크린 표적 세포가 위치하는 동물에 투여되는 약제학적 조성물.
  49. 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Xaa1(서열확인번호: 23)(여기서, Xaa1은 특정 아미노산 잔기이다)를 포함하는 6내지 약 14개 잔기 길이의 펩타이드를 함유하는, 호중구 화학주성과 비교하여 호중구 효소 방출을 우선적으로 감소시키기 위한 약제학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 유효량의 조성물이 약리학적으로 허용되는 형태로서 호중구 및 IL-8이 위치하는 동물에 투여되는 약제학적 조성물.
  51. 아미노산 서열 Arg Arg Trp Trp Cys Xaa1(서열확인번호: 23)(여기서, Xaa1은 특정 아미노산 잔기이다)를 포함하는 6내지 약 14개 잔기 길이의 펩타이드를 함유하는, 염증 감소용 약제학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 염증이 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 낭포성 섬유증인 약제학적 조성물.
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