KR100258018B1 - 티클로피딘과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물 - Google Patents

티클로피딘과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 티글로피딘(Ticlopidine)과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물에관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항혈전제로서 상기 티글로피딘과 PAF억제작용 및 항산화작용을 하는 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물을 병용투여함으로써, 티클로피딘의 단독연용시 그 독성으로 인해 초래되는 호중구 감소증 및 무과립구증을 투여과정에서 자연스럽게 억제할 수 있도록 개선된 새로운 티클로피딘과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물에 관한 것이다.

Description

티클로피딘과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물
본 발명은 티클로피딘(Ticlopidine)과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항혈전제로서 상기 티클로피딘과 PAF억제작용 및 항산화작용을 하는 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물을 병용투여함으로써, 티클로피딘의 단독연용시 그 독성으로 인해 초래되는 호중구 감소증 및 무과립구증을 투여과정에서 자연스럽게 억제할 수 있도록 개선된 새로운 티클로피딘과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물에 관한 것이다.
티클로피딘(Ticlopidine)은 티에노피리딘(Thienopyridine) 계열 물질로서 혈소판 응집저해제로 임상에서 널리 사용되고 있다. 티클로피딘은 아스피린과는 달리 프로스타사이클린-트롬복산(prostacycline-thromboxane) A2생성에는 아무런 영향이 없으나, 2-히드록시티클로피딘(2-Hydroxyticlopidine; 2-HT) 등의 대사산물은 ADP에 의한 혈소판응집을 억제할 뿐만 아니라, 그 외에도 혈소판에서 글리코프로테인 Ⅱb/Ⅲa 수용체의 발현을 촉진하는 콜라겐, 아라카돈산, 트롬빈, PAF에 의한 혈소판응집도 억제하는 기능을 가지고 있다. 이는 혈소판이 응집하여 플러그를 형성하기 위해서는 혈소판 세포막에 피브리노겐의 수용체인 글리코프로테인 Ⅱb/Ⅲa이 필요하게 되는데, 티클로피딘은 이 글리코프로테인 Ⅱb/Ⅲa 수용체의 발현을 억제하여 혈소판응집을 억제하게 된다. 따라서, 혈소판이 마치 마취된 것과 같은 상태로 기능이 억제되는 것이다.
또한, 티클로피딘은 혈장 중 피브리노겐을 감소시켜 혈액의 점도를 낮추며, 적혈구 변형능력을 증가시키기도 한다.
따라서, 티클로피딘은 혈소판 기능을 억제하는 합성 약물로서 임상적으로 동맥경화와 혈전증이 겹친 뇌졸중이나, 협심증 등의 허혈성 심장병, 간헐성 파행증등의 예방목적으로 널리 사용되고 있다.
그러나, 티클로피딘을 단독으로 연용하는 경우 주요한 부작용으로 가역적인 호중구 감소증(neutropenia), 무과립구증을 초래하는 문제점이 있다. 임상적으로 “호중구 감소증”이란 혈액내의 호중구 수효가 1200/㎣ 이하로 하락하는 증세로 규정되며, 또한 “무과립구증”이란 과립구 수효가 450/㎣ 이하로 하락하는 경우를 말한다.
이러한 독성은 치료개시 처음 3개월 동안에 0.8% 정도의 발현율로 환자에게 발생된다. 이 경우 그래뉼로사이트 콜로니 자극인자(granulocyte colony-stimulating factor)를 투여하여 개선할수 있다는 보고가 있으나, 이는 근본적인 해결방법이 되지 못한다. 따라서 뇌졸중 등에 1차의 약물로는 아스피린을 사용하고, 아스피린을 사용할 수 없는 환자에게 2차의 약물로 티클로피딘을 사용하고 있다.
그 외에도, 티클로피딘은 보다 심한 경우 골수독성을 일으켜 혈소판감소증을 유발하므로 자반병, 출혈기간 연장등을 초래하고, 또한 재생불량성 빈혈을 초래하는 문제점이 있다.
한편, 티클로피딘과 같이 호중구 감소증의 문제점을 지닌 클로자핀의 경우 이를 개선하고자 항산화제인 L-아스코르브산을 병용투여하는 방법이 개시되어 있다 [대한민국특허출원 제 92-700915호]. 그러나, 이 방법은 L-아스코르빈산이 단지 항산화작용만을 지니고 있어 클로자핀의 효과를 증대시키지는 못하는 문제점이 있어 바람직하지 않다.
본 발명은 종래 항혈전제로서 사용된 티클로피딘의 단독투여시의 문제점을 개선하기 위하여, 항산화작용과 동시에 혈소판응집 억제작용을 하는 은행잎 추출물을 티클로피딘과 병용 투여하므로써, 호중구감소증의 독성을 경감시킬 뿐만 아니라 혈소판응집 억제효과를 상승적으로 개선할 수 있는 새로운 조성의 티클로피딘과 은행잎 추출물로 이루어진 약제조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.
제1도는 16주간 티클로피딘 단독 또는 은행잎 추출물 병용처리시 흰쥐의 대퇴골 골수세포수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,
제2도는 16주간 티클로피딘 단독 또는 은행잎 추출물 병용처리 후, 2주 휴약시 흰쥐의 대퇴골 골수세포수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,
제3도는 정상군과 16주간 티클로피딘 단독 또는 은행잎 추출물 병용처리(5:1, 5:2, 5:4)시 흰쥐 대퇴골 골단 부위의 골수세포 조직을 나타낸 사진 (×400)이고,
제4도는 16주간 티클로피딘 단독 또는 은행잎 추출물 병용처리(5:2) 후, 2주 휴약시 흰쥐 대퇴골 골단 부위의 골수세포 조직을 나타낸 사진(×400)이고,
제5도는 티클로피딘과 은행잎 추출물 병용처리시 티클로피딘(30ng/㎖)에 의해 유도되는 CFU-C의 억제에 미치는 영향을 나타낸 막대그래프이고,
제6도는 티클로피딘(10-4M) 단독 또는 티클로피딘+은행잎 추출물 병용처치(5:2)시 의한 골수세포에서 과산화수소에 의해 유도되는 지질과산화에 대한 영향을 나타낸 막대그래프이다.
본 발명은 티클로피딘(Ticlopidine)과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 티클로피딘과 은행잎 추출물을 배합한 약제조성물을 유효성분으로 하는 항혈전제를 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 티클로피딘과 PAF억제작용 및 항산화작용을 하는 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물을 제조하여 티클로피딘의 단독연용에 의해 초래되는 호중구 감소증 및 무과립구증이 개선된 항혈전제로서의 티클로피딘과 은행잎 추출물로 이루어진 약제조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 티클로피딘(5-[(2-chlorophenyl) methyl]-4,5,6,7-tetrahydrothieno [3,2-C] pyridine; Ticlopidine)은 티에노피리딘(Thieneo-phridine) 계열 물질로서 항혈전형성능을 지니고 있어 혈소판 응집저해제로 임상에서 널리 사용되고 있는 물질이다. 이러한 티클로피딘은 혈소판 세포막상의 피브리노겐 수용체인 글리코프로테인 Ⅱb/Ⅲa의 발현을 억제하므로써 ADP에 의한 혈소판 응집을 억제할 뿐만 아니라, 그 외에도 콜라겐, 아라카돈산, 트롬빈, PAF에 의한 혈소판의 응집을 억제하고, 혈소판이 마치 마취된 것과 같은 상태로 혈소판 기능을 억제하므로서 출혈시간을 연장, 즉 항혈전형성능을 갖게 된다. 또한, 혈장 중 피브리노겐을 감소시켜 혈액의 점도를 낮추며, 적혈구 변형능력을 증가시키는 기능을 갖기도 한다. 그러나, 이러한 티클로피딘은 상기한 잇점에도 불구하고 호중구가 감소하거나 무과립구증 등의 문제점을 야기시킨다.
따라서, 본 발명은 상기한 티클로피딘에 적정량의 은행잎 추출물을 함유시켜 약제조성물을 제조하여 상기 문제점을 개선하면서 동시에 혈소판응집 억제효과를 상승시키고자 하는 데에 특징이 있다.
본 발명에 사용하는 은행잎 추출물은 당해 기술분야에 속하는 통상의 전문가에게 이미 알려진 공정에 의하여 추출된 것을 이용하는데, 주성분인 플라본글리코시드는 15 중량%이상을 함유하는 것이 바람직하며 특히 플라본글리코시드, 테르펜락톤와 알킬페놀화합물을 함유하는 은행잎 추출물이 더욱 바람직하다.
이와 같은 공정에 의하여 얻은 은행잎 추출물은 일반적으로 플라본글리코시드를 함유하고 있어 항산화작용과 세포보호작용이 보고되어 있으며, 테르펜락톤을 함유하여 PAF 및 ADP에 의한 혈소판응집 억제작용, 혈관이완작용 등 심혈관계에 작용을 갖는 것으로 보고되고 있다.
또한, 본 발명에서 은행잎 추출물이 티클로피딘에 의한 호중구감소증 및 무과립구증을 개선하는 기능은 항산화제로서의 기능을 갖고 있기 때문인 것으로 추정되고 있다. 다시 말하면, 티클로피딘에 은행잎 추출물을 병용투여하면 티클로피딘에 의해 유도된 과산화물 음이온과 같은 자유 라디칼의 반응성 대사산물을 제거, 즉 정화된 사람의 골수 과산화효소 및 백혈구에서 나온 단백질 및 글루타티온과 같은 친핵체에의 공유결합이 결여되기 때문에 호중구감소증이나 무과립구증 등을 현저히 감소시킬 수 있는 효과가 있는 것이다.
본 발명에서 사용되는 은행잎 추출물의 사용량을 살펴보면, 티클로피딘 100중량부에 대하여 10 ~ 240 중량부인 범위에서 매일 40㎎ ~ 480㎎, 바람직하게는 80㎎ ~ 240㎎을 투여하는 것이 바람직하다. 만일, 은행잎 추출물의 양이 10 중량부 미만이면 본 발명에서 목적으로 하는 효과가 유의성 있게 나타나지 않는 문제점이 있으며, 240 중량부를 초과하면 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 있다. 또한 일일 복용량이 상기한 40㎎ 미만이면 역시 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 480㎎을 초과하는 경우 상용량의 범위를 벗어나므로 역시 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생한다.
본 발명의 약제 조성물은 장 경유 투여, 즉 경구투여에 적합한 제형으로서, 특히 정제, 발포정, 과립제 및 경질캅셀제 캡슐 등의 형태로 제형화할 수 있다. 이러한 약제조성물은 단위투여 제형으로 되는 것이 바람직하며, 이때 각 투여제형은 소정량의 티클로피딘과 은행잎 추출물을 함유시키는 데, 이밖에도 약제 조성에 통상적인 약제방법에 따라 적당한 희석제, 담체 또는 기타 부형제를 선택하여 함께 혼합시켜 제형화할 수 있다. 가령, 정제는 활성충전제 외에 통상의 과립화제, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 안정화제, 착색제, 차광제, 감미제 및 조미제를 함유할 수도 있다.
이상에서 제형화된 단위투여 제형내의 티클로피딘의 함량은 50㎎ ~ 600㎎이 바람직하며, 특히 100㎎ ~ 250㎎이 더욱 바람직하다. 단위투여 제형내의 은행잎 추출물의 함량은 20㎎ ~240㎎이 바람직하며, 특히 40㎎ ~ 120㎎이 더욱 바람직하다. 본 발명에 따른 약제조성물의 정확한 1일 투여량은 투여방법이나 치료조건에 따라 상이하나, 경구투여시 성인의 경우 매일 1 ~ 4회 투여하는 것이 바람직하다.
이와 같은 방법으로 제조된 티클로피딘과 은행잎 추출물이 함유된 약제조성물은 지속적인 투여를 하더라도 호중구 감소증 및 무과립구증 등의 문제점이 없을 뿐만 아니라 기타 독성 등의 부작용 없이 티클로피딘에 의한 항혈전형성능 작용으로 인하여 혈전 및 색전용해제로서의 효과를 얻을 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[제조예 : 은행잎 추출물의 제조]
은행잎 건조분말 100g을 원추용기에 채워넣고 60V/V% 아세톤수용액 930㎖를 은행잎분말이 침출되도록 넣었다. 12시간 경과후 가압여과하고 여액을 감압하에 총량이 150㎖가 되도록 농축시킨 후, 그 농축액에 물을 가해 200㎖가 되게 하고 격렬하게 교반시켰다. 그런 다음, 12시간동안 15℃로 냉각시켜 방치한 후 상등액을 침전물과 분리 여과하였다.
여액을 교반하면서 황산암모늄 50g을 가하고, 15분 후에 메칠에칠케톤 37㎖와 아세톤 25㎖혼합용액을 가하여 교반후 정치시켜 유기용매층을 분리한 후 동량의 메칠에칠케톤과 아세톤 혼합용액으로 3회 반복 추출하여 분리하여 합하였다. 메칠에칠케톤, 아세톤층을 총량이 10g이 되도록 감압하에 농축시켰다. 얻어진 농축액에 50V/V% 에탄올수용액 68㎖를 가해 용해시킨후 4기압의 압력으로 다이아플로(R) 한외여과막(아미콘사; 미국)으로 여과시켰다. 그런 다음, 여액은 감압하에 5g이 되도록 농축시키고 90V/V% 에탄올 수용액 25㎖로 용해시켜 상온에서 1일밤 방치한 후 맑게 여과하고 최대 60℃로 감압하에 건조시켰다. 그리고, 그 결과, 2.16g의 유효활성물질(등황색분말)을 얻었다.
[실시예 1 : 정제]
상기 제조예에서 추출한 은행잎 추출물과 함께 다음 표 1의 성분 및 함량을 이용하여 경구투여에 적합하도록 통상적인 방법에 의하여 정제를 제조하였다. 즉, 하기의 성분들을 잘 혼합하고 낱개의 정제로 압착시켜 정제를 제조하였다.
Figure kpo00001
[실시예 2 : 발포정]
상기 제조예에서 추출한 은행잎 추출물과 함께 다음 표 2의 성분 및 함량을 함유하는 발포정을 경구투여에 적합하도록 통상적인 기술에 의하여 제조하였다. 즉 하기의 성분들을 잘 혼합하고 낱개의 정제로 압착시켜 발포정을 제조하였다.
Figure kpo00002
[실시예 3 : 과립제]
상기 제조예에서 추출한 은행잎 추출물과 함께 다음 표 3의 성분 및 함량을 함유하는 과립제를 경구투여에 적합하도록 통상적인 방법에 의하여 제조하였다.
Figure kpo00003
[실시예 4 : 경질캅셀]
상기 제조예에서 추출한 은행잎 추출물과 함께 다음 표 4의 성분 및 함량을 함유하는 경질캅셀제를 경구투여에 적합하도록 통상적인 방법에 의하여 제조하였다.
Figure kpo00004
[실험예 1 : Ex vivo 혈소판응집 억제작용]
티클로피딘(T) 50, 100 또는 200 ㎎/㎏/day를 단독으로 3일간 랫트(암컷)에 투여하거나 티클로피딘 50 ㎎/㎏에 은행잎 추출물(G)을 티클로피딘 용량의 80%(즉, T:G = 5:4)인 40 ㎎/㎏을 함께 투여하였다. 마지막 시료 투여 1시간 후 랫트를 에테르로 마취시키고, 혈액응고방지를 위하여 항응고제인 3.8% 나트륨 시트레이트용액을 미리 넣은 주사기를 이용하여 혈액을 채취하여 1 × 10-5M ADP에 의하여 유도되는 혈소판응집에 대한 영향을 비교하였다. 그리고, 그 결과를 각각 표 5에 나타내었다.
Figure kpo00005
우션, 티클로피딘 200 ㎎/㎏을 단독 투여하였을 때, ADP에 의한 혈소판응집은 98%가 저해되었으며, 티클로피딘의 용량을 100 ㎎/㎏ 또는 50 ㎎/㎏으로 줄였을 때, 각각 67% 및 65%의 저해효과를 보였다. 또한, 은행잎 추출물 단독투여군 및 아스피린 단독투여군에서는 각각 54% 및 43%의 저해가 나타났다.
상기 결과로부터 티클로피딘 50 ㎎/㎏과 은행잎 추출물 40 ㎎/㎏을 병용투여하였을 때는 98%의 혈소판응집 저해효과를 보여 티클로피딘 50 ㎎/㎏을 단독투여하였을 때보다 약 1.5배의 작용을 보였으며, 티클로피딘 200 ㎎/㎏을 투여하였을 때와 유사하게 강력한 혈소판 응집효과를 보였다.
[실험예 2 : 마우스 급성 혈전모델에서 회복율의 증가]
마우스에 시료인 티클로피딘과 은행잎 추출물을 3일간 투여하였으며, 마지막 시료 투여 1시간 후 콜라겐과 에피네프린 혼합용액(collagen 1100㎍ + epinephrine 110㎍/10㎖ 식염수/㎏)을 꼬리정맥에 주사하고 15분간 폐동맥 경색에 의한 마비의 지속, 사망 또는 마비로부터의 회복여부를 관찰하였다. 그리고, 그 결과를 다음 표 6에 나타내었다.
Figure kpo00006
상기 실험에서와 같이 콜라겐과 에피네프린 혼합용액을 정맥주사하면 단시간내에 폐동맥내에 다량의 혈전이 생성되어 폐색됨으로써, 주사후 1 분 이내에 대부분이 마비되어 움직이지 못하게 되고 동공이 커지며, 호흡곤란과 경련이 뒤따르고 5분 이내에 약 70 ~ 80%의 마우스가 사망하고, 나머지도 15분 이내에 대부분 사망하거나 15분 이상 마비가 지속되었다. 상기 표 6에 나타낸 바와 같이 정상군의 마우스는 15분 이내에 20% 만이 마비로부터 회복되어 자유롭게 움직이었다. 그러나, 티클로피딘 50 ㎎/㎏ 또는 100 ㎎/㎏을 단독으로 투여한 경우, 각각 38% 및 47%의 회복율을 보여 티클로피딘 투여에 의하여 급성혈전 모델에서도 항혈전작용을 보임을 확인하였다. 또한, 티클로피딘 50 ㎎/㎏과 은행잎 추출물 20 ㎎/㎏ 또는 40 ㎎/㎏을 동시에 투여하였을 때, 각각 43% 및 71%의 회복율을 보여 티클로피딘 단독으로 투여하였을 때보다 높은 회복율을 나타내었다.
[심험예 3 : 동맥-정맥 션트(Arterio-Venous shunt: 이하, “A-V shunt”라 함)에 의한 혈전형성과 혈소판응집도에 미치는 영향]
랫트(암컷)에 시료인 티클로피딘 50 또는 100 ㎎/㎏을 단독으로 투여하거나, 티클로피딘 50㎎과 은행잎 추출물 20㎎(5:2) 또는 40㎎(5:4)을 9일간 랫트에 투여한 후, A-V shunt내에 설치한 목면실에 생성되는 혈전의 무게를 측정하여 다음 표 7에 나타내었다. 이때, 혈전의 무게는 실험 종료후 바로 측정한 습중량(wet weight)과 완전히 건조시킨 후의 건중량(dry weight)을 각각 측정하였으며, 정상군 랫트 A-V shunt내에 생성된 혈전의 무게로부터 혈전생성억제도(%)를 구하였다.
Figure kpo00007
상기 표 7에서 보듯이, 티클로피딘 50 ㎎/㎏ 또는 100 ㎎/㎏을 단독으로 투여하였을 때, 각각 26%(wet)와 25%(dry) 및 36%(wet)와 31%(dry)의 혈전형성 억제도를 보였으며, 티클로피딘 50 ㎎/㎏과 은행잎 추출물 20 ㎎/㎏을 동시에 투여하였을 때 39%(wet) 및 36%(dry)의 억제도를 보여 티클로피딘 50 ㎎/㎏ 단독투여군에서 보다 혈전형성이 월등히 억제됨을 보였으며, 티클로피딘 100 ㎎/㎏ 투여군과 유사하거나 강력한 작용을 보였다. 또한, 티클로피딘 50 ㎎/㎏과 은행잎 추출물 40 ㎎/㎏을 동시에 투여하였을 때는 45%(wet) 및 42%(dry)의 억제도를 보여 티클로피딘 100 ㎎/㎏ 단독투여군에서 보다도 혈전생성이 강력하게 억제됨을 나타내고 있다.
[실험예 4 : A-V shunt 시술 랫트의 혈소판응집도에 미치는 영향]
상기 실험예 3에서 사용한 것과 동일 시료들을 9일간 투여한 후, A-V shunt를 시행하여 생성된 혈전의 무게를 측정하고 동시에 혈액을 채취하여 A-V shunt 후의 ex vivo 혈소판응집도에 미치는 영향을 검토하였다. 즉, 각각의 혈액으로부터 제조한 PRP(채혈한 혈액을 200 X g에서 10분간 원심분리하여 얻은 상등액)에 혈소판응집 유도물질로서 ADP 3 × 10-6M을 가하여 응집을 유도하였다
A-V shunt를 시술한 랫트의 혈소판은 정상 랫트의 혈소판보다 활성화가 되어 있어서. A-V shunt를 시술하지 않은 랫트혈액의 ex vivo 혈소판응집작용을 검색하기 위한 ADP 농도(1 × 10-5M)보다 낮은 농도의 ADP를 사용하여 검색하였으며, A-V shunt를 시행한 정상군 랫트의 최대 혈소판응집도를 100으로하여 응집도를 비교하였다. 그리고, 그 결과를 다음 표 8에 나타내었다.
Figure kpo00008
우선, 대조군으로 사용된 정상군 PRP는 ADP를 가한 후 2.4분내에 최대응집을 나타내었으며, 3분 후에도 89%의 응집도를 유지하였고, 탈응집이 완전히 일어나기까지 5.7분이 걸렸다.
한편, 티클로피딘 50 ㎎/㎏ 또는 100 ㎎/㎏을 단독으로 투여한 랫트의 경우 최대응집은 정상군에 비하여 각각 78%와 72%로 낮았고, 2분 및 3분에서는 각각 74분과 45분, 62분과 21분으로 시간경과에 따라 정상군에 비하여 응집도가 현저하게 낮아짐을 보였다. 또한, 티클로피딘 50㎎과 은행잎 추출물 20㎎(5:2) 병용투여군의 경우 최대, 2분 및 3분에서의 응집도는 각각 67%, 58% 및 27%로서 티클로피딘 100㎎ 투여군과 유사한 정도의 혈소판응집도를 보였으나, 티클로피딘 50㎎과 은행잎 추출물 40㎎(5:4) 투여군은 티클로피딘 50㎎과 은행잎 추출물 20㎎ 투여군보다 혈소판응집도가 최대, 2분 및 3분에서 모두 높게 나타났다.
최대응집을 일으키는 시간과 탈응집이 완전히 일어나기 까지의 전체시간 또한 티클로피딘 단독투여의 경우 100㎎ 투여군이 50㎎ 투여군에서보다 짧았으며, 티클로피딘 50 ㎎/㎏과 은행잎 추출물 20 ㎎/㎏ 병용시 티클로피딘 100㎎단독투여에서와 유사하게 각각 1.6분 및 3.4분이 소요되었고, 티클로피딘 50 ㎎/㎏과 은행잎 추출물 40 ㎎/㎏을 병용했을 때 혈소판의 최대응집을 일으키는 1.8분 및 전체 응집시간 4.0분보다 짧았다.
[실험예 5 : 출혈시간 연장효과]
랫트(수컷)에 시료인 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5일간 투여하였으며, 마지막 시료 투여 1시간 후에 케타민(ketamine; 250 ㎎/㎏)을 근육에 주사하여 마취시켰다. 꼬리의 끝부분으로부터 2㎜의 위치를 면도칼로 잘라낸 후 5초 간격으로 여과지에 피를 찍어내어 출혈이 멎을 때까지의 시간을 측정하였다. 그리고, 그 결과를 다음 표 9에 나타내었다.
Figure kpo00009
그 결과, 상기 표 9에서 보듯이 티클로피딘 50 ㎎/㎏을 투여한 군이 아라빅검(arabic gum)만을 투여한 정상군에 비해 출혈시간이 1.5배 증가하였으며, 100 ㎎/㎏ 투여군에서는 정상군에 비하여 1배의 출혈연장시간을 확인할 수 있었다. 또한, 티클로피딘 50 ㎎/㎏과 은행잎 추출물 20 ㎎/㎏을 병용투여하였을 때, 정상군에 비하여 증가하였지만, 티클로피딘 50 ㎎/㎏을 단독투여한 군에 비하여 출혈시간은 증가하지 않았다. 그러나, 5:4의 용량비율인 은행잎 추출물 40 ㎎/㎏을 동시에 병용투여한 경우 티클로피딘 100 ㎎/㎏의 단독투여군 보다도 출혈시간이 연장되었다.
따라서, 이러한 결과는 은행잎 추출물을 동시에 병용투여할 경우, 티클로피딘의 투여용량을 줄일 수 있으면서 동시에 동등한 효과를 기대할 수 있음을 의미한다.
[실험예 6 : 약제 조성물 16주간 투약후의 백혈구수 및 호중구, 호산구, 호염기구, 대식세포, 임파수구 비율변화]
우선, 본 발명에 따른 약제 조성물의 효능을 알아보기 위하여 하기의 시약 및 기구를 이용하여 투여실험을 수행하였다;
원심분리기, CBC 병(bottle), 5㎖용 글래스 튜브 + 헤파린(200 U/㎖) 20㎕/tube, 2㎖용 에펜도르프 튜브, 3㎖용 주사기 + 21G 니들 10㎖용 주사기, 염용액, 사이토미터, 슬라이드 글래스, 10% 포르말린 용액, 쿨터 계수기(coulter electronics Inc., Hialeah, Fla. 33010, and Mississauga, Ontario), 마이크로톰, HPLV-UV 크로마토그램(Kontron 420, Supelco Inc. Bellefonte. PA).
또한, 본 실험에서 사용한 실험동물로는 체중 60g, 생후 6주령의 스프라그-도레이(Spraque-Dawley) 흰쥐 수컷을 구입하여, 온도 23℃, 습도 50%로 유지되는 조건에서 사료와 식수를 자유롭게 섭취토록 한 조건에서 사육하였다. 그런 다음, 이들 실험동물을 이용하여 실험군을 분류하였다. 즉, 흰쥐를 정상군, 티클로피딘 투여군, 티클로피딘 + 은행잎 추출물 병용투여군(5 : 1, 5 : 2, 5 : 4)으로 나누었다.
이때 투여용량 및 배합비율에 따른 변화는 다음과 같이 정하였다. 즉, 임상적으로 티클로피딘은 1정이 100㎎, 80mg 또는 250㎎으로 1일 상용량이 200㎎ 내지 600㎎으로 되어 있으며, 반면에 은행잎 추출물은 1정에 40㎎ 또는 120㎎으로 1일 투여량이 120㎎ 내지 240㎎이다. 따라서 티클로피딘과 은행잎 추출물의 배합비율을 5 : 1 뿐만 아니라, 보다 독성이 감소를 기대하여 은행잎 추출물의 비율을 증대시킨 5 : 2, 5 : 4의 3가지 경우로 나누어 실험하였다.
Figure kpo00010
상기 시약 및 기구를 이용하여 생수 6주령된 흰쥐에게 티클로피딘을 단독 또는 은행잎 추출물을 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 비율로 16주간 경구로 병용투여하였다. 그리고 마취하 복부 대정맥에서 채혈하여 쿨터 계수기(coulter counter)로 백혈구수를 측정하고, 세포화학적 염색방법으로 혈액 중의 호중구, 호산구, 호염기구, 대식세포, 임파구수의 비율을 측정하였고, 그 결과를 다음 표 11에 나타내었다.
Figure kpo00011
그 결과, 혈액 중 백혈구수는 티클로피딘을 16주간 연속 투여시 정상군에 비해 감소되는 경향을 나타내었으나, 통계적으로 유의성 있는 차이는 없었다. 그리고, 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 비율로 16주간 병용투여시 정상군에 비해 유의성 있는 차이가 없었으며, 또한 티클로피딘 단독 투여군에 비해서도 유의성 있는 차이가 없었다.
한편, 호산구, 호염기구, 대식세포 및 임파구의 경우에 있어서도 티클로피딘을 단독 또는 은행잎 추출물을 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 16주간 병용투여시 정상군에 비해 유의성 있는 차이가 없었다.
그러나, 호중구의 경우 정상 흰쥐에 있어 14.3 ± 1.5%인데 반해, 티클로피딘 단독 투여군의 경우 10.5 ± 1.1%로 감소되었다(P＜0.05). 반면에, 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5 : 2의 비율로 16주간 병용투여시 15.0±1.8%로 티클로피딘 단독 투여시에 비해 유의성 있게 회복되었다(P＜0.05).
[실험예 7 : 16주간 약제 조성물 투약후, 2주간 휴약시의 백혈구수 및 호중구, 호산구, 호염기구, 대식세포, 임파구수 비율 변화]
실험예 6과 동일하게 16주간 약물을 투여한 후, 2주간 휴약시킨 군을 따로 사육하였다. 즉, 다음 표 12에 나타낸 바와 같이 생후 6주령된 흰쥐를 정상군, 티클로피딘 투여군, 티클로피딘 + 은행잎 추출물 병용투여군(5 : 2)의 3군으로 나누고, 16주간 경구로 병용투여후 2주간 휴약한 경우의 혈액 중 백혈구수 및 호중구, 호산구, 호염기구, 대식세포, 임파구수의 비율을 상기 실험예 6과 동일한 방법에 의하여 측정하였다.
Figure kpo00012
상기에서 측정한 결과는 다음 표 13에 나타내었다.
Figure kpo00013
전술한 표 11에서 티클로피딘을 16주간 경구투여시 총 백혈구의 경우 감소경향을 나타내었으며, 호중구의 경우에는 유의성 있게 감소되었다. 그러나, 티클로피딘을 16주간 경구투여후 2주간 휴약시 총 백혈구수의 경우 여전히 감소 경향을 나타내었으나, 호중구의 경우에는 정상군과 유사하게 회복되었다. 또한, 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5 : 2로 병용투여한 경우에도 정상군 및 티클로피딘 단독투여군과 유사한 결과를 나타내었다.
[실험예 8 : 16주간 약제 조성물 투약후의 골수세포수 변화]
티클로피딘에 의한 골수에서 백혈구 전구세포의 감소를 측정하고자 생후 6주령된 흰쥐에게 티클로피딘을 단독 또는 은행잎 추출물을 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 비율로 16주간 투약한 후, 골수세포수를 측정하였다.
보다 구체적으로 살펴보면, 우선 골수세포(granuloid cell, lymphocyte, plasma cell)수를 측정하기 위하여 흰쥐의 대퇴부를 절단한 뒤 주위 근육조직을 제거하였고, 골단 양쪽을 절단하여 길이 약 2㎝의 대퇴골을 얻었다. 3㎖용 주사기(21G)에 염용액 1㎖를 취해 공수부위로 주입하여 관류시킨 뒤, 관류액을 2㎖용 에펜도르프 튜브에 받아 2000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 침전된 세포층에 투르크 용액(Turks sol.; 10% 아세트산 + 백혈구 염색액) 1㎖를 가하였다. 그런 다음, 튜브를 부드럽게 혼합하고, 2000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 침전된 세포층에 염용액 1㎖를 가하였다. 다시 튜브를 부드럽게 혼합하고, 2000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 세척하였다. 그 뒤, 상등액을 제거하고 침전된 세포층에 염용액 0.5㎖를 가하여 혼합한 후, 사이토미터에 한방울 떨어트리고, RRRRR 5부분(4모퉁이 및 중앙)의 세포수를 측정하였다. 다음 식에 의해 골수세포수를 산출하였다;
읽은갯수×50배×100㎕=백혈구전구세포수/대퇴골
그 결과, 대퇴골의 골수세포수를 도 1에 나타내었다.
즉, 골수중 백혈구 전구세포수는 티클로피딘을 16주간 연속 투여시 정상군에 비해 유의성 있게 감소되었다. 반면에, 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5 : 2의 비율로 16주간 병용투여시 티클로피딘 단독 투여시에 비해 유의성 있게 회복되었다.
또한, 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5 : 1 또는 5 : 4의 비율로 16주간 경구로 병용투여시에도 티클로피딘 단독 투여시에 비해 증가되는 경향을 나타내었으나, 통계적으로 유의성 있는 차이는 없었다.
이러한 결과는 앞에서의 혈액 중 호중구 변화와 일치되는 결과를 나타내었다.
[실험예 9 : 16주간 약제 조성물 투약후, 2주간 휴약시의 골수세포수 변화]
상기 실험예 8과 동일한 방법으로 생후 6주령된 흰쥐에서 티클로피딘을 단독 또는 은행잎 추출물과 5 : 2의 비율로 16주간 경구로 병용투여한 다음, 2주간 휴약하였다. 그리고, 대퇴골 중 골수세포수의 변화를 측정하였고, 그 결과를 제2도에 나타내었다.
상기 제1도에서 티클로피딘을 16주간 경구투여시 골수세포수가 유의성 있게 감소되었으며, 은행잎 추출물과 병용투여시에는 정상군과 유사하였다. 반면에, 16주간 티클로피딘을 연속투여 후, 2주간 휴약시 대퇴골 중 골수세포수가 정상군과 유사하게 회복되었다. 또한 티클로피딘과 은행잎 추출물을 병용투여시에도 정상군 및 티클로피딘 단독투여시와 유사한 결과를 나타내었다.
[실험예 10 : 16주간 약제 조성물 투약후의 골수세포 조직검사]
티클로피딘에 의한 골수에서 백혈구 전구세포의 감소를 측정하고자 생후 6주령된 흰쥐에게 티클로피딘을 단독 또는 은행잎 추출물을 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 비율로 16주간 투약한 후의 골수세포 조직을 검사하였다.
즉, 보다 구체적으로 살펴보면, 골수세포 조직검사를 수행하기 위하여 각 군당 1마리씩 대퇴골을 절단하여 10% 포르말린 용액중에 저장 보관하였다. 적출한 대퇴골을 탈회액으로 탈회한 후 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀으로 포매하였다. 파라핀에 포매된 대퇴골 조직을 4㎛의 두께로 박절하여 헤마토사일린(hematoxylin)과 에오신염색을 실시한 후, 광학 현미경하에서 400배로 관찰하였다.
우선, 생후 6주령된 흰쥐에게 티클로피딘을 단독 또는 은행잎 추출물을 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 비율로 16주간 경구로 병용투여한 경우의 결과인 대퇴골의 골수세포 조직검사의 사진을 제3도에 나타내었다.
정상군에 비해 티클로피딘 단독 투여군의 골수 조밀도는 전체적으로 지방세포의 침윤에 의한 공포화 현상이 중증도를 나타났으며, 혈소판 전구세포인 메가카리오사이트(megakaryocyte)는 골단(epiphsis) 부위에서 정상군보다 감소하였다(표 14). 백혈구 전구세포 중 증식단계인 미엘로사이트(myelocyte)는 정상군보다 현저히 감소하였으나, 백혈구로의 성숙단계인 밴드 그래뉼로사이트(bandgranulocyte)의 감소는 관찰되지 않았다.
Figure kpo00014
한편, 티클로피딘과 은행잎 추출물 병용투여군의 경우 골수세포의 조밀도는 모든 군에서 중증도 이상으로 정상군과 유사하였으나, 5 : 4 군에서는 오히려 미약한 감소가 관찰되었다. 그 외의 골수 조성은 정상군과 유사하였다.
즉, 티클로피딘 투여군은 정상군에 비해 지방세포에 의한 공포화의 증가 및 조밀도의 감소 등 골수세포의 위축성 소견이 나타났으며, 백혈구 전구세포인 미엘로사이트의 감소는 호중구 감소증과 관련된 억제성 변화로 사료된다.
티클로피딘과 은행잎 추출물 병용투여군에서는 혼합비율에 따른 유의성 있는 변화는 관찰되지는 않았으나, 5 : 2 병용투여군의 경우, 골수 조밀도 및 세포의 조성이 정상군에 거의 근접해 있는 것으로 평가되었다.
[실험예 11 : 16주간 약제 조성물 투약후, 2주간 휴약시의 골수세포 조직검사]
티클로피딘에 의한 골수에서 백혈구 전구세포의 감소를 측정하고자 생후 6주령된 흰쥐에게 티클로피딘을 단독 또는 은행잎 추출물을 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 비율로 16주간 경구로 병용투여 한 후, 2주간 휴약 후의 골수세포의 조직을 검사하였다.
또한, 티클로피딘을 16주간 경구투약 후, 2주간의 휴약기간을 거친 티클로피딘 휴약군의 경우 골수의 조밀도는 중증도 이상으로 정상군과 유사하였다(참조 표 15 및 제4도).
Figure kpo00015
또한 백혈구 전구세포 중 증식단계인 미엘로사이트의 경우에서도 티클로피딘 단독투여군에 비해 증가경향이 뚜렷하였으며, 거의 정상상태로의 회복도를 보여주었다. 따라서 티클로피딘을 16주간 연속 투여 후 2주간 휴약시 골수세포의 위축성 소견의 소실과 미엘로사이트의 증가 등 회복되는 경향을 나타내는 소견으로 사료된다.
또한, 혈소판 전구세포인 메가카리오사이트는 골단 부위에서 정상군과 가까이 증가하였다.
한편, 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5 : 2의 비율로 병용하여 16주간 투여후, 2주간 휴약시 미엘로사이트의 미약한 감소가 나타났다.
[실험예 12 : CFU-C 분석]
골수세포를 생쥐 대퇴골에서 분리하였다. 다음, 골수세포 중 모노뮤클리어 세포(monomuclear cell)를 비중 1.1의 퍼콜(Percoll) 시약을 사용하여 각각 비중이 1.090, 1.075, 1.063의 3층으로 나눈 후, 밀도차 원심분리방법으로 분리하여 얻었다. 즉, 25㎖용 원심분리용 튜브에 골수세포층을 먼저 넣고, 그 위에 20㎖ 용액을 비중이 큰 것부터 3층을 지어 넣었다. 4℃에서 2000 rpm으로 30분간 원심분리 한 후, 가운데층에서 골수세포를 얻었다. 이중 T-임파구는 면양 적혈구를 이용한 E-로제트(E-rosette) 생성방법으로 제거시켰다. 얻어진 세포를 핸크밸런스드 염용액(Hank balanced salt solution; HBSS)으로 3회 세척하고, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove modified Dulbecco medium; IMDM GIBCO) 중에 분산시켰다.
배양액중 콜로니-형성군(Colony-forming unit in culture;CFU-C)에 대한 티클로피딘의 영향을 다음과 같이 실험하였다. 골수세포를 0.3% 한천(DIFCO사), 15% 소태혈청(GIBCO사), 100U 그래뉼로사이트-대식세포 콜로니-자극인자(CSF-CHUGAI), 0.02㎖ 티클로피딘, 은행잎 추출물의 각각 단독 또는 병용하여 함유한 상기의 1㎖ IMDM 중에 2 × 105수로 현탁하여 넣고 배양하였다. 이때 티클로피딘의 농도는 30 ng/㎖로 하였다.
또한, 티클로피딘 30 ng/㎖의 농도에 대해 은행잎 추출물을 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 비율로 병용하여 각각 처치한 후, 5% CO2인큐베이터내에서 37℃, 100% 습도를 유지하면서 10일간 배양하였다. 이때, 세포 억제효과는 50개 이상의 세포로 이루어진 콜로니수를 역위현미경하에서 측정하여 티클로피딘이 들어가지 않은 대조군에 대한 백분율(%)로 세포 억제효과를 측정하였다.
한편, CFU-C에 대해 약 50% 정도 억제효과를 나타내던 티클로피딘 30 ng/㎖에 은행잎 추출물을 각각 5 : 1, 5 : 2, 5 : 4의 비율로 병용하여 처치시 CFU-C의 변화를 제5도에 나타내었다. 즉, 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5 : 1 및 5 : 4로 병용처치시에는 티클로피딘 단독 처치시에 비해 유의성 있는 차이가 없었으나, 5 : 2로 병용처치시에는 유의성 있게 증가되어 대조군과 유사하게 회복되는 경향을 나타내었다.
이러한 결과는 앞의 생체내 실험에서 16주간 티클로피딘을 경구투여시 혈액중 호중구 및 골수세포수의 감소를 초래하였던 결과와 일치된다. 또한 티클로피딘과 은행잎 추출물을 5 : 2로 병용처치시 호중구 및 골수세포수의 감소가 정상군과 유사하게 회복되었던 결과와도 일치된다.
[실험예 13 : 골수세포에 대한 지질과산화 측정]
흰쥐의 대퇴부를 절단하여 주위 근육조직을 제거하고 대퇴골(femur)을 얻었다. 3㎖용 주사기에 식염수 1㎖를 취해 골수부위로 주입하여 관류시킨 후, 관류액을 튜브에 받아 3,000rpm에서 15분간 원심 분리하였다. 상등액을 제거하고 침전된 골수세포층을 IMDM으로 분산시키고, 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 세포수를 측정하여 107cell/㎖로 희석하였다. 정상군, 티클로피딘처치군, 티클로피딘+은행잎 추출물 병용처치군(5:2) 3군으로 나누고, 골수세포에서 정상군에는 10㎜ ol/L의 H2O220㎕, 티클로피딘 10-5g/㎖, 티클로피딘+은행잎 추출물 병용처치군에는 티클로피딘 10-5g/㎖에 은행잎 추출물 4 X 10-6g/㎖을 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 골수세포에 대한 지질과산화 정도를 TBA법에 의해 TBA 시액과의 반응에서 생성된 말론디알데하이드(malondialdehyde)의 양을 광학분석기(spectrophotomerter)로 측정하므로써 살펴본 결과는 다음 제6도에 나타내었다. 즉, 정상군의 TBA 측정기가 0.23 ± 0.02, 티클로피딘(10-5g/㎖)이 0.30 ± 0.02로 티클로피딘에 의해 뚜렷한 세포손상이 일어났음을 보여주었다. 한편, 은행잎 추출물(4 X 10-6g/㎖)과 병용한 결과 MDA가 0.24 ± 0.01로 대조군과 유사한 정도로 티클로피딘 단독 투여군에 비해 현저히 감소하였다. 이는 은행잎 추출물이 항산화작용에 의해 티클로피딘에 의한 세포손상에 억제적으로 작용하였음을 알 수 있다.
우선, 상술한 실험에 6~13의 결과를 살펴보면, 생후 6주령된 흰쥐에게 티클로피딘(약 300㎎/㎏/day) 100중량부를 식수에 용해하여 16주간 투여한 후 혈액 및 골수에서 호중구 감소증의 독성을 확인하고, 나아가 항산화작용을 지닌 은행잎추출물 각각 20, 40, 80중량부의 비율로 병용투여하여 호중구 감소증의 감소여부를 측정하였다. 그 결과, 티클로피딘을 16주 투여후에 유의성 있는 혈중 호중구 감소증을 초래하였으며, 골수세포의 감소와 특히, 백혈구 전구세포인 미엘로사이트의 감소를 초래하였다. 또한, 혈액중 혈소판 수의 감소경향과 골수 중 전구세포인 메가카리오사이트의 감소를 초래하였다.
이들의 억제효과는 티클로피딘을 16주간 연속투여한 후 2주간 휴약시 정상으로 회복되었다. 또한, 은행잎 추출물 40중량부를 병용처리하는 경우 혈액중의 호중구 감소증 및 골수세포의 감소가 정상군과 유사하게 회복되었다. 그러나, 티클로피딘과 은행잎 추출물을 20 또는 80중량부로 병용처리한 경우에는 유의성 있는 억제효과를 나타내지 못했다.
한편, 시험관내 실험으로 호중구 전구세포를 배양하여 세포발육에 대한 억제 효과를 측정한 바, 티클로피딘은 용량의존적으로 억제하여 세포독성을 나타내었으나, 은행잎 추출물과 병용처치한 경우는 감소되었다. 또한 시험관내에서 골수세포에 과산화효소로 산화시킨 반응에서 티클로피딘은 증가를 초래하였지만, 은행잎 추출물과 병용처치한 경우는 억제되었다.
이상의 결과는 티클로피딘이 대사산물보다는 그 자체로서 골수에 있는 호중 구전구세포에 대한 세포독성을 통해 혈액중 호중구 감소증을 초래하며, 항산화작용을 지닌 은행잎 추출물은 티클로피딘의 이러한 독성을 억제시킨다는 것을 제시해준다. 특히, 본 생체내 실험에서는 티클로피딘 100중량부에 대하여 은행잎 추출물 40중량부를 배합한 경우가 가장 바람직한 효과를 나타내었다.
이상의 결과를 종합하여 볼 때, 티클로피딘은 은행잎 추출물과 병용시켰을 때 투여량, 투여기간 및 작용 측정방법에 따라 실험결과에 차이는 있으나, 티클로피딘만을 단독으로 투여하였을 때와 비교하여 유사하거나 월등히 강력한 항혈소판, 항혈전작용을 가지고 있음을 확인할 수 있었으며, 따라서 티클로피딘을 은행잎 추출물과 병용하므로써 티클로피딘의 투여 용량을 낮출 수 있을 것으로 기대되며, 따라서 티클로피딘의 부작용을 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (7)

  1. 티클로피딘(Ticlopidine)과 은행잎 추출물을 함유한 것을 특징으로 하는 항혈전성 약제조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 은행잎 추출물은 티클로피딘 100 중량부에 대하여 10~240중량부를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 티클로피딘과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약제 조성물은 정제, 발포정, 과립제 및 경질캅셀제형태로 제형하는 것을 특징으로 하는 단위투여 제형인 티클로피딘과 은행잎 추출물을 함유한 약제조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단위투여 제형내의 티클로피딘 함량은 50㎎~600㎎, 은행잎 추출물 함량은 20㎎~240㎎을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
  5. 티클로피딘과 은행잎 추출물을 유효성분으로 함유시킨 것임을 특징으로 하는 항혈전제.
  6. 제5항에 있어서, 혈전에 의해 유도되는 질환은 허혈성 뇌혈관장해, 관상동맥질환, 만성동맥폐색증, 혈관수술 및 뇌지망막하 출혈 수술후의 혈전·색전인 것임을 특징으로 하는 항혈전제.
  7. 제5항에 있어서, 상기 약제는 티클로피딘에 의한 호중구감소증 및 무과립구증을 억제할 수 있는 것임을 특징으로 하는 항혈전제.
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