KR100254963B1

KR100254963B1 - 세포 배양용 무혈청 배지

Info

Publication number: KR100254963B1
Application number: KR1019970063663A
Authority: KR
Inventors: 이재정; 윤태욱
Original assignee: 조생현; 보령제약주식회사
Priority date: 1997-11-28
Filing date: 1997-11-28
Publication date: 2000-05-01
Also published as: KR19990042747A

Abstract

본 발명은 RDF(RPMI1640:DMEM:Ham's F-12) 혼용 기본 배지에 ITS-복합체, 리놀레산-BSA, 글루카곤, 트롬빈, 티로칼시토닌 또는 덱사메타손이 포함되어 있는 세포 배양용 배지에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 혈청을 첨가하지 않으면서도 혈청 첨가 배지에서의 사람 인슐린 세포 성장에 가까운 성장을 보이는, 세포가 요구하는 성분이 정확히 공급되어 있고, 적은 비용으로 제조 가능한 무혈청 배지를 얻을 수 있다.

Description

세포 배양용 무혈청 배지{SERUM-FREE MEDIUM FOR CULTURE OF CELL}

본 발명은 세포 배양용 무혈청 배지에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 불멸화 인슐린 분비 인체 베타 세포주를 배양하는데 적합한 무혈청 배지에 관한 것이다.

생체에서와는 달리, 체외에서 인위적으로 동물 세포를 배양하기 위하여 배양 배지를 공급하려면, 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거한 생체의 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주어야 한다. 따라서, 체액을 근거로 배양 배지 조성을 결정하고 이 결정된 배양 배지를 선택하여 혈청을 적정 비율로 세포에 맞게 첨가한 뒤 세포 배양에 이용하여 왔다. 이런 방법으로서, 배지 개발 초기에는 1950년경 모건(Morgan) 등이 체액 조성을 근거로 M199 배지를 만들어 태아 세포(primary chick)를 배양하였다(Morgan, et al., 1950). 이어서 개발된 주요 배지로는, 이글(Eagle)이 사람과 쥐의 태아 세포 배양에 이용한 기초 배양액(basal medium)(Eagle, 1955), 쥐의 태아 세포 배양에 이용한 배양액(Dulbecco's modified eagles medium, Dulbecco, et al., 1959), Ham's F-12(Ham, 1965)와 모르(Moore) 등이 햄스터 종양 세포 배양에 이용한 RPMI-1640(Moore et al., 1967) 등이 있다.

세포 배양시, 세포의 영양 요구성에 따라 상기의 기본 배지에 5 내지 20%의 혈청을 첨가하여 사용한다. 혈청에는 세포의 성장과 기능을 촉진하는 인슐린 또는 폴리펩티드 계통의 다양한 호르몬과 세포의 분열과 기능을 조절하는 성장 인자들, 그리고 피브로넥틴과 같은 부착 및 확산 인자들, 결합 단백질로 트랜스페린이 있으며, 지질, 무기질 등 미량 요소들이 다수 포함되어 있다. 혈청은 또한 완충액으로서 배양액의 삼투압과 pH를 조절하며, 단백질 분해 저해 및 물리적 충격에서 세포를 보호할 수 있는 점성 작용도 가지고 있다(Griffiths, 1987). 따라서, 기본 배지에 일정 농도의 혈청을 넣어 배양용 배지를 만들고 있다. 이처럼 다양한 기능을 가진 물질들이 포함된 혈청을 사용하여 동물 세포를 배양할 수 있다. 그러나, 세포 배양을 이용하여 특정한 종류의 단백질인 유용 물질을 산업적으로 생산하고자 하는 경우, 다음과 같은 몇가지 문제점이 있다.

첫째, 혈청에는 많은 종류의 다양한 단백질이 포함되어 있으므로 세포 배양후 얻고자 하는 유용 물질을 분리 및 정제해내기 어렵다. 둘째, 지역적 특수성 및 미량 포함된 요소로 인하여 혈청 제조시(Lot.)마다 성분이 달라지며 확인이 되지 않은 여러 성분이 존재하므로, 세포가 요구하는 성분을 정확히 공급하기 어렵고 특정 세포에 대한 성장 저해 현상이 관찰되는 경우도 있다. 셋째, 혈청은 고가이므로 세포의 산업적인 대량 배양이나 일반적인 실험시 생산 원가 및 실험비가 많이 든다. 마지막으로, 마이코플라즈마 또는 바이러스의 주된 오염원이 되기도 한다.

상기 문제점으로 인하여, 혈청의 농도를 낮춘 저혈청 배지나 혈청을 전혀 사용하지 않는 무혈청 배지의 개발이 요구되었다.

현재 시판되거나 개발 중인 저혈청 및 무혈청 배지의 종류로는, 혈청의 농도를 낮추고 부분적으로 혈청의 대체 물질을 첨가하는 경우, 혈청 대신에 호르몬이나 성장 인자들 또는 정제 단백질을 첨가하는 경우 및 화학적 조성이 밝혀진 단백질을 첨가하는 경우로 분류되어지는데, 혈청 대신에 호르몬이나 성장 인자들 또는 정제 단백질을 첨가하는 경우가 가장 많이 이용된다. 특정 세포주에 대한 무혈청 배지는 실험실에서의 개발 이외에도 제조사로부터 공급받을 수 있는 기회도 있다(Ratafia, 1989). 무혈청 배지 중에도, 혈청 대신 성장 호르몬의 세포 성장 촉진제(Hayashi et al., 1976)로 셀레나이트(selenite), 트랜스페린(transferrin), 알부민 및 레시틴을 첨가하는 무혈청 배지가 개발되었으며(Guilbert, 1976). 예를 들면, 사람 직장암 세포(Murakami et al., 1980), 단세포군항체 생성 세포용 무혈청 배지(Wolfe et al., 1988)가 연구되었다.

한편, 쥐의 섬(islet) 종양 세포주를 이용한 호르몬과 성장 인자들에 대한 연구(Fong et al., 1981)도 발표되었다. 그러나, 동물 종간(species specific) 또는 세포주(cell specific)의 특이성에 따라 영양 요구성이 다르므로, 쥐의 섬(islet) 종양 세포주를 이용한 실험 결과를 사람의 종양 세포주 배양에 직접 적용할 수는 없다. 따라서, 본 발명자들은 사람의 인슐린 분비 세포주에 적합한 무혈청 배지 조성을 찾아내기 위하여 부단히 연구한 결과, 효율적인 배양 환경을 제공하는 기본 배지와 필수 호르몬, 펩티드의 성분의 조합을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명에서는 세포가 요구하는 성분이 정확히 배합되어 있어, 혈청 첨가 배지에서와 동등한 불멸화된 인간 췌장 베타 세포의 성장 환경을 제공하는 무혈청배지를 저렴한 비용으로 제조하는 것을 목적으로 한다.

도 1a 내지 도 1f는 콜라겐, 젤라틴으로 각각 코팅된 용기 및 코팅되지 않은 용기에서 3일간 배양시킨 HB 세포의 위상차 현미경의 사진(x100)이고,

도 2 및 도 3은 호르몬 및 성장 인자 조합 RDF 배지에서의 세포수를 나타낸 그래프이다[각 값은 여섯번 실험한 평균(+ S.E.M.)으로 나타낸다].

※ 도면 주요 부분에 대한 부호의 설명

A: RDF/FCS(1%)

B: RDF(기본 배지)

C: ITS-복합체 + 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 티로칼시토닌 + 소마토스타틴 + 트롬빈 + 덱사메타손

D: 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 티로칼시토닌 + 소마토스타틴 + 트롬빈 + 덱사메타손

E: ITS-복합체 + 글루카곤 + 티로칼시토닌 + 소마토스타틴 + 트롬빈 + 덱사메타손

F: ITS-복합체 + 리놀레산-BSA + 티로칼시토닌 + 소마토스타틴 + 트롬빈 + 덱사메타손

G: ITS-복합체 + 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 소마토스타틴 + 트롬빈 + 덱사메타손

H: ITS-복합체 + 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 티로칼시토닌 + 트롬빈 + 덱사메타손

I: ITS-복합체 + 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 티로칼시토닌 + 소마토스타틴 + 덱사메타손

J: ITS-복합체 + 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 티로칼시토닌 + 소마토스타틴 + 트롬빈

K: 소 태아 혈청

L: RDF

M: ITS-복합체

N: 티로칼시토닌 + 트롬빈

O: 리놀레산-BSA + 소마토스타틴

P: 리놀레산-BSA + 소마토스타틴 + 트롬빈

Q: 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 트롬빈

R: 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 소마토스타틴 + 트롬빈

S: 리놀레산-BSA + 티로칼시토닌 + 소마토스타틴 + 트롬빈

T: 리놀레산-BSA + 글루카곤 + 티로칼시토닌

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의하면 RDF (RPMI1640:DMEM:Ham's F-12) 혼용 기본 배지에, ITS-복합체(Insulin-Transferrin-Selenite Complex), 리놀레산-BSA, 글루카곤, 티로칼시토닌, 소마토스타틴, 트롬빈, 덱사메타손이 포함되어 있는 세포 배양용 배지가 제공된다.

본 발명에 의한 배지는, 1) 저혈청 배지의 세포 적응, 2) 기본 배지의 선별, 3) 부착성 세포의 경우 부착 성분 선별, 4) 호르몬 및 성장 인자 검색, 5) 검색된 호르몬 및 성장 인자의 최적 농도 결정, 및 5) 이들을 최종적으로 조합 단계를 통하여 선정되었다.

세포 배양은 일반적으로 기본 배지에 혈청을 약 5 내지 20% 정도 사용하는데, 세포주의 저혈청 배지의 적응에 있어서, 정상 세포의 경우에는 기본 배지의 혈청을 2%까지 첨가하여도 혈청의 첨가 비율을 감소시킴에 따라 발생할 수 있는 세포의 형태적 변화, 고유 생성물의 변화가 나타나지 않으며, 종양 세포의 경우에는 혈청 첨가 비율이 2% 이하에서도 세포의 성장 및 기능의 변화가 없다(Doyle et al., 1993). 따라서, 본 발명에서는 불멸화된 인간 췌장 베타 세포를 사용하여 2% 이하까지 적응시켰다.

무혈청 배지로 사용되어지는 기본 배지를 선택함에 있어서, 연구 및 시판되어지는 기본 배지에 따라 구성 성분의 특성이 다르기 때문에, 아미노산 종류, 비타민, 미량 요소, 핵산 등 여러 요소를 고려하여 세포가 요구하는 성분을 단일 배지로 만들거나 단일 배지를 적정 비율로 조합하여 혼합형 기본 배지를 만들고 이 기본 배지에서의 세포 적응력을 분석하였다.

기본 배지의 구성 성분은 배지의 종류에 따라 상이하며, 주로 약 50여종의 성분으로, 질소원으로 이용되는 아미노산이 적게는 13종에서 많게는 20여종, 무기 염류로는 Ca²⁺, K⁺, Mg²⁺, Na⁺, HPO₄ ^-등이 10종 내외로 포함되어 배지 안의 이온 및 삼투압 유지에 이용되며, 비타민의 경우 비오틴, 판토테네이트(panthothenate), 염화 콜린(choline chloride), 엽산(folic acid), 티아민, 비타민 B₁₂등이 10종 내외로 포함되어 배지에서의 효소 촉매 작용에 사용되고, 그 외 물질로는, 핵산인 히포크산틴, 티미딘, 탄소원으로 이용되는 포도당, 세포막 구성분으로 작용하는 리놀레산, 리포산 등이 포함되어 있다. 이와 같은 성분들은 세포 종류에 따라 세포 성장에 각기 다른 영향을 주기 때문에, 배지의 구성 성분을 파악하여 단일 및 혼합형 배지를 제조하여 실험에 적용하여야 한다.

본 발명에 이용한 기본 배지의 특성을 보면 다음과 같다(표 1).

배지 조성 비교(RPMI-1640, DMEM, Ham's F-12)

배지종류배지종류	RPMI-1640	DMEM	Ham's F-12
아미노산(종)	20	15	20
유기염(종)	5	7	9
다른 성분(종)	3	2	8
비타민(종)	11	8	10

배지별 특성을 비교하면 RPMI-1640은 아미노산이 20종, 비타민이 11종 포함되어 있고, DMEM은 다른 배지에 비하여 아미노산과 비타민이 다량 포함된 고농도 포도당 배지이며, Ham's F-12는 무기 염류와 소디움 피루베이트, 히포크산틴, 푸트레신(putrescine) 등 다른 구성분들이 다양하게 포함되어 있다. 성분별로 비교하면, 아미노산의 경우 RPMI-1640이 DMEM 보다 5종이 많은 반면 농도는 약 2 내지 4배가 적으며, F-12도 RPMI-1640과 같이 20종이나 농도는 약 2배 정도 적게 포함되어 있다. 다른 구성분은, RPMI-1640의 3종과 DMEM 2종에 비하여 F-12 배지에 히포크산틴, 리포산, 푸트레신, 티미딘 등이 다양하게 포함되어 있으며, 비타민은 RPMI-1640이 11종으로 가장 많고, F-12에는 미량 첨가되어 있으며, DMEM에는 RPMI-1640보다 약 4배의 농도로 첨가되어 있다.

무혈청 배지에는 혈청이 첨가되지 않기 때문에, 부착 및 확산 인자인 피브로넥틴(Gold, 1979), 페투인(Fisher, et al., 1958), 혈청 스프레딩 인자[serum spreading factor(Honsik, 1989)] 등이 없다. 따라서, 부착성 세포의 배양에 있어서는 세포의 부착이 이루어지지 않아 성장이 되지 않으므로, 배양 배지 안에 부착 인자를 첨가하거나 배양 용기 표면에 부착 기능을 부여하기도 한다. 시판되고 있는 종류가 다양하나(Sigma, Gibco), 첨가 형태로는 피브로넥틴, 배양 용기 도포에는 콜라겐이 주로 사용된다.

무혈청 배지에는 혈청이 첨가되지 않기 때문에 특정 세포의 증식에 적합한 호르몬이나 성장 인자를 선택한 기본 배지에 첨가해 주어야 한다(Gospodarowicz, et al., 1976; Mather, et al., 1979; Murakami, 1980; Henry, 1981).

호르몬 및 성장 인자들의 역할을 몇가지 살펴보면, 표피 성장 인자[epidermal growth factor(EGF)]는 섬유아세포(fibroblasts)의 DNA 복제를 조절(D. Barnes et al., 1977), 프로스타글란딘(prostaglandin)은 DNA 복제를 조절(A.M. Otto, 1982), 코르티솔(cortisol)은 성장 인자의 생성을 자극하는 역할(Bridson, 1969), 인슐린, EGF, 글루코코르티코이드, 콜레라 톡신은 미토겐 효과[mitogenic effect(Mckeehan, 1984)] 등을 나타내며, 대부분의 성장 인자 및 호르몬들이 세포에서 DNA 합성을 촉진하거나 세포의 증식에 관여하는 미토겐 폴리펩티드들로 알려져 있다(Lazar, 1987). EGF는 경우에 따라 무혈청 배지 배양에서 사람 유표피 암종(epidermoid carcinoma)의 성장을 저해하는 경우도 있다 (D.W.Barnes, 1982).

혈청에는 여러 가지 호르몬 및 성장 인자들이 미량 첨가되어 있으므로 세포주에 영향을 줄 수 있는 인자를 선별하여 배양액에 첨가한다. 일반적으로 많이 사용하는 것이 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄(Guilbert, 1976) 등이며 인슐린-트랜스페린-나트륨 셀레나이트(ITS Complex)로 시판되어지는 것을 사용할 수도 있다.

따라서, 본 발명에서는, 불멸화된 인간 췌장 베타 세포주를 이용하여 기본 배지 및 호르몬과 성장 인자 등이 사람 인슐린 세포 성장에 미치는 영향을 조사하여 선별하고, 선별된 성분의 적합 농도를 결정하여, 이들 실험 결과를 근거로 전체 요소를 혼합함으로써 무혈청 배지를 얻는다. 그 과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

실시예 1

저혈청 배지의 적응

불멸화된 인간 췌장 베타 세포[Dr. Roger James(Uiversity of Leichester)로부터 입수]를 FCS(소태아혈청) 10%(v/v)가 포함된 배지에서 배양하면서 혈청의 농도를 7.5%, 5%, 2%, 1%로 점차적으로 낮추어가며 세포를 적응시켰다. 세포의 탈착은 트립신/EDTA(GIBCO)를 1mg/ml 농도로 사용하였으며 혈청의 농도가 높은 부분에서는 RPMI/FCS로, 5% 이하에서는 대두 트립신 저해제(Sigma)로 트립신을 중화하였으며, 배지 플라스크(25cm², Falcon)에 1x10⁵세포/6∼7ml로 배양하였으며 1주일 간격으로 세포의 계대배양을 하였다.

저혈청 배지에 적응된 세포들은 세포 동결 배양액[cell freezing medium (Sigma, C6295)]을 이용하여 냉동, 보존하였다.

RPMI/FCS 10%에 배양된 인간 췌장 베타 세포(HB-세포)를 배지 플라스크 (25cm²)에 1x10⁵세포로 배양하여, 혈청의 농도를 단계적으로 7.5%, 5%, 2.5%, 1%로 5번의 계대배양을 통하여 적응시키면서 초기 배양하였다. 트리플리케이트 12 웰 플래이트(Nunc)의 HB-세포(1x10⁵세포/웰)를 7일간 배양한 뒤 세포수를 측정한 결과, FCS 10%, 7.5%, 5%, 2.5%, 1%를 포함하는 RPMI/FCS 배양액(3ml)에서 배양된 HB-세포 수는 표 2와 같았다. 표에서, 10% FCS를 첨가하여 배양한 세포수가 5% FCS에서는 약 73%의 둔화율을 보였으며, 1% 적응 세포에서는 약 7%의 성장이 느린 것으로 나타났다.

저혈청 배지의 초기 계대적응에 따른 세포수

FCS 농도(%)세포수	10	7.5	5	2.5	1
Cell No.(x10⁵)	2.48±0.15	1.82±0.16	1.20±0.05	0.42±0.04	0.18±0.01

FCS 10%에서 1%까지 각 단계에 적응된 세포를 이용하여 저혈청 배지에서 5일간 배양 뒤 세포수를 측정하였다. 듀플리케이트 25cm²배지 플라스크(Falcon)의 HB-세포(5x10⁵세포/웰)를 5일간 배양한 뒤 세포수를 측정한 결과, FCS 10%, 7.5%, 5%, 2.5%, 1%를 포함하는 RPMI/FCS 배양액(3ml)에서 배양된 HB-세포 수는 표 3과 같았다. 표에서, FCS 10% 배지에서 FCS 2.5%까지의 혈청농도에서는 거의 유사한 세포 성장을 보였다. 이것은 대체적으로 각 단계의 적응 세포주가 저혈청 배지로 적응된 것으로 보이며, FCS 1% 첨가 배지에서도 적응 세포주가 10% 적응 세포주에 비해 약 53%의 성장 수치를 보여, 초기 적응 세포의 7%에 비하여 상당히 적응된 결과를 보여주고 있다.

저혈청 배지의 초기 계대적응에 따른 세포수

FCS 농도(%)세포수	10	7.5	5	2.5	1
Cell No.(x10⁵)	1.44±0.20	1.02±0.02	1.30±0.15	1.12±0.14	0.76±0.05

실시예 2

기본 배지의 선별

기본 배지로는 Gibco 제품인 RPMI-1640(R), Ham's F-12(F), DMEM(D), 비교 배지로는 무혈청 배지인 H-Max(Hybri-Max, Sigma)를 사용하였다. 단일 배지인 RPMI(RPMI-1640, R), F-12(Ham's F-12, F), DMEM(D), 이들을 1:1 로 혼합 사용한 D/F(DMEM:F-12), R/D(RPMI-1640:Ham's F-12), R/F(RPMI-1640:Ham's F-12), 이들을 1:1:1로 혼합한 RDF(RPMI-1640:DMEM:Ham's F-12)를 조성한 뒤, 25mM HEPES, 1.2mg/ml 중탄산 나트륨 및 항생제인 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하고, FCS(1%)에 적응된 세포를 이용하여 기본 배지의 선별 실험을 하였다. 비교 배지는 RPMI/FCS(RPMI-1640, sodium pyruvate, L-glutamine, HEPES buffer, 0.5%/1% FCS), RPMI/SF(RPMI-1640, sodium pyruvate, L-glutamine, HEPES buffer)를 이용하였다.

FCS(1%) 적응 세포를 배양하여 트립신으로 탈착한 뒤 트립신 저해제를 동량 첨가하여 중화시키고, 이를 원심분리하여 실험하고자 하는 세포 수를 얻었다. 이를 12 웰 플래이트(Nunc)에 배양 배지 2ml로 밤새 배양하여, 세포가 부착된 뒤 2ml의 배지를 완전히 제거하고, PBS(Gibco)로 배양 세포를 2 내지 3회 세척한 뒤, R, D, F, R/D, D/F, R/F, RDF를 3 ml씩 첨가하여 5일간 세포를 배양하고, 트리판 블루 배제법(tryphan blue exclusion)으로 계측하였다.

기본 배지 선별에서 RPMI/FCS(0.5%)와 RPMI/SF 및 적정 비율로 조합한 8종을 검색하였다. FCS(0.5%)와 FCS(1%) 적응 세포를, 처음 세포 농도를 5x10⁴세포/웰로 하여 12 웰 플래이트에서 RPMI/FCS(0.5%)와 RPMI/FCS(1%) 배양액 2ml 첨가한 뒤 하루 동안 배양하고, PBS로 2회 세척한 뒤 기본 배지를 3ml씩 첨가하여, FCS(0.5%) 적응 세포는 7일, FCS(1%) 적응 세포는 5일동안 트리플리케이트 배양 뒤 세포를 계측하였다. 그 결과(표 4), 0.5% 혈청에 적응된 세포를 5x10⁴세포/웰 로 7일간 배양한 경우에 RDF 배지가 무혈청 비교 배지인 H-max보다 세포 수가 많았으며, DF와 RDF를 제외한 나머지 기본 배지에서는 초기 접종 세포수보다 적게 계측되었다. 기존의 혈청이 0.5% 첨가된 배지와 기본 배지 중 가장 우수한 RDF 배지를 비교해 보면, 약 55% 이상의 성장율을 보였다. 또한, 1.0% 혈청에 적응된 세포를 5x10⁴세포/웰로 접종하여 5일간 배양한 경우에도, RDF가 기본 배지 중 가장 우수하였고 비교 배지인 H-max와 거의 유사한 성장을 보였으며, DF와 F-12도 RDF보다는 낮으나 다른 배지보다 세포 성장율에 기여하였다.

기초 배양액의 스크리닝

혈청 농도 및 적응 세포주	0.5	1.0
배양 일자	7	5
초기 접종 세포(x10⁴)	5.0	5.0
FCS 농도(%)기본 배지	세포 수(x10⁴)	세포 수(x10⁴)
H-MaxF-12DMEMRPMID/FR/DR/FRDFRPMI/FCSRPMI/SF	3.88±0.222.23±0.512.38±0.331.13±0.315.05±0.302.60±0.152.92±0.546.13±0.3211.17±0.921.22±0.04	14.00±0.889.15±1.106.50±0.581.70±0.2311.40±1.157.93±0.526.78±0.6213.22±0.1921.17±0.964.75±0.20

실시예 3

세포 부착 성분 검색

혈청에는 세포를 부착하고 확산(spreading) 할 수 있는 여러 가지 물질이 포함되어 있다. 그러나, 무혈청 배지에서는 혈청이 첨가되지 않기 때문에 세포에 따라서 이같은 물질을 첨가하여 주어야 한다. 따라서, 부착성 세포를 증식시킬 경우, 용기를 부착 불질로 도포하거나 세포 배양액에 부착 물질을 첨가함으로써 세포의 부착, 확산, 형태 유지, 분화 및 세포의 운동성을 직접, 간접적으로 유도할 수 있다.

시판되어지는 여러 가지 부착 인자들 가운데 주로 사용되어지며 실용 가능한 콜라겐(Sigma), 피브로넥틴(Sigma), 젤라틴(Sigma) 및 콜라겐(CLR)의 4종을 사용하여, 세포 배양 용기를 도포하거나 배양 배지에 첨가하여 세포의 부착능을 검색하였다.

콜라겐 타입 I(C1809, Sigma)이 0.1M 아세트산에 0.01%(w/v)인 콜라겐 용액을 준비하여, 실온에서 녹을 때까지 약 4시간 정도 저어준 뒤, 클로르포름을 이 용액의 약 10% 비율로 첨가하여, 4℃에서 밤새 정치, 반응시켰다. 용액을 분리하여 배양 용기에 10mg/cm²로 분주하고, 4℃에서 밤새 배양한 후 곧바로 자외선을 쬐어 멸균하여 실험에 사용하였다. 콜라겐(CLR)은 10mg/cm²으로 희석, 배양 용기에 분주하여 자외선을 쬐어 실험에 이용하였다. 젤라틴 용액(2%)은 37℃에서 녹인 뒤 가압, 멸균하여 0.1 내지 0.2 mg/cm²로 배양 용기에 도포하여 완전히 건조시킨 뒤 실험에 이용하였으며, 피브로넥틴을 배지에 직접 첨가하여 세포 배양을 유도하였다.

배양 배지의 첨가 방법으로, 피브로넥틴(Sigma)을 ml 당 0.5㎍, 1㎍, 1.5㎍, 2㎍, 2.5㎍, 5㎍ 첨가하여 세포의 부착을 실험하였다(표 5). FCS(0.5%) 적응 세포주를 초기 세포 접종 수 1x10⁴세포/웰로 12 웰 플래이트에서 RDF/FCS(0.5%) 2ml 배지로 밤새 배양한 뒤 PBS로 2회 세척하고, 피브로넥틴을 ml 당 0.5㎍, 1㎍, 1.5㎍, 2㎍, 2.5㎍, 5㎍ 포함된 RDF/SF 3ml씩 첨가하여 각 농도별 트리플리케이트로 10일간 배양한 뒤 세포를 계측하였다. 그 결과, RDF/SF를 대조 배지로 하여 피브로넥틴을 첨가하지 않은 경우와 0.5㎍/mg 첨가한 경우 외에는(1.0㎍/ml 내지 5.0㎍/ml), 피브로넥틴은 계속적으로 세포의 성장에 도움을 주었다.

세포 부착성에 fibronectin 요구성

결과Fibronectin 농도(㎍/ml)	세포 No.(x10⁴)
RDF/SF 단독RDF/SF + 0.5RDF/SF + 1.0RDF/SF + 1.5RDF/SF + 2.0RDF/SF + 2.5RDF/SF + 5.0	2.67±0.341.50±0.493.47±0.254.13±0.294.23±0.216.80±0.627.10±0.35

젤라틴(Sigma)의 경우, 0.2% 용액을 12 웰 플래이트에 웰 당 0.5ml, 1ml, 2ml, 3ml로 코팅한 뒤, FCS(1%) 적응 세포주를 5x10⁴세포/웰로 분주하고, RDF/SF와 RDF/FCS(1%)의 배지를 첨가하여 트리플리케이트로 7일간 배양한 뒤, 세포수를 계측하였다(표 6). 그 결과, RDF/SF와 RDF/FCS(1%)를 비교하면, RDF/SF 배지에서 젤라틴은 세포의 부착에 기여하지 못하고, RDF/FCS에서도 세포가 부유되어서 FCS가 첨가된 상태에서도 저해 작용을 보였다.

세포 부착성에 젤라틴 코팅 요구성

결과젤라틴(0.2%)/well	RDF SF(cell No. x 10³)	RDF FCS(1%)(cell No. x 10³)
0.5ml1ml2ml3ml	2.00±0.404.84±0.667.50±0.366.00±0.94	2.84±0.7820.00±2.4824.66±1.3626.84±1.40

콜라겐의 경우, 코팅 용기인 12 웰 플래이트에 Sigma제 콜라겐 용액 1, 3, 10mg/cm², CLR 콜라겐 10mg/cm²로 도포하고, 대조물로는 도포하지 않은 용기를 사용하였다. FCS(1%) 적응 세포를 5x10⁴세포/웰로 분주하고, RDF/SF와 RDF/FCS(1%) 배지를 첨가하여 트리플리케이트로 7일 배양 뒤, 세포수를 계측하였다(표 7). 그 결과, RDF/SF 배지의 경우, 비-코팅에서는 1㎍/ml 도포하였을 때와 유사하며 그 이상의 농도로 도포하였을 때에는 세포의 부착이 유지되어서 점차로 세포의 수가 증가하며, 동일한 농도에서 Sigma 제품이 CLR 제품보다 세포의 부착과 성장에 영향을 주는 것으로 보였다. RDF/FCS의 경우에는, 혈청이 첨가된 배양 배지로 인하여, 콜라겐이 도포된 것과 되지 않은 것, Sigma 와 CLR 제품간에 콜라겐의 역할은 별 차이가 없었다.

세포 부착성에 콜라겐 요구성

결과콜라겐(㎍/ml)	RDF SF(cell No. x 10⁴)	RDF FCS(1%)(cell No. x 10⁵)
비-코팅코팅Sigma(1.0)Sigma(3.0)Sigma(10.0)CLR(10.0)	1.07±0.271.02±0.201.58±0.301.73±0.351.33±0.37	2.96±0.572.97±0.523.09±2.122.58±1.372.97±0.52

실시예 4

콜라겐을 0.1M 아세트산에 가하여 0.01%(w/w) 콜라겐 용액을 얻었다. 이어서 용해될 때까지 실온에서 1 내지 3시간동안 교반하였다. 콜라겐 용액을 스크류 마개를 갖는 유리병에 옮겨, 바닥으로부터 주의깊게 클로르포름층을 형성시켰다. 웰 플래이트를 웰당 콜라겐 10㎍으로 코팅하여, 무균 조직 배양 후드에서 UV 광을 사용하여 24℃에서 밤새 건조하였다. 젤라틴 용액(2%, w/v)을 제조하고, 121℃, 15psi로 30분동안 오토클레이브하여 살균하였다. 웰을 웰당 2% 젤라틴 용액 2ml로 코팅하고, 2시간 이상 건조하였다. 코팅하지 않은 웰, 상기 콜라겐 코팅된 웰 및 젤라틴 코팅된 웰에 5 x 10⁴세포를 분주하고, 각각 RDF/SF, RDF/FCS 배지를 첨가하한 후, 3일동안 배양하여 도 1a 내지 도 1f의 결과를 얻었다. 비-코팅 RDF/SF의 경우, 예상한 바와 같이 약간의 세포만이 부착되었고, 비-코팅 RDF/FCS의 경우에는 뭉쳐졌다. 젤라틴으로 코팅된 경우(1c 및 1d), 1c(RDF/SF)는 응집 부유되고, 1d(RDF/FCS)는 약간의 세포가 넓은 분포로 부착되었다. 콜라겐으로 코팅된 경우(1e 및 1f)에는, 1e(RDF/SF)는 약간의 세포가 부착 증식되고, 1f(RDF/FCS)는 뭉쳐졌다.

실시예 5

호르몬 및 성장인자 검색

무혈청 배지에는 혈청에 존재하는 호르몬이나 성장 인자가 첨가되어야만 자랄 수 있는 세포가 있다. 사람 인슐린종 세포에 맞는 특정한 호르몬이나 성장 인자는 Sigma 사로부터 구입한 28종을 권장량에 따라서 검색에 이용하였다.

세포를 5x10⁴세포/웰로 분주하여 성장시킨 후 호르몬 및 성장 인자들을 권장 농도로 첨가하고 3일 후 세포 증식을 관찰하였다.

FCS(1%)에 적응된 세포주를 이용하여, Sigma 세포 배지 생성물인 호르몬과 성장 인자 28종에 대하여 RDF를 기본 배지로 하여 세포 성장과 저해 인자를 검색하였다(표 8). 호르몬 및 성장 인자는 문헌(material & method)에 기재된 일련의 HB-세포 트리플리케이트 플래이트에서 성장 자극에 대하여 검색하였다. 그 결과, 28종 중 24종이 세포 성장에 도움을 주었으며, 4종은 세포에 대하여 저해 작용을 하는 것으로 나타났다. 호르몬 가운데에서 ITS-복합체, 리놀레산-BSA, 글루카곤, 티로칼시토닌이 세포 성장에 크게 작용하였으며, 알도스테론, 티록신, 에스트라디올, 소디움 셀레나이트 등이 저해 인자로 작용하였으며, 성장 인자 가운데에서는 표피 성장 인자가 가장 높게 나타났고, 전반적으로 성장 인자 요구성이었다. 반면에, 인슐린은 다른 세포에서와는 달리 크게 작용하지 못하였다.

호르몬과 성장 인자에 대한 사람 인슐린종 세포의 성장 반응성

첨가량(농도, /ml)	상대 세포수/플래이트
없음(0)소태아혈청[1%(v/v)]ITS-복합체(5μg)리놀레산-BSA(1mg)글루카곤(10μg)티로칼시토닌(50ng)소마토스타틴(50ng)트롬빈(100ng)덱사메타손(500ng)히드로코르티손(5μg)트란스페린(인간)(100μg)표피 성장 인자(10ng)인슐린(20μg)티로트로핀 호르몬(10ng)플래이트렛-유도 성장 인자(10ng)	1.006.15±0.772.98±0.092.98±0.022.34±0.822.03±0.301.88±0.071.87±0.071.79±0.401.67±0.451.65±1.201.57±0.171.53±0.611.46±0.361.43±0.88

첨가량(농도, /ml)	상대 세포수/플래이트
프로스타글란딘 F2(500mg)프로스타글란딘 D2(500ng)신경 성장 인자(10ng)프로스타글란딘 E1(500ng)섬유아세포 성장 인자(100ng)프로게스테론(20ng)뉴로텐신(200ng)프로스타글란딘 E2(500ng)트리이오도티로인(250ng)퓨트레신(16.1μg)류텐화 호르몬(40ng)알도스테론(10μg)티록신(50ng)에스트라디올(10ng)소디움 셀레나이트(2μg)	1.38±0.441.32±0.711.31±0.121.27±1.001.22±0.401.22±0.131.21±0.181.10±0.101.10±0.061.04±0.771.03±0.610.93±0.300.83±0.300.80±0.130.74±0.24

실시예 6

호르몬 및 성장 인자의 최적 농도 결정

호르몬 및 성장 인자 검색에 사용된 28종 중, 세포의 성장에 다른 성분보다 효능이 있는 ITS-복합체, 리놀레산-BSA, 글루카곤, 티로칼시토닌, 소마토스타틴, 트롬빈, 덱사메타손의 7종을 권장 농도의 상하 4단계 농도로 배양 배지에 첨가하여 세포의 성장을 관찰하였다(표 9).

호르몬 및 성장 인자의 농도

호르몬/성장 인자	농도(/ml)
ITS-복합체리놀레산-BSA글루카곤티로칼시토닌소마토스타틴트롬빈덱사메타손	0.5μg0.1mg1μg5μg5ng10ng50ng	2.5μg0.5mg5μg25μg25ng50ng250ng	5μg1mg10μg50μg50ng100ng500ng	10μg2mg20μg100μg100ng200ng1mg

호르몬 및 성장 인자 검색에서 다른 성분보다 세포의 성장에 영향을 주는 ITS 복합체, 리놀레산-BSA, 글루카곤, 티로칼시토닌, 소마토스타틴, 트롬빈, 덱사메타손의 7종을, RDF 배양 배지에 아래 표 10에서 보는 바와 같은 농도로 첨가하였다. 3일간 RDF 배지에 배양한 HB 세포를 트리플리케이트로, 호르몬과 성장 인자를 세포 성장에 적정 농도에 대하여 스크리닝하였다. 결과는 다음과 같다.

호르몬과 성장 인자의 세포 성장을 위한 적정 농도 스크리닝

호르몬 & 성장 인자	농도(/ml)	세포수(x10⁴)
ITS-복합체	0.5㎍2.5㎍5㎍10㎍	2.54±0.303.73±0.753.11±0.423.13±0.21
리놀레산-BSA	0.1mg0.5mg1mg2mg	2.84±0.823.29±0.443.03±0.133.13±0.23
글루카곤	1㎍5㎍10㎍20㎍	2.23±0.252.52±0.162.51±0.343.03±0.24
티로칼시토닌	5㎍25㎍50㎍100㎍	2.86±0.314.48±0.463.60±0.893.44±0.29
소마토스타틴	5ng25ng50ng100ng	3.10±0.093.08±0.253.08±0.362.61±0.12
트롬빈	10ng50ng100ng200ng	2.18±0.112.56±0.342.84±0.293.32±0.31
덱사메타손	50ng250ng500ng1mg	2.42±0.192.56±0.132.52±0.182.37±0.34

이상의 실험을 통하여 본 발명의 배지에 첨가되는 호르몬 및 성장 인자의 적용 농도를 결정한 결과를 표 11에 나타내었다.

인간 췌장 베타 세포에 대한 호르몬과 성장 인자의 적용 농도

첨가량(농도, /ml)	범위 (농도, /ml)
없음소태아 혈청ITS-복합체리놀레산-BSA글루카곤티로칼시토닌소마토스타틴트롬빈덱사메타손히드로코르티손트란스페린(인간)표피 성장 인자인슐린티로트로핀 호르몬플래이트렛-유도 성장 인자	--5-500㎍1-100mg0.3-500㎍1-500ng0.3-500ng0.1-100㎍0.5-50㎍0.4-100㎍0.1-100㎍0.05-10㎍0.1-10mg0.03-10㎍0.05-10㎍

사람 인슐리노마 세포에 대한 호르몬과 성장 인자의 적용 농도

첨가량(농도, /ml)	범위 (농도, /ml)
프로스타글란딘 F2프로스타글란딘 D2신경 성장 인자프로스타글란딘 E1섬유아세포 성장 인자프로게스테론뉴로텐신프로스타글란딘 E2트리이오도티로인퓨트레신류텐화 호르몬알도스테론티록신에스트라디올나트륨 셀레나이트	0.25-10㎍0.25-10㎍0.05-50㎍0.25-10㎍0.5-50㎍0.01-10㎍0.1-200㎍0.25-10㎍0.1-10㎍0.1-10mM0.02-50㎍----
-: 저해 작용을 나타내는 경우임.

실시예 7

호르몬 및 성장 인자의 조합

플라스크당 5 x 10⁵세포를 25cm²배양 플라스크(Falcon)에 넣어, FCS 1%를 함유하는 배지에서 배양하였다. 밤새 배양한 후, 1% 혈청 배양 배지를, RDF 기본 배지에 7가지 성분을 모두 첨가하거나, 한 가지를 제외한 6가지 성분을 첨가한 혼합배지로 교환하였다. 혼합배지에서 각각 5일 동안 세포 배양하고, 헤모시토미터를 사용하여 수를 세어 도 2에 나타내었다.

실시예 8

호르몬 및 성장 인자의 조합

플라스크당 1 x 10⁵세포를 25cm²배양 플라스크(Falcon)에 넣어, FCS 1%를 함유하는 배지에서 배양하였다. 밤새 배양한 후, 1% 혈청 배양 배지를, RDF 기본 배지에 7가지 성분을 통합하여 첨가 또는 한가지 인자씩 첨가, 가감하거나 전체 희석한 혼합배지로 교환하였다(각각 단일, 2, 3, 4, 5, 6, 7가지 인자를 조합한 혼합 배지들을 사용하여 실험). 상기 7가지 성분은 ITS-복합체(2.5㎍/ml), 리놀레산-BSA(0.5mg/ml), 글루카곤(20㎍/ml), 티로칼시토닌(25㎍/ml), 소마토스타틴 (5ng/ml), 트롬빈(200ng/ml), 덱사메타손(250ng/ml)이다. 혼합배지에서 각각 5일동안 세포 배양하고, 헤모시토미터를 사용하여 수를 세었다. 각 조건별로 인슐린 분비 세포주의 성장이 양호하게 나타나는 조합을 선정하여 도 3에 나타내었다.

Claims

RDF(RPMI1640:DMEM:Ham`s F-12) 혼용 기본 배지에 ITS-복합체, 리놀레산-BSA, 글루카곤, 티로칼시토닌, 소마토스타틴, 트롬빈 및 덱사메타손으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 성분을, 배지 1㎖당 각각 5~500㎍, 1~100㎎, 0.3~500㎍, 1~500ng, 0.3~500ng, 0.1~100㎍ 및 0.5~50㎍의 범위로 포함하는 것을 특징으로 하는 불멸화 인간 췌장 베타 세포 배양용 배지.
제1항에 있어서, 상기 세포 배양용 배지는 히드로코르티손, 트란스페린(인간), 표피 성장 인자, 인슐린, 티로트로핀 호르몬, 플래이트렛-유도 성장 인자, 프로스타글란딘 F2, 프로스타글란딘 D2, 신경 성장 인자, 프로스타글란딘 E1, 섬유아세포 성장 인자, 프로게스테론, 뉴로텐신, 프로스타글란딘 E2, 트리이오도티로인, 퓨트레신 및 류텐화 호르몬으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 성분을, 배지 1㎖당 각각 0.4~100㎍, 0.1~100㎍, 0.05~10㎍, 0.1~10㎎, 0.03~10㎍, 0.05~10㎍, 0.25~10㎍, 0.25~10㎍, 0.05~50㎍, 0.25~10㎍, 0.5~50㎍, 0.01~10㎍, 0.1~200㎍, 0.25~10㎍, 0.1~10㎍, 0.1~10mM 및 0.02~50㎍의 범위로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 불멸화 인간 췌장 베타 세포 배양용 배지.