KR100237993B1 - 보렐리아 버그도페리 아군의 ospa 단백질, 유전자 암호화 및 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 보렐리아, 및 그로부터 유래된 OspA 항원에 관한 것이다. 상기 항원들은 공지된 OspA와 거의 상동성을 보이지 않고 따라서 백신 및 진단 약제로서 유용하다. 또한 상이한 보렐리아 군으로부터의 OspA를 기재로한 다성분 백신을 기재한다.

Description

보렐리아 버그도페리 아군의 OSPA 단백질, 유전자 암호화 및 백신

본 발명은 새로운 항원, 그의 제조 방법, 그들을 함유하는 조성물 및 사람 및 기타 동물에서 라임 질병의 예방, 치료 및 진단에서 그들의 이용에 관한 것이다. 상세히 본 발명은 라임 질병의 원인제인 스피로헤타 보렐리아 버그도페리(Borrelia burgdorferi)로부터의 외부 표면 단백질(OspA)의 새로운 혈청형/유전형, 및 하나 이상의 아군의 비이. 버그도페리를 기재로 한 백신 및 진단 약제를 기재한다.

사람에서 라임 질병은 비이. 버그도페리에 의해 야기된 만성 진전질병이며, 이는 주로 참진드기속(Ixodes) 진드기에 의해 사람에게 전염된다. 이 질병은 많은 기관들, 현저하게 피부, 심장, 간, 중추 및 말초신경계, 신장 뿐만 아니라 근골격계를 공격한다.

라임 질병 그 자체는 미합중국에서 가장 일반적인 매개체 전파 감염이고 남극을 제외한 모든 대륙에서 보고되었다.

다수의 군이 분리되었고 라임 질병에 대항하여 사용하기 위한 효능있는 백신 후보로서 비이. 버그도페리의 주요 표면 단백질(OspA)을 제안했다. 예컨대, WO 90/04411(SIMBICOM)하에 공개된 국제 특허 출원은 비이. 버그도페리 B31로부터 유래된 OspA 단백질의 클로닝 및 발현, 및 백신으로서 그의 이용을 기재하고, M.M. 시몬 및 동료들은 비이. 버그도페리 ZS7으로부터 OspA를 클로닝하고 발현했고 (번호 0418 827하에 공개된 유럽 특허 출원 번호 90117943.2) 수동 면역화된 SCID 생쥐에서 항체를 유발하는 그의 보호 능력을 증명했다(SNAS : 87 1990, 3768-3772).

플라벨 및 동료들은(Science (1991) 250 p553-556) 비이. 버그도페리 N40으로부터 OspA에 대한 유전자를 클로닝하고 발현했고 C3H/He 생쥐에서 그의 보호 효율을 증명했다.

상기 동정된 비이. 버그도페리의 모든 분리물들을 밀접하게 연관되어 있는 듯하다. 그러나 우리는 이제 일련의 면역학적, 생화학적 및 분자 유전학 기술을 사용하여 상이한 지리적 영역 및 원천으로부터 55개 스피로헤타 분리물을 분석하므로써 비이. 버그도페리의 6개 아군을 동정했다.

비이. 버그도페리 분리물중 상이한 아군의 발견은 라임 질병의 유효한 백신주사 및 진단 모두에 중요한 의미를 갖는다. 그 이유는 종 N40 이일원인 균주에 대한 ELISA 진단 분석결과 이들이 다른 아군들로부터의 종들과 반응하지 않거나 단지 부분적으로 교차 반응하기 때문이다.

동일하게 예컨대 N40으로부터의 단하나의 OspA를 기재로한 백신은 상이한 아종으로 부처의 비이. 비그도페리에 대한 최적의 보호를 제공하지 않을 것이다.

본 발명자는 서어던 블로팅 및 OspA 서열의 PCR 증폭, 및 아미노산 및 핵산 그자체에서의 및 또한 OspA 단백질에 대한 모노클로날 항체들에 대항하는 반응성에서의 차이에 근거하여 비이. 버그도페리의 5개의 부가적인 아군을 동정했다.

비이. 버그도페리가 상기 이질성을 나타낸다는 놀라운 발견은 라임 질병에 대한 백신, 및 그의 감기를 위한 진단 약제에 대한 중요한 의미를 갖는데, 그 이유는 비이. 버그도페리의 한 군으로부터의 OspA를 기재로 한 백신 또는 진단제가 제2군으로 부터의 비이. 버그도페리의 감염을 감지하거나 그에 대한 보호를 제공할 수 없기 때문이다. 사실상 본 발명자들은 재조합 OspA 또는 일군의 밀접하게 연관된 균주들내에 살아 있는 또는 죽은 생물체에 의해 발생된 항 OspA 항체에 의해 보호가 제공될 수 있는 반면, 상이한 군으로부터의 생물체에 의한 공격이 있다면 보호가 관찰되지 않거나 단지 부분적으로 관찰됨을 발견하였다.

기호 ZS7, B31, N40을 갖는 제1아형은 여기서 군 I으로 언급된다(대안적인 명명법으로 군 I을 군 A로서 부른다).

제2아군, 이후에 군 II(대안적으로, 군 B로서 공지됨)이 여기에 기재되고 종 ZQ1로 예시된다. 상기 좋은 1991년 7월 11일에 브란쯔베이그 91베 데-3300 바째로데르베그의 DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulture에 기탁되었고 수탁번호 DSM6606을 받았다. 상기 군은 군I과 다수의 사항에서 다르다.

먼저, 군 I로부터의 대표물과 비교했을 때 균주 ZQ1의 플라스미드 분석은 ZQ1이 18 및 14Kd의 적어도 두개의 고유한 플라스미드를 가짐을 보였다. 더욱기 군 I 균주에서 발견된 16Kb의 플라스미드가 균주 ZQ1에는 없다. 둘째로 ZQ1로부터의 OspA룰 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 시험했을 때 32Kd의 겉보기 분자량을 가졌다.

세째로 군 I의 OspA에 대해 특이적인 다양한 모노클로날 항체, 예컨대 항체 명칭 LA2 L26 LA28 LA33은 균 II로부터의 OspA와 반응하지 않는다. LA2 및 LA26 항체는 공지되어 있고 유럽 특허 출원 번호 EP0418827에 서술되었다. LA2를 생산하는 하이브리도마는 읠쉬어 SP40J9 포르톤 다운에 소재하는 퍼블릭 헬스 레브레이터리 서비스, 유럽콜렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐즈에 1989년 9월 13일자로 수탁 번호 ECACC 89 09 1302하에 기탁되었다. LA26을 생산하는 하이브리도마는 1990년 6월 28일에 수탁 번호 9005406하에 상기 걸쳐 콜렉션을 기탁되었다.

그러나 다른 모노클로날 항체, LA31.3은 아군 I 및 II의 OspA 종과 반응하는데, 이는 상이한 아군들의 OspA 종들 중에 공통의 에피토프들이 존재함을 시사한다.

우리는 또한 PCR 증폭에 의해 군 II균주로부터 OspA DNA를 특성화 했다. 두쌍의 OspA 프라이머를 사용했으며, 이들은 prOspAl-prOspA4 및 prOspAl-prOspAl로 명명했다.

상기 프라이머들은 하기 서열을 갖는다 :

그리고 각각 ZS7 OspA의 위치 138-160(prOspA1), 611-638(prOspA4), 및 759-778(prOspA2)의 뉴클레오티드에 상응한다. 군 II, 비이. 버그도페리의 전체 DNA는 군 II가 프라이머로서 prOspA1 및 prOspA2를 사용할 때 성공적인 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 증폭을 허용하지 않는 반면 군 I로부터의 전체 DNA는 성공적인 반응을 허용할 것이라는 점에서 군 I의 전체 DNA와 구별된다. 반면에, 프라이머로서 prOspA1 및 prOspA4를 사용할때, 군 I 및 군 II의 DNA 모두는 폴리머라제 연쇄 반응을 수행할 것이다.

상기 결과는 군 II, 비이, 버그도페리가 군 I OspA들에 대해 상이한 OspA서열을 가짐을 보여준다.

동등하게, 군 II OspA DNA눈 프로브로서 OspA ZS7을 사용하는 서어던 블롯팅에 의해 군 I OspA와 구별될 수 있다. 제한 효소 Hind III로써 비이, 버그도패리 군 II의 게놈 유전자의 소화는 군 I군주의 것과 상이한 결합 패턴을 나타낸다.

예컨대 군 I 군주는 1.2kb 및 0.3kb의 두개의 혼성화 단편을 나타내는 반면 군 II 군주는 0.9kb 및 0.4kb의 두 단편을 나타냈다.

또한, 군 II로부터의 OspA에 대한 면혁 혈청으로써 SCID 생쥐의 수동 면역화는 비이. 버그도페리 군 I 공격에 대해 보호하지 않을 것이다.

마지막으로 OspA ZS7의 서열과 비교하면 ZQ1 균주 OspA 서열 ID 1 및 2 (즉, 군 II 군주)의 DNA 및 아미노산 서열은 DNA 및 아미노산 수준 모두에서 군 I과 군 II 사이의 실질적인 변형을 증명한다.

이질성 공격에 대항하여 보호하는 데 대한 놀라운 무능함은 군 I 생물체로부터의 단일 OspA를 기재로한 백신이 군 II 생물체로부터의 비이. 버그도페리에 이한 감염에 대해 효과적이지 않을 수 있고 반대의 경우도 마찬가지임을 의미한다. 결론적으로 군 II 감염에 대항하여 보호할 수 있는 백신이 필요하다.

따라서 본 발명은 폴리머라제 연쇄 반응 증폭이 prOspA1-A4 프라이머를 사용하여 일어날 수 있으나 prOspA1-A2로는 일어나지 않는다는 점을 특징으로 하는 비이. 버그도페리로부터 유래된 OspA를 암호하는 DNA 서열을 제공하고 부가적으로 이로써 암호된 정제 또는 단리된 OspA를 제공한다.

바람직한 본 발명의 OspA는 모노클로날 항체 LA2 또는 LA26과 반응하지 않을 것이다. 가장 바람직하게 본 발명이 OspA는 기준으로서 분자량 마커를 사용하는 SDS 전기영동에 의해 측정한 바 32kDa의 상대 분자량을 갖는다.

바람직하게 OspA는 ZQ1 또는 NE11H 또는 다른 군 II 균주로부터 유래된다.

바람직하게 상기 단백질은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정한 바 적어도 70% 순도, 특히 적어도 80% 순도, 및 가장 바람직하게 적어도 95%순도이다. 바람직하게 OspA 항원은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정한 바 32kDa의 상대 분자량을 갖는다.

바람직하게 OspA 항원은 모노클로날 항제 LA2와 반응하지 않을 것이다.

본 발명의 또다른 측면에서 ZQ1으로부터의 OspA를 암호하는 DNA 서열과 실질적으로 동일한 DNA 서열을 제공한다. 실질적으로 동일한이란 DNA 서열이 서열 ID 1에 묘사된 ZQ1 OspA 서열에 적어도 85% 동일한 및 바람직하게 90% 동일한 서열을 함유함을 의미한다. 성숙 단백질은 위치 17에서 출발하고 바람직하게 본 발명은 서열 ID 2에 묘사된 바의 성숙 단백질을 암호하는 서열과 적어도 95% 동일한 DNA 서열을 제공한다.

대안적인 실시양태에, 서열 ID 2에 나열된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 OspA 서열을 제공한다. 용어 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한이란 도면에 묘사된 단백질 서열과 적어도 85% 및 바라직하게 90% 동일하고 성숙 단백질에 대해 바람직하게 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 의미한다.

또한 본 발명자들은 동일한 생화학적 및 면역학적 기술을 사용하여 다른 군 I 또는 II과 관련없는 비이. 버그도페리의 다른 군들을 발견했다. 군 III (또는 군 C)의 두개의 분리물 특징은 19857 및 21038로서 명명된 균주이다. 군 II와 같은 균주를 처럼 균주들은 PCR 조건하에 prOspA1-A2와 반응하나 prOspA1-A4와 반응하지 않는다. 그러나 그들은 ZS7 프로브 및 제한 효소 Hind III를 사용하여 서어딘 블롯팅에 의해 분석할 때 군 II균주와 상이하다. 상기 분석을 4.0kb 및 0.5kv의 혼성체화 단편을 나타낸다. 게다가 그것들은 모노클로날 항체 LA26과 반응하나 LA2와는 반응하지 않는다.

이제 우리는 PCR 기술을 사용하여 서열화했고 균주 19857로부터의 OspA를 암호하는 DNA 서열을 발현했다. DNA 및 아미노산 서열은 서열 ID No. 3 및 4에 묘사되어 있다. 다른 군들로부터의 서열과의 비교는 상기 OspA가 다른 아군들로부터의 OspA와 DNA 및 아미노산 서열에서 단지 대략 65% 동일성을 가짐을 보인다.

따라서 본 발명은 OspA 단백질을 암호하는 DNA 서열을 제공하는데, 이때 상기 DNA 서열은 서열 ID 3의 DNA 서열과 실질적으로 동일하다. 부가적인 실시양태에서, 서열 ID 4에 기재된 바와 같은 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 OspA 단백질을 제공한다.

서열 ID No.3 및 4에 묘사된 서열에 대하여 여기서 사용된 바와 용어 실질적으로 동일한이란 적어도 70% 동일성, 바람직하게 80-85% 동일성, 보다 바람직하게 85-95% 동일성을 의미한다.

비이. 버그도페리의 제 4 아군, 군 IV(또는 군 D), 예컨대 스웨덴의 분리물 ACA-1은 임의 군 I, II 또는 III와 상이하다 ; 엠. 존슨 일행(Int. Conf. Lyme Borreliosis 1990). 상기 군은 prOspA1-A2 또는 prOspA1-A4 중 하나의 PCR을 수행하지 않을 것이다. 그들의 OspA들은 모노클로날 항체 LA26과 반응하나 LA2와 반응하지 않는다.

ZS7 프로브 및 제한 효소 Hind III를 사용할 때 서어던 블롯팅 분석은 약 1.7kb의 단일 혼성체화 단편을 나타낸다.

또한 군 IV로부터 분리 또는 재조합 OspA는 본 발명의 일부를 형성하여 그들 함유하는 백신 또는 진단 조성물도 마찬가지다.

동일한 생화학적 기술을 사용함으로써, 본 발명자들은 군 V 및 군 VI으로부터의 대표물을 동정했다. 군 V 분리물은 20047로서 알려지고 군 VI의 표본을 S90으로 알려진 균주이다.

또한 군 V 및 VI 균주로부터의 분리 OspA도 본 발명의 일부를 형성한다.

또한 본 발명은 군 II, 군 III, 군 IV 및 군Ⅴ 또는 군 VI 비이. 버그도페리로부터의 OspA의 면역원 유도체에 관한 것이다.

여기서 사용된 바의 용어 면역원 유도체란 군 II, 또는 III 또는 군 IV, 또는 군 V 또는 군 VI, 비이. 버그도페리에 의한 포유동물 숙주의 감염에 의해 발생된 항체와 면역학적으로 반응성이고 바람직하게 모노클로날 항체 명칭 LA2와 반응하지 않는 끝이 잘린(truncated) 또는 혼성체 단백질과 같은 임의 분자를 포함한다. 상기 유도체는 아미노산의 치환, 또는 재배열에 의해 또는 그의 화학적 변형에 의해 제조할 수 있다.

서브유니트 백신 제조에 유용한 상기 단백질의 면역원 단편은 적당한 유전자 단편의 발현에 의해 또는 펩티드 합성에 의해, 예컨대 메리필드법(The Peptides, Vol 2., Academic Press, NY, page 3)을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 면역원 유도체는 혼성체, 즉 OspA 및/또는 Osp B를 포함하는 다른 비이. 버그도페리 면역원, 또는 예컨대 다른 병원균으로부터의 다른 면역원에 대한 하나 이상의 에피토프를 운반할 수 있는 부가적인 서열을 함유하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 면역원 유도체는 B형 간염 표면 또는 중심 항원 같은 캐리어 폴리펩티드에로 융합시키거나, 또는 보조약의 경우에서 처럼, 면역자극 성질을 갖는, 또는 그렇지않으며 OspA 단백질 또는 그의 유도체에 대한 면역 반응을 증진시키거나, 단백질 또는 그의 유도체의 발현, 정제 또는 배합시에 유용한 다른 캐리어에로 융합시킬 수 있다.

또한 본 발명은 글루타르알데히드와 같은 통상의 연결제제를 사용하여 고분자에 화학적으로 접합시킬 때 OspA 단백질 또는 그의 면역원 유도체에로 확장된다(제엘링스 일행, (1988) J. Immunol. Methods, 106, 239-244).

특히 바람직한 유도체는 인플루엔자 비-구조 단백질 NSI 및 OspA 또는 끝이 잘린 OspA 유도체의 혼성체 융합 단백질이다. 이들은 이롭게 이. 콜리(E. coli)에서 고수율로 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.

따라서, 본 발명은 인플루엔자로부터의 단백질 NSI의 N말단 부분에 융합된 OspA 단백질을 제공한다. 바람직하게 융합 단백질의 OspA 부분의 끝을 절단해 적어도 소수성 시그날 서열을 제거한다.

보다 바람직하게 OspA의 성숙 단백질의 첫번째 아미노산의 시스테인 잔기 및 시그날 서열을 나타내는 N 말단 16개 아미노산이 손실된다.

바람직하게 융합 단백질의 NSI 부분은 유전자의 N-말단 부분의 3 내지 81개 아미노산으로 구성된다. 융합체의 NSI 부분이 길수록 바람직한데, 이는 이러한 것이 단백질의 더 높은 발현 수준을 허용하기 때문이다.

본 발명의 상기 혼성체 단백질은, 천면 재조합 OspA와는 달리, 비-응집 단백질로서 용해성 분획으로 부터 회수가능하고 높은 수준으로 발현된다. 상기 단백질은 천연 OspA에 대항하여 유발된 모노클로날 항체의 반응하는 능력을 보유하고 실험실 동물, 예컨대 생쥐 또는 토끼에서 보호면역 반응을 유발할 수 있다.

본 발명의 실시 양태로, 군 I로서 공지된 OspA군, 예컨대 EP 0418-827에 기재된 바의 균주 ZS7, 또는 호웨 일행, Science 227 p645, 1985에 의해 서술된 바의 B31, 또는 플라벨 일행에 의해 서술된 바이 N40으로부터의 OspA로부터의 NSI OspA 융합 단백질을 제공한다. 상기 OspA들은 DNA 및 아미노산 수준 모두에서 유의한 서열 상동성을 나타내고 교차 보호성이다.

본 발명의 부가적인 실시양태로 OspA가 군 II로서 공지된 군으로부터 인 NSI-OspA를 제공한다. 예컨대 여기서 서술된 바의 비이. 버그도페리 균주 ZQ1으로부터의 Osp.

본 발명의 부가적인 실시양태로 OspA가 군 III로서 공지된 군으로 부터인 NSI-OspA를 제공한다. 예컨대 군주 19857. 본 발명은 부가적으로 군 IV NSI-OspA를 제공하는데, 예컨대 이때 OspA는 균주 AcaI로부터 유래된다.

부가적으로 본 발명은 상기 서술된 바대로 NSI-OspA 유합 단백질을 암호하는 DNA 서열을 제공한다. 특히 본 발명은 첨부된 서열 ID Nos 5 내지 12에 제시된 바와 같은 NSI-OspA 단백질을 암호하는 DNA 서열 및 단백질 그 자체를 제공한다.

본 발명의 단백질은 공지 균주로부터의 다른 OspA 단백질을 생산하기 위한 당업계의 표준 방법에 의해 생산할 수 있다. 예컨대, OspA 단백질은 재조합 DNA 기술을 사용하여 이. 콜리에서 생산될 수 있다. 특히, 상기 단백질은 전체 길이 미성숙 단백질 또는 성숙 단백질로서 생산될 수 있다. 또한 단백질은 NSI-융합 단백질 같은 융합 단백질로서 발현될 수 있다.

본 발명의 단백질 (예컨대 OspA ZQ1 또는 OspA 19857)을 암호하는 DNA 서열은 표준 DNA 합성 기술을 사용하여, 예컨대 Biochemistry 1985, 24, 5090-5098에 D. M. 로버츠 일행에 의해 서술된 바의 효소 결찰(ligation)에 의해, 화학적 합성에 의해, 생체의 효소 중합에 의해, 또는 예컨대 열안정성 폴리머라제를 사용하는 PCR 기술에 의해, 또는 상기 기술들의 조합에 의해 합성할 수 있다.

DNA의 효소 중합은 일반적으로 50㎕ 이하의 부피로, 10°-37℃의 온도에서 요구된 바의 뉴클레오시드 삼인산염 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 함유하는 적절한 완충액에서 DNA 폴리머라제 1(Klenow 단편) 같은 DNA 폴리 머라제를 사용하여 생체외에 수행할 수 있다. DNA 단편의 효소 결찰은 40℃ 내지 주변의 온도에서, 일반적으로 50ml 이하의 부피로, 0.05M 트리스(pH 7.4), 0.01MgCl₂, 0.01M 디티오트레이톨, 1mM 스페르미딘, 1mM ATP 및 0.1mg/ml 소혈청 알부민 같은 적절한 완충액에서 T4 DNA 리가제 같은 DNA 리라제를 사용하여 수행할 수 있다. DNA 중합체 또는 단편들의 화학적 합성은 통상적인 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포라미디트 화학약품에 의해, `유전자 단편의 화학적 및 효소적 합성-실험실 메뉴얼'(de. H. G. Gassen 및 A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim(1982)에, 또는 기타 과학 출판물, 예컨대 M. J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat, 및 R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243 ; B. S. Sproat 및 W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci 및 M. H Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D. Matteucci 및 M. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981. 103. 3185; S. P. Adams 일동., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, 및 H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539 ; 및 H. W. D. Matthes 일동., EMBO Journal, 1984. 3. 801.에 서술된 것들과 같은 고체 상기술을 사용하여 수행할 수 있다.

대안적으로, 암호화 서열은 공지된 기술(예컨대, 상보적 cDNA 가닥을 생산하는 (mRNA의 역전사), 및 구입가능한 cDNA 키트를 사용하여 비이. 버그도페리 mRNA로부터 유래될 수 있다.

OspA 단백질의 돌연변이를 암호하는 DNA 폴리머라제는 G. 원터 일행에 의해 Nature 1982, 299, 756-758에 서술된 것들 또는 졸러 및 스미스 1982; Nucl, Acids Res., 10, 6487-6500에 서술된 것들과 같은 통상 방법에 의해 단백질을 암호하는 cDNA의 부위-조작(site-directed) 돌연변이 유발에 의해, 또는 Nucl. Acids Res., 1984, 12. 2407-225에 G. 원터 일행에 의해 서술된 것과 같은 결실 돌연변이유발에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 방법은 마니아티스 일행, 분자 클로닝-실험실 메뉴얼; Cold Spring Harbor, 1982-1989에 서술된 바와 같은 통상적인 재조합 기술에 수행할 수 있다.

구체적으로, 상기 방법은 하기 단계들로 구성된다 :

i) 본 발명의 단백질 또는 그의 면역원 유도체를 암호하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 DNA 중합체를 숙주세포에서 발현할 수 있는 복제성 또는 합성 발현 벡터를 제조하고;

ii) 상기 벡터로써 숙주 세포를 형질전환시키고;

iii) 상기 DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 상기 단백질을 생산하고; 그리고

iv) 상기 단백질을 회수한다.

여기서 사용된 용어 “형질전환”이란 숙주 세포내로 외래 DNA의 도입을 의미한다. 이는 예컨대 적당한 플라스미드 또는 비루스 벡터로써 형질전환, 트랜스펙션(transfection) 또는 감염에 의해 예컨대 유전공학; Eds. S. M. Kingsman 및 A. J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988에 서술된 바의 통상적인 기술을 사용하여 성취될 수 있다. 용어 `형질전환된' 또는 `형질전환체'는 이후에 관시미있는 외래 유전자를 함유하고 발현하는 결과 생산된 숙주 세포에 대해 사용될 수 것이다.

상기 발현 벡터들은 신규하고 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

복제성 발현 벡터는 본 발명에 따라, 숙주 세포와 양립가능한 벡터를 절단시켜 무상(無傷) 레플리콘을 갖는 선형 DNA 분절을 제공하고, 상기 선형 분절과 함께 결찰 조건하에서 NSI OspA-융합 단백질 같은 OspA 단백질 또는 그의 유도체를 암호하는 DNA 중합체와 같은, 원하는 생성물을 암호하는 하나 이상의 DNA 분자와 상기 선형 분절을 조합하여 제조할 수 있다.

따라서, 상기 DNA 중합체는 원하는 바대로 미리 형성하거나 벡터의 구성 중에 형성할 수 있다.

벡터 선택은 숙주 세포에 의해 부분적으로 결정되는데, 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 및 재조합 비루스를 포함한다.

복제성 발현 벡터의 제조는 통상적으로 예컨대 상기 언급된 만니아티스 일행에 서술된 절차에 의해 DNA의 제한, 중합 및 결찰을 위한 적절한 효소로써 수행할 수 있다.

본 발명에 따라, 제조합 숙주 세포는 형질전환 조건하에서 본 발명의 복제성 발현 벡터로서 숙주 세포를 형질전환시키므로써 제조된다.

적합한 형질전환 조건은 통상적이고 예컨대 상기 언급된 만니아티스 일행, 또는 “DNA 클로닝” Vol. II. D.M. Glover'ed., IRL Press Ltd, 1985에 서술되어 있다.

형질전환 조건의 선택은 숙주 세포에 의해 결정된다. 따라서, 이, 콜리 같은 세균 숙주는 CaCl₂용액으로써(Cohen 일행, Proc, Nat, Acad, Sci., 1973, 69, 2110) 또는 RbCl, MnCl2, 아세트산칼륨 및 글리세롤로 구성된 용액으로써, 및 그 다음 3-[N-모르폴리노]-프로판-설폰산, RbCl 및 글리세롤로써 처리할 수 있다. 배양물내 포유동물 세포는 상에로 벡터 DNA의 칼슘 공동-침전에 의해 형질전환시킬 수 있다. 또한 본 발명은 본 발명의 복제성 발현 벡터로서 형질전환된 숙주 세포예로 확장된다.

DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포의 배양은 예컨대 상기 언급된 만니아티스 일행 및 “DNA 클로닝”에 서술된 바대로 수행한다. 따라서, 바람직하게 세포에 영양물을 공급하고 50℃미만의 온도에서 배양한다.

생산물을 숙주 세포에 따라 통상 방법에 의해 회수한다. 따라서, 숙주 세포가 세균, 예컨대 이. 콜리인 경우에 그것은 물리적으로, 화학적으로 또는 효소적으로 용균시킬 수 있고 결과의 용균질로부터 단백질 생산물을 분리한다. 숙주 세포가 포유동물인 경우에, 생산물은 일반적으로 영양 배지로부터 또는 무세포 추출물로부터 분리할 수 있다. 통상의 단백질 분리 기술은 선택 침전, 흡수 크로마토그패리, 및 모노클로날 항체친화 컬럼을 포함하는 친화 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명의 단백질은 전체 길이 단백질로서, 이. 콜리에서 발현될때 면역원성인 리포단백질 미셀을 생산한다. 상기 전체 길이 리포단백질은 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명의 모든 단백질이 백신 및 진단 응용물에 유용함을 알 수 있다.

더우기, 비이. 버그도페리 분리물로부터의 Osp B 또는 다른 OspA 항원 또는 다른 병원균으로부터의 항원과 같은 다른 항원 성분이 본 발명의 백신조성물에 포함될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 게다가 다른 생물체로 부터의 다른 항원도 백신에 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 사용되는 OspA 항원은 OspA의 면역원 단편, 즉 면역원 B 또는 T-세포 에피토프를 함유하는 OspA, 또는 상이한 군으로 부터의 OspA들의 융합체를 포함하는, 상기 에피토프를 함유하는 융합단백질의 단편을 포함한다.

본 발명의 한 측면으로, 아군 II 군주로부터 OspA 또는 그의 유도체를 포함하는 백신 또는 진단 조성물을 제공한다. 특히 그것이 prOspA1-A4 프라이머를 사용하여 성공적인 폴리머라제 연쇄 반응이 일어나게 하나, prOspA1-A2를 사용하여서는 일어나지 않는 DNA 서열에 의해 암호된다는 점에서 특징지워지며, 이때 상기 단백질은 적합한 익시피언트 또는 캐리어의 혼합물이다. 보다 특히 서열 ID No. 2에 묘사된 단백질 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 군 II 균주로부터의 OspA 또는 그의 유도체를 함유하는 조성물을 제공한다.

이롭게 상기 조성물은 또한 아군 I 균주로부터의 OspA 유도체를 함유할 수 있다.

따라서, 본 발명은 바람직한 실시양태로, 조성물, 바람직하게 아군 I 비이. 버그도페리로부터 유래된 OspA 항원 및 아군 II 비이. 버그도페리로 부터의 OspA 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

바람직하게 군 I로부터의 OspA 항원은 군 B31, ZS7 및 N40으로부터 선택된다.

바람직하게 군 II로부터의 OspA 항원을 군 ZQ1, NE11H로 부터 선택된다.

또한 본 발명은 아군 III 군주로부터의 OspA 또는 유도체를 포함하는 백신 또는 진단 조성물을 제공하며, 상기 단백질은 적당한 익시피언트 또는 캐리어의 혼합물이다. 보다 특히 백신 또는 진단 조성물은 서열 ID No. 4에 묘사된 단백질 서열과 실질적으로 동이리한 아미노산 서열을 갖는 OspA 또는 유도체를 함유한다.

바람직하게 OspA는 균주 19857로부터 유래된다.

또한 본 발명은 아군 IV, V 또는 VI로부터의 OspA 또는 유도체를 함유하는 백신 또는 진단 조성물을 제공한다.

바람직한 실시양태로 상이한 비이. 비그도페리 아군들로부터의 적어도 두개의 OspA 또는 그의 유도체를 포함하는 조합 백신을 제공한다. 상기 백신 조성물은 지금까지보다 넓은 범위의 보렐리아 감염으로부터의 보호를 제공한다. 바람직하게 백신은 군 I 내지 IV 각각으로 부터의 OspA 및 가장 바람직하게 군 I 내지 VI 각각으로부터의 OspA를 포함한다.

본 발명의 백신에서, 단백질(들)의 수용액은 직접사용할 수 있다.

대안적으로, 앞서 동결건조된 또는 안된 단백질이 임의 다양한 공지 보조약과 혼합되거나 그로써 흡수될 수 있다. 상기 보조약은 수산화 알루미늄, 뮤라밀 디펩티드 및 사포닌 예컨대 큐일(Quil) A를 포함하여 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 보조약은 MPL(모노포스포릴 리피드 A) 및 3D-MPL(3 데아실화 모노포스포릴 리피드 A)이다. 더욱더 바람직한 보조약은 QS 21로 공지된 것이다. 3DMPL은 영국 특허 번호. 220211에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있는 한편 QS21은 미합중국 특허 번호. 5,057,540에 기재된 방법에 의해 얻을 수 있다. 부가적인 예시 대안으로서, 단백질은 리포솜 같은 미세입자내에 캡슐화되거나 수중유(oil in water) 유탁액과 조합될 수 있다. 또 다른 예시 대안으로서, 단백질은 죽은 보르데텔라(Bordetella) 또는 파상풍균 독소같은 면역자극성 고분자에 접합시킬 수 있다.

본 발명의 단백질은 BCG, 리스테리아 또는 살모델라와 같은 생(live) 벡터에 의해 발현될 수 있고 상기 벡터들을 사용하는 생 백신으로 배합될 수 있다.

일반적으로 백신 제조는 백신의 새로운 경향 및 발전, Voller 일행(eds.),에 서술되어 있다. University Park Press, Baltimore. Marylond, 1978. 리포솜내 캡슐화는 Fullerton의 미합중국 특허 4,235,877에 서술된다. 고분자에로 단백질의 접합은 예컨대 Likhite의 미합중국 특허 4,372,945 및 Armor 일행의, 미합중국 특허 4,474,747에 의해 서술된다.

큐일 A의 사용은 Dalsgaard 일행, Acta Vet Scand, 18:349(1977)에 의해 기재되어 있다. 3D-MPL의 사용은 Ribi 일행, Microbilogy(1986) LEVIE 일행(Eds) American Sco. for Microbiol. Wash. D. C. pp 9-13에 의해 서술된다.

각 백신 투여량에 존재하는 본 발명의 단백질의 양은 전형적인 백신에서 유의한 부작용 없이 면역보호 반응을 유발하는 양 만큼으로 선택된다. 상기 양은 특정 면역원이 사용되는가에 따라 및 백신에 보조되는가에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 각 투여량은 단백질 1-1000㎕, 바람직하게 1-200㎕로 구성될 것으로 예측된다. 특정 백신에 대한 최적량은 항체 역가 및 대상체에서의 기타 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신주사에 이어, 면역 반응을 증진시키기 위해 부가적인 투여를 대상체에 제공할 수 있다.

[보렐리아 버그도페리 균주 ZQ1의 특징]

[1.1 분리]

1988년 5월 31일에 개로부터 프레이버그-캅펠에서 암컷 참진드기속 진드기의 중장 샘플을 포획했고 ; 카나마이신 및 플루오르라실로써 보충된 BSK에서 증시켰고 ; 배양물은 1988년 6월 8일에 양성이 되었다 ; 분취물을 1988년 6월 20일에 액체 질소에서 및 -70℃에서 동결시켰다.

비이. 버그도페리의 제2 및 3 실험에 보통 사용된 생체의 경로를 사용한다.

[1.2 배양]

보렐리아 버그도페리 균주 ZQ1을 균주 ZS7에 대해 서술된 바와 같은 바부어-스토에너-켈리 배지에서 증식시켰다(Schailble 일행., J. Exp. Med. 170. 1989 ; ). 세대 시간은 대략 30 내지 40시간이었다(균주 ZS7 ; 대략 20-24시간 보다 느림).

[1.3 플라스미드]

플라스미드 분석을 바부어 및 카론(1977)의 프로토콜에 따라 균주 ZQ1, ZS7, Z37, GeHo, 및 B31에 대해 동등하게 수행했다 : 49, 29, 25, 20, 18kb의 분자량을 갖는 플라스미드 및 14kb에서 약한 띠가 균주 ZQ1에서 발견되었다. 또한 49 및 25kb 플라스미드가 B31, Z37, GeHo 및 ZS7에 존재하는 반면, ZS7에서 29 및 20kb 플라스미드만이 감지가능했다. 18 및 14kb 플라스미드는 ZQ1에 대해고유한 것 같다. 나머지 시험 균주에서 발견된 16kb 플라스미드가 ZQ1에는 없었다.

[1.4 폴리아크릴아미드 겔 전기영동]

폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 은염색에 의해 밝혀진 바 처럼 다른 균주들과 비교할 때 균주 ZQ1에서 단백질의 독특한 패턴이 있다 ; 34kDa의 범위(Osp B)내에 띠가 없고 ; 대부분 아마도 OspA를 나타내는 띠는 대략 32kDa의 분자량을 갖는다. 다른 균주들(ZS7, Z37, GeHo, B31)에서의 상응하는 띠는 31kDa에로 이동한다.

[1.5 웨스턴 블롯 분석]

보렐리아 버그도페리(B31, GeHo)에 대한 모노클로날 항체들(mAb)을 사용했고, ZQ1은 균주 ZS7 및 B31의 것과 다른 염색 패턴을 나타내고 ; 대략 32kDa의 분자 질량 범위의 상응하는 띠와 반응하는 OspA 특이적 mAb LA31.3을 제외하고 임의 OspA 특이적 mAb 들에 의해 염색이 없다. B31, ZS7의 Osp B에 대해 특이적인 어느 mAb도 ZQ1의 단백질과 반응하지 않는다. 또한 20kDa 항원에 대해 mAb LA.7에 의한 염색이 없다. 65kDa 및 70kDa 항원에 대해 특이적인 mAb는 다른 균주의 것들에 상응하는 ZQ1 내 구조물을 염색한다.

[면역 혈청]

ZQ1 유래 32kDa 단백질(OspA)는 보렐리아 버그도페리 B31에 대한 토끼 면역 혈청(IS), 보렐리아 버그도페리 B31에 대한 생쥐 IS 및 보렐리아 버그도페리 ZS7에 대한 생쥐 IS에 인식된다. 34kDa의 범위에서 염색이 없고, 보렐리아 버그도페리 ZQ1에 대한 IS는 OspA, 플라겔린 및 20(희미한 띠), 50 및 65(희미한 띠) kDa 띠와 반응하나 균주 ZS7의 Osp B와 반응하지 않는다.

[실시예 2]

[2.1 DNA 제조 및 PCR 증폭]

비이. 버그도페리 세포를 세정제 SDS를 사용하여 용해시키고 단백질을 비특이적 세린 프로테아제로써 소화에 의해 제거하고, 프로테아제 K 세포벽파편, 다당류 및 잔여 단백질을 CTAB(세틸트리메틸암모늄 브롬화물)로써 선택 침전에 의해 제거하고, DNA를 이소프로판을 침전에 의해 결과의 상등액으로부터 회수했다. 간단히, 스피로헤타 (10¹⁸세포)를 PBS에 세척하고 91ml TE에 현탁시켰다. 1ml SDS(20%) 및 50㎕ 프로테아제 K(20mg/ml)의 첨가 후에, 용액을 37℃에서 1시간 동안 항 처리했다. 마지막으로, 1.5ml 5M NaCl 및 1.25ml CTAB (0.7M NaCl 내 20%)를 첨가하고 혼합물을 65℃에서 10분동안 유지시켰다. DNA를 페놀 및 클로로포름/이소아밀알콜 추출에 의해 정제하고 이어서 실온에서 10분 동안 0.6 부피 이소프로판올로써 침전시켰다. 펠릿을 70% 에탄올을 사용하여 세척하고, 건조시키고 TE (10mM 트리스 0.1mol EDTA, pH 7.4)에 용해시켰다.

폴리머라제 연쇄 반응을 위한 뉴클레오티드 프라이머를 어플라이드 바이오시스템(ABI) DNA 합성기 및 b-시아노에틸 화학약품을 사용하여 화학적으로 제조했다. 실험 동안 내내 하기 서열의 올리고뉴클레오티드를 사용했다 :

Taq DNA 폴리머라제 및 PCR 약제(Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, Conn.)를 50㎕ 반응마다 사용했다. 각 폴리머라제 연쇄 반응은 800mM 데옥시 뉴클레오시드 삼인산염, 2U Taq DNA 폴리머라제, 1.5mM MgCl₂, 및 각각의 프라이머 0.5mM을 포함했다. 일상적으로, 10ng의 전체 게놈 비이. 버그도페리 DNA를 하기 조건 : 94℃에서 1.2분간 ; 42℃ 2분간 : 72℃ 2분간 하에서 35주간 동안 증폭시켰다. 반응 당 10㎕의 총량을 표준 전기염동 조건하에서 1.5% 아가로스겔 상에서 분석했다.

[2.2 서어던 분석]

전체 게놈 비이. 버그도페리 DNA(20㎍)를 지시된 바의 제한 효소로써 소화하고, 0.8% 아가로스 겔상에서 전기 염동에 의해 분리시키고 나일론막(Hybond-N, Amersham)에로 이동시켰다. 블롯을 60℃에서 Church-완충액(0.5M NaHPO₄17%, NaDodSO₄, pH 7.2)에서 밤새도록 랜덤 프라이머 확장에 의해³²P로써 표지된 OspA(균주 ZS7) 프로브와 함께 혼성체화하고 55℃에서 0.1×SSC/0.1% SDS에 세척했다.

[결과]

표 1. 서어던 블록팅 및 PCR에 의해 분석된 바의 비이. 버그도페리 균주의 유전형 및 표현형 분석은 표 1에 제시된다.

플라스미드 암호화 OspA 유전자에 제한 단폄 크기 다형성

Hind III를 사용하여 OspA에 대한 RFPL은 시험된 비이. 버그도페리 분리물 중에 적어도 6개 상이한 혼성체와 패턴을 밝혔다. 군A, A, A로 임시로 칭한 바이. 버그도페리 균주 모두는 (fla, HSP60, HSP70의 경우) 1.2kb 및 0.3kb이 두개의 혼성체화 단편을 특징으로 하고 (B31, ZS7 ; OspA 유형 I) 군 B, B, B(fla, HSP60, HSP70의 경우) 균주의 대부분(17/25)은 0.9kb 및 0.4kb의 두 단편을 나타냈다(ZQ1 : OspA 유형 II). 비이. 버그도페리 균주 19857 및 21038(fla, HSP60, HSP70의 경우에는 군 II, A/B.A)는 4kb 및 0.5kb의 두개의 혼성체화 단편을 나타내고 (OspA 유전형 III), 모든 ACA-1 유사 군주(군 II, B, A)는 약 1.7kb의 단지하나의 단편을 나타냈다.

(OspA 유형 IV), 균주 20047 및 S90(군 II, B, B)는 각각 3kb(OspA 유형 V) 및 1.1kb(OspA 유형 VI)의 한 단편을 나타냈다(표 1). 보렐리아의 다른 종들의 일원으로부터 단리된 DNA를 OspA-특이적 프로브와 혼성체화하지 않았다. 시험된 비이. 버그도페리 분리물 중에 개별 OspA 유전형의 빈도는 하기와 같다 : 30/55(55%) OspA 유형 1, 17/55(31%) 유형 II, 2/55(4%) 유형 III, 4/55(7%) 유형 IV, 1/55(2%) 유형 V 및 1/55(2%) 유형 VI 상기 결과에 대해 분석된 미국 비이. 버그도페리 분리물이, OspA 유전형 III을 나타내는 두 균주, 19857 및 21038을 제외하고 단지 하나의 OspA 유전형, 즉 유형 I에 속하며 ; 반대로, 유럽 분리물 중에 5개 OspA 유전형, 즉, I, II, IV, V 및 VI이 있음에 주의하라.

결과는 표 4에 요약된다.

[실시예 3]

[병원성]

Scid 생쥐를 꼬리에 피하내로 10⁸ZQ1으로써 접종하여 접종후(50일 쯤에 임상적 관절염을 유발했다. 57일째에 관찰된 무릎내에서의 조직병리학적 변형을 상기 질병의 초기 단계에서 균주 ZS7으로써 감염된 Scid 생쥐에 대해 서술된 것들에 필적했다. 따라서 ZQ1는 ZS7 보다 덜 병원성이다. 스피로헤타는 ZQ1으로써 감염된 Scid 생쥐로부터 접종후 57일에 단리할 수 있었다.

5C 57BL/6 생쥐를 꼬리에 피하내로 10⁸B.b.ZQ1로써 접종했을 때, 단지 한마리의 생쥐가 160일의 전체 관찰 기간내에 접종후 71째날에 단족 임상 관절염을 진전시켰다.

[실시예 4]

[교차보호]

ZQ1에 대한 IS로써 SCID 생쥐의 재구성 (32㎍ 특이적 1g/ml ; 0 및 4일에 100㎕, 7 및 11일에 200ml 및 15 및 19일에 300㎕)은 0일에 주어진 ZS7으로써의 공격에 대항하여 상기 생쥐를 보호하지 않았다.

[실시예 5]

부가적인 교차보호 연구는 균주 군 II 균주 NE11H 및 군 I 균주 ZS7을 사용하여 수행했다. 표 2I에 제시된 바대로 SCID 생쥐 내로 면역 혈청의 전달은 단지 동종 공격(즉, 동일 군내의 공격)에 대해 보호했다.

[실시예 6]

[균주 ZS7의 재조합 OspA에 대한 또는 다양한 비이. 버그도페리 단리물에 대한 면역 혈청에 대한 또는 단리물을 사용하는 교차보호 실험]

재료 및 방법

[방법]

생쥐(C57BL/6 또는 DBA/2)를 균주 ZS7(IS 항-ZS7), ZQ1(IS 항-ZQ1), NE11H(IS 항-NE11H), B31(SI 항-B31) 또는 균주 20047, ZS7, NE11H, 21035, 21038, 21343, 26816, 28691 및 19535의 동등양을 함유하는 혼합물(IS 항-칵테일)의 생 비이. 버그도페리 스피로헤타로써 꼬리의 기부내로 피하내로(sc) 접종했다.

균주 ZS7으로 부터의 재조합 OspA는 에쉬리치아 콜리에서 pUEX1 발현 벡터로부터 발현되었고, 상기 단백질은 OspA 특이적 지도(LA-2)를 사용하여 추출 및 친화 정제했다. 생쥐에 보조약(ABM2 : Sebac, Aidenbach, FRG) 내 10㎍ 재조합 OspA로써 피하내로 주입시키고 10 및 20일 후에 증강시켰다.

면역 혈청(IS)을 접종 후(p. i) 3 내지 10주 사이에 몇번의 출혈에 의해 상기 생쥐들로부터 얻었다. SCID 생쥐를 접종 전 1시간에 한번(60㎍ 비이. 버그도페리 특이적 1g : IS 항-ZS7, IS 항-NE11H, IS 항-칵테일, IS 항 재조합 OspA) 또는 항체의 양을 증가시키면서 (1 및 4일후 100㎕, 7 및 11일후 200㎕, 14 및 17일후 300㎕) 3주동안 6번(IS-항-B31 함유 60㎍/ml 특이적 1g : IS 항-ZQ1 함유 32㎍/ml) IS로써 복막내로 주사했다.

SCID 생쥐를 혈청의 (첫번째) 전달 후 1시간에 꼬리의 기부내로 피하내로 균주 ZS7, SH-2-82-P5, 21038, NE11H 또는 20047의 1×10⁸생 비이. 버그도페리로써 접종했다.

[결과]

아군 I 균주 ZS7 및 B31에 대한 면역 혈청은 동종 공격에 대해 보호하나, 균주 20047(아군V)로써의 이종 공격에 대해 단지 부분적으로 보호하고 아군 II 군주 NE11H로써의 이종 공격에 대해 전혀 보호하지 않았다.

군 II 균주 NE11H에 대한 면역 혈청은 균주 20047(아군V)에 의한 이종 공격에 대해 단지 부분적으로 보호하고 균주 ZS7(아군 I)에 의해 이종 공격에 대해 전혀 보호하지 않았다.

일특이적 항-재조합 OspA(ZS7) IS로써 SCID 생쥐의 예비처리는 균주 zs7(2/6) 또는 SH-2-82-P5(2/3 ; flaA, OspA/Osp B I)로써 공격했을 때 질병의 진전에 대해 상당한 보호를 초래했고 20047(1/3 ; fla B, QspA/OspB V) 또는 21038(2/3 ; flaB, OspA/Osp B III ; 표 2)로써 공격했을 때 보호를 부분적으로 결과했다. 상기 조건하에서 상기 생쥐의 대부분에서 관찰된 임상적 관절염은 단지 온화했다. 반대로, 재조합 OspA에 대한 동일 IS로써 처리되고 이어서 NE11H(fla, B, Ospa/OspB II)로써 공격된 SCID는 전혀 보호되지 않았다. 상기 생쥐를 모두는 감염된 및 달리 미처리 SCID 생쥐에서 나타낸 것에 필적으로 임상적 관절염을 일으켰다(3/3)(표 3).

[실시예 7]

[NS1-OspA(ZS7) 융합체를 암호하는 발현 플라스미드의 구성]

제1도는 새 플라스미드 pOA0-10, pOA-12 및 p04-18의 구성에 대한 윤팍이다.

간단히, POA-10은 3단계로 창출했다. 먼저, 끝이 잘린 OspA 유전다를 함유하는 pZST-2(Dr wallich)의 1.1kb NspH 1 단편을 돌출한 말단을 잘라낸 후에, Sma 1로써 선형화된 pUC 19와 결찰시켰다. pOA-5로 명명된 결과의 플라스미드에서, OspA 유전자는 다양한 독특한 제한 부위에 의해 플랭킹 되어 (5' 말단에서 이들은 Hind III, Sph I, Pst I Sal I, Xba 및 BamH 이고 3' 말단에서 Sac 1 및 EcoR I 임), 그의 서브클로닝을 더 용이하게 한다. 두번째로, pOA-5를 Xba I에 의해 선형화시키고 BamHI에 의해 선형화된 pMG로써 결찰시키고, 두 단편들의 말단을 충전(fill-in)한 후에 pO-A-9를 창출했다. Puc 19로부터 유래된 상기 플라스미드의 부분을 이어서 NcoI 소화에 의해 제거하여 p04-10을 생성했다. 상기 플라스미드에서, 끝이 잘린 OspA 유전자는 NSI의 첫번째 코돈과 함께 프레임내에 있다. 삽입물의 5' 말단에서의 결합은 서열화에 의해 확증되었다.

pOA2 및 pOA-18을 창출하기 위하여, 우리는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 끝이잘린 OspA를 암호하는 DNA 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 Ncol 및 XbaI 제한 부위를 생성했다. NcoI 및 XbaI로써의 소화 후에, 상기 단편을 동일 효소로써 소화된 pMC42 또는 TCM67와 결찰시켜 각각 pOA-12 및 pOA-18을 얻었다. 첫번째 플라스미드 p0A-12는 첫번째 42아미노산에 융합된 끝이잘린 OspA 유전자를 발현하고, 후자, p04-18는 첫번째 81 아미노산에 융합된 끝이잘린 OspA 유전자를 발현한다. PCR 중에 아미노산 치환의 OspA 유전자내에 도입되지 않았음을 입증하기 위하여 상기 두 플라스미드의 삽입부를 서열화했다.

모든 세 플라스미드를 나리딕스산의 첨가에 의해 λpL 프로모터의 도입을 허용하여 이. 콜리 AR120 내로 형질 전환시켰다. 게다가 모든 세플라스미드를 온도의 증가에 의해 λpL 프로모터의 유도를 허용하는 이. 콜리 AR58 내로 형질전환 시켰다.

[실시예 8]

[pOA-10, pOA-12 및 pOA-18로부터 재조합 tr OspA의 발현]

세 균주 AR120(pOA-10), AR120(pOA-12) 및 AR120(pOA-18)의 50ml 배양물(적절한 항생제로써 보충된 LB 배지)을 0.25ml의 밤새 예비배양물에 접종하고 37℃에서 증식시켰다. 약 0.3의 A₆₂₀에서, 배양물 5ml에 함유된세포를 수확했고 SDS 샘플 완충액에 재현탁했다. 나리딕스 산을 60mg/ml의 최종 농도가 되도록 잔여 배양물에 첨가했다. 세 시간 후에 5ml 배양물로부터의 세포를 수확하고 SDS 샘플 완충액에 재현탁했다.

세 AR120 균주와 동등하게, JM109 및 JM109(pZS7-2) 균주를 0.6의 광학 밀도(620nm)까지 LB 배지 50ml에서 증식시켰고 상기 서술된 바대로 처리했다. JM109 (pZS7-2)에서, OspA의 천연 형태는 그 자체의 프로모터로 부터 구조적으로 발현된다. 모든 샘플을 mAb LA-2, LA-26, 및 LA-31의 풀(pool)을 사용하여 SDS-DAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 적용시켜 OspA 유도체를 감지했다.

비유도 및 유도 세포(pZS7-2의 경우에 플라스미드를 갖는 또는 없는 숙주)에 상응하는 샘플의 분석을 수행했다. 각 웰내로 적재된 물질의 양은 상기 배양물의 광학 밀도를 기준으로 표준화했다(0.05 A620/웰). 염색된 겔에 근거하여, 유도된 JM109 (pZS7-2)의 및 유도된 AR120 (pOA-18)의 레인에서, 새로운 띠는 이동이 발현되는 생산물의 예측크기와 일치함을 나타낸다(각각 NSI의 81 아미노산에 융합된 천연 OspA 및 trOspA). 천연 OspA는 이중띠로서 나타나고 이는 세균의 전체 단백질 함량의 및 퍼센트를 나타낸다. pOA-18의 생산물은 천연 단백질보다 더 높은 수준으로 발현했다. 웨스턴 블롯 분석은 상기 새로운 띠들이 OspA 유도체에 상응함을 확증했다. 그 외의 블롯 분석은 AR120(pOA-12)이 NSI의 42 아미노산과 융합된 trOspA를 발현했으나 낮은 수준이었다. pOA-10으로부터 trOspA의 발현은 희미한 띠로서 나타났으며, 이는 trOspA의 예측 크기에 상응하고 웨스턴 블롯에 근거해 관찰되었다.

동일 플라스미드를 이. 콜리 AR58 내로 도입했을 때 유사한 결과가 관찰되었고 OspA 유전자 유도체의 발현은 온도의 증가에 의해 유되었다.

또한 우리는 카나마이신 저항성 암호화 플라스미드를 사용하여 유사한 NSI_1-81OspA ZS7에 융합 단백질을 얻었다.

[실시예 9]

[AR120(pOA18) 및 JM109(pZS7-2)의 세포 분획 비교]

이. 콜리 균주 AR120 (pOA18)을 증식시켰고, OspA 유전자의 발현은 상기 서술된 바대로 유도되었다.

OspA의 천연 유전자가 그의 프로모터로부터 구조적으로 발현되는 이. 콜리 균주 JM109(pZS7-2)를 100㎕/ml의 암피실린으로 보충된 LB 배지 50ml에서 0.6의 광학 밀도(620mm)까지 증식시켰다.

그다음 두 균주의 세포를 하기와 같이 처리했다. 5ml 내에 포함된 세포를 원심분리에 의해 수확하고 SDS-PAGE 샘플 완충액(샘플 T3)에 재현탁했다. 나머지 40ml 내 세포를 수확하고, 완충액 A(트리스-HCl 50mH, pH 7.5)에서 2번 세척하고 프렌치 압력 셀을 통하여 10,000 1b/in²에서 두번 통과에 의해 동일 완충액에서 붕괴시켰다. 세포 균질물을 원심분리에 의해 분획했다. 상등액을 -20℃에서 저장했다(샘플 D3). 펠릿을 완충액 A에서 두번 세척하고 실온에서 SDS-PAGE 샘플 완충액에 밤새도록 용해시켰다(샘플(C3) 2개의 발현 균주의 세포 분획 결과를 SDS-PAGE에 의해 분석했고 웨스턴 블롯은 “세포-동등물”인 0.025 A620만을 각 웰에 적재한 것을 제외하고 상기와 같이 수행했다. JM19(pZS7-2)에서 발현된 천연 OspA는 가용성(S3) 및 불용성(C3) 세포질 분획 모두에서 발견되었다. 우선적으로 이중띠중 아래쪽 디는 불용성 분획에서 발견된 한편, 위쪽 띠는 거의 완전히 가용성 분획에 있다. JM109(pZS7-2)의 (3레인에서만 나타나는 고분자량 단백질은 항-OspA 항체에 의해 인식되지 않고 따라서 아마도 OspA-유래가 아니다. 반면에 pOA-18의 생산물은 거의 오로지 가용성 분획에서 발견되었다.

[실시예 10]

[pOA-18로부터의 NSI-OspA와 4개의 항-OspA mAb의 반응성]

pf AR120(pOA-18) 및 JM109 (pZS7-2)의 조세포 추출물을 상기 서술된 바대로 제조했다. 그드을 네개의 일련의 나란한 웰 (AR120(pOA-18) 및 JM109(pZS7-2)에서 SDS-PAGE에 적용시키고 그들의 단백질은 니트로셀룰로스 막 상에로 이동시켰다. 그다음 막을 네개의 단편으로 절단했고, 이때 각각은 한쌍의 나란한 레인을 포함했다. 각각의 단편을 상이한 항-OspA mAb와 함께 웨스턴 블롯 분석에 적용시켰다. 결과는 pOA-18에 의해 암호된 NSI-OspA 및 천연 OspA가 유사한 방식으로 모든 네개의 모노클로날과 반응함을 나타낸다.

[실시예 11]

pOA-18의 구성과 유사한 방식으로, 다른 비이. 버그도페리 균주로부터 NSI-OspA 융합 단백질을 발현하도록 플라스미드를 구성했다. 특히, 하기 균주로 부터의 하기 융합체를 제조했고 상기 지시된바대로 시험했다 :

NSI-OspA(ZQ1) ; ZS1-OspA(AcaI) 및 NSI-OspA(19857).

[요약 및 결론]

천연 단백질의 16개 첫번째 아미노산이 결여되고 NS1의 첫번째 81 아미노산에 융합된, OspA의 제조합체의 끝이 잘린 형태는 천연 OspA 보다 높은 수준으로 발현했다. 그것은 천연 단백질보다 더 용해성이고 보조약과 함께 사용했을 때 면역원인 각각의 천연 OspA에 결합하는 상기 모노클로날 항체들과의 반응성을 보유하고 전염성 비이. 버그도페리에 의한 공격으로 부터 동물을 보호하는 능력을 갖는다.

[표 1]

[표 1a]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 4a]

[표 4b]

Claims (10)

1. OspA 부분을 암호하는 서열이 서열 ID No. 1 또는 3에 묘사된 서열과 실질적으로 동일한, OspA 단백질을 암호하는 DNA 서열.
2. 제1항에 있어서, 서열 ID No. 1 또는 3에 묘사된 서열과 90% 동일한 DNA 서열.
3. 서열 ID No. 2 또는 4에 나열된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산을 함유하는 OspA 단백질.
4. OspA 단백질이 상이한 군들로부터 유래됨을 특징으로 하는, 두 개 이상의 OspA 단백질을 포함하는 백신 또는 진단 조성물.
5. 군 I, 군 II, 군 III 및 군 IV로부터 선택된 OspA 및 군 I, 군 II, 군 III 및 군 IV로부터 선택된 두번째 OspA로 구성되며, 단 첫번째 및 두번째 OspA가 상이한 군으로부터 선택되는 백신 조성물.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, ZS7 OspA 및 ZQ1 OspA 및 적당한 부형제의 배합물로 구성되는 백신.
7. 제3항에 따른 OspA 단백질 및 적당한 부형제의 배합물로 구성되는 배신 조성물.
8. a) 제1항에 청구된 바와 같은 DNA 서열을 포함하는 벡터로써 숙주를 형질전환시키고, b) 적당한 숙주 내에서 상기 단백질을 발현시키며, c) 생산된 단백질 또는 유도체를 단리시키는 것으로 구성되는, 제3항에 청구된 바의 OspA 단백질을 생산하는 방법.
9. 약품으로 하기 위한 제3항에 청구된 바와 같은 단백질.
10. 비이. 버그도페리(B. burgdoferi) 균주 ZQ1.