KR100236471B1 - 파네실 전이효소 저해제의 효능을 평가할 수 있는Ras 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그의 제조방법 - Google Patents

파네실 전이효소 저해제의 효능을 평가할 수 있는Ras 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 H-Ras 단백질과 K-Ras 4B 단백질을 결합시킨 융합 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 H-Ras 단백질의 아미노 말단의 공통 서열과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단의 특이 서열을 결합시킨 융합 단백질 (이하 "H-Ras-K-Ras 4B 단백질" 이라고 약칭함), 이를 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 발현 벡터, 이를 생산하는 형질전환된 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그들의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 세포주는 Ras 단백질의 발암성과 관련이 있는 파네실 전이효소에 작용하는 저해제의 효능을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

파네실 전이효소 저해제의 효능을 평가할 수 있는 Ras 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그의 제조방법
본 발명은 H-Ras 단백질과 K-Ras 4B 단백질을 결합시킨 융합 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 H-Ras 단백질의 아미노 말단의 공통 서열과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단의 특이 서열을 결합시킨 융합 단백질 (이하 "H-Ras-K-Ras 4B 단백질" 이라고 약칭함), 이를 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 발현 벡터, 이를 생산하는 형질전환된 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그들의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 세포주는 Ras 단백질의 발암성과 관련이 있는 파네실 전이효소에 작용하는 저해제의 효능을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Ras 단백질은 세포가 성장하고 분화하는데 중요한 역할을 하는 21 kDa 크기의 단백질로서, 구아닌 뉴클레오타이드와 결합하여 구아노신 트리포스페이트 (GTP)를 구아노신 다이포스페이트 (GDP)로 가수분해하는 작용을 한다. 이와 같이 Ras 단백질은 세포 내의 특이적인 GTPase 회로를 조절하는 분자 스위치로 작용하므로 세포 신호전달계에서 매우 중요하다 (Bourne, H. R., Sanders, D. A., McCormick, F., Nature, 1991, 349, 117).
포유동물 세포는 3가지 ras 유전자로부터 아미노산 188개로 이루어진 K-Ras 4B 단백질 또는 아미노산 189개로 이루어진 H-Ras, K-Ras 4A 및 N-Ras 단백질을 생성한다. 이들 단백질의 아미노산 번호 12, 13 및 61 번에 위치하는 아미노산들은 GTP 의 인산기와 근접하여 있어 이들 아미노산 잔기들이 GTP 가 가수분해되는 과정에 관여하는 물 분자의 공간적 위치에 영향을 주므로 Ras 단백질의 GTPase 효소 활성을 저해한다. 구체적으로 인체에서 발생하는 몇몇 암 세포는 상기 아미노산 위치에서 돌연변이가 생긴 것이 관찰되는데, 이 돌연변이로 인해 Ras 단백질 고유의 GTPase 효소 활성이 저해되면 GTP 가 계속적으로 결합되어 있는 상태가 되므로 비정상적인 성장 신호가 지속적으로 전달되게 된다. 이러한 신호 전달체계의 이상으로 발암성이 유발되는 것으로 보고되어 있다. 실제로 이들 발암성 을 갖는 ras 유전자는 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암 등과 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Bos, J. L., Cancer Res., 49, 4682, 1989).
Ras 단백질은 세포막 내에 부착되어야 상기와 같은 생물학적 활성을 나타내게 된다. 따라서 Ras 단백질은 세포막에 부착되기 전에 다양한 효소 단백질이 작용하는 과정을 거쳐야 한다. 구체적으로 파네실화에 관여하는 Ras 파네실 전이효소 (Farnesyltransferase), Ras 단백질의 카복시 말단에 존재하는 3개 아미노산으로 구성된 AAX 펩타이드 절단효소, 메칠 전이효소 및 팔미토일 전이효소 등이 작용하여 단백질이 전이된 다음 그의 카복시 말단이 변형되어야 한다. 상기 과정 중 첫 번째인 파네실화는 파네실 전이효소에 의해 이루어지는데, 이는 Ras 단백질의 카복시 말단에 존재하는 CA1A2X 라는 4개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 기질로서 사용한다. 여기서 C 는 시스테인이고 A1 및 A2 는 전기적 부하를 띄지 않는 지방족 아미노산이고 X 는 메티오닌, 알라닌 및 세린 등이다. 이러한 파네실화 반응은 시스테인 부위에서 일어나 황에테르 결합을 형성하는데, 특히 H-Ras 와 N-Ras 단백질의 경우는 그의 카복시 말단 근처에 존재하는 또 다른 시스테인에서 팔미토일화도 일어난다. 파네실화의 결과로 Ras 단백질은 친소성이 증가되어 세포막 내에 부착될 수 있으며, 파네실화된 Ras 단백질은 다시 그의 카복시 말단의 3개 아미노산 AAX 의 펩타이드가 절단효소에 의해 제거되면서 메틸화되므로, Ras 단백질의 파네실기가 세포막 내의 지질층 또는 다른 수용체와 용이하게 결합되게 한다고 알려져 있다. 실제로 Ras 단백질이 세포막 내에 최적의 조건으로 부착되기 위해서는 상기의 모든 변형 단계가 필요하지만 Ras 단백질이 활성을 나타내는데는 파네실화 자체만으로 충분하다고 보고되어 있다. 따라서, 상기 파네실화 과정을 차단하면 돌연변이로 인해 유발되는 Ras 단백질의 발암성을 효과적으로 저해할 수 있으므로 파네실화를 저해하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Buss, J. E. et al., Chemistry & Biology, 2, 787, 1995).
상기에서 기술한 바와 같이 포유동물 세포에는 네 가지 종류의 Ras 단백질이 있는데, 이들 단백질은 서로 구조적으로 매우 유사하다. 구체적으로 Ras 단백질의 아미노 말단에 존재하는 86개 아미노산은 그 서열이 완전히 동일하고, 87번째 아미노산부터 164번째 아미노산까지는 그 서열이 약 90% 정도 동일한 것으로 나타난다. 그러나 165번째 아미노산부터 카복시 말단에 이르는 아미노산 서열은 매우 다르게 나타나는데, 특히 K-Ras 단백질의 경우는 카복시 말단에 존재하는 CA1A2X 서열의 펩타이드 앞쪽에 라이신이 연결되는 특이적인 아미노산 서열을 가지고 있다. 따라서 Ras 단백질의 카복시기가 변형되는데 필요한 시스테인 잔기가 결핍되어 있어 N-Ras 단백질 및 H-Ras 단백질과 구별된다.
따라서 Ras 단백질의 카복시 말단에 존재하는 펩타이드 서열이 이에 작용하는 효소의 기질 특이성을 결정하는데 매우 중요하고, 이러한 특성을 이용하여 Ras 단백질의 발암성과 관련이 있는 파네실 전이효소의 기질 특이성을 변화시킬 수 있다. 구체적으로 세포 내에 존재하는 상기 4개의 Ras 단백질은 파네실 전이효소에 의한 파네실화 정도에 차이가 날 수 있으며, 파네실 전이효소의 활성을 억제하는 저해제의 작용 특성에도 차이가 있을 수 있다.
이에 본 발명자들은 파네실 전이효소 활성이 저해되는 정도를 정량적으로 평가할 수 있는 세포주를 개발하기 위하여, H-Ras 단백질에 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단의 24개 아미노산 서열을 결합시킨 융합 단백질을 포유동물 세포에서 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조하고 이를 Rat 2 피브로블라스트 세포에 형질전환시켜 상기 융합 단백질을 생산하는 형질전환된 세포주를 얻은 다음 상기 세포주에서 Ras 단백질이 발현됨을 Ras 단백질의 아미노 말단의 59번에서 64번까지의 아미노산 서열을 인지하는 쥐의 단일 클론 항체 (Y13-259)을 이용한 면역침전법 등을 사용하여 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 H-Ras 단백질과 K-Ras 4B 단백질을 결합시킨 융합 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주, 그 제조방법 및 그의 용도를 제공함에 목적이 있다.
구체적으로 본 발명은 H-Ras 단백질의 아미노 말단에 존재하는 공통 서열인 164개 아미노산 서열과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단에 존재하는 특이 서열인 24개 아미노산 서열을 결합시킨 융합 단백질 (H-Ras-K-Ras 4B 단백질)을 제공한다. 본 발명은 상기 H-Ras 단백질로서 12번째 아미노산이 글리신에서 발린으로 치환된 단백질을 사용하고, 상기 융합 단백질은 서열 6 의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 H-Ras 단백질의 아미노 말단과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단을 결합시킨 융합 단백질 유전자 (H-Ras-K-Ras 4B 유전자)를 제공함에 그 목적이 있다. 상기 유전자는 서열 5의 염기 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 H-Ras-K-Ras 4B 단백질을 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 발현 벡터 (pCDNA3-H-Ras-K-Ras 4B)를 제공함에 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 Ras 단백질을 생산하는 형질전환된 Rat 2 피브로블라스트 세포주를 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명의 Rat 2 피브로블라스트 세포주는 상기 H-Ras-K-Ras 4B 단백질을 생산한다.
또한, 본 발명은 Rat 2 피브로블라스트 세포주에 상기 발현 벡터를 형질전환시켜 배양하고, H-Ras-K-Ras 4B 단백질을 생산하는 세포주를 면역침전법 등으로 선별함으로써 형질전환된 세포주를 얻는 제조방법을 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 Ras 단백질의 아미노 말단에 존재하는 59번에서 64번까지의 아미노산 서열을 인지하는 쥐의 단일 클론 항체 (Y13-259) 및 이를 이용한 면역침전법으로 형질전환된 세포주를 선별한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 Rat 2 피브로블라스트 세포주를 Ras 단백질의 발암성과 관련이 있는 파네실 전이효소에 작용하는 저해제의 효능을 평가하는데 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.
도 1 은 본 발명의 H-Ras 단백질 (12번째 아미노산이 글리신에서 발린으로 치환) 과 K-Ras 4B 단백질을 결합시킨 융합 단백질 (H-Ras-K-Ras 4B 단백질)의 아미노산 서열 및 유전자의 염기 서열을 나타낸 것이다.
도 2 는 본 발명의 H-Ras-K-Ras 4B 단백질의 유전자를 클로닝하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 3a 는 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 H-Ras-K-Ras 4B 단백질을 생산하는 형질전환된 Rat 2 피브로블라스트 세포를 도립 현미경으로 관찰한 사진이고,
도 3b 는 도 3a 에 대한 대조군을 나타낸 사진이다.
도 4 는 본 발명의 H-Ras-K-Ras 4B 단백질을 생산하는 세포를 이용하여 면역침전 (Immunoprecipitation)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 Ras 단백질의 발암성과 관련이 있는 파네실 전이효소 (Farnesyl transferase)에 작용하는 저해제의 효능을 효과적으로 평가하기 위하여, 파네실 전이효소의 활성 부위를 포함하는 Ras 단백질을 세포 내에서 생산할 수 있는 새로운 형질전환된 세포주를 제공한다.
상기와 같은 복적을 달성하기 위하여, 본 발명은 H-Ras 단백질과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단을 결합시킨 융합 단백질 (H-Ras-K-Ras 4B 단백질) 및 그의 유전자를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 H-Ras 단백질의 아미노 말단에 존재하는 공통 서열인 164개의 아미노산 서열과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단에 존재하는 특이 서열인 24개 아미노산 서열을 결합시킨 융합 단백질을 제조하는데, 이를 위하여 상기 서열에 해당하는 유전자 (이하 "H-Ras-K-Ras 4B 유전자" 라고 약칭함)를 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 제조한다. 이 때 시발체로는 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4 의 염기 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하는데, 서열 2 및 서열 3 의 시발체는 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단 24개 아미노산 서열에 해당하는 유전자를 증폭하고, 서열 1 및 서열 4 의 시발체는 H-Ras 단백질의 아미노 말단 164개 아미노산 서열에 해당하는 유전자를 증폭하는데 사용된다. 상기 과정에서 본 발명은 H-Ras 단백질로서 12번째 아미노산이 글리신에서 발린 (Gly->Val)으로 치환된 Ras 단백질 (버클리 대학, 정현호)을 사용한다. 상기에서 얻은 두 가지 유전자 절편을 주형으로 다시 서열 3 및 서열 4 의 시발체는 H-Ras 단백질과 K-Ras 4B 단백질 유전자를 결합시킨 유전자 (H-Ras-K-Ras 4B 유전자)를 증폭하는데 사용된다.
그 결과 본 발명은 서열 5 의 염기 서열을 포함하는 H-Ras-K-Ras 4B 유전자를 제공하고, 이로부터 유추한 서열 6 의 아미노산 서열을 포함하는 H-Ras-K-Ras 4B 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 Ras 단백질을 세포 내에서 생산할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 ras 유전자의 공통 서열과 특이 서열을 함께 가지는상기 H-Ras-N-Ras 4B 유전자를 포함하는 발현 벡터 pCDNA3 H-Ras-K-Ras 4B 를 제조한다 (도 2 참조).
또한, 본 발명은 Ras 단백질의 발암성과 관련이 있는 파네실 전이효소에 작용하는 저해제의 효능을 평가하는데 유용하게 사용될 수 있는 새로운 세포주 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 Rat 2 피브로블라스트 세포를 상기 발현 벡터 pCDNA3-H-Ras-K-Ras 4B 를 이용하여 형질전환시킨다.
구체적으로 상기 발현 벡터를 마커로 사용되는 네오마이신 (neomycin) 유전자를 포함하는 발현 벡터와 함께 Rat 2 피브로블라스트 세포에 리포펙타민 방법 (Lipofectamine 방법) 등으로 형질전환시킨다 (도 3 참조). 다음 형질전환된 세포가 파네실 전이효소에 작용하는 저해제의 효능을 평가하는데 유효한가를 조사하기 위하여, 활성을 나타내는 H-Ras-K-Ras 4B 단백질의 발현 정도를 확인한다. 구체적으로 본 발명은 Ras 단백질의 아미노 말단에 존재하는 59번에서 64번까지의 아미노산 서열을 인지하는 쥐의 단일 클론 항체 (Y13-259) 및 이를 이용한 면역침전 (Immunoprecipitation) 방법을 사용하는데 드크루 등 (Declude, J. Z. et al., Cancer Research, 51: 712, 1991)에 의해 보고된 방법을 변형하여 수행한다 (도 4 참조).
상기 형질전환된 Rat 2 피브로블라스트 세포주 (Rat2 fibroblast (H-Ras/K-Ras 4B))를 1997년 1월 29일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0311BP).
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> H-Ras 단백질 및 K-Ras 4B 단백질 유전자의 클로닝
본 발명은 H-Ras 단백질의 아미노 말단에 존재하는 164개의 아미노산 서열과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단에 존재하는 24개의 아미노산 서열을 결합시킨 융합 단백질을 제조하기 위하여 다음과 같은 과정을 수행하였다.
(단계 1) 시발체의 고안 및 합성
H-Ras 단백질의 아미노 말단의 164개 아미노산 서열에 해당하는 유전자 및 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단의 24개 아미노산 서열에 해당하는 유전자를 얻기 위하여, 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이 때 이용하는 시발체로서 4개의 올리고 뉴클레오타이드를 DNA 합성기 (Applied Biosystems, Inc., 모델 380 B, 미국)로 합성하고 이들을 변성 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 분리하였다. 다음 이들을 다시 C18 셉-팩 (C18 Sep-pack, Waters Inc., 미국)을 이용하여 순수 정제하고, 260nm 에서 그의 흡광도를 측정하여 시발체의 농도를 결정하였다.
(단계 2) 유전자의 증폭
우선 단계 1 에서 제조한 서열 2 및 서열 3 의 염기 서열을 가지는 시발체를 이용하여 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단 24개 아미노산 서열에 해당하는 유전자 절편을 중합효소 연쇄반응으로 증폭하였다. 다음 서열 1 및 서열 4 의 염기 서열을 가지는 시발체를 이용하고, H-Ras 단백질 (12번째 아미노산인 글리신이 발린 (Gly->Val)으로 바뀐 Ras 단백질; 버클리 대학, 정현호)을 주형으로 그의 아미노 말단 164개 아미노산 서열에 해당하는 유전자 절편을 중합효소 연쇄반응으로 증폭하였다.
상기 각 유전자 절편을 7% 폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동으로 분리한 다음, 두 개의 유전자 절편과 서열 3 및 서열 4의 염기 서열을 가지는 시발체를 사용하여 다시 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 그 결과 다음의 기술한 방법으로 H-Ras 단백질과 K-Ras 4B 단백질 유전자를 결합시킨 융합 단백질 유전자 (H-Ras-K-Ras 4B 유전자)를 얻었다.
상기 중합효소 연쇄반응을 수행하는데 사용한, 1) K-Ras 4B 유전자를 얻는데 사용한 증폭 반응액 1, 2) H-Ras 유전자를 얻는데 사용한 증폭 반응액 2 그리고 3) H-Ras-K-Ras 4B 유전자를 얻는데 사용한 증폭 반응액 3 는 다음의 성분을 포함하도록 하였다. 구체적으로 증폭 반응액 1 은 유전자 주형이 없이 10㎕의 10 X 농축 반응용액, 6㎕ 의 25mM MgCl2, 2㎕의 10mM dNTP, 3㎕의 0.75㎍ 서열 2 의 시발체, 3㎕의 0.75㎍ 서열 3 시발체, Taq 중합효소 0.4㎕ (5U/㎕, Promega, 미국)에 75㎕의 증류수를 가하여 제조되었다. 또한, 반응액 2 는 위에서 언급한 시발체만을 제외한 성분이 들어 있는 튜브 속에 3㎕의 0.75㎍ 서열 1 의 시발체, 3㎕의 0.75㎍ 서열 4의 시발체와 2㎕의 주형으로 사용되는 H-Ras 유전자 0.1㎍을 넣어 제조되었고, 반응액 3 도 위에서 언급한 시발체만을 제외한 성분이 들어 있는 튜브속에 3㎕의 0.75㎍ 서열 3 의 시발체, 3㎕의 0.75㎍ 서열 4 의 시발체를 넣고, 다시 반응액 1 과 반응액 2 로부터 정제한 유전자 절편 0.1㎍ 씩을 가하여 제조되었다.
상기 반응액 1, 2 및 3 을 이용한 중합효소 연쇄반응은 94℃에서 1분 30초; 50℃에서 1분; 72℃에서 1분 30초의 반응을 30회 동안 반복함으로써 수행하였다. 그 결과 반응액 1 에서는 72개 염기쌍의 K-Ras 4B 유전자가, 반응액 2에서는 492개 염기쌍의 H-Ras 유전자가 증폭되었고, 여기서 얻은 유전자 절편들을 이용하여 반응액 3 에서는 564개 염기쌍으로 이루어진 H-Ras-K-Ras 4B 유전자를 얻을 수 있었다. 이들 유전자를 기존의 통상적인 방법으로 페놀/클로로포름 (phenol/ chloroform) 및 100% 에탄올 등을 이용하여 추출한 다음, 20㎕의 TE 완충용액에 녹여 다음 단계에 사용하였다.
(단계 3) 발현 벡터 pCDNA3 H-Ras-K-Ras 4B 의 제조
상기 반응액 3 을 16㎕ 취한 다음 그 반응액에 제한효소 Bam HI 및 Xho Ⅰ 1㎕ 씩을 첨가하고 10X 제한효소 반응 용액 2㎕을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 통상적인 방법으로 원하는 제한효소 인지 부위를 가진 DNA 절편을 얻었다.
인비트로겐사 (Invitrogen, Cat # V790-20, 미국)로부터 구입한 벡터 pCDNA3 1㎍ 을 제한효소 Bam HI 와 Xho Ⅰ을 이용하여 완전히 절단하고 1% 아가로즈 젤상에서 분리하여 위에서 얻은 DNA 절편과 다음과 같이 연결시켰다.
0.1㎍의 H-Ras-K-Ras 4B 유전자를 제한효소 Bam HI 및 XhoⅠ으로 절단한 DNA 절편과 0.1㎍의 발현 벡터 pCDNA3 를 제한효소 Bam HI 및 Xho Ⅰ 효소로 절단한 DNA 절편을, 2㎕의 10X 연결 반응 용액 (500mM 트리스-염산, pH 7.8, 100mM MgCl2, 100mM DTT, 10mM ATP), 10U의 T4 DNA 리가제를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이 반응액을 대장균 HB101 (ATCC # 33694) 컴피턴트 세포에 첨가하여 대장균을 형질전환시킨 다음 LB-엠피실린 (50㎍/ml 엠피실린을 포함하는 LB 배지) 평판에 평판하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 상기 클로닝 과정은 도 2 에 도시하였다.
<실시예 2> H-Ras-K-Ras 4B 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주의 제조
상기에서 제조한 발현 벡터 pCDNA3-H-Ras-K-Ras 4B 를 대량으로 추출하여 DNA 염기 서열을 확인한 다음, 이를 리포펙타민 방법 (Lipofectamine 방법, GibcoBRL cat # 18324-012)을 이용하여 Rat 2 피브로블라스트 세포 (ATCC cat# CRL-1764)에 다음의 방법으로 형질전환시켰다.
Rat 2 피브로블라스트 세포를 3×105의 세포수를 가지도록 6공 평판 (6-well plate, Falcon cat # 3046, 미국)에 평판한 다음 5% 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GibcoBRL cat # 12800) 2ml을 첨가하여 37℃의 CO2배양기에서 약 18시간 동안 배양하였다. 형질전환에 사용하는 발현 벡터 pCDNA3-H-Ras-K-Ras 4B 1㎍ 과 형질전환된 세포를 선택하는 마커로 사용하는 네오마이신 (neomycin) 유전자를 포함하는 발현 벡터 pRSVneo (Molecular cloning Laboratory manual) 0.1㎍ 을 서로 잘 섞어준 다음 100㎕의 혈청-결핍 (Serum-free) DMEM 배지를 첨가하여 용액 A 를 만들었다. 또한 2㎕의 리포펙타민(Lipofectamine)을 100㎕의 혈청-결핍 DMEM 배지에 첨가하여 용액 B 를 만들고 용액 A 와 용액 B 를 잘 섞어 준 다음 30분 동안 약 25℃에서 방치하였다. 상기 혼합 용액을 0.8ml의 혈청-결핍 DMEM 배지에 넣어 잘 섞고 다시 2ml 혈청-결핍 배지로 1번 세척한 Rat 2 세포를 넣어서 약 5시간 동안 37℃의 CO2배양기에서 배양하였다. 여기에 다시 혈청을 가지는 DMEM 배지 1ml 을 넣어 18시간 동안 배양하고 배지를 다시 40mg/l 농도의 제네티신 (Geneticin, GibcoBRL cat# 11811, 미국)과 항생제인 안티바이오틱-안티마이오틱 (Antibiotic-Antimyotic, GibcoBRL cat#15240) 1× 용액, 그리고 5% 혈청을 가지고 있는 DMEM 배지로 바꾸어 준 다음하나의 세포군이 형성될 때까지 신선한 배지로 바꿔주면서 방치하였다 (도 3 참조).
<실시예 3> 형질전환된 세포 내에서 발현되는 H-Ras-K-Ras 4B 단백질의 검출 방법
상기 실시예 2 에서 선별한 세포군을 이용하여 활성을 나타내는 H-Ras-K-Ras 4B 단백질의 발현 정도를 조사하기 위하여, 면역 침전 (Immunoprecipitation) 방법을 사용하였다. 구체적으로 실험 방법은 드크루 등 (Declude, J. Z. et al., Cancer Research, 51: 712, 1991)에 의해 보고된 방법을 변형하여 수행하였는데, 상기 방법을 상세히 기술하면 다음과 같다.
형질전환된 Rat 2 피브로블라스트 세포주를 60mm 세포 배양 디쉬에 3×105세포수로 분주하여 37℃의 세포배양기에서 48시간 동안 배양하고 50% 이상의 밀도로 세포가 자란 다음 시료를 처리하였다. 이 때 시료를 녹이는 용매로는 디메칠설폭사이드 (DMSO)를 사용하는데, 대조군 및 시험군에 공통적으로 1% 농도의 디메칠설폭사이드를 사용하였다. 시료를 처리하고 4시간이 경과된 후에는 배지 1ml 당 150 마이크로큐리의 방사성 동위원소 [35S]로 표지된 메치오닌을 첨가하고 다시 20시간 을 더 배양한 다음 생리 식염수로 세포를 세척하였다. 세포를 용해시키기 위하여 1ml 의 차가운 세포용해 완충용액 (5mM MgCl2, 1mM DTT, 1% NP 40, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 2uM 펩틴, 2uM 펩스타틴 에이 및 2uM 안티패인을 포함하는 50mM 소디움 히피스 완충용액)을 사용하고, 세포가 용해된 상등액을 고속원심분리(12,000g × 5분)하여 얻었다. 상기 상등액의 방사성동위원소 표지량을 측정하여 면역침전 반응에서 정량적으로 그 결과를 얻을 수 있도록 표준화한 다음 Ras 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체, Y13-259 (Furth, M. E. et al., J. Virol, 43: 294, 1982)를 넣어 4℃에서 15시간 동안 반응시켰다. 이 용액에 다시 고트에서 유래된 쥐의 면역글로블린에 대한 항체가 결합된 프로테인 A-아가로즈 현탁액을 넣어 1시간 동안 4℃에서 반응시킨 다음 면역반응 침전물에서 비특이적 결합물을 제거하기 위하여 완충용액 (50mM NaCl, 0.5% 소디움 디옥시 콜레이트, 0.5% NP 40 및 0.1% SDS 를 포함하는 50mM 트리스-염산 완충용액)으로 세척하였다.
침전물을 분석하기 위하여 전기영동 방법을 사용하며, 침전물을 전기영동시료 완충용액에 끓인 다음 13.5% SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 수행하여 분석하였다. 전기영동한 젤은 고정하여 건조시킨 다음 X-선 필름에 감광시켜 현상 인화하였다. 그 결과, Rat 2 피브로블라스트 세포 내에서 본 발명의 H-Ras-K-Ras 4B 단백질이 발현됨을 확인하였고 그 정도도 측정할 수 있었으며, 이는 도 4 에 도시하였다.
본 발명은 H-Ras 단백질에 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단을 효과적으로 결합시켜 Ras 단백질의 발암성과 관련이 있는 파네실 전이효소의 활성 부위를 포함하는 융합 단백질을 생산하는 발현 벡터를 제조하고, 이를 포유동물 세포인 Rat 2 피브로블라스트 세포에 형질전환시켜 상기 융합 단백질을 효과적으로 생산하는 형질전환된 세포를 선별함으로써 Rat 2 피브로블라스트 세포주를 제조하며, 이와 같이 하여 제조된 Rat 2 피브로블라스트 세포주는 파네실 전이효소에 작용하는 저해제의 효능을 평가하는데 유용하게 이용될 수 있다.
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 1
서열의 길이 : 24
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
[서열 1]
Figure kpo00001
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 2
서열의 길이 : 51
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
[서열 2]
Figure kpo00002
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 3
서열의 길이 : 57
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오티드)
[서열 3]
Figure kpo00003
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 4
서열의 길이 : 30
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오티드)
[서열 4]
Figure kpo00004
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 5
서열의 길이 : 564
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : DNA (유전자)
[서열 5]
Figure kpo00005
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 6
서열의 길이 : 188
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
[서열 6a]
Figure kpo00006
[서열 6b]
Figure kpo00007

Claims (7)

  1. H-Ras 단백질의 아미노 말단의 164개의 아미노산 서열과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단의 24개의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, H-Ras 단백질은 그의 아미노 말단 12번째 아미노산이 발린으로 치환된 단백질인 서열 6 의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  3. H-Ras 단백질의 아미노 말단과 K-Ras 4B 단백질의 카복시 말단의 유전자를 결합시킨 서열 5 의 염기서열을 포함하는 융합 단백질 유전자.
  4. 제 1항의 융합 단백질을 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 발현 벡터 pCDNA3-H-Ras-K-Ras 4B.
  5. 제 4항의 발현벡터로 포유동물세포를 형질전환시켜 얻는 형질전환체.
  6. 제 5항에 있어서, 포유동물세포는 Rat 2 피브로블라스트인 형질전환체 (수탁번호: KCTC 0311BP).
  7. Rat 2 피브로블라스트 세포에 제 4항의 발현 벡터를 형질전환시켜 배양하고, 제 1항의 융합 단백질을 생산하는 세포를 면역적인 방법으로 선별하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 Rat 2 피브로블라스트 세포주를 제조하는 방법.
KR1019970014409A 1997-04-18 1997-04-18 파네실 전이효소 저해제의 효능을 평가할 수 있는Ras 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그의 제조방법 KR100236471B1 (ko)

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