KR100221898B1 - 스키조사카로마이세스-특이적 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스키조사카로마이세스－특이적 단백질 및 이의 항체에 관한 것이다. 이들 단백질 및 항체는 효모스키조사카로마이세스속을 동정하는데 사용할 수 있다.

Description

스키조사카로마이세스－특이적 폴리펩타이드
본 발명은 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)－특이적 단백질 및 이의 항체에 관한 것이다. 이들 단백질 및 항체는 효모 스키조사카로마이세스속을 동정하는데 사용할 수 있다.
슬로프(Slooff)[참조 : W. C. Slooff(1970) "Genus 19. Schizosaccharomyces" in The Yeast. A. taxonomic study. The North Holland Publishing Co. Amsterdam, pp. 733－755]는 분열 효모 스키조사카로마이세스가 4개의 종, 즉 에스. 폼베(S. pombe), 에스. 말리데보란스(S. malidevorans), 에스. 옥토스포러스(S. octosporus) 및 에스. 자포니커스(S. japonicus)를 포함하는 것으로 기술하였으며, 에스. 자포니커스는 에스. 자포니커스 변종(variant) 자포니커스 및 에스. 자포니커스 변종 베르사틸리스(versatilis)로 세분된다. 그러나, 이러한 분류법은 일반적으로 허용되지 않으며, 옥토스포로마이세스(Octosporomyces) 또는 하세가웨아(Hasegawaea)와 같은 속의 추가의 명칭을 도입하는 가능성이 논의되고 있다.
형태학상의 범주는 별문제로 하고, 효모의 동정 및 분류는 일반적으로 모노－, 디－ 및 트리사카라이드의 이용, 니트레이트의 이용 및 특정 비타민의 요구와 같은 생리학상의 특성에 근거한다. 그러나, 이러한 특징에 의한 동정이 항상 명백한 것은 아니며 또한 실수를 초래할 수도 있다.
본 발명에 이르러, 뮤린 모노클로날 항체 mAb JHF13－17에 의해 인지되는 특정 단백질이 스키조사카로마이세스에 대해 특이적이라는 사실이 밝혀졌다.
상기 언급된 mAb JHF13－17을 분비하는 하이브리도마(hybridoma)는 부다페스트 조약에 따라 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌게.엠.베.하.(DSM)[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures G.m.b.H]에 1991년 3월 6일에 기탁번호 DSM ACC 2005로 기탁되었다.
따라서, 본 발명은 ;
1. 모노클로날 항체 JHF13－17에 의해 인지되는, 스키조사카로마이세스로부터의 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 부분.
2. 모노클로날 항체 JHF13－17
3. 스키조사카로마이세스로부터의 폴리펩타이드 또는 면역원성 부분에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체(여기서, 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 부분은 모노클로날 항체 JHF13－17에 의해 인지된다).
4. a) 모노클로날 항체 JHF13－17에 의해 인지되는 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 부분을 분리하는 단계, 및 b) 적합한 유기체를 단계 a)로부터의 폴리펩타이드, 또는 면역원성 부분을 사용하여 면역화시키는 단계를 포함하는, 폴리클로날 항체의 제조방법.
5. 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 부분에 대한 항체와 스키조사카로마이세스를 특허청구의 범위 제1항에 청구된 바와 같이 배양함을 포함하는, 스키조사카로마이세스의 동정방법.
6. 스키조사카로마이세스를 동정하기 위한, 모노클로날 항체 JHF13－17에 의해 인지되는 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 부분에 대한 항체의 용도.
7 . 모노클로날 항체 JHF13－17에 의해 인지되는 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 부분에 대한 항체를 포함하는, 스키조사카로마이세스를 동정하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 바람직한 양태에서, 하기에 상세하게 기술될 것이다.
뮤린 모노클로날 항체 mAb JHF13－17을 사용하여 예를 들어 브르네테[참조 : Burnette W. N. (1981) Anal. Biochem. 112, 195－203]에 의해서 기술된 것과 같은 면역효소학적 방법으로 에스. 폼베, 에스. 말리데보란스 및 에스. 자포니커스에서 2개의 스키조사카로마이세스－특이적 폴리펩타이드(Schizosaccharomyces－specific polypeptide: SSP) SSP－A 및 SSP－B를 검출하였다. 동일한 mAb를 사용하여, 에스. 옥토스포러스에서 2개의 추가의 스키조사카로마이세스－특이적 폴리펩타이드 SSP－B' 및 SSP－C를 발견하였다. 그러나, 폴리펩타이드 SSP－A, SSP－B, SSP－B' 또는 SSP－C는 스키조사카로마이세스속에 속하지 않는 하기의 효모종에서 검출되지 않았다 : 불레라 알바(Bullera alba), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코카스 네어포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 데레우스(Cryptococcus terreus), 엑소바시듐 자포니컴(Exobasidium japonicum), 필로바시듐 플로리포르메(Filobasidium floriforme), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 크루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 류코스포리듐 니발레(Leucosporidium nivale), 메취니코비아 풀체리마(Metschnikowia pulcherrima), 로도토룰라 그라미니스(Rhodotorula graminis), 로도토룰라 미뉴타(Rhodotorula minuta), 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), 사카로마이세스 세레비지애(Sacdharomyces cerevisiae), 사카로마이코데스 루뒤기(Saccharomycodes ludwigii), 스포로볼로마이세스 홀사티커스(Sporobolomyces holsaticus), 트리초스포론 쿠타늄(Trichosporon cutaneum), 트리고노프시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis) 및 우스틸라고 제애(Ustilago zeae).
또한, 스키조사카로마이세스－특이적 폴리펩타이드(SSP－A, SSP－B, SSP－B' 및 SSP－C)는 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)와 염소 및 토끼의 혈청에서도 검출되지 않았다.
발견된 폴리펩타이드의 상대적 분자량은 일반적으로 표준 크기와 비교하여 결정된다. 단백질 SSP－A, SSP－B 또는 SSP－B' 및 SSP－C의 밴드는 예를 들어 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 변성 조건하에 약 40,000 내지 60,000의 분자량 범위에서 검출된다. 하기의 상대적 분자량이 개개의 단백질 밴드에 대하여 바람직하게 결정된다.
SSP－A : 50,000 내지 54,000, 특히 약 52,000,
SSP－B 또는 SSP－B' : 48,000 내지 52,000, 특히 약 50,000,
SSP－C : 46,000 내지 50,000, 특히 약 48,000.
또한, 본 발명은 공지된 방법, 예를 들어 문헌[참조 : Coghlan L. G. & Hanausk M. (1990), J. Immunol. Meth. 129, 135－138]에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있는 SSP－A, SSP－B, SSP－B' 및 SSP－C에 대한 폴리클로날 항체에 관한 것이다. 수득된 일특이적 폴리클로날 항체는, 스키조사카로마이세스에 대해 특이적힌 당해 단백질의 면역원성 부분, 또는 에피토프(epitope) 뿐만 아니라, 폴리펩타이드 SSP－A, SSP－B, SSP－B' 및 SSP－C 자체를 증명하기 위하여 사용할 수 있다. 마지막으로, 본 발명은 또한 mAb JHF13－17와는 작용상 상이하여, 그 결과 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 다른 에피토프를 인지하는 상기 언급된 폴리펩타이드에 대한 mAb도 포함한다.
이들 mAb는 일반적으로 공지된 방법에 의해 제조된다[참조 : Ed Harlow and David Lane, eds. Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(1988)]. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 특히 mAb 13－17은 예를 들어 면역 형광법, 면역 블롯팅 또는 ELISA 시험에서 효모 스키조사카로마이세스속을 동정하는데 일반적으로 사용된다. 모노클로날 항체와 달리, 일특이적 폴리클로날 항체는 또한 일반적으로로 공지된 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피에 의해 SSP－A, SSP－B, SSP－B', 및/또는 SSP－C를 분리하기 위해 사용될 수도 있다.
mAb JHF13－17을 사용하여, SSP－A, SSP－B, SSP－B' 또는 SSP－C를 암호화하는 유전자를 클로닝하고 특이적 DNA 또는 RNA 서열에 의해 스키조사카로마이세스를 동정하는 것도 가능하다. 또한, 특이적 마커로서 작용하는 SSP 유전자 또는 이들의 암호와 영역을 다른 효모에 형질전환시킬 수 있다.
스키조사카로마이세스의 검출은 특히, 정성 대조에서 예를 들어, 당밀로부터 알콜의 생산, 포도주 제조 또는 스키조사카로마이세스중에서의 이종성 단백질의 생산에 사용된다. 스키조사카로마이세스의 특이적 및 민감성 검출일 특히 유리하다. 따라서, 예를 들면, 사카로 마이세스 세레비지애종 및 에스, 폼베종 사이에서 생성된 효모 하이브리드를 명백하게 동정할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해서 보다 상세하게 설명될 것이다.
[실시예 1]
다양한 미생물을 180rpm의 진탕기내의 250삼각(Erlenmeyer) 플라스크내 YPD 배지(1효모 추출물, 2펩톤, 2글루코즈)중에서 3일 동안 15및 30에서 배양한다. 배양액 10분취량을 원심분리시키고, 세포를 수거하여 10mM 트리스－완충액(pH 7.5) 1중에 침지하고, 유리 비이드를 가한후, 배치를 유리 비이드 분쇄기로 처리한다. 균질물을 라엠리(U. K. Laemmli(1970) Nature 227, 680－685]의 방법에 따라 가열하고, 10농도의 SDS 폴리아클릴아미드 겔내에서 분리하여, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시킨다[참조: Burnette W. N. loc. cit.]. 니트로셀룰로즈 스트립을 mAb JHF13－17(10/)을 함유하는 트리스－완충액(10mM 트리스 HCL, pH 7.5, 150mM NaCl, 1젤라틴, 4Tween 29)중에서 배양한다. 알칼린 포스파타제와 커플링된 항－마우스 항체를 접합체로서 사용한다. 사용된 기질은 페스트블루 B 염(Fast Blue B salt ; Serva 제조원, Heidelberg) 및 나프톨 AS－MX 포스페이트(Sigma Chemie 제조원, Munich)이다.
상대적 분자량을 측정하기 위해서, RainbowTM단백질 분자량 마커(Amersham Buchler GmbH, Brunswick)를 니트로셀룰로즈 스트립에 추가로 적용한다.
mAb JHF13－17을 사용하여, 스키조사카로마이세스－특이적 단백질을 하기 스키조사카로마이세스 균주중에서 검출하였다.
[목록 1]
수집 균주의 약어 목록 :
The Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, The Netherlands; Deutsche Stammsammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Brunswick, Federal Republic of Germany; Versuchs－und Lehranstalt fur Spiritusfabrikation und Fermentationstechnologie in Berlin (VLSF), Berlin, Federal Republic of Germany; Institute for Fermentation (IFO), Osake, Japan; Council of Science of Industrial Research (CSIR), Pretoria, South Africa; National Collection of Yeast Cultures (NCYC), Norwich, England; Bayerische Landesanstalt fur Weinbau und Gartenbau (BLWG), Wurzburg, Federal Republic of Germany; American Type Culture Collection (ATCD), Rockville, Maryland, USA.
에스. 폼베, 에스. 말리데보란스 및 에스. 자포니커스의 세포 추출물은 각각의 경우에서 약 52,000(SSP－A) 및 약 50,000(SSP－B)의 상대적 분자량을 갖는 이중 밴드로 나타났다. 전기영동에서 이중 밴드의 이동도는 모든 시험 균주에서 동일하였다. mAb JHF13－17과의 교차－반응성에 의해 2개의 단백질을 서로 관련된 것으로 추론된다.
또한, 에스. 옥토스포러스의 세포 추출물도 상기 기술된 방법에 의해 이중 밴드로 나타났다. 반대로, 전기영동에서 상기 세포 추출물의 이동도는 상단의 단백질 밴드(SSP－B')가 SSP－B의 수준에서 이동한다는 사실에 비추어 에스. 폼베, 에스. 말리데보란스 및 에스. 자포니커스와는 상이하다. 두번째 에스. 옥토스포러스 단백질(SSP－C)은 약 48,000의 상대적 분자량을 갖는다. 전기영동에서 이중 밴드의 이동도는 에스. 옥토스포러스 시험 균주와 동일하였다.
[실시예 2]
mAb JHF13－17과 반응하는, 단백질 SSP－A, SSP－B 및 SSP－C가 분열 효모에 대해 특이적인지에 대한 의문을 해결하기 위해서 23개의 다른 효모종의 세포 추출물을 실시예 1에서 기술된 방법에 의해 실험한다(목록 2). 시험종은 하기와 같다 : 불레라 알바(Bullera alba) DSM 70002, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 크루세이(Candida Krusei), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 테레우스(Cryptococcus terreus) DSM 70222, 엑소바시듐 자포니컴(Exobasidium japonicum) DSM 4461, 필로바시듐 플로리포르메(Filobasidium floriforme) DSM 4655, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) (1eul)a), 크루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) SDll(lac4, trpl)a), 류코스포리듐 니발레(Leucosporidium nivale) DSM 4635, 메취니코비아 풀체리마(Metschnikowia pulcherrima) DSM 70879, 로도토룰라 그라미니스(Rhodotorula graminis), 로도토룰라 미뉴타(Rhodotorula minuta), 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) VLSF 104, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) (ura 3－2, leu 2, his, pral, prbl, prcl, cpsl)a), 사카로마이코데스 루뒤기(Saccharomycodes ludwigii) DSM 3447, 스포로볼로마이세스 홀사티커스(Sporbolomyces holsaticus) DSM 70580, 스테리그마토마이세스 할로필루스(Sterigmaomyces halophilus) DSM 4668, 트리초스포론 쿠타늄(Trichosporon cutaneum) DSM 70698, 트리초스포론 쿠타늄(Trichosporon cutaneum), 트리고노프시스 바리아빌리스(Trigonopsis variabilis) DSM 70714, 우스틸라고 저애(Ustilago zeae) DSM 4500,
a)=유전자 마커
이 결과, 이들 효모종 중에서는 mAb JHF13－17에 의해 어떠한 단백질도 검출되지 않았다. 또한, 염소 및 토끼의 혈청뿐만 아니라 에스케리키아 콜라이의 세포 추출물도 mAb JHF13－17에 의해 특이적으로 인지되는 단백질을 함유하지 않았다. 따라서, 단백질 SSP－A, SSP－B, SSP－B' 및 SSP－C 상에서 mAb JHF13－17에 의해 인지되는 에피토프는 분열 효모에 대해서 특이적이다.
[실시예 3]
mAb JHF13－17에 의해 인지되는 스키조사카로마이세스－특이적 단백질(SSP)의 에피토프가 특이적일 뿐만 아니라, 단백질 자체가 스키조사카로마이세스에 대해 특이적이라는 것을 증명하기 위해서, SSP－A 및 SSP－B에 대한 폴리클로날 혈청을 에스. 폼베로부터 제조한다. 이를 위해, 에스. 폼베 세포추출물의 단백질을 실시예 1에서 기술된 방법에 의해 니트로셀룰로오즈로 이동시키고, SSP－A 및 SSP－B의 위치에 상응하는 단면을 절단한다. 코글란 및 하나섹의 방법[참조 : Coglan and Hanausek, J. Immunol. Method. 129, 135－138 (1990)]에 의해 토끼를 이들 니트로셀룰로즈－결합된 SSP－A 및 SSP－B로 면역화시킨다. 웨스턴 블롯 분석에 있어서, 수득된 일특이적 폴리클로날항혈청은 4개의 스키조사카로마이세스 종의 SSP(SSP－A, SSP－B, SSP－B' 및 SSP－C)와만 반응하며, 다른 세포 추출물 단백질 또는 상이한 효모 종으로부터의 단백질과는 반응하지 않았다. 따라서, 상기 언급된 SSP는 분열 효모에 대해 특이적이다.

Claims (11)

  1. 모노클로날 항체 JHF13－17(DSM ACC 2005)에 의해서 인지되는, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)로부터의 SSP－A, SSP－B, SSP－B' 및 SSP－C로 이루어진 그룹중에서 선택되는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 변성 조건하에서의 상대적 분자량이 40,000 내지 60,000인 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 에스. 폼베(S. pombe), 에스. 말리데보란스(S. malidevorans), 에스. 자포니커스(S. japonicus) 또는 에스. 옥포스포러스(S. octosporus)에서 기원한 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 따른 폴리펩타이드에 대한 모노클로날 항체.
  5. 제4항에 있어서, 모노클로날 항체 JHF13－17(DSM ACC 2005)인 모노클로날 항체.
  6. 제1항에 따른 폴리펩타이드에 대한 폴리클로날 항체.
  7. a) 모노클로날 항체 JHF13－17에 의해 인지되는, 스키조사카로마이세스로부터의 SSP－A, SSP－B, SSP－B' 및 SSP－C로 이루어진 그룹중에서 선택되는 폴리펩타이드를 분리하는 단계, 및 b) 단계 a)로부터의 폴리펩타이드를 사용하여 적합한 유기체를 면역화시키는 단게를 포함하는, 폴리클로날 항체의 제조 방법.
  8. 제1항에 따른 폴리펩타이드에 대한 항체와 함께 스키조사카로마이세스를 배양하는 단계를 포함하는, 스키조사카로마이세스의 동정 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항체가 폴리클로날 또는 모노클로날 항체인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 모노클로날 항체 JHF13－17(DSM ACC 2005)가 사용되는 방법.
  11. 제1항에 따른 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함하는, 스키조사카로마이세스를 동정하기 위한 조성물.
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