KR0176741B1 - 신균주 바실러스 리케니포르미스 ns115와 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제 - Google Patents

신균주 바실러스 리케니포르미스 ns115와 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115(KCTC 0240BP)와 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제(Exopeptidase)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 치즈숙성과정을 가속화 시킬 수 있으며, 우유단백질이 갖고 있는 항원물질을 제거할 뿐 아니라 단백질을 분해하여 향미성분을 제조하여 독특한 풍미를 내도록 하는 효소인 엑소펩티다아제를 생산하는 신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115(KCTC 0240BP)와 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제(Exopeptidase)에 관한 것이다.

Description

신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115(KCTC 0240BP)와 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제(Exopeptidase)
제1도는 본 발명의 신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115의 전자현미경 사진(× 20,000)이고,
제2도는 본 발명 실시예 2에 따른 신규 엑소펩티다아제와 표준단백질과의 SDS 전기영동사진을 나타낸 것이며,
제3도는 본 발명 실시예 2에 따른 신규 엑소펩티다아제와 표준단백질과의 네이티브(Native) 전기영동사진을 나타낸 것이고,
제4도는 본 발명 실험예 2에 따른 신규 엑소펩티다아제의 등전점을 측정한 것이고,
제5도는 본 발명 실험예 3에 따른 신규 엑소펩티다아제의 최적pH와 pH 안정성 및 최적 온도와 온도안정성을 측정한 그래프이며,
제6도는 본 발명 실험예 5에 따른 신규 엑소펩티다아제의 파라나이트로아닐라이드에 대한 효소의 Km값과 Vmax값을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115(KCTC 0240BP)와 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제(Exopeptidase)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 치즈숙성과정을 가속화 시킬 수 있으며, 우유단백질이 갖고 있는 항원물질을 제거할 뿐 아니라 단백질을 분해하여 향미성분을 제조함으로써 독특한 풍미를 내도록 하는 효소인 엑소펩티다아제를 생산하는 신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115(KCTC 0240BP)와 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제(Exopeptidase)에 관한 것이다.
일반적으로, 효소의 특이성을 기초로 하는 프로테아제(protease)는 엔도펩티다아제(Endopeptidase)와 엑소펩티다아제(Exopeptidase)로 분류된다. 여기서, 엔도펩티다아제는 효소의 특이성 요구에 맞는 단백질을 무작위로 끊어주어 펩타이드(peptide)를 형성시키며, 형성된 펩타이드 사슬을 따라 엑소펩티다아제가 작용하여 아미노산 단위로 분해함으로써 단백질을 완벽하게 분해한다. 그리고, 엑소펩티다아제 중 아미노펩티다아제(Aminopeptidase)는 아미노가 말단에서부터 펩타이드 결합을 분해하며, 카르복시펩티다아제(Carboxypeptidase)는 카르복실기 말단에서부터 펩타이드 결합을 분해한다.
이와같은 작용을 통해 단백질 가수분해물은 상기와 같은 엔도펩티다아제와 엑소펩티다아제의 혼합에 의해서 생산된다.
한편, 유아용 조제분유제조시 케이신과 유청단백질을 조정하여 모유 단백질 구성에 가깝게 조성을 바꾸므로써 영양적으로 증강되는 효과를 나타내지만, 다른 한편으로는 이들 물질로 인하여 항원성이 매우 높은 유청단백질이 소화계와 면역계의 발달이 미숙한 유아에게 우유알레르기를 일으키는 원인 물질, 즉 알레르기 항원(allergen)으로 작용하여 유아의 성장에 좋지않은 영향을 줄 수 있다. 이러한 우유알레르기를 유발하지 않으려면 알레르기 항원의 섭취를 피해야 하지만, 유아에게 우유성분의 섭취가 불가피한 경우에는 차선책으로 알레르기 항원의 항원성을 낮추므로써 우유알레르기를 최소한으로 억제시키는 방안이 강구되고 있다. 이중에서도 가장 용이한 방법이 효소에 의한 우유중에 포함된 항원의 가수분해이다. 따라서 과알레르기 식품이나 유아용 조제분유 생산에 있어서 서로 다른 기질특이성이 있는 효소를 조합하여 가수분해하는 것을 이용할 수 있다.
만약 단백질의 폴리펩타이드 결합이 효소에 의해서 가수분해 된다면 항원성은 낮아지게 되는데, 이와 같은 현상은 단백질의 항원성이 가수분해에 의해서 고차구조 의존성 항원결정기가 파괴되며 점차 가수분해 시간이 지속됨에 따라서 일차구조 의존형 항원 결정기가 파괴될 수 있다는 데 기초를 두고 있다. 이를 이용하여 역가가 높은 엔도펩티다아제와 엑소펩티다아제를 처리하여 과알레르기 식품이나 유아용 조제 분유의 알레르기를 억제시킬 수 있다.
한편, 치즈제조 중 단백질분해는 치즈 풍미생성에 있어서 주요한 과정 중의 하나로, 이는 주로 치즈제조시 첨가되는 스타터(starter) 배양 및 치즈숙성 중의 2차적 미생물 균총이 분비하는 효소에 의해서 이루어지는데, 스타터 미생물의 단백질 분해작용의 결과로서 치즈 숙성중에 생성되는 유리아미노산은 숙성도와 기호도를 나타내는 또 하나의 지표로서 치즈 풍미에 중요한 역할을 한다. 치즈를 6개월 숙성시 개별 아미노산 중에는 글루탐익 추출물, 아스팔틱 추출물, 발린 추출물 등의 함량이 높으며, 이들이 치즈의 풍미에 관여한다. 이때, 글루탐산 추출물을 분해하는 역가가 높은 엑소펩티다아제로 효소 처리하는 경우 치즈 풍미생성 증진, 단백분해와 관련된 숙성 촉진 효과 고미생성의 억제 및 고무질성의 치즈 조직이 부드러워지는 효과를 얻을 수 있다. 이런 경우는 치즈 뿐만 아니라 효소분해 간장 및 맛관련 단백질 분해물을 제조하는데도 동일하게 적용되기 때문에 특성이 좋은 엑소펩티다아제의 생산 및 이용방안의 개발은 단백질 이용 산업에 중요한 요인 중의 하나이다.
지금까지 유럽을 중심으로 엑소펩티다아제 연구(J.R.Klein 등 1993, D.N.Tzanetakis 등)가 진행되어 왔고, 단백질 분해효소인 엑소펩티다아제에 의해 항원성이 낮아지는 것에 대한 연구(Lerner 등 1984)와 치즈 숙성 촉진과 독특한 풍미 개발에 대한 연구(Mojarro-Guerra 등 1991, Bouton과 Grappin 등1994)가 진행되어 왔다. 그러나, 이와같은 연구들에서는 일반적으로 엔도펩티다아제와 엑소펩티다아제에 의한 항원성 변화에 대하여 가수분해된 단백질의 분자량을 5000달톤 이하로 유지시켜야 하는 점과 치즈 숙성시 효소에 의한 단백질 분해물이 쓴맛을 생성하는 문제가 있다.
따라서, 본 발명자들은 미생물이 생산하는 엑소펩티다아제, 특히 종래의 엑소펩티다아제와 비교하여 활성이 뛰어나 엔도펩티다아제와 엑소펩티다아제에 의해 가수분해된 단백질의 분자량을 5000달톤 이하로 작게하고, 펩타이드를 분해하여 풍미와 맛을 좋게 하는 엑소펩티다아제를 얻기 위해 전국 각지의 토양 및 축사 주변의 시료로부터 얻은 수천종의 균주 중에서 신규 엑소펩티다아제를 생산하는 신규 미생물을 분리 동정하였으며, 이 신규 미생물은 효소의 활성이 뛰어나고 단백질 분해산물 제조시 쓴맛의 원인이 되는 아르기닌과 페닐알라닌에 대해서는 활성이 없으며 풍미에 관여하는 글루탐익 추출물에서는 활성이 매우 높아 단백질 분해산물 생산 중 문제시 되는 쓴맛과 숙성기간의 난점을 극복할 수 있을 뿐만 아니라 효소가 신규성이 있다고 판단하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115(KCTC 0240BP)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 미생물이 생산하는 최적온도가 55 ℃이고, 최적pH가 8.0이며, 분자량이 42 kDa과 22 kDa이고, 등전점이 5.2이며, N-말단아미노산 서열이 [서열표]의 서열번호 1과 2로 표시되는 신규 엑소펩티다아제 관한 것도 포함한다.
이와같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115과 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제에 관한 것으로서, 본 발명의 신규 미생물의 분리 및 동정과정은 다음과 같다.
[신규 미생물의 분리]
단백질 분해작용으로 생성되는 풍미를 갖는 아미노산을 생산하는 엑소펩티다아제를 분리하기 위해 축사주변의 토양시료로부터 수천개의 각각 다른 콜로니(colony)를 액체 LB 배지에 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양한 후 원심분리하여(12,000 g/10 분) 상등액 100 ㎕을 완충액 기질인 글루탄산파라나이트로아닐라이드 50 ㎕와 50 ℃에서 20~25분 동안 반응하여 아미노산과 파라나이트로 아닐린으로 분해시킬 수 있는 엑소펩티다아제를 생산하는 미생물을 분리하였다. 이때, 분해 정도는 410 ㎚에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다.
[신규 미생물의 동정]
상기에서 분리된 균주의 미생물학적 특징은 다음과 같다.
1) 형태학적 특성
최적 생육배지조건에서 배양한 균주를 그람염색(Gram Staining)과 포자염색(Spore Staining)을 실시한 결과 포자를 형성하는 그람양성균으로 나타났다. 균주를 전자현미경으로 그 형태를 관찰하였으며, 그 결과는 첨부도면 제1도에 나타낸 바와 같다. 첨부도면 제1도에서 보는 바와 같이 세포의 크기와 길이는 각각 0.7~1.0 ㎛, 1.2 ~ 2.5 ㎛의 간상(rod)형으로 관찰되었으며, 카탈라아제(Catalase) 실험결과 양성반응을 보여 바실러스속(Bacillus sp.) 미생물이 갖는 형태적 특징과 일치한다.
2) 생리학적 특성
분리된 미생물의 생리학적 특성은 다음 표 1에 나타낸 바와 같다. 다음 표 1에서와 같이 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)와 아르기닌 디하이드로라제(Argnine dehydrolase)를 생산하고 라이신 디카복실라아제(Lysine decarboxylase)와 우레아제(urease)는 생산하지 못한다. 그리고, 카탈라아제는 양성반응으로 나타나며, 글루코오즈(D-Glucose), 아라비노즈(L-Arabinose), 자일로즈(D-xylose), 만니톨(D-Mannitol)로부터 산을 생성하고 니트레이트(Nitrate)를 니트라이트(Nitrite)로 환원할 수 있는 특성을 가졌다. 이와 같은 생리학적 특성은 바실러스속(Bacillus sp.) 미생물이 갖는 일반적인 특성으로서 분리된 미생물은 바실러스속(Bacillus sp.) 미생물로 인정되었다.
3) 균체 화학적 특징
균체를 수확하여 균체내의 지방산 조성, G + C 함량, 뮤레인 형(Murein Type) 및 주요 멜라키논(Main melaquinone)을 분석하였으며, 그 결과는 다음 표 2에 나타낸 바와 같다. 다음 표 2에서 보듯이 지방산 조성의 경우 15 : 0 ISO, 15 : 0 ANTEISO, 17 : 0 ANTEISO가 주지방산으로 나타나서 MIDT(Microbial Identification System)의 결과와 비교한 결과 신균주는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로 확정하였다.
상기와 같은 형태학적, 생리학적 및 균체화학적 특성을 종합분석한 결과 분리된 신규 미생물은 바실러스속에 속하는 미생물임을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol 2 (Williams Wilkins Co., 1989)에서 확인하였다.
따라서, 분리된 미생물을 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115로 명명하고, 1996년 4월 10일자로 대한민국 특허 균주기탁기관인 생명공학연구소내 유전자원센타에 기탁하여 수탁번호 KCTC 0240BP를 부여받았다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[신규 엑소펩티다아제(Exopeptidase)의 생산]
엑소펩티다아제를 생산하기 위하여 KHPO0.24%, KHPO0.24%, MgSOㆍ7HO 0.02% 전분 1%, 효모 추출물 0.1%를 포함한 배지를 pH 6.7로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 동일한 배지 조성으로 미리 37℃ 12시간 동안 플라스크에서 배양한 종배양액을 1% 접종하여 효소를 생산하였다.
효소 역가의 측정은 pH 7.5로 조정된 0.2M 트리스(Tris) 완충액에 5mM 글루탐산 파라나이트로 아닐라이드가 함유된 용액을 기질로하여 37℃에서 25분간 발색시킨 후 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 역가는 1분당 1μ㏖의 파라나이트로 아닐라이드를 분해하는 효소량을 1단위로 하였다. 측정결과 신규 효소는 단백질 ㎎당 1.1 단위의 효소 역가를 가졌다.
[실시예 2]
[신규 엑소펩티다아제의 효소적 특성]
상기의 실시예 1에 따라 생산된 신규 미생물의 배양액을 원심분리(6,000 g, 20분)한 후 상등액을 70% 암모늄설페이트((NH4)2SO4)로 포화시켜 생성된 침전물을 원심분리(8,000 g, 20분)하여 제거하였다. 그리고, 상등액을 10mM 인산염 완충액(pH 7.0), 1.5M (NH4)2SO4로 평형화한 페닐세파로오즈(Phenyl Sepharose) CL-4B 컬럼에 가하여 분획한 결과 5개의 단백질 피크(peak)를 얻었다. 비흡착 부위인 부근에서 엑소펩티다아제 활성을 가지는 반면 나머지 4개의 단백질 피크에서는 엑소펩티다아제 활성을 전혀 보이지 않았다. 엑소펩티다아제 활성이 있는 분획만을 모아 농축한 후 두번째 컬럼으로 리소스(Resource) Q를 사용하였으며, 그 결과 농도를 1 M 까지 증가시켜서 엑소펩티다아제 역가를 갖는 단백질 피크를 얻었고 이 단백질을 모아 마지막으로 슈페로오즈(Superose) 12 HR 10/30 컬럼을 사용하여 효소를 순수 분리하였다. 순수분리된 효소의 순수도와 분자량을 알기 위하여 분자량을 알고 있는 표준 단백질과 상기에서 분리된 엑소펩티다아제로 SDS-전기영동을 실시하였으며, 그 결과는 첨부도면 제2도에 나타낸 바와 같다. 첨부도면 제2도에서 1 레인은 표준단백질이고, 2와 3 레인은 정제된 엑소펩티다아제를 나타낸 것이다.
첨부도면 제2도에서와 같이 각각의 컬럼 단계를 거쳐 순수 분리되는 과정에서 분자량이 42 kDa과 22 kDa의 두 밴드(band)가 같은 강도로 나타나 헤테로다이머(Heterodimer)로 추정하고 효소가 헤테로다이머임을 확인하기 위해서 우선, 네이티브(Native) 전기영동을 실시하였으며 그 결과는 첨부도면 제3도에 나타낸 바와 같다. 첨부도면 제3도에서 1레인은 α-락토알부민, 2 레인은 카보닉안하이드라제, 3 레인은 치킨에그 알부민(Chicken Egg Albumin)과 보바인 세럼 알부민(Bovine Serum Albumin)이며, 4 레인은 정제된 엑소펩티다아제를 나타낸다.
첨부도면 제3도에서와 같이 단일밴드로 나와 단일밴드 부분을 용출하여 SDS 전기영동한 결과 42 kDa와 22 kDa의 두밴드가 나타났다. 두 번째로, 겔 투과크로마토그라피(Gel permeation chromatography)를 이용하여 엑소펩티다아제의 분자량을 추정한 결과 64,000의 분자량임을 알 수 있었다. 세 번째로, 판 상태에서 엑소펩티다아제 역가를 측정할 수 있는 판(plate)에 네이티브(native)젤을 올려 놓았을 때 네이티브 전기영동에서 단일밴드로 나타난 위치에서만 발색이 되었다.
상기 세가지 실험결과를 통해 순수 분리된 엑소펩티다아제는 헤테로다이머로 분자량이 각가 42 kDa와 22 kDa으로 밝혀졌다.
[실험예 1]
[효소 단백질의 분자량 및 N-말단 아미노산 서열 결정]
순수분리된 효소단백질을 SDS-PAGE 전기영동법으로 분자량을 측정한 결과 64,000 Da의 분자량을 얻었다.
또한 분리된 효소 단백질을 단백질/펩타이드 시퀀서(Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 N-말단 아미노산 서열을 결정한 결과는 다음 [서열표]에 나타낸 바와 같다.
[서열표]의 서열번호 1은 본 발명 신균주로부터 생산된 엑소펩티다아제 중 분자량 42 kDa인 것의 N-말단 아미노산 서열이고, 서열번호 2는 본 발명 신균주로부터 생산된 엑소펩티다아제 중 분자량 22 kDa인 것의 N-말단 아미노산 서열이다.
그리고, 서열번호 3은 종래 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans) 유래의 엑소펩티다아제의 N-말단 아미노산 서열이고, 서열번호 4는 종래 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 엑소펩티다아제의 N-말단 아미노산 서열이며, 서열번호 5는 종래 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 유래의 엑소펩티다아제의 N-말단 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
[서열표]의 결과로부터 본 발명의 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115(KCTC 0240BP)가 생산하는 엑소펩티다아제는 신규 효소임을 알 수 있다.
[실험예 2]
[신규 엑소펩티다아제의 등전점]
본 발명 신균주가 생산하는 엑소펩티다아제의 등전점을 조사하기 위해 암폴라이트(ampholyte) pH 3 ~ 10을 사용해서 대략적인 등전점을 확인한 후 등전점이 5 부근에 나타나 다시 암폴라이트(ampholyte) pH 4 ~ 6.5를 사용하여 좀더 정확한 등전점을 확인한 결과 5.2로 밝혀졌다. 그 결과는 첨부도면 제4도에 나타낸 바와 같다.
첨부도면 제4도에서 1 레인은 등전점 3.55인 아밀로글로코시다아제와 5.85인 카보닉안하이드라제 B, 2 레인은 등전점 4.55인 트립신 저해제와 6.57인 카보닉안하이드라제이고, 3 레인은 정제된 엑소펩티다아제 및 4 레인은 등전점 5.13인 β-락토글로블린 A이다.
[실험예 3]
[열과 pH에 대한 활성 및 안정성]
온도 및 pH가 엑소펩티다아제의 활성과 안정성에 미치는 영향을 조사하기 위해서 상기에서 순수분리된 효소를 이용해서 조사한 결과 최적 온도는 55℃로 나타났다. 열에 대한 안정성을 측정하기 위해 각 온도에서 30분간 방치한 후 잔존 활성을 측정한 결과 첨부도면 제5도(a)에 나타난 바와 같이 50℃까지 안정하였으며 55℃에서도 70%의 활성을 유지하였다.
엑소펩티다아제의 활성을 pH를 달리하면서 측정한 결과 최적 pH가 8.0으로 나타났으며, pH에 대한 안정성을 측정하기 위하여 여러 가지 pH 용액을 30℃에서 1시간 동안 방치한 후 엑소펩티다아제의 잔존 활성을 측정한 결과 첨부도면 제5도(b)에 나타낸 바와 같이 pH 5와 pH 12인 상태에서도 역가가 60%이상이었다.
[실험예 4]
[저해제 및 금속이온이 효소활성에 미치는 영향]
금속이온과 저해제가 본 발명의 효소에 미치는 영향은 다음 표 3에 나타낸 바와 같다.
다음 표 3의 결과로부터 EDTA는 1mM과 5mM에서 효소활성을 20%정도 저해하며, SDS 5mM에서는 대부분의 효소 활성이 저해됨을 알 수 있다. 금속이온의 경우 아연이온(Zn2+) 5mM에서 50%이상의 효소 활성의 감소를 가져 왔다.
[실험예 5]
[반응속도에 미치는 기질의 영향]
기질인 파라나이트로아닐라이드의 농도를 조절하여 효소와 반응시킨 후 엑소펩티다아제 분해효소의 활성을 Lineweaver-Burk plot 상에서 조사하였으며, 그 결과는 첨부도면 제6도에 나타낸 바와 같다. 첨부도면 제6도에서와 같이 파라나이트로아닐라이드에 대한 효소의 Michaelis-Menten상수(Km값)와 최대반응속도(Vmax)는 각각 0.087 mM과 1.64 유닛/ ㎎이었다.
[실험예 6]
[신규 엑소펩티다아제의 치즈의 쓴맛 감소와 풍미향상]
본 발명의 신규 엑소펩티다아제에 의한 치즈의 쓴맛 감소효과를 측정하기 위하여 수분 함량이 50% 정도되도록 조절된 원료치즈를 디소듐포스페이트를 1.5~2.5%되도록 첨가한 후 살균처리하여 사용하였다. 시판되고 있는 뉴트라제(Neutrase, 시그마사 제품)라는 단백분해 효소를 10배 희석하여 가열처리된 원료치즈에 첨가하였다. 45℃에서 약 8~24시간 또는 48 시간 반응시키고 나면 쓴맛과 불쾌한 냄새가 강하게 나게 되는데, 이것은 뉴트라제가 케이신을 분해하여 쓴맛이 강한 펩타이드를 생성하기 때문이다. 이때 신규 엑소펩티다아제를 원료 치즈에 10 유닛 정도 첨가하여 8~72시간 배양하면 쓴맛이 감소된다. 이때 사용한 엑소펩티다아제 효소액은 바실러스 리케니포르미스 배양액을 한외여과를 통해 농축한 후 저온진공 농축시켜 동결건조기로 건조하여 사용하였다. 뉴트라제만 첨가한 치즈의 FPLC(파마시아 제품)프로파일(profile)은 뉴트라제를 첨가하지 않은 치즈보다도 많은 피크를 보여주었다. 뉴트라제로 12시간 반응시킨 후 신규 엑소펩티다아제를 첨가하여 반응시키고 FPLC로 분석한 결과, 후반부에 있던 피크가 소멸된 반면에 초기의 피크들이 증가되는 것으로 보아 유리아미노산의 함량이 증가되었음을 알 수 있다. 이것은 뉴트라제가 케이신에 작용하여 생성한 큰 펩타이드들이 엑소펩티다아제의 좋은 기질로 이용되고 있다는 것을 의미한다.
또한, 생성된 유리아미노산은 치즈의 숙성도와 기호도를 나타내는 또하나의 지표로서 치즈 풍미와 중요한 관계가 있다. 유리아미노산은 총 17종이 검출되었으며, 유리아미노산 분석용 치즈시료의 전처리는 O'keeffe등(1976)의 방법에 따라 하였다. 치즈 30 g을 증류수 70 ㎖에 분쇄, 균질하여 -5 ℃에서 3,000 g으로 20분간 원심분리하고, 상층액 50 ㎖에 동량의 25% 트리클로로아세트산(TCA) 용액을 첨가하고 건냉소에서 1시간 동안 정치시켰다. 다시 -5 ℃에서 3,000 g으로 30분간 원심분리하여 상층액 50㎖를 취한 후 동량의 에틸에테르로서 TCA와 지질 등을 제거하고 36 ℃에서 진공농축시킨 농축액을 소듐시트레이트 완충액을 사용하여 25 ㎖로 채운 후 유리아미노산 분석용 시료로 이용하였다. 유리아미노산 분석은 아미노산 분석기(파마시아 제품)을 사용하였다.
신규 엑소펩티다아제를 처리한 후 유리아미노산 분석결과를[Dept. of Food Science, McGill University, Montreal and Food RD Center, Agriculture Canada, St.-Hyacinithe, Canada]에서 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei) ssp.를 사용하여 실험한 유리아미노산 분석하였으며, 그 결과는 다음 표 4에 나타낸 바와 같다.
상기 표의 결과로부터 일반 체다치즈의 주요 풍미성분으로는 메싸지온, 글루탐산, 라이신으로서 락토바실러스 카세이를 사용했을때보다 본 발명의 신규 엑소펩티다아제를 사용했을 때 훨씬 양이 많이 생산되었고, Mojarro-Guerra등(1991)이 보고한 Vacherin Mont d'Or 치즈의 유리아미노산 함량을 분석한 결과 글루탐산, 라이신, 프롤린 및 발린이 50 nM/㎎이상이었다고 한 것보다 본 발명 신규 엑소펩티다아제 처리한 치즈에서 높게 나왔다. 뿐만 아니라 단백질 분해산물 제조시 쓴맛의 원인인 아르기닌과 페닐알라닌은 매우 적게 나왔다.
[서열표]
서열번호 : 1
서열의 길이 : 14
서열의 형 : 아미노산
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
서열
Asn-Gly-Asp-Asp-Gly-Asp-Lys-Val-Ala-Val-Gly-Lys-Asp-Gly
서열번호 : 2
서열의 길이 : 15
서열의 형 : 아미노산
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
서열
Thr-Thr-His-Phe-Thr-Val-Thr-Asp-Gln-Trp-Gly-Asn-Val-Val-Ser
서열번호 : 3
서열의 길이 : 14
서열의 형 : 아미노산
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
서열
Asn-Leu-Asp-Glu-Val-His-Ile-Ser-Val-Thr-Pro-Gly-Asp-Thr
서열번호 : 4
서열의 길이 : 14
서열의 형 : 아미노산
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
서열
Val-Leu-Lys-Asp-Gly-Asp-Ile-Ile-Ser-Ile-Asp-Ile-Gly-Ala
서열번호 : 5
서열의 길이 : 13
서열의 형 : 아미노산
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 단백질
서열
Asn-Gly-Asn-Val-Ile-Asp-Gly-Phe-Thr-Leu-Thr-Phe-Lys

Claims (5)

  1. 신균주 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) NS115(KCTC 0240BP).
  2. 제1항의 미생물을 단백질 분해과정 중에 첨가하는 사용하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단백질 분해 과정은 치즈숙성과정인 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항의 미생물이 생산하는 최적온도가 55 ℃이고, 최적 pH가 8.0이며, 분자량이 42 kDa과 22 kDa이고, 등전점이 5.2이며, N-말단아미노산 서열이 [서열표]의 서열 번호 1과 2로 표시되는 신규 엑소펩티다아제.
  5. 제4항의 엑소펩티다아제를 맛개선을 위한 유효성분으로 하는 치즈 첨가제.
KR1019960019826A 1996-06-04 1996-06-04 신균주 바실러스 리케니포르미스 ns115와 이로부터 생산되는 신규 엑소펩티다아제 KR0176741B1 (ko)

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