KR0176420B1 - 고구마 배양세포 유래의 퍼옥시다제 유전자 및 이를 이용한 퍼옥시다제의 대량생산 방법 - Google Patents

고구마 배양세포 유래의 퍼옥시다제 유전자 및 이를 이용한 퍼옥시다제의 대량생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 배양세포 유래의 퍼옥시다제(peroxidase) 유전자 및 이를 이용한 퍼옥시다제의 생산방법에 관한 것으로, 고구마 배양세포로부터 분리된 본 발명의 산성 퍼옥시다제 swp A1 및 중성 퍼옥시다제 swp N1 유전자는 고구마 배양세포와 식물체 줄기에서 특이적으로 발현하며 제놈내에 복수로 존재하는 특징이 있으며, 이의 전체 또는 일부를 세포, 식물체, 미생물 및 박테리아에 형질전환시킴으로서 퍼옥시다제를 안정적으로 대량생산할 수 있다.

Description

고구마 배양세포 유래의 퍼옥시다제 유전자 및 이를 이용한 퍼옥시다제의 대량생산 방법
본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 배양세포 유래의 퍼옥시다제(peroxidase)유전자 및 이를 이용한 퍼옥시다제의 대량생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고구마 식물체에서 유도된 고구마 배양세포로부터 고생산되는 퍼옥시다제의 유전자를 분리하고 이를 식물, 대장균 등에 도입한 형질전환체를 통하여 퍼옥시다제를 대량생산하는 방법에 관한 것이다.
퍼옥시다제는 과산화수소 존재하에서 기질을 산화시키는 작용을 하는 효소로서 효소반응이 민감하기 때문에 각종 임상시험용 시약, 화학분석용 시약 또는 유기화합물의 산화반응 등에 통상적으로 사용되는 상업적으로 중요한 효소이다. 이 효소는 여러 식물체에 존재하는데 특히 서양겨자무(horse radish)의 주근에 많이 함유되어 있으며, 현재 시약으로 이용되는 대부분의 퍼옥시다제는 이로부터 추출된 것이다. 그러나 이와 같은 원료식물을 대량재배하는 데에는 비옥한 넓은 토양이 필요할 뿐 아니라 기후, 토양 및 수확시기 등 재배조건에 따라 이들의 수확량 및 품질도 영향을 받기 때문에, 고품질의 퍼옥시다제를 안정하게 수득하기에는 어려움이 따른다.
재배 식물체로부터 퍼옥시다제를 추출하는데 따르는 이와 같은 문제점을 해결하는 수단으로서, 세포배양 방법을 이용하여 배양세포로부터 퍼옥시다제를 생산하는 방법이 있다. 그러나 퍼옥시다제가 존재하는 것으로 보고된 땅콩, 서양겨자무, 토끼풀, 황벽나무, 파파이야 등 수종의 식물에 이 방법을 적용한 결과, 배양세포로부터 퍼옥시다제의 생산성이 매우 낮아 실제적으로는 이용하지 못하고 있는 실정이다.
한편, 조직배양 방법을 이용하여 퍼옥시다제를 생산하는 방법에 관한 연구가 많이 보고되어 있다. 예를 들어, 일본 특허공개공보 소62-138188호, 소63-233782호, 평1-222777호, 평1-222778호, 평1-269489호 및 국제특허공개 WO 91-10729호등이 있으나, 이들 보고에서도 아직 고품질 퍼옥시다제의 효과적이고 상업적인 생산방법을 확립시키지 못하고 있다.
본 발명자들은 고품질의 퍼옥시다제를 생산하기 위해서는 일차적으로 생산성이 높은 배양세포주를 개발해야 한다는 것을 인식하여 메꽃과에 속하는 고구마(Ipomoea batatas (L.) Lam, cv White Star) 식물체로부터, 지금까지 보고된 어느 식물체의 배양세포 보다도 퍼옥시다제를 대량 생산하는 배양세포를 개발하여 보고한 바 있다(대한민국 특허출원 제93-21925호, 한국생화학회지, 27, 32-137(1994); Phytochemistry, 39, 981-984(1995)).
식물의 퍼옥시다제를 코드할 수 있는 유전자에 대해서는 지금까지 서양겨자무, 보리, 밀, 유채, 애기장대풀, 담배, 시금치, 벼 등 19종의 식물로부터 유래된 일부동위효소의 것이 보고되어 있을 뿐, 세계적으로 주요 작물인 고구마에서 퍼옥시다제 유전자에 대해서는 아직 보고된 바 없다(Plant Peroxidase Newsletter, 3, 7-11(1994)).
본 발명자들은 고구마 식물체로부터 유도한 고구마 배양세포에서 고생산되는 퍼옥시다제를 암호하는 신규 유전자를 분리하고 염기서열을 결정하였으며, 계속해서 이와 같이 분리된 퍼옥시다제 유전자가 고구마 배양세포와 식물체 줄기에서 특이적으로 발현된다는 것을 발견하였을 뿐 아니라, 이 유전자를 도입한 형질전환체를 이용하여 퍼옥시다제를 대량생산하는 시스템을 개발하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 고구마 배양세포로부터 고생산되는 퍼옥시다제를 암호하는 신규 유전자를 분리하여 염기서열을 결정하고, 이 유전자를 도입한 형질전환제를 통하여 퍼옥시다제를 대량생산하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 염기서열을 갖는 고구마 배양세포의 산성 퍼옥시다제 유전자:
및 하기 염기서열을 갖는, 고구마 배양세포의 중성 퍼옥시다제 유전자를 제공한다:
또한 본 발명에서는 상기 퍼옥시다제 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터롤 형질전환된 담배 식물체와 대장균, 그리고 이들 형질전환체를 배양하여 퍼옥시다제를 회수하는 것을 포함하는 퍼옥시다제의 대량생산 방법을 제공한다.
제1도는 본 발명의 고구마 배양세포로부터 분리된 퍼옥시다제(swp A1 및 swp N1)를 암호하는 유전자의 염기서열 및 이로부터 번역된 아미노산 서열을 나타낸 것이고,
제2도는 고구마 배양세포와 식물체의 각 조직으로부터 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자의 발현 여부를 노던(Northern) 분석한 결과이고,
제3도는 본 발명의 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자가 존재하는 고구마 제놈 DNA를 제놈 써던(Southern) 분석한 결과를 나타낸 것이고,
제4도는 본 발명의 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자가 도입된 담배 식물체의 PCR 분석결과를 나타낸 것이고,
제5도는 본 발명의 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자를 포함하는 발현벡터의 제한효소 절단결과를 나타내는 것이다.
고구마 배양세포에서 고생산되는 퍼옥시다제를 암호화하는 유전자의 클론을 얻기 위하여, 고구마 배양세포에서 정제한 주성분 퍼옥시다제 동위효소의 N-말단구조에 기초한 프라이머를 사용하여 부분 PCR 산물을 얻는다. 즉, 고구마 배양세포주(KCTC 0086BP)를 배양하여 전체 RNA를 분리정제하고, 이로부터 poly(A)+RNA를 제조한 후, 고구마 배양세포에서 정제된 퍼옥시다제의 N-말단서열과 감자 및 토마토의 근위(proximal) 히스티딘 영역으로부터 고안된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한다. 수득된 PCR 산물(0.5kb)을 탐침으로 해서 DNA 라이브러리(library)를 제작하고 이로부터 유전자 크기가 1kb 이상인 20개의 양성클론(positive clone)을 수득한다. 생거의 방법(Sanger, et al, Proc Natl Acad, U.S.A, 53, 1035-1040(1977))에 따라 DNA의 염기서열을 결정하고, 아미노산의 상동성에 따라 산성과 중성의 퍼옥시다제를 분류하고 각 그룹의 대표 클론을 산성 퍼옥시다제 swp A1과 중성 퍼옥시다제 swp N1라 명명하였다.
제1도는 본 발명의 고구마 배양세포로부터 분리된 퍼옥시다제(swp A1 및 swp N1)를 암호하는 유전자의 염기서열 및 이로부터 번역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
swp A1은 66개의 분비 펩티드(signal peptide)를, swp N1은 67개의 분비 펩티드를 가지고 있으며 성숙 N-말단은 모두 Asp(aspartic acid)로, 현재까지 보고된 대부분의 성숙 퍼옥시다제의 N-말단이 피로글루탐산(pyroglutamic acid)인 것(Intapruk, et al, J. Ferment, Bioeng, 75, 166-172(1993))과는 차이가 있다. swp A1에서는 고구마 배양세포로부터 전제한 주성분 퍼옥시다제 동위효소의 N-말단 아미노산 서열(Asp-Glu-Ala-Cys-Val-Phe-Ser-Ala-Val-Lys-Glu-Val-Val)이 확인되었으며, swp N1에서는 3개의 다른 아미노산서열을 보여주었다. swp A1과 swp N1의 성숙단백질의 등전점(isoelectric point)은 각각 4.8와 6.9로, swp A1은 산성 퍼옥시다제를, swp N1은 중성퍼옥시다제를 암호하는 것을 알 수 있었다. 이들의 3'-말단 비번역영역(untranslated region)에는 전형적인 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal)인 AATAAA와 poly (A) tail이 존재하였다.
swp A1과 swp N1은 아미노산수준에서 63%, 뉴클레오티드 수준에서 66%의 상동성을 보였다. 또한 이 두 클론은 상동성에 따른 퍼옥시다제의 분류에서 그룹 Ⅲ에 속하는 감자와 토마토의 것과 51 내지 55%의 상동성을 보였고, 원위 히스티딘(distal histidine) 영역에서도 역시 그룹 Ⅲ(토마토, 감자)과 가장 높은 상동성을 보인 것으로 보아, 고구마 퍼옥시다제는 그룹 Ⅲ의 것으로 분류될 수 있는 것으로 보인다.
본 발명에서 분리한 퍼옥시다제 유전자의 발현을 고구마 배양세포와 고구마의 각 조직(잎, 줄기, 뿌리 및 구근)을 대상으로 조사한 결과, 전장의 퍼옥시다제 cDNA를 탐침으로 한 경우는 배양세포에서 강하게 발현하고 식물체에서는 줄기에서만 약하게 발현하였을 뿐, 잎, 뿌리, 구근에서는 발현하지 않았으며, swp A1과 swp N1의 3'-말단 비번역영역을 각각 탐침으로 한 경우에도 전장의 cDNA를 사용하였을 때와 마찬가지로 배양세포에서 강하게 그리고 식물체에는 줄기에서만 약하게 발현되었음을 알 수 있었다.
이어서 본 발명의 swp A1와 swp N1 유전자가 고구마의 제놈(genome)내에 존재하는 유전자임을 확인하기 위하여, 고구마 배양세포로부터 제놈 DNA를 추출한 후 EcoRI, HincII 및 HindIII의 제한효소로 절단하여 혼성화반응을 수행한 결과, 두 유전자는 제한효소의 절단패턴이 다르고 2개 이상의 밴드를 나타내었으므로, 서로 다른 제놈내에 복수로 존재하는 유전자임을 확인할 수 있다.
본 발명이 다른 목적에 따라 퍼옥시다제를 대량생산하는 시스템을 개발하기 위하여, 담배와 대장균을 모델로 하여 swp A1과 swp N1을 도입한 형질전환체를 개발하였다. swp A1과 swp N1으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404와 담배 잎절편을 함께 배양한 후 선발배지에서 형질전환된 담배 식물체를 유도하였으며, 형질전환된 담배 식물체의 염색체내 퍼옥시다제 cDNA의 도입여부는 PCR로 확인하였다. 그리고, 대장균에서도 pQE발현벡터 시스템을 사용하여 두 유전자를 발현시켰으며 제한효소 절단으로 그 도입 여부를 확인하였다.
이상과 같이, 본 발명에서는 고구마 배양세포로부터 퍼옥시다제를 암호하는 유전자를 처음으로 클로닝하였으며, 본 발명의 신규한 산성 퍼옥시다제 swp A1과 중성 퍼옥시다제 swp N1는 고구마 배양세포와 식물체의 줄기에서 특이적으로 발현되며 제놈내에 복수로 존재함을 확인하였다. 또한, 본 발명의 고구마 배양세포로부터 분리된 퍼옥시다제 유전자를 도입한 형질전환 담배와 대장균을 확인하였으며, 따라서 이러한 퍼옥시다제 유전자 또는 그 일부를 이용하여 세포, 식물체, 미생물 및 박테리아 등의 형질전환체를 개발하여 퍼옥시다제를 대량생산할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
cDNA 라이브러리 제작 및 퍼옥시다제 유전자의 분리
고구마 배양세포주(KCTC 0086BP)를 2,4-디클로페녹시아세트산 1mg/ℓ가 첨가된 LS(Linsmaier and Skoog) 배지중 25℃ 암조건에서 100rpm으로 진탕배양하였다. 계대배양한지 10일째의 배양세포에서 분리한 전체 RNA로부터 폴리 A 트랙 mRNA분리 시스템(Promega사)을 이용하여 poly(A)+RNA를 제조하였다. 고구마 배양세포에서 정제된 주성분 퍼옥시다제의 N-말단서열(Asp-Glu-Ala-Cys-Val-Phe-Ser-Ala-Val-Lys-Glu-Val-Val)과 감자 및 토마토에 보존되어 있는 근위 히스티딘 영역으로부터 각각 고안된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 퍼옥시다제를 코드하는 cDNA를 클로닝하기 위해, PCR 산물을 탐침으로 하고 λMOSSlox(Amersham사)를 이용하여 아머샴사의 방법에 따라 λMOSSlox cDNA라 라이브러리(library)를 제작하였다. 혼성화반응(hybridization)은 반응용액(6 × SSC, 5 × Denhardt 용액, 0.5% SDS, 100 μg/㎖ 연어 정자 DNA)에서 55℃로 24시간 동안 실시하였다. 이어서 막을 2 × SSC/0.5 SDS로 실온에서 1회 가볍게 세척한 후 1 × SSC/0.1% SDS로 55℃에서 2회 세척하고 양성 플라크(positive plaque)를 취해 희석한 후, 동일한 방법으로 2차, 3차 스크리닝(screening)을 행하였다. 2 × 104파아지 플라크(phage plaque)를 스크리닝하여 유전자 크기가 1kb 이상인 20개의 양성클론(positive clone)을 얻었다. 생거의 방법(Sanger, et al., Proc Natl Acad, U.S.A, 53, 1035-1040(1977)에 따라 DNA 염기서열을 결정하고, 이 염기서열을 바탕으로 1차 구조 분석한 결과, 아미노산의 상동성에 따라 크게 산성 및 중성 퍼옥시다제로 분류하였으며 각 그룹의 대표로서 산성 퍼옥시다제 swp A1 및 중성 퍼옥시다제 swp N1를 선정하였다.
[실시예 2]
퍼옥시다제 swp Al 및 swp N1 유전자의 염기서열 분석
상기 분리한 swp A1은 1380 bp로 351개의 아미노산으로 이루어진 ORF(open reading frame)을 가지며, swp N1은 1263 bp로 348개의 아미노산으로 이루어진 ORF를 가지고 있다.
제1도는 본 발명의 고구마 배양세포로부터 분리된 퍼옥시다제를 암호하는 유전자의 염기서열 및 이로부터 번역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 여기에서 밑줄 부위는 정제된 단백질의 N-말단서열에 해당하는 부위이고, 두줄로 밑줄친 부위는 원위 히스티딘과 근위 히스티딘 영역을 나타낸다.
swp A1은 66개의 분비 펩티드(signal peptide)를 가지며 swp N1은 67개의 분비 펩티드를 갖는데, 성숙 N-말단은 모두 Asp(aspartic acid)로, 현재까지 보고된 대부분의 성숙 퍼옥시다제의 N-말단이 피로글루탐산(pyroglutamic acid)인 것(Intapruk, et al., J. Ferment, Bioeng, 75, 166-172(1993))과는 다름을 알 수 있다. swp A1에서는 고구마 배양세포로부터 정제한 퍼옥시다제 동위효소의 N-말단 아미노산 서열(Asp-Glu-Ala-Cys-Val-Phe-Ser-Ala-Val-Lys-Glu-Val-Val)을 관찰할 수 있었으며, swp N1에서는 3개의 다른 아미노산 서열이 존재하였다. swp A1 및 swp N1 성숙 단백질의 등전점(isoelectric point)은 각각 4.8 및 6.9로, swp A1은 산성 퍼옥시다제를, swp N1은 중성 퍼옥시다제를 코드하는 유전자임을 알 수 있다. 이들의 3'-말단 비번역영역(untranslated region)에는 전형적인 폴리아데닐화 신호인 AATAAA와 poly (A) tail이 존재한다.
산성 퍼옥시다제 swp A1과 중성 퍼옥시다제 swp N1은 아미노산 수준에서 63%, 뉴클레오티드 수준에서 66%의 상동성을 보였다. 또한 두 클론의 상동성에 따른 퍼옥시다제의 분류(Intapruk, et al., J. Ferment, Bioeng, 75, 166-172(1993))에 따라, 퍼옥시다제 그룹Ⅲ에 속하는 감자와 토마토의 퍼옥시다제와는 51 내지 55%의 상동성을 나타내었고, 그룹 Ⅰ에 속하는 애기장대풀 및 서양겨자무 등의 퍼옥시다제와는 31 내지 35%의 상동성을, 그룹 Ⅱ에 속하는 벼, 토마토, 오이, 순무, 밀 및 땅콩 등의 퍼옥시다제와는 30 내지 40%의 낮은 상동성을 나타내었다. 일반적으로 퍼옥시다제의 활성중심인 원위(distal) 히스티딘 영역과 근위(proximal) 히스티딘 영역의 염기서열이 잘 보존되어 있다. 원위 히스티딘 영역에 비해 근위 히스티딘 영역은 그룹간에 다소 차이가 존재하는데, 근위 히스티딘 영역에서 퍼옥시다제 그룹Ⅲ의 식물은 그룹Ⅰ 및 Ⅱ의 식물과는 많은 차이를 나타낸다. 산성 퍼옥시다제 swp A1과 중성 퍼옥시다제 swp N1의 원위 히스티딘 영역은 그룹Ⅲ(토마토 및 감자)의 원위 히스티딘 영역과 가장 높은 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터 고구마 퍼옥시다제는 그룹Ⅲ의 것으로 분류될 수 있을 것으로 본다.
[실시예 3]
퍼옥시다제 유전자의 발현 유도
실시예 1에서 분리한 퍼옥시다제 유전자, 즉 산성 퍼옥시다제 swp A1 및 중성 퍼옥시다제 swp N1 유전자가 고구마 배양세포와 고구마 식물체의 각 조직(잎, 줄기, 뿌리 및 구근)에서 발현되는지의 여부를 관찰하기 위해, 노던(Northern) 분석을 실행하였다.
먼저, 퍼옥시다제의 전반적인 발현을 알아보기 위하여, swp A1 및 전장의 퍼옥시다제 cDNA를 탐침으로 사용하던 노던 분석을 실행하였다. 그 결과, 고구마 배양세포에서는 퍼옥시다제 유전자가 강하게 발현하였으며, 고구마의 각 조직에서는 줄기에서만 약하게 발현하였고 잎, 뿌리 및 구근에서는 퍼옥시다제 유전자가 발현되지 않았다.
이어서, 각 유전자의 발현 정도를 관찰하기 위하여, swp N1의 3'-말단 비번역영역(untranslated region)이 자신이 유전자에만 결합하는 특이성(specificity)을 가짐을 써던(Southern) 분석을 통하여 확인한 후, 이를 탐침으로 사용하여 노던 분석을 실행하였다. 그 결과, 전장의 cDNA를 탐침으로 사용하였을 때와 마찬가지로 고구마 배양세포에서는 퍼옥시다아제 유전자가 강하게 발현되었고, 고구마 조직에서는 줄기에서만 약하게 발현되었다.
제2도는 고구마 배양세포와 식물체의 각 조직으로부터 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자의 발현 여부를 노던(Northern) 분석한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 Ca는 캘러스에서 분리한 전체 RNA 10㎍, Ce는 현탁배양세포에서 분리한 전체 RNA 10㎍을 나타내고, L은 잎, S는 줄기, nR은 비괴근, 그리고 tR은 괴근에서 분리한 전체 RNA 20㎍을 나타낸다. 각 도면의 하단은 사용한 각 전체 RNA의 리보좀 RNA를 나타낸다.
[실시예 4]
퍼옥시다제 유전자 제놈 DNA 분석
산성 퍼옥시다제 swp A1 및 중성 퍼옥시다제 swp N1가 고구마의 제놈(genome) 내에 존재하는 유전자임을 확인하기 위하여, 제놈분석(Southern)을 실시하였다. 고구마 배양세포로부터 델라포타의 방법(Dellaporta, Newsletter, 57, 26-29(1983))에 따라 추출한 제놈 DNA 10㎍을 제한효소 EcoRI, HincII 및 HindIII로 절단하여 아가로즈 겔 전기영동하고 나일론 막으로 전사한 다음, 산성 퍼옥시다제 swp A1과 중성 퍼옥시다제 swp N1의 3'-말단 비번역영역을32P로 표지하여 써던(Sourthern) 혼성화 반응을 수행하였다.
제3도는 본 발명의 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자가 존재하는 고구마 제놈 DNA를 제놈 써던(Southern) 분석한 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 두 유전자는 제한효소의 절단패턴이 달랐으며 2개 이상의 밴드를 나타내어 분리한 유전자가 서로 다른 제놈내에 복수로 존재하는 유전자임을 알 수 있다.
[실시예 5]
퍼옥시다제에 의한 담배 식물체의 형질전환
본 발명이 산성 퍼옥시다제 swp A1 및 퍼옥시다제 swp N1를 도입한 형질전환체로부터 퍼옥시다제를 대량생산하는 시스템을 개발하기 위하여, 담배 식물체를 모델로 하여 형질전환 식물체를 개발하였다. 즉, 산성 퍼옥시다제 swp A1 및 중성 퍼옥시다제 swp N1 유전자를 모두 갖는 2원(binary) 벡터를 제작하기 위해, 제한효소 KpnⅠ 또는 XbaⅠ의 인지부위를 가지고 있는 프라이머를 이용하여 swp A1와 swp N1 유전자를 PCR 증폭하고, 수득된 PCR 산물을 제한효소 KpnⅠ 및 XbaⅠ으로 절단하여 2원 벡터인 pMBP-1(벡터 pBⅠ121(Stratagene사)에 35S 이원 프로모터를 삽입하여 변형시킴)에 삽입하여 swp A1 및 swp N1 유전자가 각각 도입된 발현벡터 pMBP62 및 pMBP18를 제작하였다.
이어서 상기 발현벡터를 변형된 안의 방법(An, Method in Enzymol, 153, 292-305(1987))에 따라 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)에 도입시키고, 형질전환된 아그로박테리아를 50㎍/m1의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 YEP 아가(agar) 배지에서 선별하였다. 멸균된 담배의 어린잎을 0.5 × 0.5 cm 크기로 일정하게 자른 20장의 담배 잎절편을 페트리 디쉬(petridish)에 담고 5ml의 캘러스 유도배지(1mg/ℓ NAA, 0.1mg/ℓ BA)에서 형질전환된 아그로박테리아를 함께 넣어 25℃에서 2일 동안 정치배양하였다. 이어서, 담배잎의 절편을 멸균수로 여러번 세척한 뒤, 카베니실린(carbenicillin) 250㎍/㎖과 카나마이신 150㎍/㎖이 함유된 선택배지에서 배양하였다. 잎에서 신초(shoot)가 유도되면 호르몬이 포함되지 않은 배지로 옮겨 뿌리를 유도하였다. 모든 식물체의 배양은 16시간의 광주기와 8시간의 암주기 조건에서 배양하였다.
형질전환된 담배 식물체의 염색체내에 퍼옥시다제 유전자가 발현되는지의 여부를 확인하기 위해 PCR를 실시하였다. 항생제 카나마이신에 대해 저항성을 나타내는 NPT II 유전자가 염색체상에 존재하는가를 NPT II 프라이머를 사용하여 살펴본 결과, 700bp의 밴드가 관찰되었다. 32개의 형질전환체중, 20개의 식물체(1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,13,14,15,18,20,22,24,28,31 및 32 식물체)가 NPT II 유전자를 가지고 있음이 관찰되었다.
이어서, 산성 퍼옥시다제 swp A1과 중성 퍼옥시다제 swp N1의 특이성 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 퍼옥시다제 cDNA가 염색체 내에 존재하는지를 살펴보았다. swp N1 유전자를 갖는 형질전환체에서는 400 bp의 밴드(1,2,3,4,5,6,7,8, 및 9 식물체)가, swp A1 유전자를 갖는 형질전환체에서는 600 bp의 밴드(11,13,15,18,20,28,31 및 32 식물체)가 나타났다. 이들로부터 swp N1 유전자를 갖는 담배 식물체 9개, swp A1 유전자를 갖는 담배 식물체 8개를 얻을 수 있었다. 형질전환이 확인된 담배 식물체의 3번째 잎으로부터 단백질을 추출하여 전기영동한 후, 퍼옥시다제를 검출한 결과 정상의 담배에서 검출되지 않은 새로운 밴드가 검출되어 고구마 퍼옥시다제 유전자가 성공적으로 담배에 도입되었음을 확인하였다. 형질전환체의 퍼옥시다제 활성은 정상식물에 비해 단위 식물체 무게당 평균 3.2배, 단위 단백질당 평균 1.7배 높았다. 가장 높은 개체는 약 7배였다. 활성이 가장 높은 개체로부터 캘러스를 유도하여 담배 세포주(Nicotiana tobacum)를 1996년 6월 26일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 0253BP호로서 기탁하였다.
제4도는 본 발명의 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자가 도입된 담배 식물체의 PCR 분석결과를 나타낸 것이다. 여기에서 제 M 열은 1kb의 표준 핵산 분자량을 나타내고, 제1열 내지 제9열은 중성 퍼옥시다제 swp N1 유전자가 도입된 아그로박테리아로 형질전환시킨 담배를 나타내고, 제10열 내지 제32열은 산성 퍼옥시다제 swp A1 유전자가 도입된 아그로박테리아로 형질전환시킨 담배를 나타낸다.
[실시예 6]
퍼옥시다제에 의한 대장균의 형질전환
고구마 퍼옥시다아제 유전자를 대장균에서 발현시키기 위해, Qiagen사의 pQE 발현벡터 시스템을 사용하였다. BamHⅠ 인지부위 및 번역개시코돈(ATG)을 포함하는 5'-말단 프라이머(swp A1의 프라이머: 5'-ATAGGATCCATGGCTTCCTTCGTGGCT-3'; swp N1의 프라이머: 5'-ATCGGATCCATGGCTTCCTTTATGAA-3')와 T7 프로모터 프라이머(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3')를 이용하여 PCR을 30회 수행하였다(94℃ 1분 및 72℃ 1분). 수득된 PCR 산물들을 제한효소 BamHⅠ 및 SacⅠ으로 절단하여, 미리 제한효소 BamHⅠ 및 SacⅠ으로 절단시킨 플라스미드 pQE(Qiagen사)에 각각 삽입하여 발현벡터 pQEA1 및 pQEN1을 제작하였다. 이를 100㎍/㎖의 앰피실린이 들어 있는 LB 배지에서 선별하여 플라스미드 DNA를 얻고, BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단하여 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자가 발현벡터에 삽입된 것을 확인할 수 있다.
제5도는 본 발명의 퍼옥시다제 swp A1 및 swp N1 유전자를 포함하는 발현벡터의 제한효소 절단결과를 나타내는 것이다. 여기에서, 제M열은 BRL's 1kb의 표준 핵산 분자량을 나타내고, 제1열 및 제3열은 pQE30 플라스미드 DNA를 제한효소 BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단한 결과이고, 제2열은 swp A1 유전자가 삽입된 pQE30 플라스미드 DNA를 제한효소 BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단한 결과이고, 제4열은 swp N1 유전자가 삽입된 pQE30 플라스미드 DNA를 제한효소 BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단한 결과를 나타낸다.
본 발명에서는 고구마 배양세포로부터 퍼옥시다제를 암호하는 유전자를 처음으로 클로닝하였으며, 본 발명의 신규한 산성 퍼옥시다제 swp A1과 중성 퍼옥시다제 swp N1는 고구마 배양세포와 식물체의 줄기에서 특이적으로 발현되며 제놈내에 복수로 존재함을 확인하였다. 또한, 본 발명의 고구마 배양세포로부터 분리된 퍼옥시다제 유전자를 도입한 형질전환 담배와 대장균을 확인하였으며, 따라서 이러한 퍼옥시다제 유전자 또는 그 일부를 이용하여 세포, 식물체, 미생물 및 박테리아 등의 형질전환체를 개발하여 퍼옥시다제를 대량생산할 수 있을 것으로 기대된다

Claims (8)

  1. 하기 염기서열을 갖는, 고구마 배양세포의 산성 퍼옥시다제 유전자:
  2. 하기 염기서열을 갖는, 고구마 배양세포의 중성 퍼옥시다제 유전자:
  3. 제1항 또는 제2항의 퍼옥시다제 유전자를 포함하는 발현벡터.
  4. 제3항에 있어서, 발현벡터 pMBP62 또는 pMBP18.
  5. 제3항에 있어서, 발현벡터 pQEA1 또는 pQEN1.
  6. 제4항의 발현벡터로 형질전환된 담배 세포주.
  7. 제6항에 있어서, 담배 세포주(Nicotiana tabacum)(KCTC 0253bp).
  8. 제6항의 담배 세포주를 배양하여 퍼옥시다제를 회수하는 것을 포함하는 퍼옥시다제의 생산방법.
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