KR0175429B1

KR0175429B1 - 적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법

Info

Publication number: KR0175429B1
Application number: KR1019950052201A
Authority: KR
Inventors: 신길상; 손태호
Original assignee: 손일호; 경창산업주식회사
Priority date: 1995-12-19
Filing date: 1995-12-19
Publication date: 1999-02-01
Also published as: KR970043013A

Abstract

본 발명에 따라 적외선 온도센서를 이용하는 생체시료의 고정방법은 (a) 고정할 생체시료를 비이커에 넣은 다음 생리식염수나 완충용액을 넣어 생체시료 고정기의 공진실내에 투입하는 단계, (b) 파형조사시간을 결정하여 생체시료의 고정레벨을 선택하는 단계, (c) 상기 공진실내의 생체시료에 발진주파수 2450MHz, 출력 600W의 마그네트론을 1초간격으로 50%의 듀티 사이클로 작동시켜 마이크로파 에너지를 상기 파형조사시간동안 인가하는 단계, (d) 상기 마이크로파 에너지의 인가단계에서 마그네트론의 오프기간중 상기 가열된 생체시료의 표면에서 발산하는 적외선(열)을 일정거리에서 감지하여 증폭한 다음, 이 증폭신호를 메인보드에 전송하는 단계, 및 (e) 상기 증폭신호를 고정기내 메인보드에 입력된 소정의 고정온도 신호값과 비교하여 일치하는 경우 마그네트론의 동작을 정지시키는 단계를 구비하는 것을 특징으로 한다.

Description

적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법

본 발명은 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법에 관한 것으로, 특히 마이크로파 고정기에서의 생체시료 고정시간을 단축시키고 단백질 축출이 거의 없는 적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법에 관한 것이다.

일반적으로, 생명과학 분야에서 생체시료의 내부를 관찰하기 위해서는 고정 단계를 거쳐야 한다. 이는 조직의 변형을 막고 구조적 보관을 유지하면서 시료를 현미경으로 관찰할 수 있도록 하기 위해 취하는 단계이다.

즉, 생체시료의 구성물질이 여러 가지 용매에 축출되지 않도록 하고 광선이 투과될 수 있는 절편제작이 가능하도록 하며 확대촬영과 명암(明暗)의 대조를 높이는 과정이라고 할 수 있다. 따라서 생체조직의 구조나 특정세포 및 바이러스와 효소등을 관찰할 때 필히 고정단계를 거쳐, 대상 조직을 절편하고 염색하여 현미경으로 검사하여야 한다.

이런 생체시료의 고정법은 주로 용액을 사용하는 화학고정법과 열을 사용하는 물리고정법으로 구분될 수 있다. 그러나 일반적인 열 고정법은 시료내에서 생기는 열전도의 차이로 인하여 고정 정도가 일정하지 않고 조직내의 물질이 대량 축출될 가능성이 있으므로 선호도가 낮은 방법이다. 또한 화학고정법을 사용할 때는 시료의 크기에 제한이 있고 고정액 침투 시간이 많이 소용되며, 수소이온 농도, 삼투압 등이 고려되어도 저분자 용해성 단백질의 40 ∼ 50%가 축출된다. 이런 단점은 시료의 질(質)과 염색성, 확대율, 명암의 대조 등에 좋지 않은 영향을 미치게 되었다.

그러나 종래기술에 있어서는, 상기 화학고정법의 단점을 보완하기 위하여 무리고정법의 하나인 마이크로파 열(microwave heat)을 이용하는 방법이 개발되었다. 이 방법은 조직 내에 고정 정도의 차이가 발생하지 않고 고정시간도 초(秒) 단위로 종료될 수 있으며 조직내의 물질변화나 축출되는 물질의 양이 비교적 적은 것으로 알려져 있다. 한편, 마이크로파는 3 X 10⁹∼ 3 X 10¹⁰회/초의 진동주파수와 10cm ∼ 1cm의 파장을 갖는 바이온화 방사선(nonionizing radiation)을 의미한다. 고정에 사용되는 마이크로파는 2450 ±50 MHz(2.45 GHz)의 진동수를 갖는 것인데, 이것은 시료에 흡수되어 200℃ 정도의 열을 발생시키며, 이 열이 시료내에 균일하게 전도하여 고정효과를 나타낸다고 알려져 있다.

종래의 화학고정법에 비교하여 여러 가지 장점을 갖는다고 생각되는 마이크로파 열 고정법의 응용범위는 점차 넓어지고 있으나, 아직 일부의 실험실에서 제한된 범위의 시료 고정에 사용될 뿐이다. 이러한 이유는 두가지로 요약할 수 있다.

첫째, 고정시 주로 사용된 가정용 마이크로파 오븐의 마이크로파 발진 장치인 마그네트론(magnetron)의 출력이 제조회사에 따라 상이할 뿐만 아니라, 마이크로파 조사(照射)시 사용하는 온도, 용액(고정액, 수용액 혹은 완충용액)등의 변수로 인하여 저자들이 서로 상이한 결론을 얻었다.

둘째, 가정용으로는 마이크로파 조사중에 시료의 온도측정이 대단히 어려우며, 마이크로파를 발진하는 주기가 상이하여 마이크로파가 균일하게 조사되지 않았다.

그런데 종래의 마이크로파 오븐 및 그 생체시료 고정방법에 있어서는, 생체 시료를 고정시키기 위해 화학용액인 포르말린으로 고정하는 방법을 사용하였다. 이때, 고정에 소요되는 시간이 조직의 크기에 따라 2∼6일이 소요되어 전체 검사시간이 6∼12일이 걸려 판정결과에 오랜 시간이 소요되는 문제점이 있었다. 또한, 화학적고정법은 조직내 용해성단백질이 40∼50% 가량 축출되는 단점을 가지고 있어 고정 이후에도 조직의 변형이 일어난 상태에서 검사를 하게 되는 문제점이 있었다.

또한, 화학고정액을 사용하지 않고 전자파로 생체시료를 고정시키는 종래의 마이크로웨이브 오븐에 있어서는, 생체시료가 적정한 고정상태에 도달되었는지를 판단하기 위해 접촉식센서가 사용되었는데, 이 접촉식센서는 온도 감응속도가 느리고 전자파 잡음에 의해 정확한 감지가 불가능한 문제점이 있었다. 또한, 정밀도가 없는 비접촉식 온도센서 역시 정확도가 떨어지는 문제점이 있어 이들 센서를 이용 할 경우 정확한 감지가 불가능하여 조직관찰이 불가능한 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 창안된 것으로서, 본 발명의 목적은 고정시간을 십수초로 단축시키면서도 단백질의 축출이 거의 없는 적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 물체의 표면에서 발산하는 적외선을 감지하여 고정 온도를 정밀하게 측정할 수 있는 적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법을 제공하는데 있다.

제1a도는 본 발명의 마이크로파 고정기의 외부사시도.

제1b도는 제1a도에 도시된 동작조절부(20)의 세부도.

제2도는 본 발명의 마이크로파 고정기의 블록 구성도.

제3도는 본 발명의 마이크로파 고정기의 내부 구조도.

제4도는 생체시료가 고정된 조직내 구조를 보여주는 현미경 확대도.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 시료용 비이커 2 : 고정레벨 선택버튼

3 : 버퍼용량 선택버튼 4 : 정지버튼

5 : 시작버튼 6 : 문열림버튼

7 : 공진실 8 : 생체시료

9 : 완충용액 10 : 적외선 온도센서

11 : 마그네트론 12 : 센서보드

13 : 메인보드 14 : 마그네트론 구동부

20 : 동작조절부

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법은, 고정할 생체시료를 비이커에 넣은 다음 생리식염수나 완충용액을 넣어 생체 시료 고정기의 공진실내에 투입시키는 과정과, 상기 시료의 크기에 따라 파형조사시간을 결정하여 생체시료의 고정레벨을 선택시키는 과정과, 상기 공진실내의 생체시료에 마이크로파 에너지를 상기 파형조사시간동안 일정간격으로 인가시키는 과정과, 상기 마이크로파 에너지가 인가되지 않는 시간에서는 상기 가열된 생체시료의 표면에서 발산하는 적외선(열)을 감지하여 이를 증폭시키는 과정과, 상기 증폭된 신호를 미리 입력된 소정의 고정온도 신호값과 비교하여 상기 마이크로파 에너지의 공급을 제어하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 고정레벨 선택과정에서 결정된 기본 파형조사 시간외에, 혼합되는 생리식염수나 완충용액의 기본량에 추가되는 양에 비례하여 마그네트론의 파형조사시간을 일정시간동안 연장시키도록 하는 과정을 추가로 구비한다.

이하, 본 발명의 일실시예에 관하여 첨부도면을 참조하면서 상세히 설명한다.

제1a도는 본 발명의 마이크로파 고정기의 외부사시도이고, 제1b도는 제1a도에 도시된 동작조절부(20)의 세부도이고, 제2도는 본 발명의 마이크로파 고정기의 블록 구성도이고, 제3도는 본 발명의 마이크로파 고정기의 내부 구조도이고, 제4도는 생체시료가 고정된 조직내 구조를 보여주는 현미경 확대도이다.

제1a도 및 제1b도에서,부호 1은 생체시료와 적당량의 생리식염수나 인산등의 완충용액이 담긴 시료용 비이커를 나타내고, 부호 20은 동작조절부를 나타낸다.

상기 동작조절부(20)는 마이크로파의 파형과 조사시간을 지정하기 위한 고정 레벨 선택버튼(2)과, 시료용 비이커(1)에 담긴 버퍼용량(buffer capacity)을 지정하는 버퍼용량 선택버튼(3)과, 마이크로파 고정기의 동작을 정지시키는 정지버튼(4)과, 마이크로파 고정기의 동작을 개시하는 시작버튼(5)을 포함하고 있다.

마이크로파 고정기에서 시료에 대한 마이크로파 에너지를 효율적으로 조사하기 위하여 공진실(7)내에 시료용 비이커(1)를 안치한다. 마이크로파 고정기의 문(30)은 문열림버튼(6)에 의해 개폐조절된다.

제2도와 제3도에 도시된 바와 같이, 시료용 비이커(1)에 검사할 시료(8)와 생리식염수(physiological saline solution) 또는 완충용액(buffer solution)(9)을 담아 가열실 즉, 공진실(7)안에 안치한 후 고정기의 문(30)을 닫은 다음 동작조절부(20)를 조작하여 생체시료 고정기를 시동시킨다.

상기 동작조절부(20)의 이면에는 메인보드(13)가 접속되고, 메인보드(13)는 마그네트론 구동부(14)를 조절하도록 접속되어 마그네트론(11)에의 전원공급을 제어한다.

상기 마그네트론(11)은 공진실(7) 상단의 일측에 설치되어 구동시에 마이크로파 에너지를 시료용 비이커(1)에 조사한다.

공진실(7)의 천장에 부착된 적외선 온도센서(10)는 센서보드(12)를 통해 메인보드(13)에 접속된다.

이상과 같은 구조를 갖는 마이크로파 고정기는 다음과 같이 작동한다.

본 발명의 마이크로파 고정기는 종래의 화학고정액을 사용하지 않고 전자파로 생체시료를 고정하는 방법이다.

생체시료가 전자파를 받으면 분극(polarization) 현상에 의해 시료분자가 진동하며, 진동 에너지에 의해 구조의 변형을 막음으로서 고정효과를 가지게 된다.

마이크로파의 주파수 범위는 0.3 GHz∼GHz이며, 이 마이크로파의 주파수중 2.45GHz는 물분자의 고유진동주파수와 일치하므로 고정기에 적용하는 마이크로파 주파수 2450MHz를 적용하였다.

한편, 생체시료가 적정한 고정상태에 도달되었는가의 판단은 진동에 의해 발생되는 시료의 온도로서 판단될 수 있으므로 본 고정기에서는 고정밀도 특성을 갖는 비접촉식 적외선센서를 사용하였다.

마이크로파에 의한 고정은 마이크로파를 조직에 인가하는 시간과 파형에 매우 민감하므로 이를 감지하는 온도센서가 중요한 역할을 하게 된다. 종래의 접촉식센서는 온도 감응속도가 느리고 전자파 잡음에 의해 정확한 감지가 불가능하였다. 또한, 정밀도가 없는 비접촉식 온도 센서 역시 정확도가 떨어져 사용할 수 없었다. 따라서, 이들 센서를 이용할 경우 마이크로파 에너지를 고정을 위해 적정하게 받지 못하므로써, 고정과정이 실패하여 결국 조직관찰이 불가능하게 되었다.

본 발명에 적용된 센서는 반도체 산업의 발달에 따라 개발된 0.1도 이내의 온도 정확도를 갖는 비접촉식 적외선 센서이다. 이에 의해 최적의 고정온도인 28도에 달하면 이를 정확히 감지하여 센서회로에 전달하고 메인 보드에서 고정작용을 멈추게 한다.

그러면, 제2도에 도시된 본 발명의 블록구성도를 보면서 상세한 동작을 설명하기로 한다.

먼저, 고정기 전편 패널(제1도)에 부착된 고정레벨 선택버튼(2)을 눌러 고정레벨을 선택하면 메인보드(13)에 의해 파형조사기간이 결정된다. 이에 따라 마그네트론(11)이 동작하고 시료(8)는 마이크로파 에너지를 받는다. 적외선 센서(10)에 의해 감지된 온도는 센서보드(12)에서 증폭되고 이 값을 메인보드(13)에 전달하여 선택한 고정레벨상태와 같게될 때 동작을 멈추게 한다.

시료에 대한 마이크로파 에너지를 효율적으로 조사하기 위하여 공진실(7)을 이용하며, 공진실(7) 속에서 고정을 위하여 시료(8)가 받는 에너지는 마이크로파를 발생시키는 마그네트론(11) 출력과 파형 및 조사시간에 의해 결정된다.

따라서, 본 발명은 다년간 여러 형태의 과정을 통하여 고정결과가 우수함을 입증할 수 있는 파형 및 조사시간을 결정하여 이를 고정기에 적용하였다. 적용된 고정기의 블록별 세부 동작은 다음과 같다.

마그네트론(11)은 고압발생장치인 구동부(14)를 포함하여 메인보드(13)에 의해 제어되며, 발진주파수 2450MHz, 출력 600W, 50% 듀티사이클(duty cycle)로 1초 간격으로 온/오프 동작을 되풀이 한다. 1초간 50% 듀사이클로, 온/오프하는 이유는 마이크로파 에너지를 순차적으로 공급하여 생체조직의 파괴를 줄이기 위해서이고 더불어, 오프 시간동안 시료의 온도를 감지하므포써 마이크로파 인가중의 잡음을 없애기 위해서이다.

적외선센서(10)는 비접촉식 센서로 접촉식 센서에서 유기되는 잡음을 없애고, 빠른 반응속도로, 즉 수 ns 이내에 0.1도 오차범위내의 정확한 온도를 감지하여 센서보드(12)에 전송한다. 따라서, 고정기 전체로는 온도오차가 1도 이내로 되는 초 정밀온도제어가 가능하게 된다.

센서보드(12)는 적외선센서(10)가 감지한 온도신호를 증폭하고 또한 공진실내 주위온도를 보상하여 보다 정확한 시료온도를 감지하게 한다. 또한, 샘플 및 홀드(sample hold)회로로 마그테트론 온(on)시간동안 시료의 온도를 유지하고 오프(off)시간동안 출력을 메인보드(13)로 공급, 전달하여 잡음 및 회로의 오동작을 방지한다.

메인보드(13) 부분에서는 고정기 패널(panel) 상에 부착된 고정레벨 선택버튼(2)이 선택한 고정레벨에 따라 마그네트론(11)이 적정하게 동작하도록 한다. 또한, 패널상 버퍼용량 선택버튼(2)이 선택한 버퍼용량(buffer capacity)에 따라 고정이 최적 상태가 되도록 마그네트론(11)을 추가 동작시켜 마이크로파 에너지를 생체시료(8)에 공급한다.

검사할 시료의 크기에 따라 비이커(1)에 담은 생리 식염수, 혹은 완충용액(9)의 양이 달라지므로 시료(8)를 포함한 비이커 내부의 용량에 따라 고정시간이 달라져야 양호한 고정을 수행할 수 있다. 생리식염수나 완충용액(9)은 생체조직의 수소 이온농도(ph)와 같은 수용액으로 생체에서 조직을 발췌하였을 때 자기분해를 방지하게 하기 위하여 담구며, 또한 고정할 때 강한 마이크로파에 의해 조직이 파괴되는 것을 방지하는 역할을 한다.

따라서, 용량에 따라 고정을 수행하는 방법은 매우 중요하다. 연구결과 용량이 20∼60ml 범위에서 10ml씩 증가할 때마다 3초간의 마그테트론 온/오프 동작시간을 추가하면 양호한 고정결과를 얻을 수 있었다.

즉, 생체시료(8)의 크기가 작아서 20ml의 생리식염수 혹은 완충용액(9)을 사용할 경우 기본적으로 마그네트론(11)을 12∼13회 1초씩 온/오프 동작시켜 마이크로파 에너지를 시료(8)에 인가한다.

또한, 시료(8)의 크기에 따라 생리식염수 혹은 완충용액(9)의 차이가 발생하므로 이에 따라 고정시간 즉, 생체에 인가하는 마이크로파 에너지 조사시간을 다음과 같이 조정하여 적용한다. 패널상 버퍼용량 선택버튼을 눌러 버퍼용량을 선택할 경우 고정기의 동작상태는 다음과 같다.

20ml 경우 - 기본동작(마그네트론 on, off를 12-13회 반복동작)

30ml 경우 - 기본동작에서 3초간 3회씩 on, off 추가동작

40ml 경우 - 기본동작에서 6초간 6회씩 on , off 추가동작

50ml 경우 - 기본동작에서 9초간 9회씩 on, off 추가동작

60ml 경우 - 기본동작에서 12초간 12회씩 on, off 추가동작

이상과 같이 개발된 마이크로파 고정기를 이용하여 시료인 생쥐의 신장(kidney), 췌장(ancreas), 소장(small intestines), 간(liver) 및 근육(muscles)조직을 크기별로 약 3년에 걸쳐 고정하여 본 결과, 고정시간은 12∼24초 정도이고 고정된 시료를 5∼10㎛ 절편하여 염색한 결과는 기존의 화학적 고정법의 결과보다 매우 우수한 결과를 얻었다. 특히, 이 결과는 화학적 고정법보다 단백질의 축출이 적기 때문에 내장기관의 배상세포, 근융조직내의 핵산 및 히스타민, 비타민D 수용체등 효소활성의 관찰에도 적용될 수 있음을 입증하였다. 특히, 인체에 해로운 강한 독극물이 필요한 전자현미경 관찰용 고정에도 이 발명의 방법을 사용할 경우 독극물을 최소량 사용하여도 고정이 되는 획기적인 융용성을 보이고 있음이 현재 본 발명자에 의한 다음의 실험에 의해 증명되고 있다.

본 실시예에 사용된 마이크로파 고정기은 비접촉식 적외선 온도 센서(infrared temperature sensor)를 장착하여 제작된 마이크로파 고정기를 사용하였고, 대비를 위하여 종래기술의 가정용 마이크로파 고정기를 사용한 경우도 실시하였다.

종래 기술의 가정용 마이크로파 오븐은 550W의 출력을 10단계, 게이트의 신호를 2단계, 도합 20단계의 출력조절이 가능하고, 고전압 다이오드는 마그테트론 양극의 전압을 4KV로 승압시키는 것을 사용하였다. 이 마이크로파 오븐에는 접촉식 온도 측정기가 부착되어 있으나 온도 편차는 ±5℃로서 실제 시료 온도 측정에는 효과가 없었다. 또한 가정용 마이크로파 오븐으로 고정하고 온도 측정에 열전대(thermocouple)를 사용했을 때, 시료의 온도는 매우 불안정하여 결과를 체계적으로 정리할 수 없었다. 그러나 어떤 경우에는 이 방법으로 시료가 고정되고 절편 제작이 가능하였다.

적외선 마이크로파 고정기은 시료의 표면에서 발산되는 적외선을 수신하여 온도를 감지하는 적외선 비접촉식이며, 센서보드에서 온도 변화를 70dB 증폭시키고 초저 드리프트(super - low drift)회로를 체택하여 ±1℃의 온도 편차를 나타내도록 제작 되었다. 감지된 온도는 디지털로 표시되며 3단계의 마이크로파 강도 조절 기능과 조사시간을 4단계로 제어할 수 있으므로 도합 15단계의 출력 조절이 가능하도록 고안되었다. (제2도). 이때 적외선 마이크로파 고정기의 최고 출력은 500W 이고 양극의 전압은 3.8KV이다.

마이크로파 조사후 시료의 온도 검증은 온도감지 정밀도가 ±0.1%(±0.7℃)인 크롬 - 니켈 열전대(chromium - nickel thermocouple)를 사용하여 측정하였는데, 시료가 받은 온도는 지름 1.2mm인 열전대의 끝을 시료속에 삽입하여 측정하였다. 적외선 마이크로파 고정기의 디지털 표시 온도는 완충용액 표면의 온도이나, 이는 완충용액의 양이 일정했을 때 대체로 안정하여 열전대로 측정한 시료 온도와의 차이는 ±1℃였다.

본 실험에 사용된 시료인 생쥐의 신장은 조직구성이, 고정의 우열을 판단할 수 있는 기준 조직으로 알려져 있어 선택되었다. 시료중 대조군은 최대 5mm³정도의 크기로 3.5% 중성 포르말린, 혹은 카르노브스키(Karnovsky) 고정액에 고정되었고 마이크로파가 조사된 실험군은 1cm³의 크기를 갖는 특수 제작된 사각형 칼로서 절단하여 각각 7ml, 10ml, 20ml, 50ml의 생리 식염수나 인산 완충액 내에서 고정하였다.

본 실험에서는 실험동물을 마이크로파 장(field)내에서 급사시키고 가능한 짧은 시간내에 시료의 채취가 가능하도록 시도하였다. 생쥐의 경우 마이크로파 장내에서 3∼5초 내에 즉사하게 되나 채취된 시료들은 화학 마취제를 사용했을 경우와 외관상 차이가 없었다. 화학 고정액을 사용한 대조군의 시료는 고정액에 48 ∼ 72시간 고정되었고 48 ∼ 72시간 세척하였으나 마이크로파로서 고정된 시료는 세척과정이 없이 포매되었다.

마이크로파 고정의 장점중의 하나인 시료 제작기간을 단축하기 위하여 마이크로파 장에서 고정된 시료는 냉동절편 되었다. 이때 시판되는 냉매는 강한 탈수 작용이 있는 폴리비닐 알콜(polyviny alcohol)이나 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)등이 혼합되어 있어서 절편 제작 후 시료의 가장자리로부터 많은 조직 물질이 축출되었다. 이 작용을 방지하기 위하여 시료를 파라핀에 포매하면 냉동되기 어려웠다. 따라서 고정된 시료들은 글루코스로 포화된 파라핀에 포매되었는데, 이 시료들은 냉동되었을 뿐만 아니라 절편 제작에도 어려움을 주지 않았다. 이는 포매 후 일정한 공간속에서 높인 압력으로 인하여 냉동에 방해가 되는 수분이 글루코스 분자의 흡수 작용에 의하여 제거되는 것으로 생각되었다. 이 방법을 사용할 때 절편 제작을 완료할 때까지 소비되는 총 시간은 2∼4시간이었고 절편의 질은 이 연구에서 사용된 다른 고정법에 의한 것보다도 우수하였다.

절편의 염색은 헤마톡실린, 에오신, 혹은 조직 화학을 위하여는 PAS(Periodica cid Schiff's) 염색법을 사용하였고 1% 화스트 그린(fast green) 수용액으로 대조염색(counter stain)하였다. 촬영은 AO광학 현미경 2071형을 사용하였고 전원으로부터 오는 빛은 AO No 512 일광평형필터(day light balancing filter)를 통하여 자연광에 근사하도록 조절되었으며 아그파(Agfa) 칼라 필름 XR100(ASA 100)을 사용하였다.

이상의 실험으로부터 다음의 결과가 도출되었다.

종래 기술의 화학 고정법으로 시료를 고정하면 사용되는 고정액에 따라 다르지만 마이크로파를 사용할 때와 비교하여 보통의 고정상태를 나타내었으며, 전체적으로 구조 보존력이 있다고 할 수 있었다.

3.5%중성 포르말린에 고정된 생쥐 신장의 경우 때때로 적혈구가 파괴되고 신소관(kidney tubules) 사이와 보우만씨 낭(Bowman's capsule)의 낭상피 사이에 형성되는 낭공간(capsular space)이 넓어져 있고 각 신소관의 내부 경계가 명확하지 않으나, 동질 염색성과 신소관의 표면이 균일하고 핵이 보존되는 등 구조의 보존은 적절하다고 할 수 있었다(제4도의 사진 1)염색성은 헤마톡실린과 에오신으로 염색했을 때 마이크로파로 고정할 때보다 호염기성으로 나타난다.

본 발명의 방법에 의한 물리고정법인 마이크로파 열고정에 의하면, 마이크로파를 사용하여 생체시료를 고정할 때, 최적 조건은 가정용과 적외선 마이크로파 고정기을 사용할 때 각각 다른 것으로 나타난다. 가정용을 사용하고, 7ml완충용액에서 10초동안 시료를 고정하면 최적고정온도는 62±2℃이었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 가정용 고정기을 사용할 경우 결과는 매우 발안정하여 동일 조건이 제공되어도 시료의 구조가 보존될 때와 아닌 경우가 구분되었다. 이것은 한편으로는 마이크로파를 발진시키는 마그네트론의 주기에 의한 차이와 다른 편으로는 사용되는 완충용액의 종류와 양, 용기(유리 혹은 플라스틱)의 종류, 두께 및 초기 온도 등에 원인이 있는 것으로 생각되었다. 그러나 일반 고정에서 엄격한 기준이 적용되지 않으면 전체적인 구조 보존력은 있다고 할 수 있었다. 적절한 마이크로파 에너지를 사용하여 고정된 시료들은 각 칼라 필름의 특성에 관계없이 대조군에 비교하여 염색성이 보다 호산성으로 관찰되는 경향이 있었다. 화학고정액에 고정된 시료가 일반적으로 호염기성인데 비교하여 이러한 마이크로파 고정의 특징은 시료 염색에 좋은 영향을 주는 것으로 보인다. 이러한 점은 시료에 미치는 마이크로파 열을 적외선 온도 센서를 장착한 마이크로파 고정기을 사용할 때 더욱 정교하게 조절될 수 있었다.

1) 적외선 마이크로파 고정기

이 연구에서 개발된 비접촉식 적외선 온도 센서가 장착된 마이크로파 고정기을 사용할 경우 20ml의 완충용액 혹은 생리식 식염수(초기온도15℃), 마이크로파 조사시간 10초, 고정온도28±1℃에서 가장 우수한 고정 효과를 나타내었다.(제4도의 사진 2 내지 4).

이 온도에 고정되고 PAS방법으로 염색된 시료에서 보면 내피 세포로 구성된 각종 신소관 사이의 경계가 분명하고 간격들이 치밀하여 전체 구조가 우수하게 보존되었다고 볼 수 있었다. 각 조직 성분의 염색성이 분명하여 신소관 수준에서 PAS양성, 음성반응이 구분되고 이로서 신소관의 종류를 알 수 있었다.

평행연수외피(Juxtamedullar cortex)에서 수방선(medullary ray), 단부선회소관(distal convoluted tubule), 혈관 등의 기저층은 PAS 양성이나 이들 소관을 형성하는 상피세포들은 PAS염색에 반응하지 않았다(제4도의 사진2). 고정효과의 관점에서, 신소관을 형성하는 상피세포들을 분명하게 관찰할 수 있고 각 신소관의 경계와 이에 따르는 염색이 동질성을 보이는 것으로 보아서 보다 우수하게 고정된 것으로 관찰된다.

내피질부(inner cortex)에서는 위에 언급한 신소관들 외에 기부선회소관(proximal convoluted tubule)과 Hanle's loop등이 관찰되는데 기부선회소관의 내부는 강한 PAS양성반응을 나타내는 물질로 채워져 있다(제4도의 사진3). 한편, 피질부에서도 사구체와 구심성 및 원심성 동맥, 기부선회소관 등은 PAS양성인데, 단 부선회소관의 내부와 요극(urinary poly)의 평행사구체세포(juxtaglomerular cell), 치밀반(macular densa)등은 PAS염색에 반응하지 않았다(제4도의 사진 4a 및 4b).

화학 고정의 경우 이러한 조직화학 반응에 따른 구조보존은 고정액의 종류에 따라 반응하지 않고, 반응하더라도 일반적으로 그 정도가 미약하여 분명하지 않은 것이 보통이었다.

적외선 마이크로파 고정기을 사용한 경우 광학 현미경에서 보이는 장점중의 하나는 사구체와 보우만씨 낭에서 나타난다.

대조군(제4도의 사진1)에서는 사구체가 수축되어 있는 반면 28±1℃로 고정된 시료에서는 수축의 정도가 약하고 모세혈관, 낭상피, 요극(urinary poly), 관극(vascular poly), 낭공간(capsular space) 내의 세포(화살표)등의 보우만씨 낭의 내부 구조를 관찰할 수 있었다(제4도의 사진 3, 사진 4a 및 4b).

피질부에서 기부선회소관의 내부가 PAS양성인 것은 주로 브로시보더(brush borders)인 것으로 관찰된다. 신소관의 기저층과 소관들 사이의 결합조직이 PAS양성인데 비교하여 내피세포 자체는 대개 PAS 음성인 것은 특징적이다.

28℃이상의 온도에서, 예로서 32℃로 고정되고 동일한 과정을 거쳐 처리된 시료는 다른 것 외에도 세포핵들이 세포밖으로 돌출하여 불규칙한 것을 관찰할 수 있었다(제4도의 사진5).

2) 가정용 마이크로파 고정기

위에서 설명한 바와 같이 가정용 마이크로파 고정기를 사용할 경우의 결과는 출력, 마그네트론의 발진 주기, 사용되는 용기 및 초기 온도 등 여러 가지 요소에 의하여 영향을 받았다.

시료를 주의 깊게 처리하였을 때 가장 좋은 결과는 본 실험에서 62±2℃이었다. 이 온도에서 생쥐 신장의 전체적인 구조는 신장 외피가 파괴되지 않고 외측의 지방 조직과 혈관내의 적혈구가 건재하여 구조 보존력이 있는 것으로 관찰되었다(제4도의 사진6). 그러나 신소관들이 경계가 분명하지 않으며 그 사이의 간격과 보우만씨 낭이 확장되고 염색성 등에서 28℃의 것보다 우수하지 못하는 것으로 관찰된다.

가정용 마이크로파 고정기을 사용하고 화학고정액, 예를 들어 카르노브스키 고정액속에서 가열되면 62±2℃보다 낮은 온도(60℃)에서 시료의 염색성은 점차 호염기성으로 변하는 것이 관찰되었고 전체의 구조에 있어서도 고정효과는 우수하지 못하였다(제4도의 사진 7). 세포 핵은 보존되었으나 신소관 사이의 간격이 확장 되었으며, 혈구들은 파괴되는 것이 관찰된다.

이와 같이 화학고정액 속에 시료를 넣고 마이크로파를 조사하여 고정할 경우도 있으나 결과는 완충용액이나 생리적 식염수속에서 가열할 때와 비교하여 우수하지 못하다.

카르노브스키 고정액에 시료를 넣고 마이크로파를 조사하여 고정온도가 70℃에 접근하면 적혈구의 구조는 부분적으로 보존되나 신소관 사이의 간격이 넓어지고, 보우만씨 낭이 파괴되며, 내피세포 핵의 위치가 변하는 것 등이 관찰되었다(제4도의 사진8). 이 경우 조직 화학반응이 약할 뿐 아니라 화학 고정액의 세척하기 위하여 재차 마이크로파를 사용하면 추축할 수 있는 바와 같이 적혈구의 파괴와 함께 구조 보존력이 적어지게 된다.

이상의 실험 결과에서 관찰한 바와 같이, 화학 고정액을 사용하는 경우 고정액의 침투를 용이하게 하기 위하여 시료의 크기가 작게 제작되어도 많은 고정액 침투시간이 소요(25∼72시간/5mm³)되며, 3∼5%의 중성포르말린을 고정액으로 사용해도 저분자 용해성 단백질의 40∼50%가 축출되어 구조 보존력이 적을 뿐만 아니라 현미경 관찰시 확대율, 명암의 대조, 동질 염색성, 특히 조직화학 반응 등에 많은 부정적 영향을 주고 있다. 그러나 침투 속도가 빠르고 조직물의 축출 또는 물질변화를 최소화시키는 화학고정액은 보고되지 않고 있는데, 이러한 점을 보상할 수 있는 방법이 물리고정법이라고 생각된다.

생체시료를 물리적 방법으로 고정할 경우 핫왁스욕(hot wax bath), 열기(hot air), 초음파(ultrasound) 등 주로 열에너지를 사용하여 시료를 급속히 가열하는 방법 등이 응용될 수 있으나 보다 큰 시료인 경우 조직내에서 열전도의 차이로 인하여 고정 정도에 차이가 발생하므로 효과가 일정하지 못하다는 것은 이미 알려진 사실이다.

이러한 생체시료 고정법의 단점을 보완하는 방법으로서 마이크로파 열에너지를 사용할 수 있다고 생각된다. 마이크로파 고정법은 비교적 큰 시료(15∼60mm³)를 고정 정도의 차이가 발생하지 않도록 하며 고정시간도 초(秒)단위로 종료되며 조직내의 물질 변화나 축출되는 물질의 양도 적게 수반하는 방법으로 보고된 바 있다.

마이크로파가 생체 시료에 흡수되어 열을 발생시키는 이유는 흡수된 마이크로파가 시료내에 물분자와 같이 전하를 갖는 분자들을 2.45billion/초의 속도로 회전시키고 이때 주위 물질과의 경계에서 마찰열이 발생하기 때문으로 알려져 있다. 그러나 이때 마이크로파가 갖는 양자 에너지(proton energy)는 10^-5eV로서 생체물질 분자의 공유쌍(covalent bond)을 변화시키지는 않는다.

따라서 마이크로파를 이용하는 열고정법은 본 실험의 결과로서 볼 때 일상적인 고정법으로 뿐만 아니라 보다 우수한 고정효과 및 조직화학적 결과를 얻기 위하여 사용이 가능하다고 생각된다.

고정효과의 우열에 관하여는 각 조직의 특수성으로 인하여 일괄된 기준은 알려져 있지 않다. 형태적인 관점에서 고정 정도가 우수하다고 하는 것은 절편 제작 과정에서 시료의 경도(硬度)로 나타나는 문제가 발생하지 않아야 하며 현미경 하에서 동질 염색성을 가져야 하고 그 구조의 보존 상태가 양호해야 하는 것으로 알려져 있다.

이러한 고정의 기준은 시료와 조직의 종류가 달라지면 조직 특수성으로 인하여 일반성을 상실할 수 있는데, 포유류 신장의 경우는 세부적인 고정 기준이 알려져 있어서, 고저의 우열을 판단하는 기준 조직으로 사용되기도 한다. 이러한 기준에 대하여 신장선회소관 사이의 간격, 고정의 동질성, 신소관 표면의 균일성, 핵 구조와 혈구세포의 형태, 동질 염색성과 염색액의 확산이 없어야 한다고 한다. 이러한 고정기준은 몇가지 예외를 제외하고는 다른 여러 가지 조직에도 적용되는 기준이 될 수 있다고 생각된다.

본 발명의 실험에서 사용된 몇가지 복합적인 고정법 중에서 위의 기준에 가장 잘 부합된다고 생각되는 실험군은 적외선 마이크로파 고정기를 사용하여 20ml의 완충용액, 고정시간 10초, 고정온도28±1℃에서 고정한 시료이었다. 가정용 고정기를 사용할 경우 7ml의 완충용액에서 10초간 가열하여 고정온도 62±2℃일 때 시료는 비교적 위에서 언급한 신장의 고정 기준에 근접하였다. 이 결과들은 3.5%중성 포르말린으로 고정한 시료보다 우수한 것으로 혹은 최소한 동일한 고정효과가 있는 것으로 관찰되었다.

마이크로파 고정법이 화학고정법과 초소한 동일한 고정작용을 갖는다고 볼 때 마이크로파 고정은 일반 화학고정법에 비교하여 고정의 속도가 대단히 빠르고 고정시간 만큼 소비되는 세척시간을 생략할 수 있으므로 많은 시간을 절약할 수 있으며, 보다 큰 시료의 고정이 가능하다는 점에서 현미경하의 시야를 증가시키고 있는 것으로 나타난다. 그러나 가정용 마이크로파 고정기를 사용할 때 문헌상의 고정시간은 10초(E. C. Chew 등의 연구, 『Cell Biology International Reports』 Vol.7, No.2, February 1983. p.135) 또는 16초(M. K. Patterson, Jr. and Ronald Bulard의 연구, 『Stain Technology』 The Williams Wilkins Co., Vol.55, No.2, 1980. p.71)와 저자에 따라 상이하며 특수한 목적을 위하여 출력을 높인 마이크로파 고정기을 사용하여 26∼90밀리초 동안 고정시키는 초고속 마이크로파 에너지 고정법도 알려진 바 있다.

동일한 시료라도 마이크로파 조사시간과 온도분포의 범위가 넓어서 35±2℃ 내지는 60∼90℃까지 사용되어 마이크로파 사용시 시료 고정에 필요한 시간 및 온도에 일정성이 없다.

이는 사용되는 마이크로파 고정기의 출력(55∼750W)과 마이크로파 발진 주기, 고정액 또는 완충용액의 양과 이들의 초기 온도, 용기의 종류 및 두께, 온도 측정방법, 마이크로파 고정기 내의 시료 위치등 여러 가지 면에 있어서 저자에 따라 실험 방법이 상이했기 때문으로 생각된다.

고정의 온도에 조직 특수성이 있어서 생쥐의 내장기관인 경우 60∼90℃가 최적이라고 알려져 있으나 최적온도를 50∼90℃로 산출하고 70℃ 이상에서는 열에 불안정한 물질이 파괴 또는 효소의 양이 감소한다고 추찰된다.

이러한 결과는 예를 들면 마이크로파 장(場) 속에서 시료가 받는 온도를 측정하기가 대단히 어렵다는 데에도 그 원인이 있다고 생각된다.

시료가 받는 마이크로파 에너지는 시간과 출력의 함수이므로 출력과 마이크로파 조사 주기가 제작회사에 따라 상이한 가정용 마이크로파 고정기은 실험 목적에는 부합되지 않고, 시료가 받는 마이크로파 열의 강도를 조직 특수성에 따라 조절하기도 어렵다. 이것으로 위에서 설명한 저자에 따른 마이크로파 발진시간과 온도의 변화를 설명할 수 있으며, 또한 발진되는 마이크로파가 생체시료를 고정하기 위한 목적에는 일치하지 않도록 강한 마이크로파를 발진시킨다는 사실로 볼 때, 실험 목적으로 특수 제작된 마이크로파 고정기가 사용될 수 있다면 보다 우수한 결과를 기대할 수 있을 것으로 생각되었다.

이 실험에서는 이러한 점을 보완하기 위하여, 제3도에서와 같이 시료가 가열되는 중에 온도를 측정할 수 있는 적외선 비접촉식 온도 센서를 장착하고 실질적으로 출력이 감소된 마이크로파 고정기을 제작하였다.

이를 사용한 최적의 고정온도는, 결과에서 보는 바와 같이 본 실험에서 사용한 조건들에서 28±1℃이었다.

이 온도는 지금까지 보고된 고정온도중에서 가장 낮은 온도이며 생쥐의 체온보다 낮은 온도이다. 본 실험의 재료들은 20ml의 식염수 혹은 인산 완충용액에서 10초간 조사되었고, 글루코스로 포화된 파라핀에 포매된 후 냉동절편 되었으므로 일반적으로 처리되는 탈수과정의 알콜등에서 추가된 고정작용이 있었다고 생각되지는 않았다. 이러한 결과는 마이크로파의 생체시료 고정작용이 조사시간 동안에 발생되는 열 외에 다른 요소가 있을 수 있다는 사실을 긍정적으로 생각하게 하는 결과이었다. 이러한 요소중의 하나는 조사시간으로 생각된다. 가정용 마이크로 고정기으로 7ml의 인산 완충용액에서 8∼10초간 조사하여 온도가 62±2℃인 시료도 중성 포르말린으로 고정된 시료와 고정의 질에서 유사한 결과를 나타낸 바 있다.

한편, 혈구와 같은 자유세표는 화학고정법으로도 고정되기 어려운 시료이며 마이크로파 장(場)속에서도 불안정하여 쉽게 파괴되는데, 이는 생체시료에 작용하는 마이크로파의 최대 열전도 부위가 시료의 중앙부와 표면이라는 사실에 그 원인이 있다. 그러나 적외선 마이크로파 고정기을 사용하면, 이 세포들을 고정할 수 있을 뿐만 아니라 보다 좋은 고정의 질에 기인하여 조기화학에도 용이하게 응용될 수 있는 것으로 관찰된다.

조직화학에 사용되는 시료는 화학반응을 일으키는 시료의 부위 혹은 특수 물질에 따라 고정액의 종류와 처리시간에 변화가 있다. 예를 들면 호일겐 반응(Feulgen reaction)을 관찰할때에 고정액으로서 카르노아 고정액(Carnoy's fixative), 포르말린, 젱커용액(Zenker's solution) 등이 사용될 수 있으나, 가수 분해 및 염색의 어려운 점으로 인하여 일반적으로 Bouin 용액은 사용되지 않는다.

이러한 현상은 화학 고정액이 이미 시료내의 물질과 반응하여 목적하는 조직 화학 반응을 방해하기 때문으로 알려져 있는데, 마이크로파 고정법은 시료내에서 화학반응을 일으키지 않으므서 특수 염색액으로 처리되면 보다 명확하고 신속한 조직화학 반응이 진행되는 것으로 생각된다.

이와 같은 이유로서 마이크로파 고정법은 내장기관의 배상세포, 근육조직의 핵산을 확인하기 위한 PAS, 호일겐 염색이 보다 용이하고 시료내의 CAMP, 히스타민, 비타민 D 수용체 등 효소 활성을 증명하기 위하여 응용된다는 것을 이해할 수 있다.

고정온도가 가정용 마이크로파 고정기에서 62±2℃, 그리고 적외선 마이크로파 고정기에서 각각 28±1℃로서 차이가 있는 것은 발 이해되지 않고 있다. 문헌의 기록을 종합하면 완충용액의 양이 7∼50ml일 때 8∼12초의 조사 시간에서 가장 적절한 고정효과를 나타내고 있는데 마이크로파의 생체시료 고정은 위에서 말한 바와 같이 열 외에 다른 작용이 추측되고 있으나 알려져 있지 않다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법에 의하면, 고정할 생체시료를 비이커에 넣은 다음 생리식염수나 완충용액을 넣어 생체시료 고정기의 공진실내에 투입시키고, 상기 시료의 크기에 따라 파형조사시간을 결정하여 생체시료의 고정레벨을 선택시키고, 상기 공진 실내의 생체시료에 마이크로파 에너지를 상기 파형조사시간동안 일정간격으로 인가시키고, 상기 마이크로파 에너지가 인가되지 않는 시간에서는 상기 가열된 생체시료의 표면에서 발산하는 적외선(열)을 감지하여 이를 증폭시키고, 상기 증폭된 신호를 미리 입력된 소정의 고정온도 신호값과 비교하여 상기 마이크로파 에너지의 공급을 제어하도록 구성되어 있으므로, 고정시간을 단축시키면서도 단백질의 축출이 거의 없도록 하고, 물체의 표면에서 발산하는 적외선을 감지하여 고정 온도를 정밀하게 측정할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.

아울러 본 발명의 바람직한 실시예들은 예시의 목적을 위해 개시된 것이며, 당업자라면 본 발명의 사상과 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims

적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법에 있어서, 고정할 생체시료를 비이커에 넣은 다음 생리식염수나 완충용액을 넣어 생체시료 고정기의 공진실내에 투입시키는 과정과, 상기 시료의 크기에 따라 파형조사시간을 결정하여 생체시료의 고정레벨을 선택시키는 과정과, 상기 공진실내의 생체시료에 마이크로파 에너지를 상기 파형조사시간동안 일정간격으로 인가시키는 과정과, 상기 마이크로파 에너지가 인가되지 않는 시간에서는 상기 가열된 생체시료의 표면에서 발산하는 적외선(열)을 감지하여 이를 증폭시키는 과정과, 상기 증폭된 신호를 미리 입력된 소정의 고정온도 신호값과 비교하여 상기 마이크로파 에너지의 공급을 제어하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법.
제1항에 있어서, 상기 고정레벨 선택과정에서 결정된 기본 파형조사 시간외에, 혼합되는 생리식염수나 완충용액의 기본량에 추가되는 양에 비례하여 마그네트론의 파형조사시간을 일정시간동안 연장시키도록 하는 과정을 추가로 구비한 것을 특징으로 하는 적외선 온도센서가 부착된 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법.
제1항에 있어서, 상기 소정의 고정온도는 28±1℃인 것을 특징으로 하는 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법.
제1항에 있어서, 상기 적외선 온도 감지는 비접촉식 적외선 온도 센서에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 마이크로파 고정기의 생체시료 고정방법.