KR0154505B1 - 올리고펩티드계 아미노펩티데이스 저해물질 - Google Patents

올리고펩티드계 아미노펩티데이스 저해물질

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KR0154505B1 KR1019950024647A KR19950024647A KR0154505B1 KR 0154505 B1 KR0154505 B1 KR 0154505B1 KR 1019950024647 A KR1019950024647 A KR 1019950024647A KR 19950024647 A KR19950024647 A KR 19950024647A KR 0154505 B1 KR0154505 B1 KR 0154505B1
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Abstract

본 발명은 하기의 구조식을 갖는 신규의 아미노펩티데이스 저해물질 MR-387A1 및 MR-387A2에 관한 것이다.

Description

올리고펩티드계 아미노펩티데이스 저해물질
제1도는 본 발명의 아미노펩티데이스 저해물질인 MR-3871A1의 브롬화 칼륨중에서의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이고,
제2도는 본 발명의 아미노펩티데이스 저해물질인 MR-387A2의 브롬화 칼륨중에서의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이고,
제3도는 MR-387A1의 중수소물(D2O)내에서 측정한 수소핵자기 공명 스텍트럼(300MHz)을 나타낸 것이고,
제4도는 MR-387A2의 중수소물(D2O)내에서 측정한 수소핵자기 공명 스텍트럼(300MHz)을 나타낸 것이다.
본 발명은 신규한 아미노펩티데이스(aminopeptidase) 저해물질에 관한 것이다. 보다 상세하게는 아미노펩티데이스 활성의 저해작용 및 면역증강 활성을 나타내는 신규한 아미노펩티데이스의 저해물질 MR-387A1 및 MR-387A2에 관한 것이다.
생체내에 존재한는 아미노펩티데이스는 단백질 또는 펩티드의 N-말단을 절단하는 효소로서 여러 가지 생리적 작용에 관여한다. 특히, 아미노펩티데이스 M(또는 아미노펩티데이스 N, EC 3.4.11.2)은 무통각 효과를 나타내는 엔케팔린(enkephalin)을 분해함으로써 불활성화시킬 뿐 아니라(C. Gros et al., Biochemistry, 24, 2179-2185(1985)), 최근에는 암세포의 전이과정중 암세포의 침입(invasion)에 관여한다고 보고되었다(I. Saiki et al., Int. J. Cancer 54, 137-143(1993); A. Menrad et al., Cancer Res. 53, 1450-1455(1993)). 특히 케이. 이노 등은 아미노펩티데이스 M의 저해물질이 골수유래의 백혈병 세포 및 장막암 세포의 성장을 저해시킨다고 함으로써, 직접적인 항암제로서의 사용 가능성을 보고 하였다(K. Ino. et al., Jpn. J. Cancer Res., 85, 927-933(1994)). 따라서 새로운 구조를 갖는 아미노펩티데이스 M 저해물질의 개발은 비마약성 진통제, 암전이 억제제, 면역 증강제 및 백혈병과 장막암에 대한 항암제의 개발을 위해 필수불가결한 요인이 될 것으로 예측된다.
미생물이 생산하는 생리활성 물질중 액티노닌(actinonin)(H.Umezawa et al., J. Antibiotics 38, 1629-1630(1985))과 베스타틴(bestatin)(H. Umezawa et al., J. Antibiotics 29, 97-99(1976)) 등은 아미노펩티데이스 M의 저해작용 및 면역 증강작용, 그리고 비임파성 백혈병 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이들 저해물질의 아미노펩티데이스M에 대한 IC50은 액티노닌이 0.4㎍/㎖, 베스타틴이 6.2㎍/㎖ 등으로 저해활성이 낮기 때문에 보다 활성이 강한 새로운 저해물질의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 아미노펩티데이스M에 대하여 더욱 강한 저해활성을 갖는 물질을 개발하기 위해 연구하였으며, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 균주의 배양액중 아미노펩티데이스 M에 대해 강한 저해활성을 나타내는 2종류의 저해물질을 단리, 정제하여 이들을 각각 'MR-387A' 및 'MR-387B'라 명명하여 특허 출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제94-9469호). 이들 저해물질 MR-387A 및 MR-387B는 각각 분자량이 504 m.w. 및 488m.w.로 크기 때문에 연구목적 및 실제 응용면에 있어서 불리한 점이 많다. 이에 따라, 본 발명자들은 저해 메카니즘의 해석 및 생체내에서의 안정적인 유지를 위해 필수적인 저분자량을 갖는 저해물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, MR-387A 및 MR-387B의 구조를 기본으로 하면서 분자량이 이들 보다 작은 2 종류의 저해물질을 합성하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 아미노펩티데이스에 대해 강한 저해활성 작용 및 면역증강 활성작용을 하는 저분자량의 새로운 아미노펩티데이스 저해물질을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 구조식의 아미노펩티데이스 저해물질을 제공한다 :
여기에서 R은 H 또는 OH이다.
이하, 본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 신규한 아미노펩티데이스 저해물질인 MR-387A1의 이화학적 특성은 다음과 같다.
(1) 색 및 형상 : 부정형의 백색 분말
(2) 분자식 : C20H29N3O5
(3) 분자량 : 373, ESI-MS, m/z
(4) 자외선 흡수 스펙트럼 : 1㎎/㎖의 메탄올 용액중에서 λmax(ε)는 264(149)nm, 258(155)nm, 252(144)nm 및 220(446)nm의 특이적 흡수를 나타낸다.
(5) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제1도 참조
(6) 수소핵자기 공명 스펙트럼 : 제3도 참조
(7) 정색반응 : 실리카겔 박층상에서 난히드린 시약에 양성반응을 나타낸다.
(8) 용해성 : 물, 메탄올, 디메틸설폭시드에 용해되고, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산에 불용성이다.
(9) 박층 크로마토그래피의 Rf 치 :
실리카(박층실리카겔(Merck사, Art, 5715)),
전개용매 : n-부탄올 : 초산 : 물(4:1:1)
Rf=0.65
(10) 구조식
또한, 본 발명의 신규한 아미노펩티데이스 저해물질인 MR-387A2의 이화학적 특성은 다음과 같다.
(1) 색 및 형상 : 부정형의 백색 분말
(2) 분자식 : C20H29N3O6
(3) 분자량 : 389, ESI-MS, m/z
(4) 자외선 흡수 스펙트럼 : 1㎎/㎖의 메탄올 용액중에서 λmax(ε)는 264(197)nm, 258(209)nm, 252(196)nm 및 220(642)nm의 특이적 흡수를 나타낸다.
(5) 적외선 흡수 스펙트럼 : 제2도 참조
(6) 수소핵자기 공명 스펙트럼 : 제4도 참조
(7) 정색반응 : 실리카겔 박층상에서 닌히드린 시약에 양성반응을 나타낸다.
(8) 용해성 : 물, 메탄올, 디메틸설폭시드에 용해되고, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산에 불용성이다.
(9) 박층 크로마토그래피의 Rf치 :
실리카(박층실리카겔(Merck사, Art. 5715)),
전개용매 : n-부탄올 : 초산 : 물(4:1:1)
Rf=0.53
(10) 구조식:
본 발명의 아미노펩티데이스 저해물질 MR-387A1은 (3-아미노-2-히드록시-4-페닐부타노인산)-발린-프롤린의 아미노산 서열을, MR-387A2는(3-아미노-2-히드록시-4-페닐부터노인산)-발린-(4-히드록시프롤린)의 아미노산 서열을 각각 포함하는 올리고펩티드로서, 펙티드 자동합성기를 이용하여 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
MR-387A1 및 MR-387A2의 합성 및 정제
펩티드 자동합성기(Applied Biosystems Instrunment, U. S. A. 모델 431A)로 아미노산과 (2S, 3R)-3-아미노-2-히드록시-4-페닐부타노인산(시그마사)을 이용하여 HMP-수지상에서 고체상 합성법(solid phase synthetic method : J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman and Co., San Francisco, (1969))에 따라 합성하였다.
0.5㎖의 탈이온수 및 9.5㎖의 트리플루오로아세트산의 혼합용액에 합성된 수지-펩티드(250㎎)를 넣고 실온에서 1.5시간 동안 반응시킨 후 여과하고, 고체를 3㎖의 디메틸에테르로 3회 세척하였다. 이어서, 고체를 소량의 메탄올을 용해시켜 고압 액체 크로마토그래피 칼럼(YMC-ODS-A, Φ4.6 x 250nm)상에서, 이동상으로 17% 아세토닐트릴-0.1% 트로플루오로아세트산을 1.5㎖/분의 속도로 용출시켜 MR-387A1 및 MR-387A2를 각각 분리하였다.
[실시예 2]
MR-387A1 및 MR-387A2의 구조 확인
MR-387A1 및 MR-387A2의 구조는 핵자기공명 스펙트럼, 질량분석, 자외선 또는 적외선 스펙트럼 등의 방법에 의하여 확인하였다.
MR-387A1 및 MR-387A2의 적외선 흡수 스펙트럼은 각각 제1도와 제2도에, 수소핵자기 공명 스펙트럼 1300MHz는 각각 제3도와 제4도에 나타내었으며, 수소핵자기 공명에 의한 아미노산의 확인결과는 하기 표1에 나타내었다.
[실시예 3]
MR-387A1 및 MR-387A2의 돼지신장 유래 아미노펩티데이스 M 저해활성
먼저 물에 녹인 각 검체 20㎕씩을 96공 마이크로플레이트(microplate)에 넣고, 160㎕의 로이신-p-니트로아닐리드 용액(1.25 ㎍/㎖ 0.1M 트리스-염산 완충용액, pH 7.0)을 넣은 후 20㎕의 효소용액(돼지신장 유래 아미노펩티데이스 M, 1mU)을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 다음, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, 바이오라드사)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 저해율(%)의 측정은 하기 식과 같이 하였다.
효소 저해율(%) = (A-B)/A x 100
A : 검체를 넣지 않은 대조구의 흡광도
B : 검체를 첨가한 것의 흡광도
IC50값은 효소활성의 50%를 저해하는 저해물질의 농도로 결정하였다
상기 결과는 하기 표2에 나타내었다.
* 실험에 사용한 베스타틴은 시그마사(미국)로부터 구입하여 사용하였으며, 나머지 저해물질은 본 발명자들이 미생물 배양액으로부터 분리하거나 화학합성하여 사용하였다.
[실시예 4]
MR-387A1 및 MR-387A2의 섬유육종 및 백혈병 세포주의 아미노펩티데이스 M 저해활성
종양세포주 아미노펩티데이스 M의 활성을 측정하기 위하여, 인간 유래 섬유육종 세포인 HT-1080과 백혈병 세포인 K-562를 RPMI 1640 배지(집코사)에 10%의 송아지 혈청(집코사)을 넣은 배지에서, 5%의 이산화탄소와 95% 공기의 습윤 대기상태, 37℃의 조건으로 2 내지 3일간 배양하였다.
배양된 HT-1080을 20μM의 로이신-p-니트로아닐리드 용액(0.1M 트리스-염산 완충용액, pH 7.0에 녹인 용액)에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 상층액에 대하여 실시예 3과 같이 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 배양된 K-562 세포는 먼저 원심분리한 후 HT-1080과 동일한 방법으로 기질 및 시료를 넣고 활성을 측정하였다.
효소 저해율 및 IC50 값은 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였다. 상기 결과는 표3에 나타내었다.
[실시예 5]
MR-387A1 및 MR-387A2의 백혈병 세포주의 아미노펩티데이스B 저해활성
실시예 4와 같이 배양한 K-562를 원심분리하여 배지를 제거하고 여기에 기질인 리신-p-니트로아닐리드 용액(0.1M 트리스-염산 완충용액, pH 7.0에 녹인용액) 200μM과 검체를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 상충액에 대하여 실시예 3과 같이 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소 저해율 및 IC50값은 실시예 3과 동일한 방법으로 결정하였다. 이 실험으로부터 얻은 결과를 표 4에 도시하였다.

Claims (1)

  1. 하기 구조식을 갖는 아미노펩티데이스의 저해물질 :
    여기에서 R은 수소 또는 히드록시기이다.
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