KR0131736B1

KR0131736B1 - 테린 화합물

Info

Publication number: KR0131736B1
Application number: KR1019940007601A
Authority: KR
Inventors: 임정빈; 차기원
Original assignee: 임정빈
Priority date: 1994-04-12
Filing date: 1994-04-12
Publication date: 1998-04-11
Also published as: KR950029281A

Abstract

광합성 세균 클로로비움 리미콜라 포마 티오설파토필름에서 추출된 수용성인 하기 구조식(Ⅰ)의 새로운 테린 화합물로서 리미테린은 글리코사이드를 포함하고 있으므로 방향족 화합물에 대한 유해를 최소화시키는 특징을 지니며 인체에 유해한 파장의 자외선을 흡수하는 성질을 지니므로 자외선 보호제로 화장품등에 이용가능하며, 그의 생체내 존재형태인 하기 구조식(Ⅱ)의 테트라하이드로리미테린은 항산화제로서의 유용성을 지닌다.

상기구조식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)에서, Ac는 아세틸기를 나타낸다.

Description

테린 화합물

제1도는 리미테린 및 그의 가수분해 산물의 화학구조식으로, 각 구조식에서 Ac는 아세틸기를 나타내며,

제2도는 도웩스 또는 차콜법으로 처리한 용액의 델타팍 C18(30㎜×30㎜) 컬럼의 HPLC의 용출결과를 나타낸 그래프이고,

제3a도는 노바팍 C18 (2.5㎜ × 15㎝) 컬럼으로 정제한 리미테린의 HPLC의 용출결과를 나타낸 그래프이고,

제3b도는 표준 테린의 존재하 및 비존재하에서 pH 8.4의 0.1 M 보릭에시드-소디움 보레이트 전개 완충용액(running buffer)을 사용하여 수행한 모세관 전기 영동(capillary electrophoresis)결과를 나타낸 그래프이고,

제4도는 가수분해산물의 바이오테린의 존재하 및 비존재하에서 제3b도와 동일한 조건에서 실행한 전기영동 결과를 나타낸 그패프이고,

제5a도는 물, 0.1N 염산 및 0.1N 수산화나트륨에서 측정한 리미테린의 형광스펙트라이고,

제5b도는 물, 0.1N 염산 및 0.1N 수산화나트륨에서 측정한 리미테린의 가수분해 산물의 형광스펙트라이고,

제5c도는 물, 0.1N 염산 및 0.1N수산화나트륨에서 측정한 바이오테린과 그의 가수분해 산물의 혼합물의 형광스펙트라이고,

제6a도는 물, 0.1N 염산 및 0.1N수산화나트륨에서 측정한 리미테린의 흡수스펙트라이고,

제6b도는 물, 0.1N 염산 및 0.1N수산화나트륨에서 측정한 리미테린의 가수분해 산물의 흡수스펙트라이고,

제6c도는 물, 0.1N 염산 및 0.1N수산화나트륨에서 측정한 순수한 바이오테린의 흡수스펙트라이고,

제7a도는 리미테린의 패스트 아톰 밤바드먼트(FAB) 및 열스프레이(thermospray) 질량 스펙트라이고,

제7b도는 리미테린의 가수분해 산물의 패스트 아톰 밤바드먼트 및 열스프레이 질량 스펙트라이고,

제7c도는 순수한 바이오테린의 패스트 아톰 밤바드먼트 및 열스프레이 질량스펙트라이고,

제8a도는 500 MHz에서 측정한 리미테린의 'H-헥자기공명(NMR)스펙트라이고,

제8b도는 500 MHz에서 측정한 리미테린의 가수분해 산물의 'H-헥자기공명(NMR)스펙트라이고,

제8c도는 500 MHz에서 측정한 순수한 바이오테린의 'H-헥자기공명(NMR)스펙트라이고,

제9도는 리미테린의 13C-헥자기공명 스펙트라이고,

제10도는 리미테린의 적외선 스펙트라이고,

제11도는 리미테린, 그의 가수분해 산물 및 순수한 바이오테린의 퍼아이오데이트 산화 패턴을 나타낸 그래프이고,

제12도는 β - N - 아세틸글루코스아미네이즈에 의한 리미테린에서 바이오테린으로의 전환 정도를 HPLC의 용출결과로 나타낸 그래프이고,

제13도는 산화후 (C 및 D) 샘플 (5.0㎕)를 파르티실 5 ODS - 3 HPLC 컬럼(4.6 ㎜×25㎝)에 로딩하여 컬럼을 pH 5.5인 10mM 포타슘포스페이트로 1분당 1.0㎖의 속도로 전개시킨 후 형광 측정으로 확인한 산 또는 염기에서의 요오드 산화 패턴으로 확인한 천연 리미테린의 산화 상태를 나타낸 그래프이다.

[산업상 이용분야]

본 발명은 테린(pterine) 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세히는 광합성 세균 클로로비움리미콜라 포마 티오설파토필름(Chlorobium limicola forma thiosulfatophilum)에서 추출한 새로운 테린 화합물로서 생체내에서는 테트라하이드로화된 형태로 존재하며, 수용성이며 글라이코사이드를 포함하고 있는 테린 화합물에 관한 것이다.

[종래 기술]

테린은 하기한 구조를 지닌다.

이와같은 테린 화합물의 일종으로 널리 알려져 있는 것으로는 크산토테린(2-아미노-4,6-디하이드록시테린), 이소크산토테린(2-아미노-4,7-디하이드록시테리딘), 로이코테린(2-아미노-4,6,7-트리하이드록시테리딘)등이 있다. 이외에도 테리딘(a), L-바이오테린(b), L-모나테린(c), D-네오테린(d)등의 테린 화합물이 존재하며, 그 구조는 하기와 같다.

일반적으로 테린은 결합된(conjugated) 테린 및 결합되지 않은 (noncojugated)테린으로 구분되며, 결합된 테린이란 변형된 형태인 폴레이트(folate)와 같이 p-아미노벤제닐글루타메이트가 결합된 테린을 일컬으며, 결합되지 않은 테린은 바이오테린(biopterin), 몰리브도테린(molybdopterin)과 테린 색소를 일컫는다. 그러나 이 두 형태의 보조인자(cofactor)들은 구조의 유사함에도 불구하고, 서로 다른 기능을 지닌다. 즉 이들 각각은 탄소 운반과 하이드록시화 반응에 관여한다. 테린 화합물은 일반적으로 신경 조절 또는 호르몬 조절에 관여하며, 이 사실로부터 테린화합물들이 신경전달 물질의 합성을 저정하는 역할을 함이 알려져 다. 또한 최근에는 테린 화합물의 합성이상으로 나타나는 여러 병의 치료에 테린 화합물을 이용하기도 한다.

일반적으로 테린 화합물은 높은 융점을 지니며, 보통의 유기용매에는 녹지 으나 알칼리에는 녹는다. 테린의 용액은 특유의 강한 형광을 내는 성질을 지닌다.

상기와 같은 결합된 또는 결합되지 않은 형태를 포함하는 모든 테린화합물은 공통 전구체 GTP로부터 GTP사이클로하이드로레이즈 I(GTP cyclohydrolase I)에 의해 생합성된다.

상기한 특징의 테린 화합물은 결합된 형태뿐만 아니라 다양한 단순한 형태로 다수의 미생물내에 존재한다.

특히 다수의 광합성 박테리아에서는 테린 화합물이 비교적 높은 함량으로 존재하며, 그때 존재하는 테린 화합물의 양은 세포의 배양 방법과 밀접한 관계를 지니고 있다.

[발명의 목적]

본 발명은 수용성이고 글리코사이드를 포함하고 있어 방향족 화합물의 유해도 최소화할 수 있는 새로운 테린 화합물 및 그의 생체내 존재 형태인 테트라하이드로테린 화합물을 제공하며, 또한 그의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

[발명의 구성]

본 발명자는 혐기성 광합성 독립 영양 박테리아의 일종으로서 그린 설퍼 박테리아인 클로로비움 리미콜라 포마 티오설파토필룸 NCIB 8327에서 새로운 테린글리코사이드를 분리 정제하고, 이를 리미테린이라 명명하였으며, 새로이 추출한 리미테린의 구조적인 특징을 밝혔다.

본 발명은 하기한 구조식(Ⅰ)의 테린 화합물과 하기한 구조식(Ⅱ)의 테트라하이드로테린 화합물을 제공한다.

상기구조식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)에서 Ac는 아세틸기를 나타낸다.

더하여, 광합성 세균 클로로비움 리미콜라 포마 티오설파토필룸에서 상기한 테린화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 구조식(Ⅱ)의 테트라하이드로테린은 상기 구조식(Ⅰ)의 테린화합물의 생체내 존재형태이다.

[작용]

본 발명의 리미테린은 글리코사이드를 포함하고 있으므로 방향족 화합물에 대한 유해를 최소화시키며, 기존의 테린 화합물들과는 달리 수용성이므로 이용하기가 편리하다. 상기한 리미테린은 광합성 세균에서 분리된 순수 천연물질이며, 인체에 해로운 276nm의 자외선은 흡수하고, 비타민 D의 생성에 도움을 주는 장파장(346nm)의 자외선은 비교적 소량 흡수하며, 더하여 수용성이므로 자외선 보호제로 화장품 첨가제로 이용 가능하다. 또한 상기한 리미테린의 산화형태인 테트라하이드로 리미테린은 항산화제로서의 유용성을 지닌다.

실시예

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본발명의 구성 및 효과를 보여주기 위한 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명의 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

Ⅰ.균주 및 배양

균주로는 에스. 실레버그(S. Srevag)에 의해서 제공된 클로로비움 리미콜라 포마 티오설파토피룸 NCIB 8327을 사용하였다.

배양은 50-80파(par) 강도의 빛에서 30℃로 5 내지 6일 동안 이루어졌다. 이때 배지로는 KH₂PO₄1.0g, NH₄C1 0.5g, Na₂S₂O₃5H₂O 1.0g, MgSO₄7H₂O 0.4g, NaC1 0.5g, CaCl₂2H₂O 0.058g, 비타민 A₄용액(2.0 ㎎/1000㎖) 1.0㎖, 미량원소(trace edement) 용액 1.0㎖, 5%Na₂S ·9H₂O와 5%소디움바이카보네이트 용액 40㎖로 구성된 pH 6.8의 변형된 페니그(pfening) 배지를 사용하였으며, 이 페니그 배지 19.8ℓ를 포함하고 있는 좁은 목 폴리카보네이트 카보이(carboy)에서 균주를 배양하였다.

상기한 조건에서 배양된 클로로비움 리미콜라 포마 티오설파토필룸 세포들은 CEPA 원심분리를 계속적으로 행하여 배지에서 분리되었으며, 세포들의 수득율은 배지 1리터당 1.3g이었다. 배양된 세포들은 리미테린을 정제하기 위해서 즉시 사용되거나 다음 단계에서 사용할때까지 영하 40℃에서 저장 보관하였다.

Ⅱ. 리미테린의 정제

클로로비움 리미콜라 포마 티오설파코필룸에서 리미테린을 정제하기 위하여 하기의 2가지 다른 방법을 사용하였다.

(1)도웩스-델타팍 방법(Dowex-DeltaPak method)

상기한 방법으로 배양 분리한 후 냉동 저장해 둔 냉동 세포 100g을 세포의 8배 부피의 0.1 M H₃PO₄에 현탁하였다. 이 현탁액을 초음파 발생장치(sonicator)를 사용하여 4℃에서 1시간동안 초음파 파괴시킨후 그 샘플을 7000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 생성된 상층액에 2.0N TCA(트리클로로아세트산) 80㎖과 1% I₂/2% KI를 포함한 2N트리클로로아세트산인 산성 요오드 용액 400㎖을 가하였다. 이 샘플을 1시간 동안 교반한 후 생성된 최종 침전물을 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 제거하고, 상층액에 남아 있는 과량의 요오드를 환원시키기 위해서 고체 아스코르브산 2.0g을 상층액의 색깔이 엷은 노란색으로 변할 까지 혼합하였다. 상기한 과정으로 준비된 옅은 노란색의 상층액용액(1,400 ㎖)을 증류수로 평형시킨 도웩스(Dowex) 50W × 8 칼럼(Vt = 50㎖, H+ 형태, 100 메쉬)으로 크로마토그래피를 실행하였다.

컬럼을 증류수 500㎖로 세수하고 1.0N NH₄OH 500㎖로 120㎖/hr의 속도로 용출시킨 후 형광 물질이 결합된 분획에 pH 6.0의 빙초산(glacial aceticacid)을 가하여 산성화시켰다. 상기 산성화된 용액을 회전증발기(rotatory evaporator)를 사용하여 21㎖로 농축시킨 후 나이트로셀룰로오즈 막으로 걸러서 정제하였으며 농축된 샘풀 1.2㎖를 델타팍 C18 HPLC 컬럼에 주입한 후 15 m/min의 속도로 20%의 메탄올 수용액으로 균등하게 크로마토그래프를 실시하였다.

상기한 크로마토그래피의 38.7분의 정체시간(retention time)에서의 용출액인 형광을 보이는 피크(peak)에 해당하는 분획을 모으고 그 분획을 7.8㎎의 건조도로 회전 증발기(rotatory evaporator)와 고속진공농축기(speed vac. concentrator)을 사용하여 농축시켰다.

(2) 차콜-델타팍 방법(Charcoal-DeltaPak method)

배양 분리한후 냉동 보관해 두었던 냉동세포 200g을 pH 6.8의 50 mM 포타슘 포스페이트와 5.0 mM β-머캅토에탄올을 포함한 세포 부피의 8배 부피의 완충용액에 현탁시켰다. 현탁액을 초음파 파괴시킨 후 원심분리하여 생성된 상충액(1940 ㎖)에 고체 암모니움 설페이트를 70%로 포화되도록 가하였다. 그 후 TCA와 산성 요오드 용액으로 처리하고, 원심 분리한 후 색깔이 엷은 노란색으로 변할 까지 아스코르브산을 가하였다. 30g의 차콜(Fluka)을 가하여 가용성 형광 화합물을 흡수한 후 400㎖ 증류수로 차콜을 완전히 제수한 후 600㎖의 에탄올:3% NH₄OH로 용출시켰다. 이 용출액에 빙초산(22.5㎖)을 pH6에 이를때까지 가함으로써 산성화시키고, 회전 증발기와 고속증발 농축기를 사용하여 12㎖로 농축시켰다.

12㎖로 농축시킨 샘플을 셉-팍(Sep-Pak) C18과 막을 이용하여 정제한 후 상기 도웩스 컬럼법(Dowex column method)에 기술된 방법과 동일하게 델타-팍 C18 HPLC을 행하여 리미테린을 정제하였다.

상기의 두 종류의 다른 정제 방법은 동일한 최종산물을 제공하지만 수득율은 두 번째 방법으로 정제하였을 때 (19㎎/100g수분함유 세포중량)가 첫 번째 방법으로 행하였을 때(7.5㎎/100g수분함유 세포중량)보다 높았다.

도웩스 또는 차콜법으로 처리된 용액의 주요성분은 276nm에서의 흡광하는 리미테린임을 제2a부터 알았다. 이 리미테린의 정제 정도를 분석용 HPLC 또는 모세관 전기 영동으로 확인하고, 그 결과를 제3a와 제3b에 기록하였다. 또한 테리딘을 확인하는데 매우 유용한 형광/흡광의 비를 조사하기 위하여 360nm에서 활성되고 450nm에서 방출되는 형광/277mn에서의 흡광의 비를 측정하고 그 수치와 순수 화합물에서의 형광/흡광의 수치를 비교하여 그 결과를 표 에 기록하였다. 표 에 기록되어 있듯이 리미테린의 형광/흡광의 비는 바이오테린의 형광/흡광의 비 1.00과는 약간 다른 값을 지닌다.

더하여, HPLC 노팍(NovaPak) C18에서의 리미테린의 정체 시간도 측정하였는데 리미테린은 바이오테린(4.05분) 및 테린(4.33분) 보다 긴 4.82분의 정체시간을 지녔다.

Ⅲ. 리미테린의 순도 및 구조 조사

1. 리미테린의 산성 가수분해

체된 리미테린의 가수 분해속도는 pH에 따라 변하는데 가수분해 산물은 pH 1.0내지 pH 2.0으로 처리하였을 때에 얻을 수 있다. 따라서 정제된 리미테린 18.4 ㎎을 pH 1.0 의 0.1M 소디움 포스페이트 완충용액 1.0㎖에 녹여서 가수분해함으로써 가수분해 산물을 얻었으며, 이때 생성된 가수분해산물은 물에 녹지 않고 가수분해 반응도중 또는 정제된 물질의 농축도중에 침전화되었다. 이 최종 침전물을 마이크로 원심분리로 모운 후 가능한 한 적은 양의 밀리(Milli)-Q물에 다시 용해시켰다.

델타팍 C18 HPLC를 사용하여 가수분해물로부터 정제된 리이테린의 산성 가수분해 산물은 순수 리미테린보다 짧은 정체시간을 지니는 테린화합물중의 하나이며, 이때 정제된 테린 화합물의 순도를 확인하기 위해서 분석용 HPLC와 모세관 전기 영동을 행하고, 그 결과는 표 1에 기록하였다. 표 1에서 알 수 있듯이 리미테린의 가수분해 산물은 RP-HPLC(리크로소브(Lichrosorb0 C18과 마이크로본다팍 (μBondaPark) C18)컬럼상에서 순수 바이오테린과 동일한 정체시간을 나타낼 뿐만 아니라 형광/흡광비도 역시 바이오테린의 형광/흡광의 비와 동일한 수치로 나타났다. 이 가수분해 산물과 순수 바이오테린은 셀룰로오즈 판상의 얇은 막 크로마토그래피와 모세관 전기 영동으로도 서로 구분할 수 없었다. 얇은 막 크로마토그래피의 결과는 표 2에, 모세관 전기 영동 결과는 제4도에 기록하였다.

따라서 분석용 HPLC와 모세관 전기 영동 둘 모두의 결과로부터 상기 가수분해 산물은 순수물임을 확인하였다.

2) 리미테린의 β-N-아세틸글루코스아미네이즈에 의한 가수 분해

pH 4.0의 100mM사이트레이트 완충용액과 5.0 uM 리미테린과 β-N-아세틸글루코스아미네이즈 0.4 ㎛을 25℃에서 반응시켰다. 간간이, 가수분해된 시료의 일정양의 분획을 반응산물을 분석하기 위해서 HPLC로 분석하였다.

3)퍼아이오데이트 산화

각각의 10μM테린화합물(리미테린, 바이오테린 그리고 가수분해 산물) 50㎕에 0.2M NaIO₄2.0㎕를 가하여 산화시켰다. 반응 산물을 노바팍 C18컬럼으로 HPLC로 분석한 후, 최종 정체 시간을 표준치와 비교하고 그 결과를 제11도에 나타내었다.

퍼아이오데이트 산화 패턴을 나타낸 제11도로부터 리미테린의 가수분해 산물은 리미테린과는 달리 테린-6-알데하이드를 제공하는 퍼아이오데이트 산화를 함을 알았으며, 이로부터 리미테린의 1' 또는 2' 측쇄-OH기가 산성 조건에서 가수분해되는 N-아세틸글루코사민에 의해 보호되어 있음도 알았다.

4) 패스트 아톰 밤바드먼트(Fast atom bambardment)와 열스프레이스펙트로스피(thermospray spectroscopy)

리미테린과 그의 가수분해 산물의 분자량 및 구조를 알기 의하여 패스트 아톰 밤바드먼트 탐침(probe)이 장치된 브이지 콰트로(VG Quattro)사극자 질량 스펙트럼을 사용하여 패스트 아톰 밤바드먼트 질량 스펙트로스코피(FAB-MS)를 행하였다. 0.5㎎/㎖ 티오글리세롤속에 용해된 샘플을 스테인레스 스틸 탐침에 넣고 10 KeV로 활성화된 세슘-요오드 원자로 충격을 가하였으며 이때 샘플의 온도와 탐침의 온도는 가각 200℃와 150℃이었다. 열스프레이-질량 스펙트로스코피는 열스프레이 액체 크로마토그래피와 질량 스펙트로미트리 접촉면이 장치된 점만 제외하고는 상기한 것과 동일한 질량 스펙트럼 시스템을 사용하여 실행하였다. 샘플을 0.1M 아세테이트를 함유한 50%수용액성 아세톤 나이트릴에 용해시킨 후 주입하고, 샘플 온도 240℃, 탐침온도 22℃에서 유출 속도 0.6㎖/min으로 분석하였다.

리미테린의 FAB 질량 스펙트럼의 제7a도에 기록하였다. 이 스펙트럼에서는 m/z=441에서 MH⁺의 피크가 나타났으며 열스프레이-질량 스펙트로미트리에서도 역시 m/z=441에 MH⁺가 나타났다. 이 결과들로부터 리미테린의 분자량이 440임을 확인하였다.

한편 리미테린의 가수분해 산물은 m/z=238이라는 MH⁺값을 나타내었다.

5) 1H=핵자기공명 스펙트럼(NMR) 정제된 리미테린(1.2 mg)을 0.5mm 시험관속의 0.6㎖ D₂O 또는 DMSO에 녹였다. 높은 해상도¹H-NMR 스펙트럼을 부루커(Bruker) AMX-500 스펙트로미터를 사용하여 얻었는데 이때 스펙트로미터는 301K에서 플리에-트랜스품 모드로 작동시켰으며 공명 주파수는 500 MHz이고 축적도 (accumulation number)는 800이었다. 화학적 이동(chemical shift)은 TMS를 표준물질로 하여 상대적으로 나타내었다. 리미테린의 가수분해 산물과 순수 바이오테린의 'H NMR도 동일한 방법으로 얻었으며 그 스펙트라는 제8b도와 제8c도에 기록하였다.

제8b도에 제시된 리미테린의 가수분해 산물의 500 MHz 'H-NMR 스펙트럼은 화학적 이동, 커플링 상수 및 쪼개짐 형상 모두에서 제8c도의 순수 바이오테린의 스펙트럼과 완전히 일치하였다. 제8b도의 가수분해산물의 스펙트럼에서는 6개의 치환된 테린을 매개하는 7-H 원자핵에서 기인하는 8.81 ppm에서의 단일선, N3-H에서 기인하는 11.58ppm에서의 넓은 피크 및 2-아미노 기의 수소의 원자핵에서 기인하는 및 6.98ppm에서의 넓은 피크, 1.18ppm에서 나타나는 3’-메틸기의 수소의 원자핵에서 기인하는 이중선, 1'메틸렌의 수소의 원자핵에서 기인하는 4.45 ppm에서의 삼중선, 2'메틸렌의 수소의 원자핵에서 기인하는 4.02ppm에서의 다중선, 메틸렌의 수소 또는 6-측쇄 연쇄에 결합되어 있는 1'수소에서 기인하는 5.68ppm에서의 이중선 및 2'하이드록시 수소에서 기인하는 4.80ppm에서의 이중선 등의 시그날 등이 나타났다. 그 결과는 표 3과 표 4에 요약하였다.

제8a도에 제시된 리미테린의 'H-NRM 스펙트럼에는 가수분해 산물에서는 나타나지않는 부가적인 시그날이 존재한다. 이 시그날들 중 8.74ppm에서의 7a, 4.56ppm에서의 1b, 4.28ppm에서의 2b 및 1.33ppm에서의 3b는 테린부분에서 기인한 것이며, 8.74ppm에서의 시그날은 테린링의 C7에 붙어있는 수소의 원자핵에서 기인한 특징적인 위치의 시그날이다. 바이오테린 또는 리미테린의 가수분해 산물과는 다른 부분에서 나오는 리미테린에서만 나타나는 부가적인 시그날로부터 리미테린에만 존재하는 다른 부분이 N-아세틸글루코사민임을 알았다.

더하여 4.75 ppm에서의 1C의 커플링 상수로부터 이 글라이코사이드가 β-글라이코시드 가교에 의해 테린 잔기임을 확인하였는데, 이는 α-글라이코사이드는 -3Hz의 커플링 상수를 지니는데 반해 β-글라이코사이드의 J1.2 커플링 상수가 일반적으로 -7.4Hz라는 사실로부터 결정된 것이다.

6) UV-가시광선 및 형광 스펙트럼

UV-가시광선 흡수 스펙트라는 헤우렛 팩카드 (Hewlett Packard)8452A 다이오드 배열(array) 스펙트로포토미터를 이용하여 얻었으며 형광 스펙트라는 각각의 다른 pH값들에서 시마드주(Shimadzu) RF540 스펙트로형광포토스펙트럼을 이용하여 얻었다.

제6a도에 기록된 리미테린의 UV-가시광선 스펙트라에서 240nm이상의 파장에서는 리미테린의 UV스펙트라와 바이오테린의 UV 스펙트라는 동일하나 240mn이하의 단파장에서는 서로 다른 스펙트라를 지님을 알았다.

그리고 제5도에서는 리미테린이 360nm에서 활성화되고 450mn에서 발광하는 테린 화합물의 전형적인 형광을 지니며 가수분해 산물과 순수 바이오테린은 상호 완전히 동일한 형광 및 흡광 스페트럼을 지닌다는 사실도 제6b도 및 제6c도로부터 확인하였다.

7) 모세관 전기영동

모세관 전기영동 기기로는 P/ACE 소프트웨어가 장치된 P/ACE 2000(베크만 기기)로 자동화된 것을 사용하였으며, 25 kV전압에서 모세관 카세트로 직경 75㎛, 길이 57㎝의 용해된 실리카 컬럼을 사용하여 모세관 전기영동을 행하였다. 5분동안 가압하며 샘플을 주입하고 214mn에서 UV 흡광으로 컬럼을 검지하였다.

모세관 전기영동에 사용한 사용한 모든 완충용액은 밀리(Milli)-Q 물로 제조되고 0.2㎛ 멤브레인 필터로 걸러진 것이었다. 전개 완충용액은 pH 8.4로 0.1 M 보릭 에시드-소디움 보레이트로 구성되었으며 전개 완충용액으로 모세관을 채워서 첫 번째 세정(Rinse)을 행한 후, 5초간 시료를 가압 주입하였으며, 전개 완충용액을 이용하여 10분간 분리하였다. 회수성을 높이기 위해서 매회마다 0.1N 소디움 하이드로옥사이드 용액을 2분간 흘려주어 2번째 세정을 한 후 다시 2분간 물을 흘려주어 3번째 세정을 행하였다.

8) 얇은 막 크로마토그래피

100㎍의 리미테린을 100℃ 2.0N 트리블소화아세트산 용액에서 2시간 동안 가수분해하고, 그 가수분해 산물을 농축시킨 후 40 ㎕의 50% 이소프로판을 수용액에 용해시켰다. 샘플을 표준 당 물질과 함께 카이젤-60 플레이트(메르크)에 스파팅하고 플레이트를 n-프로판을/에틸아세테이트/물(7/2/1, v/v) 또는 n-부탄을/피리딘/0.1M HC1(5/3/2, v/v)로 전개시켰다. 그 후 디페닐아민 아닐린과 인산을 포함하고 있는 시약을 스프레이하여 스팟을 검지하였다.

측정된 리미테린, 리미테린의 가수분해 산물 및 순수 바이오테린의 Rf 값을 표준 테리딘 화합물과 비교하였다. 그 값은 표 2에 기록되어 있다.

가수분해 산물 및 순수 바이오테린의 Rf값은 동일하였지만 리미테린은 모든 종류의 표준 테리딘과는 다른 유동성(mobility)를 보였다. 즉, 리미테린은 이소프로판올과 부탄올을 포함하는 유기 용매에서 보다 3%암모니움 클로라이드 또는 4%소디움 사이트레이트와 같은 수용성 용매시스템에서 더 빠르게 이동하는 경향을 보였다. 이러한 경향을 보이는 리미테린내에 존재하는 당부분의 종류를 조사하기 위하여 리미테린 산성 가수분해 산물을 표준 당과 함께 얇은막 크로마토그래피를 행하고, 그 결과를 표 4에 기록하였다. 표 5에 기록된 결과로부터 리미테린은 당기로 N-아세틸글루코사민을 포함하고 있음을 확인하였다.

9) 리미테린의 생체내 산화 상태 결정

리미테린의 생체내 산화상태를 결정하기 위하여 약간 변형된 후쿠시마와 닉슨법을 사용하였다. 0.02% 아스코르브산의 존재하에서 20분간 8400×g로 배양한 세포들을 0.2% 아스코르브산을 포함하는 0,1M 인산의 10배 부피에 현탁시켰다. 초음파로 세포들을 파괴한 후 파괴한 세포 조각들은 20분간 4000×g로 원심분리하여 제거하였으며, 크루드(crude) 현탁액(100㎕)은 2.0N HC1 또는 2.0N NaOH 50㎕을 가하여 혼합한 후 1%, I₂/2% KI용액 350㎕을 가하여 산화시켰다. 2시간 동안 산화시킨 후, 염기성 시료를 2.0N HC1 100㎕을 가하여 산성화 시켰다.

최종 침전물을 12000rpm으로 마이크로원심분리하여 얻었으며, 2%아스코르브산 200㎕을 침전물에 가하고 HPLC(와트만 50DS-3,4.6mm ×25㎝)로 분석하였다. 이때 컬럼은 pH 5.5 의 10mm포타슘포스페이트를 포함하는 유동기(mobile phase)로 1.0㎖/min의 속도로 전개시켰다.

10) 적외선(IR) 스펙트로메트리

리미테린 구조의 결정을 위하여 적외선 스펙트로메트리를 행하였으며 그 결과는 제10도에 제시된 스펙트럼이다. 적외선 스펙트로스코피의 결과인 제10도로부터 리미테린은 수소가 붙어있는 -OH(3.290㎛), C=O 또는 하나 건너 존재하는 C=O(1.695㎛) 및 C-O 등의 작용기를 포함하고 있다는 것을 확인하였고, 스펙트럼에 나타난 다른 작은 골들로부터 지방족 -CH(2.800㎛), -NH(3450㎛), 방향족 C=C(1.416-1.538㎛) 및 CH3, C-N(1400-1300㎛)도 리미테린내에 존재하고 있음을 확인하였다.

Ⅳ. 리미테린의 구조 및 생체내 산화상태 결정

상기한 여러 종류의 스펙트로스코피와 가수분해의 결과로부터 리미테린의 완벽한 구조를 결정할 수 있었으며 그 구조를 제1도에 도시하였다. 리미테린의 분자 구조는 분자량이 440달톤(Da)인 C₁₇H₂₄O₈N₆이었다. 리미테린내에 N-아세틸글루코사민의 결합되어 있음은 β-N-아세틸글루코사미니데이즈를 사용한 효소의 가수분해 실험에서 리미테린이 N-아세틸글루코사민에 대하여 특이하게 반응하는 이 효소에 의해 쉽게 분해된다는 사실로부터 확인할 수 있었는데 이 실험의 결과는 제12도에 기록되어 있다. 천연 리미테린의 산화상태는 분별 요오드 실험에 의해 표 6에 기술된대로 결정되었으며 이 실험으로부터 93%이상의 리미테린이 생체내에서는 테트라하이드로 형태임을 알았다.

표 6에서 리미테린의 생체내 농도는 1.85 μmol/g 건조 중량임이 계산되었는데, 이 수치는 쥐의 송과선에 존재하는 바이오테린의 양의 약 10배에 해당하며 메타노박테리움에 존재하는 메타노테린의 양과 비슷한 값이다.

본 발명의 리미테린 외에도 비교적 많은 양의 테린글라이코사이드가 시아노박테리아와 아르카 박테리아를 포함하는 다양한 미생물들에서 발견되었으며 열친화성 아르카박테리아의 하나인 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)에서도 본발명의 리미테린과 비슷한 구조의 솔파펙트린(에리트로-네오테린-3’-D--디옥시-2-아미노글루코피라노사이드)이 발견되었다.

[효과]

광합성 박테리아에서 새로이 추출된 본 발명의 리미테린은 글리코사이드를 포함하고 있으므로 방향족 화합물과 함께 사용될 때 그 방향족 화합물에 대한 유해를 최소화시키며, 기존의 테린 화합물들과는 달리 수용성이어서 여러 목적으로 이용하기에 용이한 효과를 지닌다. 이와 같은 본 발명의 리미테린은 광합성 세균에서 분리된 순수 천연 물질이며, 자외선 스펙트럼에서 인체에 유해한 276nm의 빛은 흡과하고 비타민 D의 생성에 도움을 주는 유용한 빛은 소량 흡수하는 성질을 지니며, 앞서 언급하였듯이 수용성이므로 자외선 보호제로서 화장품 등에 첨가제로 이용하는 것이 가능하다. 더하여 본 발명의 리미테린의 생체내 산화형태인 테트라하이드로미테린은 항산화제로서의 기능을 지니고 있으므로 그 자체로도 상당한 유용성을 지닌다.

얇은막 크로마토그래피는 상기한 공정으로 실행하였다. 미리 코팅된 셀룰로오즈 판은 하기 용매 시스템에서 전개되었다.

A : 3% 암모니움 클로라이드

B : 4% 소디움사이트레이트

C : 5% 아세트산

D : 이소프로판을 - 1%암모니아 = 2: 1

E : 이소프로판을 - 2% 암모니움 아세테이트 = 1: 1

F : 이소프로판을 - 물 =7:3

G : n-부탄을 - 아세트산- 물 = 4 : 1: 1

TLC를 행하고 하기 용매시스템을 사용하여 재료 및 방법에서 검지하였다.

용매 A : n-프로판을/에틸아세테이트/물=7/1/2

용매 B : 부탄올/피리딘/0.1N HCI = 5/3/2

용매 A : n-프로판올/에틸아세테이트/물=7/1/2

용매 B : 부탄올/피리딘/0.1N HCL = 5/3/2

단위는 건조세포 μ m o l e s / g이다.

괄호속의 수치는 상대적인 퍼센트 ±표준 편차를 나타낸다.

Claims

하기한 구조식(Ⅰ)의 테린 화합물.

상기식에서, Ac는 아세틸기를 나타낸다.
하기한 구조식(Ⅱ)의 테트라하이드로 테린 화합물.

상기식에서, Ac는 아세틸기를 나타낸다.
클로비움 리미콜라 포마 티오설파토필룸을 이용한 상기 구조식(Ⅰ)의 테린 화합물의 제조 방법.