JPWO2023275601A5 - - Google Patents
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Description
まとめると、これらの結果は、非常に小さいＲＮＡガイドＴｎｐＢヌクレアーゼが、真核生物ｇＤＮＡを切断可能であり、ゲノム編集のためのツールとして採用され得、ゲノム編集用途についての異なる生化学的要件を伴う、新しいクラスの非常に小さい非Ｃａｓヌクレアーゼを提供することを示す。下の表は、ＲＮＡガイドＴｎｐＢヌクレアーゼとＣａｓ９及びＣａｓ１２ヌクレアーゼとの比較を提供する。
本明細書に記載の例は、本発明の実施形態の説明的な例として理解される。更なる実施形態及び例が想定される。任意の１つの例又は実施形態に関連して記載される任意の特徴は、単独で又は他の特徴と組み合わせて使用され得る。更に、任意の１つの例又は実施形態に関連して記載される任意の特徴はまた、任意の他の例又は実施形態の１又は複数の特徴と組み合わせて、又は、任意の他の例又は実施形態の任意の組み合わせで使用され得る。更に、本明細書に記載されない同等物及び改変がまた、請求項において定義される発明の範囲内において採用され得る。
［項目１］
エフェクター複合体を用いてポリヌクレオチドを切断するための方法であって、前記ポリヌクレオチドは標的配列を含み、前記エフェクター複合体は：
（ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質；及び
（ｂ）
（ｉ）前記標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＲＮＡが前記ＴｎｐＢタンパク質と結合して前記エフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント
を含む前記ＲＮＡ
を備え、ここで、前記方法は、前記ポリヌクレオチドを前記エフェクター複合体と接触させ、前記ＴｎｐＢタンパク質が前記ポリヌクレオチドを切断することを可能にする段階を備える
方法。
［項目２］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の方法。
［項目３］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目２に記載の方法。
［項目４］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの前記可動遺伝因子のＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目３に記載の方法。
［項目５］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ｔｎｐＢ遺伝子から取得された前記タンパク質の前記アミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する、項目２から４のいずれか一項に記載の方法。
［項目６］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はそれから成る、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
［項目７］
前記ＲＮＡは、５０～３００ヌクレオチドの長さである、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
［項目８］
前記ＲＮＡは、１００～２００ヌクレオチドの長さである、項目７に記載の方法。
［項目９］
前記ＲＮＡは、１４０～１５０ヌクレオチドの長さである、項目８に記載の方法。
［項目１０］
前記ＲＮＡの前記ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
［項目１１］
前記ＲＮＡの前記ガイド配列は、１５～２５ヌクレオチドの長さである、項目１０に記載の方法。
［項目１２］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは逆位反復配列を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［項目１３］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、少なくとも部分的な回文配列を含み、少なくとも部分的な前記回文配列は、ヘアピン又は不完全なヘアピンを形成可能である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子からの右端の不完全な回文配列からの配列を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項目１５］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子の右端の配列からの配列を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項目１６］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、前記ＴｎｐＢタンパク質をコードする遺伝子を含む挿入配列の前記右端からの配列を含む、項目１４又は項目１５に記載の方法。
［項目１７］
前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：２を含む配列を含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８］
前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含み、前記ＴｎｐＢタンパク質は配列番号：１を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１９］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
［項目２０］
前記ポリヌクレオチドは、二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフを含む、項目１９に記載の方法。
［項目２１］
前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、前記二本鎖ＤＮＡの非標的鎖を指す前記標的配列の５'に位置する、項目２０に記載の方法。
［項目２２］
前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、２～６ヌクレオチドの長さである、項目２０又は項目２１に記載の方法。
［項目２３］
前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴである、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
［項目２４］
前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴであり、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、項目２３に記載の方法。
［項目２５］
前記ポリヌクレオチドは、スーパーコイル状の、リラックスした、又はほどかれた二本鎖ＤＮＡである、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
［項目２６］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡであり、前記二本鎖ＤＮＡの切断は段違い二本鎖切断部を産生する、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
［項目２７］
前記段違い二本鎖切断部は５'オーバーハングを有する、項目２６に記載の方法。
［項目２８］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡであり、前記二本鎖ＤＮＡを切断して平滑端二本鎖切断部を産生する、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
［項目２９］
前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドは染色体ＤＮＡである、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
［項目３０］
前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドは、染色体外ＤＮＡである、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
［項目３１］
前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
［項目３２］
前記方法はインビボの方法である、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項目３３］
前記方法はエクスビボの方法である、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項目３４］
前記方法はインビトロの方法である、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項目３５］
前記ポリヌクレオチドは細胞内にある、項目１から３４のいずれか一項に記載の方法。
［項目３６］
前記細胞は原核細胞である、項目３５に記載の方法。
［項目３７］
前記細胞は真核細胞である、項目３５に記載の方法。
［項目３８］
前記細胞は非ヒト動物細胞である、項目３７に記載の方法。
［項目３９］
前記細胞はヒト細胞である、項目３７に記載の方法。
［項目４０］
前記細胞は幹細胞である、項目３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
［項目４１］
前記幹細胞がヒト幹細胞であるとき、それは全能性幹細胞でない、項目４０に記載の方法。
［項目４２］
前記細胞は人工多能性幹細胞である、項目４０に記載の方法。
［項目４３］
前記細胞は植物細胞である、項目３７に記載の方法。
［項目４４］
前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ及び／又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナルを含む、項目１から４３のいずれか一項に記載の方法。
［項目４５］
前記接触は、細胞内に：（１）前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質、又は、前記タンパク質をコードする配列を含む第２ポリヌクレオチド配列；及び、（２）前記ＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードする配列を含む第３ポリヌクレオチド配列を導入することを含む、項目１から４４のいずれか一項に記載の方法。
［項目４６］
（１）及び（２）は、少なくとも１つのベクターにおいて前記細胞内に導入される、項目４５に記載の方法。
［項目４７］
前記少なくとも１つのベクターは、（１）を含む第１ベクター及び（２）を含む第２ベクターを含む、項目４６に記載の方法。
［項目４８］
前記少なくとも１つのベクターは、少なくとも１つの非ウイルスベクター、任意選択的に、プラスミド、又は、リポソーム又はエクソソームなどの非ウイルス粒子である、項目４６又は項目４７に記載の方法。
［項目４９］
前記少なくとも１つのベクターは、少なくとも１つのウイルスベクター、任意選択的に、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又は単純ヘルペスウイルスベクターである、項目４６又は項目４７に記載の方法。
［項目５０］
前記少なくとも１つのウイルスベクターはＡＡＶベクターである、項目４９に記載の方法。
［項目５１］
前記接触は、前記第２ポリヌクレオチド配列及び前記第３ポリヌクレオチド配列を前記細胞内に導入することを含み、ここで、前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質及び前記ＲＮＡは、前記細胞において発現される、項目４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
［項目５２］
前記第２ポリヌクレオチド配列は、前記タンパク質をコードする前記配列に動作可能に連結されて前記タンパク質の発現を制御する第１調節因子を含み、及び／又は、前記第３ポリヌクレオチド配列は、前記ＲＮＡをコードする前記配列に動作可能に連結されて前記ＲＮＡの発現を制御する第２調節因子を含む、項目４５から５１のいずれか一項に記載の方法。
［項目５３］
前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質及び前記ＲＮＡが、エフェクター複合体の形態で前記細胞内に導入される、項目４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
［項目５４］
前記細胞内への前記導入は、マイクロインジェクション又は電気穿孔によるものであり、任意選択的に、リポソームの使用と組み合わされる、項目４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
［項目５５］
前記細胞内への前記導入は、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション又はカチオン系ポリマートランスフェクションなどの化学ベーストランスフェクションである、項目４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
［項目５６］
前記接触は、前記切断されたポリヌクレオチドの非相同末端結合又は相同組換え修復を可能にする条件下で発生する、項目１から５５のいずれか一項に記載の方法。
［項目５７］
前記方法は更に、相同組換え修復のために前記ポリヌクレオチドをドナーポリヌクレオチドと接触させる段階を備える、項目５６に記載の方法。
［項目５８］
前記方法は、人体又は動物の体の治療の方法ではない、項目１から５７のいずれか一項に記載の方法。
［項目５９］
前記方法は、ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではない、項目１から５８のいずれか一項に記載の方法。
［項目６０］
前記方法は、産業上の目的のためのヒト胎児の使用ではない、項目１から５９のいずれか一項に記載の方法。
［項目６１］
エフェクター複合体をポリヌクレオチドにおける標的領域へガイドするためのＲＮＡであって、
（ｉ）前記ポリヌクレオチドの前記標的領域における標的配列にハイブリダイズすることが可能であるガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質に結合して前記エフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント
を備えるＲＮＡ。
［項目６２］
前記ＲＮＡは、５０～３００ヌクレオチドの長さである、項目６１に記載のＲＮＡ。
［項目６３］
前記ＲＮＡは、１００～２００ヌクレオチドの長さである、項目６２に記載のＲＮＡ。
［項目６４］
前記ＲＮＡは、１４０～１５０ヌクレオチドの長さである、項目６３に記載のＲＮＡ。
［項目６５］
前記ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである、項目６１から６４のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目６６］
前記ガイド配列は、１５～２５ヌクレオチドの長さである、項目６５に記載のＲＮＡ。
［項目６７］
前記タンパク質結合セグメントは逆位反復配列を含む、項目６１から６６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目６８］
前記タンパク質結合セグメントは、少なくとも部分的な回文配列を含み、少なくとも部分的な前記回文配列は、ヘアピン又は不完全なヘアピンを形成可能である、項目６１から６７のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目６９］
前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子からの右端不完全回文配列からの配列、又は、ＩＳ６０７ファミリーからの可動遺伝因子の右端からの配列を含む、項目６１から６８のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７０］
前記タンパク質結合セグメントは、前記ＴｎｐＢタンパク質をコードする遺伝子を含む挿入配列の前記右端からの配列を含む、項目６９に記載のＲＮＡ。
［項目７１］
前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、項目６１から７０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７２］
前記タンパク質結合セグメントが結合可能な前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目６１から７１のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７３］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目７２に記載のＲＮＡ。
［項目７４］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目７３に記載のＲＮＡ。
［項目７５］
タンパク質結合セグメントが結合可能な前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、それから成る、項目６１から７４のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７６］
前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：２を含み、前記タンパク質結合セグメントが結合可能なＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１を含む、項目６１から７５のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７７］
前記ガイド配列がハイブリダイズ可能な前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドはＤＮＡである、項目６１から７６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７８］
前記ガイド配列がハイブリダイズ可能な前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、項目６１から７６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７９］
単離ＲＮＡである、項目６１から７８のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目８０］
前記ＲＮＡは、設計された、天然に発生しないＲＮＡである、項目６１から７９のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目８１］
ポリヌクレオチドにおける標的領域に結合するためのエフェクター複合体であって、前記エフェクター複合体は、タンパク質及びＲＮＡを含み、ここで、前記タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質を含み、又は、それから成り、前記ＲＮＡは：
（ｉ）前記標的領域に含まれる標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント
を含む、エフェクター複合体。
［項目８２］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、項目８１に記載のエフェクター複合体。
［項目８３］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、項目８２に記載のエフェクター複合体。
［項目８４］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、項目８３に記載のエフェクター複合体。
［項目８５］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、それから成る、項目８１から８４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目８６］
前記ＲＮＡは項目６１から８０のいずれか一項において定義される、項目８１から８５のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目８７］
前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、項目８１から８６のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目８８］
前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナルを含み、及び／又は、前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の細胞膜透過ペプチドを含む、項目８１から８７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目８９］
前記エフェクター複合体は、前記ポリヌクレオチドの前記標的領域を改変するためのものである、項目８１から８８のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９０］
前記エフェクター複合体は、前記ＴｎｐＢタンパク質を用いて前記ポリヌクレオチドの前記標的領域を切断するためのものである、項目８１から８９のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９１］
前記エフェクター複合体は、不活性化されたヌクレアーゼドメインを有するＴｎｐＢタンパク質を含む、項目８１から８９のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９２］
前記標的領域の改変のための１又は複数のエフェクター分子を含む、項目８１から９１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９３］
１又は複数の前記エフェクター分子は、ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、及び逆転写酵素でないエンドヌクレアーゼから選択される、項目９２に記載のエフェクター複合体。
［項目９４］
前記ベースエディターは、デアミナーゼであり、任意選択的に、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼである、項目９３に記載のエフェクター複合体。
［項目９５］
前記エフェクター複合体は、シチジンデアミナーゼ及びウラシルグリコシラーゼインヒビターを含む、項目９４に記載のエフェクター複合体。
［項目９６］
前記標的領域の標識のために、１又は複数のエフェクター分子を含む、項目８１から９２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９７］
前記標識は蛍光タンパク質である、項目９６に記載のエフェクター複合体。
［項目９８］
前記標的領域の転写又は翻訳を増加又は減少させるための１又は複数のエフェクター分子を含む、項目８１から９１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９９］
１又は複数の前記エフェクター分子は１又は複数の転写活性化因子である、項目９８に記載のエフェクター複合体。
［項目１００］
１又は複数の前記エフェクター分子は、１又は複数の転写抑制因子である、項目９８のエフェクター複合体。
［項目１０１］
前記タンパク質は、前記ＴｎｐＢタンパク質及び前記１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質である、項目９２から１００のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１０２］
固体支持体に結合される、項目８１から１０１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１０３］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、項目８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１０４］
前記二本鎖ＤＮＡは、スーパーコイル状の、リラックスした、又はほどかれたものである、項目１０３に記載のエフェクター複合体。
［項目１０５］
前記ポリヌクレオチドは、前記二本鎖ＤＮＡの非標的鎖を指す、前記標的配列の５'に位置するＴｎｐＢ会合配列モチーフを含む、項目１０３又は項目１０４に記載のエフェクター複合体。
［項目１０６］
前記ポリヌクレオチドの前記ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、２～６ヌクレオチドの長さである、項目１０５に記載のエフェクター複合体。
［項目１０７］
前記ポリヌクレオチドの前記ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴである、項目１０５又は項目１０６に記載のエフェクター複合体。
［項目１０８］
前記ＴｎｐＢタンパク質は前記二本鎖ＤＮＡを切断して段違い二本鎖切断部を産生することが可能である、項目１０３から１０７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１０９］
前記段違い二本鎖切断部は、５'オーバーハングを有する、項目１０８に記載のエフェクター複合体。
［項目１１０］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記二本鎖ＤＮＡを切断して平滑端二本鎖切断部を産生することが可能である、項目１０３から１０７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１１］
前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、項目８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１２］
前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、項目８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１３］
単離されたエフェクター複合体である、項目８１から１１２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１４］
前記エフェクター複合体は、設計された、天然に発生しないエフェクター複合体である、項目８１から１１２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１５］
項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡを有するエフェクター複合体を形成するための融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質、及び、（ｉ）前記融合タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナル及び／又は細胞膜透過ペプチド、及び／又は、（ｉｉ）１又は複数のエフェクター分子を含む、融合タンパク質。
［項目１１６］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、項目１１５に記載の融合タンパク質。
［項目１１７］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、項目１１６に記載の融合タンパク質。
［項目１１８］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、項目１１７に記載の融合タンパク質。
［項目１１９］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、それから成る、項目１１５から１１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［項目１２０］
前記１又は複数のエフェクター分子は、ポリヌクレオチド内の標的領域を改変し、標識し、又は、前記標的領域の転写又は翻訳を増加又は減少させるためのものである、項目１１５から１１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［項目１２１］
前記１又は複数のエフェクター分子は、前記ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、標識、転写活性化因子、及び転写抑制因子でないエンドヌクレアーゼから選択される１又は複数である、項目１１５から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［項目１２２］
前記ベースエディターは、デアミナーゼであり、任意選択的に、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼである、項目１２１に記載の融合タンパク質。
［項目１２３］
シチジンデアミナーゼ及びウラシルグリコシラーゼインヒビターを含む、項目１２２に記載の融合タンパク質。
［項目１２４］
前記標識は、蛍光タンパク質又はレポーター酵素である、項目１２１に記載の融合タンパク質。
［項目１２５］
変異を含む変異ＴｎｐＢタンパク質であって、前記変異は、前記タンパク質のヌクレアーゼドメインを不活性するためのものであり、前記変異ＴｎｐＢタンパク質は、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡに結合するよう構成され、任意選択的に、前記変異ＴｎｐＢタンパク質は、項目１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質の前記ＴｎｐＢタンパク質である、変異ＴｎｐＢタンパク質。
［項目１２６］
項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
［項目１２７］
項目８２から８５のいずれか一項において定義され前記ＴｎｐＢタンパク質を含むタンパク質を更にコードし、又は、項目１２５の変異ＴｎｐＢタンパク質を含むタンパク質を更にコードする、項目１２６に記載のＤＮＡ。
［項目１２８］
項目１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を更にコードする、項目１２６に記載のＤＮＡ。
［項目１２９］
項目１１５から１２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
［項目１３０］
項目１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質をコードするＤＮＡ。
［項目１３１］
前記ＤＮＡは、設計された、天然に発生しないＤＮＡである、項目１２６から１３０のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
［項目１３２］
任意選択的に、プラスミド、又は、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである、項目１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む組み換え発現ベクター。
［項目１３３］
項目１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ、又は、項目１３２のいずれか一項に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞。
［項目１３４］
項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、項目１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、項目１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質、項目１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ、項目１３２に記載の組み換え発現ベクター、又は、項目１３３に記載の宿主細胞、及び緩衝液を備える組成物。
［項目１３５］
前記緩衝液は、医薬的に許容可能な緩衝液である、項目１３４に記載の組成物。
［項目１３６］
項目１２６から１２８のいずれか一項に記載のＤＮＡを発現する段階、又は、前記ＲＮＡを化学的に合成する段階を備える、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡを産生するインビトロ又はエクスビボの方法。
［項目１３７］
項目１２９又は１３０に記載のＤＮＡを発現する段階を備える、項目１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は、項目１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質を産生するインビトロ又はエクスビボの方法。
［項目１３８］
前記ＲＮＡを前記タンパク質と接触させて前記エフェクター複合体を形成する段階を備え、任意選択的に、前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質をコードするＤＮＡを発現する段階、及び、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡを発現する段階を備える、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体を産生するインビトロ又はエクスビボの方法。
［項目１３９］
前記方法は、細胞においてインビトロで実行される、項目１３６から１３８のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４０］
前記方法は、無細胞系においてインビトロで実行される、項目１３６から１３８のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４１］
前記方法は、産生された前記ＲＮＡ、産生された前記融合タンパク質、産生された前記変異ＴｎｐＢタンパク質、又は、産生された前記エフェクター複合体を精製する段階を備える、項目１３６から１４０のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４２］
ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変するためのシステムであって、前記標的領域は標的配列を含み、前記システムは：
ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む、又は、それから成るタンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、及び
ｂ）ＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ
を備え、前記ＲＮＡは：
（ｉ）前記標的配列に相補的である配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント
を含む、システム。
［項目１４３］
（ａ）前記タンパク質及び（ｂ）前記ＲＮＡを備える、項目１４２に記載のシステム。
［項目１４４］
（ａ）前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ、及び、（ｂ）前記ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを備える、項目１４２に記載のシステム。
［項目１４５］
（ａ）前記タンパク質をコードする前記ＲＮＡ、及び、（ｂ）前記ＲＮＡを備える、項目１４２に記載のシステム。
［項目１４６］
（ａ）前記タンパク質、（ｂ）前記ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを備える、項目１４２に記載のシステム。
［項目１４７］
前記ＲＮＡは、項目６１から８０のいずれか一項において定義される、項目１４２から１４６のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１４８］
前記タンパク質は、項目８２から８５のいずれか一項において定義される、項目１４２から１４７のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１４９］
前記タンパク質は、項目１１５から１２４のいずれか一項において定義される融合タンパク質である、項目１４２から１４７のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５０］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、不活性化ヌクレアーゼドメインを含む、項目１４２から１４９のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５１］
前記ポリヌクレオチドは、項目１９から２３又は２９から３１のいずれか一項において定義される、項目１４２から１５０のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５２］
（ａ）及び／又は（ｂ）は少なくとも１つのベクターに含まれる、項目１４２から１５１のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５３］
少なくとも１つの前記ベクターは、少なくとも１つの非ウイルスベクターである、項目１５２に記載のシステム。
［項目１５４］
少なくとも１つの前記非ウイルスベクターは、少なくとも１つのプラスミド、又は、リポソーム又はエクソソームなどの少なくとも１つの非ウイルス粒子である、項目１５３に記載のシステム。
［項目１５５］
少なくとも１つの前記ベクターは少なくとも１つのウイルスベクターである、項目１５２に記載のシステム。
［項目１５６］
少なくとも１つの前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又は、単純ヘルペスウイルスベクターから選択される、項目１５５に記載のシステム。
［項目１５７］
少なくとも１つの前記ウイルスベクターは、少なくとも１つのＡＡＶベクターである、項目１５６に記載のシステム。
［項目１５８］
前記システムは、設計された、天然に発生しないシステムである、項目１４２から１５７のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５９］
薬剤として使用するための、又は、診断において使用するための、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１６０］
対象における疾病を治療又は予防するための薬剤の製造のための、又は、対象における疾病の診断のための診断組成物の製造のための、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目１６１］
前記ＲＮＡは、項目８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義される前記タンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと組み合わせて使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目１６２］
前記ＲＮＡは、項目１１５から１２４のいずれか一項において定義される前記融合タンパク質、又は、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと組み合わせて使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目１６３］
項目８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義されるタンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡと共に使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、項目１２６に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
［項目１６４］
項目１１５から１２４のいずれか一項において定義される融合タンパク質、又は、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡと共に使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、項目１２６に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
［項目１６５］
薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するためのタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであって、前記タンパク質は、項目８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義され、前記ＤＮＡは、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡと共に使用される、ＤＮＡ又はＲＮＡ。
［項目１６６］
薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであって、前記融合タンパク質は、項目１１５から１２４のいずれか一項において定義され、前記ＤＮＡは、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡと共に使用される、ＤＮＡ又はＲＮＡ。
［項目１６７］
試料における標的配列を含むポリヌクレオチドの存在を判定するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目１６８］
標的配列を含むポリヌクレオチドの標的領域を改変するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目１６９］
細胞を遺伝子改変するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目１７０］
前記細胞は、項目３６から４３のいずれか一項において定義される、項目１６９に記載の使用。
［項目１７１］
対象において薬剤として使用される遺伝子改変細胞であって、前記遺伝子改変細胞は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステム、又は、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体を使用して、前記対象から取得される細胞を遺伝子改変する段階を備える方法によって取得される、遺伝子改変細胞。
［項目１７２］
前記方法は、前記対象から取得される前記細胞を培養して増やす段階を備える、項目１７１に記載の遺伝子改変細胞。
［項目１７３］
前記対象から取得される前記細胞は、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又はＴ細胞である、項目１７１及び項目１７２に記載の遺伝子改変細胞。
［項目１７４］
エフェクター複合体を用いて、ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変し、標識し、又は、前記標的領域からの発現を制御するための方法であって、前記標的領域は標的配列を含み、
前記エフェクター複合体は：（ｉ）項目８１から１１４のいずれかのエフェクター複合体であり；（ｉｉ）項目１１５から１２４のいずれかの融合タンパク質、及び、項目６１から８０のいずれかのＲＮＡを含み；又は、（ｉｉｉ）項目１２５の変異ＴｎｐＢタンパク質、又は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質を含む融合タンパク質、及び、項目６１から８０のいずれかのＲＮＡを含み、
前記方法は、前記ポリヌクレオチドを前記エフェクター複合体と接触させる段階を備え、前記ＲＮＡのガイド配列は、前記標的配列にハイブリダイズし、前記エフェクター複合体が前記標的領域を改変又は標識すること、又は、前記標的領域からの発現を制御することを可能にする、
方法。
［項目１７５］
前記エフェクター複合体は１又は複数のエフェクター分子を含む、項目１７４に記載の方法。
［項目１７６］
１又は複数の前記エフェクター分子は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、標識、転写活性化因子、及び転写抑制因子でないエンドヌクレアーゼから選択される１又は複数である、項目１７５に記載の方法。
［項目１７７］
前記エフェクター複合体は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質及び１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質を含む、項目１７４から１７６のいずれか一項に記載の方法。
［項目１７８］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、項目１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１７９］
前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、項目１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８０］
前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、項目１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８１］
前記方法はインビボ方法である、項目１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８２］
前記方法はエクスビボの方法である、項目１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８３］
前記方法はインビトロの方法である、項目１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８４］
前記ポリヌクレオチドは細胞内にある、項目１７４から１８３のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８５］
前記細胞は原核細胞である、項目１８４に記載の方法。
［項目１８６］
前記細胞は真核細胞である、項目１８４に記載の方法。
［項目１８７］
前記細胞は非ヒト動物細胞である、項目１８６に記載の方法。
［項目１８８］
前記細胞はヒト細胞である、項目１８６に記載の方法。
［項目１８９］
前記細胞は幹細胞である、項目１８６から１８８のいずれか一項に記載の方法。
［項目１９０］
前記幹細胞がヒト幹細胞であるとき、それは全能性幹細胞でない、項目１８９に記載の方法。
［項目１９１］
前記細胞は人工多能性幹細胞である、項目１８９に記載の方法。
［項目１９２］
前記細胞は植物細胞である、項目１８６に記載の方法。
［項目１９３］
前記方法は、エフェクター複合体を細胞内に導入する段階、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムを細胞内に導入する段階を備える、項目１７４から１９２のいずれか一項に記載の方法。
［項目１９４］
前記導入する段階は、電気穿孔又はマイクロインジェクションを含み、任意選択的に、リポソームの使用と組み合わせる、項目１９３に記載の方法。
［項目１９５］
前記細胞への前記導入は、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション又はカチオン系ポリマートランスフェクションなどの化学ベーストランスフェクションである、項目１９３に記載の方法。
［項目１９６］
前記細胞内への前記導入は、ウイルスベクターを用いる送達による、項目１９３に記載の方法。
［項目１９７］
前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、項目１９６に記載の方法。
［項目１９８］
前記方法は、人体又は動物の体の治療の方法でない、項目１７４から１９７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１９９］
前記方法は、ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法でない、項目１７４から１９８のいずれか一項に記載の方法。
［項目２００］
前記方法は、産業上の目的のためのヒト胎児の使用でない、項目１７４から１９９のいずれか一項に記載の方法。
［項目１］
エフェクター複合体を用いてポリヌクレオチドを切断するための方法であって、前記ポリヌクレオチドは標的配列を含み、前記エフェクター複合体は：
（ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質；及び
（ｂ）
（ｉ）前記標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＲＮＡが前記ＴｎｐＢタンパク質と結合して前記エフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント
を含む前記ＲＮＡ
を備え、ここで、前記方法は、前記ポリヌクレオチドを前記エフェクター複合体と接触させ、前記ＴｎｐＢタンパク質が前記ポリヌクレオチドを切断することを可能にする段階を備える
方法。
［項目２］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の方法。
［項目３］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目２に記載の方法。
［項目４］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの前記可動遺伝因子のＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目３に記載の方法。
［項目５］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ｔｎｐＢ遺伝子から取得された前記タンパク質の前記アミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する、項目２から４のいずれか一項に記載の方法。
［項目６］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はそれから成る、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
［項目７］
前記ＲＮＡは、５０～３００ヌクレオチドの長さである、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
［項目８］
前記ＲＮＡは、１００～２００ヌクレオチドの長さである、項目７に記載の方法。
［項目９］
前記ＲＮＡは、１４０～１５０ヌクレオチドの長さである、項目８に記載の方法。
［項目１０］
前記ＲＮＡの前記ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
［項目１１］
前記ＲＮＡの前記ガイド配列は、１５～２５ヌクレオチドの長さである、項目１０に記載の方法。
［項目１２］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは逆位反復配列を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
［項目１３］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、少なくとも部分的な回文配列を含み、少なくとも部分的な前記回文配列は、ヘアピン又は不完全なヘアピンを形成可能である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子からの右端の不完全な回文配列からの配列を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項目１５］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子の右端の配列からの配列を含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項目１６］
前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、前記ＴｎｐＢタンパク質をコードする遺伝子を含む挿入配列の前記右端からの配列を含む、項目１４又は項目１５に記載の方法。
［項目１７］
前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：２を含む配列を含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８］
前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含み、前記ＴｎｐＢタンパク質は配列番号：１を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１９］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
［項目２０］
前記ポリヌクレオチドは、二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフを含む、項目１９に記載の方法。
［項目２１］
前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、前記二本鎖ＤＮＡの非標的鎖を指す前記標的配列の５'に位置する、項目２０に記載の方法。
［項目２２］
前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、２～６ヌクレオチドの長さである、項目２０又は項目２１に記載の方法。
［項目２３］
前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴである、項目２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
［項目２４］
前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴであり、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、項目２３に記載の方法。
［項目２５］
前記ポリヌクレオチドは、スーパーコイル状の、リラックスした、又はほどかれた二本鎖ＤＮＡである、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
［項目２６］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡであり、前記二本鎖ＤＮＡの切断は段違い二本鎖切断部を産生する、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
［項目２７］
前記段違い二本鎖切断部は５'オーバーハングを有する、項目２６に記載の方法。
［項目２８］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡであり、前記二本鎖ＤＮＡを切断して平滑端二本鎖切断部を産生する、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
［項目２９］
前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドは染色体ＤＮＡである、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
［項目３０］
前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドは、染色体外ＤＮＡである、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
［項目３１］
前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
［項目３２］
前記方法はインビボの方法である、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項目３３］
前記方法はエクスビボの方法である、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項目３４］
前記方法はインビトロの方法である、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
［項目３５］
前記ポリヌクレオチドは細胞内にある、項目１から３４のいずれか一項に記載の方法。
［項目３６］
前記細胞は原核細胞である、項目３５に記載の方法。
［項目３７］
前記細胞は真核細胞である、項目３５に記載の方法。
［項目３８］
前記細胞は非ヒト動物細胞である、項目３７に記載の方法。
［項目３９］
前記細胞はヒト細胞である、項目３７に記載の方法。
［項目４０］
前記細胞は幹細胞である、項目３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
［項目４１］
前記幹細胞がヒト幹細胞であるとき、それは全能性幹細胞でない、項目４０に記載の方法。
［項目４２］
前記細胞は人工多能性幹細胞である、項目４０に記載の方法。
［項目４３］
前記細胞は植物細胞である、項目３７に記載の方法。
［項目４４］
前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ及び／又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナルを含む、項目１から４３のいずれか一項に記載の方法。
［項目４５］
前記接触は、細胞内に：（１）前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質、又は、前記タンパク質をコードする配列を含む第２ポリヌクレオチド配列；及び、（２）前記ＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードする配列を含む第３ポリヌクレオチド配列を導入することを含む、項目１から４４のいずれか一項に記載の方法。
［項目４６］
（１）及び（２）は、少なくとも１つのベクターにおいて前記細胞内に導入される、項目４５に記載の方法。
［項目４７］
前記少なくとも１つのベクターは、（１）を含む第１ベクター及び（２）を含む第２ベクターを含む、項目４６に記載の方法。
［項目４８］
前記少なくとも１つのベクターは、少なくとも１つの非ウイルスベクター、任意選択的に、プラスミド、又は、リポソーム又はエクソソームなどの非ウイルス粒子である、項目４６又は項目４７に記載の方法。
［項目４９］
前記少なくとも１つのベクターは、少なくとも１つのウイルスベクター、任意選択的に、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又は単純ヘルペスウイルスベクターである、項目４６又は項目４７に記載の方法。
［項目５０］
前記少なくとも１つのウイルスベクターはＡＡＶベクターである、項目４９に記載の方法。
［項目５１］
前記接触は、前記第２ポリヌクレオチド配列及び前記第３ポリヌクレオチド配列を前記細胞内に導入することを含み、ここで、前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質及び前記ＲＮＡは、前記細胞において発現される、項目４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
［項目５２］
前記第２ポリヌクレオチド配列は、前記タンパク質をコードする前記配列に動作可能に連結されて前記タンパク質の発現を制御する第１調節因子を含み、及び／又は、前記第３ポリヌクレオチド配列は、前記ＲＮＡをコードする前記配列に動作可能に連結されて前記ＲＮＡの発現を制御する第２調節因子を含む、項目４５から５１のいずれか一項に記載の方法。
［項目５３］
前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質及び前記ＲＮＡが、エフェクター複合体の形態で前記細胞内に導入される、項目４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
［項目５４］
前記細胞内への前記導入は、マイクロインジェクション又は電気穿孔によるものであり、任意選択的に、リポソームの使用と組み合わされる、項目４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
［項目５５］
前記細胞内への前記導入は、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション又はカチオン系ポリマートランスフェクションなどの化学ベーストランスフェクションである、項目４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
［項目５６］
前記接触は、前記切断されたポリヌクレオチドの非相同末端結合又は相同組換え修復を可能にする条件下で発生する、項目１から５５のいずれか一項に記載の方法。
［項目５７］
前記方法は更に、相同組換え修復のために前記ポリヌクレオチドをドナーポリヌクレオチドと接触させる段階を備える、項目５６に記載の方法。
［項目５８］
前記方法は、人体又は動物の体の治療の方法ではない、項目１から５７のいずれか一項に記載の方法。
［項目５９］
前記方法は、ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではない、項目１から５８のいずれか一項に記載の方法。
［項目６０］
前記方法は、産業上の目的のためのヒト胎児の使用ではない、項目１から５９のいずれか一項に記載の方法。
［項目６１］
エフェクター複合体をポリヌクレオチドにおける標的領域へガイドするためのＲＮＡであって、
（ｉ）前記ポリヌクレオチドの前記標的領域における標的配列にハイブリダイズすることが可能であるガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質に結合して前記エフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント
を備えるＲＮＡ。
［項目６２］
前記ＲＮＡは、５０～３００ヌクレオチドの長さである、項目６１に記載のＲＮＡ。
［項目６３］
前記ＲＮＡは、１００～２００ヌクレオチドの長さである、項目６２に記載のＲＮＡ。
［項目６４］
前記ＲＮＡは、１４０～１５０ヌクレオチドの長さである、項目６３に記載のＲＮＡ。
［項目６５］
前記ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである、項目６１から６４のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目６６］
前記ガイド配列は、１５～２５ヌクレオチドの長さである、項目６５に記載のＲＮＡ。
［項目６７］
前記タンパク質結合セグメントは逆位反復配列を含む、項目６１から６６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目６８］
前記タンパク質結合セグメントは、少なくとも部分的な回文配列を含み、少なくとも部分的な前記回文配列は、ヘアピン又は不完全なヘアピンを形成可能である、項目６１から６７のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目６９］
前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子からの右端不完全回文配列からの配列、又は、ＩＳ６０７ファミリーからの可動遺伝因子の右端からの配列を含む、項目６１から６８のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７０］
前記タンパク質結合セグメントは、前記ＴｎｐＢタンパク質をコードする遺伝子を含む挿入配列の前記右端からの配列を含む、項目６９に記載のＲＮＡ。
［項目７１］
前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、項目６１から７０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７２］
前記タンパク質結合セグメントが結合可能な前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目６１から７１のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７３］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目７２に記載のＲＮＡ。
［項目７４］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、項目７３に記載のＲＮＡ。
［項目７５］
タンパク質結合セグメントが結合可能な前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、それから成る、項目６１から７４のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７６］
前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：２を含み、前記タンパク質結合セグメントが結合可能なＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１を含む、項目６１から７５のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７７］
前記ガイド配列がハイブリダイズ可能な前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドはＤＮＡである、項目６１から７６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７８］
前記ガイド配列がハイブリダイズ可能な前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、項目６１から７６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目７９］
単離ＲＮＡである、項目６１から７８のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目８０］
前記ＲＮＡは、設計された、天然に発生しないＲＮＡである、項目６１から７９のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目８１］
ポリヌクレオチドにおける標的領域に結合するためのエフェクター複合体であって、前記エフェクター複合体は、タンパク質及びＲＮＡを含み、ここで、前記タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質を含み、又は、それから成り、前記ＲＮＡは：
（ｉ）前記標的領域に含まれる標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント
を含む、エフェクター複合体。
［項目８２］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、項目８１に記載のエフェクター複合体。
［項目８３］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、項目８２に記載のエフェクター複合体。
［項目８４］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、項目８３に記載のエフェクター複合体。
［項目８５］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、それから成る、項目８１から８４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目８６］
前記ＲＮＡは項目６１から８０のいずれか一項において定義される、項目８１から８５のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目８７］
前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、項目８１から８６のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目８８］
前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナルを含み、及び／又は、前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の細胞膜透過ペプチドを含む、項目８１から８７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目８９］
前記エフェクター複合体は、前記ポリヌクレオチドの前記標的領域を改変するためのものである、項目８１から８８のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９０］
前記エフェクター複合体は、前記ＴｎｐＢタンパク質を用いて前記ポリヌクレオチドの前記標的領域を切断するためのものである、項目８１から８９のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９１］
前記エフェクター複合体は、不活性化されたヌクレアーゼドメインを有するＴｎｐＢタンパク質を含む、項目８１から８９のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９２］
前記標的領域の改変のための１又は複数のエフェクター分子を含む、項目８１から９１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９３］
１又は複数の前記エフェクター分子は、ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、及び逆転写酵素でないエンドヌクレアーゼから選択される、項目９２に記載のエフェクター複合体。
［項目９４］
前記ベースエディターは、デアミナーゼであり、任意選択的に、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼである、項目９３に記載のエフェクター複合体。
［項目９５］
前記エフェクター複合体は、シチジンデアミナーゼ及びウラシルグリコシラーゼインヒビターを含む、項目９４に記載のエフェクター複合体。
［項目９６］
前記標的領域の標識のために、１又は複数のエフェクター分子を含む、項目８１から９２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９７］
前記標識は蛍光タンパク質である、項目９６に記載のエフェクター複合体。
［項目９８］
前記標的領域の転写又は翻訳を増加又は減少させるための１又は複数のエフェクター分子を含む、項目８１から９１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目９９］
１又は複数の前記エフェクター分子は１又は複数の転写活性化因子である、項目９８に記載のエフェクター複合体。
［項目１００］
１又は複数の前記エフェクター分子は、１又は複数の転写抑制因子である、項目９８のエフェクター複合体。
［項目１０１］
前記タンパク質は、前記ＴｎｐＢタンパク質及び前記１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質である、項目９２から１００のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１０２］
固体支持体に結合される、項目８１から１０１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１０３］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、項目８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１０４］
前記二本鎖ＤＮＡは、スーパーコイル状の、リラックスした、又はほどかれたものである、項目１０３に記載のエフェクター複合体。
［項目１０５］
前記ポリヌクレオチドは、前記二本鎖ＤＮＡの非標的鎖を指す、前記標的配列の５'に位置するＴｎｐＢ会合配列モチーフを含む、項目１０３又は項目１０４に記載のエフェクター複合体。
［項目１０６］
前記ポリヌクレオチドの前記ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、２～６ヌクレオチドの長さである、項目１０５に記載のエフェクター複合体。
［項目１０７］
前記ポリヌクレオチドの前記ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴである、項目１０５又は項目１０６に記載のエフェクター複合体。
［項目１０８］
前記ＴｎｐＢタンパク質は前記二本鎖ＤＮＡを切断して段違い二本鎖切断部を産生することが可能である、項目１０３から１０７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１０９］
前記段違い二本鎖切断部は、５'オーバーハングを有する、項目１０８に記載のエフェクター複合体。
［項目１１０］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記二本鎖ＤＮＡを切断して平滑端二本鎖切断部を産生することが可能である、項目１０３から１０７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１１］
前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、項目８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１２］
前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、項目８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１３］
単離されたエフェクター複合体である、項目８１から１１２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１４］
前記エフェクター複合体は、設計された、天然に発生しないエフェクター複合体である、項目８１から１１２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
［項目１１５］
項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡを有するエフェクター複合体を形成するための融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質、及び、（ｉ）前記融合タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナル及び／又は細胞膜透過ペプチド、及び／又は、（ｉｉ）１又は複数のエフェクター分子を含む、融合タンパク質。
［項目１１６］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、項目１１５に記載の融合タンパク質。
［項目１１７］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、項目１１６に記載の融合タンパク質。
［項目１１８］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、項目１１７に記載の融合タンパク質。
［項目１１９］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、それから成る、項目１１５から１１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［項目１２０］
前記１又は複数のエフェクター分子は、ポリヌクレオチド内の標的領域を改変し、標識し、又は、前記標的領域の転写又は翻訳を増加又は減少させるためのものである、項目１１５から１１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［項目１２１］
前記１又は複数のエフェクター分子は、前記ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、標識、転写活性化因子、及び転写抑制因子でないエンドヌクレアーゼから選択される１又は複数である、項目１１５から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
［項目１２２］
前記ベースエディターは、デアミナーゼであり、任意選択的に、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼである、項目１２１に記載の融合タンパク質。
［項目１２３］
シチジンデアミナーゼ及びウラシルグリコシラーゼインヒビターを含む、項目１２２に記載の融合タンパク質。
［項目１２４］
前記標識は、蛍光タンパク質又はレポーター酵素である、項目１２１に記載の融合タンパク質。
［項目１２５］
変異を含む変異ＴｎｐＢタンパク質であって、前記変異は、前記タンパク質のヌクレアーゼドメインを不活性するためのものであり、前記変異ＴｎｐＢタンパク質は、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡに結合するよう構成され、任意選択的に、前記変異ＴｎｐＢタンパク質は、項目１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質の前記ＴｎｐＢタンパク質である、変異ＴｎｐＢタンパク質。
［項目１２６］
項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
［項目１２７］
項目８２から８５のいずれか一項において定義され前記ＴｎｐＢタンパク質を含むタンパク質を更にコードし、又は、項目１２５の変異ＴｎｐＢタンパク質を含むタンパク質を更にコードする、項目１２６に記載のＤＮＡ。
［項目１２８］
項目１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を更にコードする、項目１２６に記載のＤＮＡ。
［項目１２９］
項目１１５から１２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
［項目１３０］
項目１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質をコードするＤＮＡ。
［項目１３１］
前記ＤＮＡは、設計された、天然に発生しないＤＮＡである、項目１２６から１３０のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
［項目１３２］
任意選択的に、プラスミド、又は、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである、項目１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む組み換え発現ベクター。
［項目１３３］
項目１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ、又は、項目１３２のいずれか一項に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞。
［項目１３４］
項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、項目１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、項目１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質、項目１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ、項目１３２に記載の組み換え発現ベクター、又は、項目１３３に記載の宿主細胞、及び緩衝液を備える組成物。
［項目１３５］
前記緩衝液は、医薬的に許容可能な緩衝液である、項目１３４に記載の組成物。
［項目１３６］
項目１２６から１２８のいずれか一項に記載のＤＮＡを発現する段階、又は、前記ＲＮＡを化学的に合成する段階を備える、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡを産生するインビトロ又はエクスビボの方法。
［項目１３７］
項目１２９又は１３０に記載のＤＮＡを発現する段階を備える、項目１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は、項目１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質を産生するインビトロ又はエクスビボの方法。
［項目１３８］
前記ＲＮＡを前記タンパク質と接触させて前記エフェクター複合体を形成する段階を備え、任意選択的に、前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質をコードするＤＮＡを発現する段階、及び、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡを発現する段階を備える、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体を産生するインビトロ又はエクスビボの方法。
［項目１３９］
前記方法は、細胞においてインビトロで実行される、項目１３６から１３８のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４０］
前記方法は、無細胞系においてインビトロで実行される、項目１３６から１３８のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４１］
前記方法は、産生された前記ＲＮＡ、産生された前記融合タンパク質、産生された前記変異ＴｎｐＢタンパク質、又は、産生された前記エフェクター複合体を精製する段階を備える、項目１３６から１４０のいずれか一項に記載の方法。
［項目１４２］
ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変するためのシステムであって、前記標的領域は標的配列を含み、前記システムは：
ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む、又は、それから成るタンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、及び
ｂ）ＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ
を備え、前記ＲＮＡは：
（ｉ）前記標的配列に相補的である配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント
を含む、システム。
［項目１４３］
（ａ）前記タンパク質及び（ｂ）前記ＲＮＡを備える、項目１４２に記載のシステム。
［項目１４４］
（ａ）前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ、及び、（ｂ）前記ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを備える、項目１４２に記載のシステム。
［項目１４５］
（ａ）前記タンパク質をコードする前記ＲＮＡ、及び、（ｂ）前記ＲＮＡを備える、項目１４２に記載のシステム。
［項目１４６］
（ａ）前記タンパク質、（ｂ）前記ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを備える、項目１４２に記載のシステム。
［項目１４７］
前記ＲＮＡは、項目６１から８０のいずれか一項において定義される、項目１４２から１４６のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１４８］
前記タンパク質は、項目８２から８５のいずれか一項において定義される、項目１４２から１４７のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１４９］
前記タンパク質は、項目１１５から１２４のいずれか一項において定義される融合タンパク質である、項目１４２から１４７のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５０］
前記ＴｎｐＢタンパク質は、不活性化ヌクレアーゼドメインを含む、項目１４２から１４９のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５１］
前記ポリヌクレオチドは、項目１９から２３又は２９から３１のいずれか一項において定義される、項目１４２から１５０のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５２］
（ａ）及び／又は（ｂ）は少なくとも１つのベクターに含まれる、項目１４２から１５１のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５３］
少なくとも１つの前記ベクターは、少なくとも１つの非ウイルスベクターである、項目１５２に記載のシステム。
［項目１５４］
少なくとも１つの前記非ウイルスベクターは、少なくとも１つのプラスミド、又は、リポソーム又はエクソソームなどの少なくとも１つの非ウイルス粒子である、項目１５３に記載のシステム。
［項目１５５］
少なくとも１つの前記ベクターは少なくとも１つのウイルスベクターである、項目１５２に記載のシステム。
［項目１５６］
少なくとも１つの前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又は、単純ヘルペスウイルスベクターから選択される、項目１５５に記載のシステム。
［項目１５７］
少なくとも１つの前記ウイルスベクターは、少なくとも１つのＡＡＶベクターである、項目１５６に記載のシステム。
［項目１５８］
前記システムは、設計された、天然に発生しないシステムである、項目１４２から１５７のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１５９］
薬剤として使用するための、又は、診断において使用するための、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステム。
［項目１６０］
対象における疾病を治療又は予防するための薬剤の製造のための、又は、対象における疾病の診断のための診断組成物の製造のための、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目１６１］
前記ＲＮＡは、項目８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義される前記タンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと組み合わせて使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目１６２］
前記ＲＮＡは、項目１１５から１２４のいずれか一項において定義される前記融合タンパク質、又は、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと組み合わせて使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［項目１６３］
項目８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義されるタンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡと共に使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、項目１２６に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
［項目１６４］
項目１１５から１２４のいずれか一項において定義される融合タンパク質、又は、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡと共に使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、項目１２６に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。
［項目１６５］
薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するためのタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであって、前記タンパク質は、項目８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義され、前記ＤＮＡは、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡと共に使用される、ＤＮＡ又はＲＮＡ。
［項目１６６］
薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであって、前記融合タンパク質は、項目１１５から１２４のいずれか一項において定義され、前記ＤＮＡは、項目６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡと共に使用される、ＤＮＡ又はＲＮＡ。
［項目１６７］
試料における標的配列を含むポリヌクレオチドの存在を判定するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目１６８］
標的配列を含むポリヌクレオチドの標的領域を改変するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目１６９］
細胞を遺伝子改変するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。
［項目１７０］
前記細胞は、項目３６から４３のいずれか一項において定義される、項目１６９に記載の使用。
［項目１７１］
対象において薬剤として使用される遺伝子改変細胞であって、前記遺伝子改変細胞は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステム、又は、項目８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体を使用して、前記対象から取得される細胞を遺伝子改変する段階を備える方法によって取得される、遺伝子改変細胞。
［項目１７２］
前記方法は、前記対象から取得される前記細胞を培養して増やす段階を備える、項目１７１に記載の遺伝子改変細胞。
［項目１７３］
前記対象から取得される前記細胞は、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又はＴ細胞である、項目１７１及び項目１７２に記載の遺伝子改変細胞。
［項目１７４］
エフェクター複合体を用いて、ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変し、標識し、又は、前記標的領域からの発現を制御するための方法であって、前記標的領域は標的配列を含み、
前記エフェクター複合体は：（ｉ）項目８１から１１４のいずれかのエフェクター複合体であり；（ｉｉ）項目１１５から１２４のいずれかの融合タンパク質、及び、項目６１から８０のいずれかのＲＮＡを含み；又は、（ｉｉｉ）項目１２５の変異ＴｎｐＢタンパク質、又は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質を含む融合タンパク質、及び、項目６１から８０のいずれかのＲＮＡを含み、
前記方法は、前記ポリヌクレオチドを前記エフェクター複合体と接触させる段階を備え、前記ＲＮＡのガイド配列は、前記標的配列にハイブリダイズし、前記エフェクター複合体が前記標的領域を改変又は標識すること、又は、前記標的領域からの発現を制御することを可能にする、
方法。
［項目１７５］
前記エフェクター複合体は１又は複数のエフェクター分子を含む、項目１７４に記載の方法。
［項目１７６］
１又は複数の前記エフェクター分子は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、標識、転写活性化因子、及び転写抑制因子でないエンドヌクレアーゼから選択される１又は複数である、項目１７５に記載の方法。
［項目１７７］
前記エフェクター複合体は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質及び１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質を含む、項目１７４から１７６のいずれか一項に記載の方法。
［項目１７８］
前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、項目１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１７９］
前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、項目１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８０］
前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、項目１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８１］
前記方法はインビボ方法である、項目１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８２］
前記方法はエクスビボの方法である、項目１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８３］
前記方法はインビトロの方法である、項目１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８４］
前記ポリヌクレオチドは細胞内にある、項目１７４から１８３のいずれか一項に記載の方法。
［項目１８５］
前記細胞は原核細胞である、項目１８４に記載の方法。
［項目１８６］
前記細胞は真核細胞である、項目１８４に記載の方法。
［項目１８７］
前記細胞は非ヒト動物細胞である、項目１８６に記載の方法。
［項目１８８］
前記細胞はヒト細胞である、項目１８６に記載の方法。
［項目１８９］
前記細胞は幹細胞である、項目１８６から１８８のいずれか一項に記載の方法。
［項目１９０］
前記幹細胞がヒト幹細胞であるとき、それは全能性幹細胞でない、項目１８９に記載の方法。
［項目１９１］
前記細胞は人工多能性幹細胞である、項目１８９に記載の方法。
［項目１９２］
前記細胞は植物細胞である、項目１８６に記載の方法。
［項目１９３］
前記方法は、エフェクター複合体を細胞内に導入する段階、又は、項目１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムを細胞内に導入する段階を備える、項目１７４から１９２のいずれか一項に記載の方法。
［項目１９４］
前記導入する段階は、電気穿孔又はマイクロインジェクションを含み、任意選択的に、リポソームの使用と組み合わせる、項目１９３に記載の方法。
［項目１９５］
前記細胞への前記導入は、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション又はカチオン系ポリマートランスフェクションなどの化学ベーストランスフェクションである、項目１９３に記載の方法。
［項目１９６］
前記細胞内への前記導入は、ウイルスベクターを用いる送達による、項目１９３に記載の方法。
［項目１９７］
前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、項目１９６に記載の方法。
［項目１９８］
前記方法は、人体又は動物の体の治療の方法でない、項目１７４から１９７のいずれか一項に記載の方法。
［項目１９９］
前記方法は、ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法でない、項目１７４から１９８のいずれか一項に記載の方法。
［項目２００］
前記方法は、産業上の目的のためのヒト胎児の使用でない、項目１７４から１９９のいずれか一項に記載の方法。
Claims (20)
- エフェクター複合体を用いてポリヌクレオチドを切断するための方法であって、前記ポリヌクレオチドは標的配列を含み、前記エフェクター複合体は：
（ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質；及び
（ｂ）
（ｉ）前記標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＲＮＡが前記ＴｎｐＢタンパク質と結合して前記エフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント
を含む前記ＲＮＡ
を備え、ここで、前記方法は、前記ポリヌクレオチドを前記エフェクター複合体と接触させ、前記ＴｎｐＢタンパク質が前記ポリヌクレオチドを切断することを可能にする段階を備える
方法。 - 前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の方法。
- 前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの前記可動遺伝因子のＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
- 前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ｔｎｐＢ遺伝子から取得された前記タンパク質の前記アミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はそれから成る、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡは、５０～３００ヌクレオチドの長さである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡの前記ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーの挿入配列の右端と、前記ＴｎｐＢタンパク質をコードする配列の一部とを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：１６を含む配列、又は配列番号：１６と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、トランスポゾン関連モチーフを含み、前記ポリヌクレオチドのトランスポゾン関連モチーフはＴＴＧＡＴである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは配列番号：１６、又は、配列番号：１６と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
- ポリヌクレオチドにおける標的領域に結合するためのエフェクター複合体であって、前記エフェクター複合体は、タンパク質及びＲＮＡを含み、ここで、前記タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質を含み、又は、それから成り、前記ＲＮＡは：
（ｉ）前記標的領域に含まれる標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント
を含む、エフェクター複合体。 - 前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、請求項１３に記載のエフェクター複合体。
- 前記エフェクター複合体は、不活性化されたヌクレアーゼドメインを有するＴｎｐＢタンパク質を含む、請求項１３または１４に記載のエフェクター複合体。
- 前記標的領域の改変のための１又は複数のエフェクター分子を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。
- １又は複数の前記エフェクター分子は、ＴｎｐＢタンパク質でないエンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、及び逆転写酵素から選択される、請求項１６に記載のエフェクター複合体。
- 前記タンパク質は、前記ＴｎｐＢタンパク質及び前記１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質である、請求項１６または１７に記載のエフェクター複合体。
- 変異を含む変異ＴｎｐＢタンパク質であって、前記変異は、前記タンパク質のヌクレアーゼドメインを不活性するためのものであり、前記変異ＴｎｐＢタンパク質は、エフェクター複合体をポリヌクレオチドの標的領域に誘導するためのＲＮＡに結合するよう構成され、
前記ＲＮＡは、
（ｉ）前記ポリヌクレオチドの前記標的領域の標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質と結合して前記エフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント；
を含む、変異ＴｎｐＢタンパク質。 - エフェクター複合体を用いて、ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変し、標識し、又は、前記標的領域からの発現を制御するための方法であって、前記標的領域は標的配列を含み、
前記エフェクター複合体は、請求項１３から１８のいずれか一項のエフェクター複合体であり、
前記方法は、前記ポリヌクレオチドを前記エフェクター複合体と接触させる段階を備え、前記ＲＮＡのガイド配列は、前記標的配列にハイブリダイズし、前記エフェクター複合体が前記標的領域を改変又は標識すること、又は、前記標的領域からの発現を制御することを可能にする、
方法。
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2021
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