本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には明白であろう。本開示から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換がここで当業者に想起されるであろう。本明細書に記載される本開示の実施形態に対する様々な代替案が、本開示の実施において用いられ得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の方法及び構造が、それらによって包含されることが意図される。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
［発明１］
低いデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を有し、遺伝子編集のためのＤＮＡポリメラーゼを含む細胞内で遺伝子編集効率を増加させる方法であって、前記方法が、
ベースラインｄＮＴＰ濃度と比較して、前記細胞内の前記ｄＮＴＰ濃度を増加させることを含む、方法。
［発明２］
前記細胞内の前記ｄＮＴＰ濃度を増加させることが、前記細胞内のデオキシヌクレオチド三リン酸トリホスホヒドロラーゼを阻害することを含む、発明１に記載の方法。
［発明３］
前記デオキシヌクレオチド三リン酸トリホスホヒドロラーゼが、ＳＡＭドメイン及びＨＤドメイン含有タンパク質１（ＳＡＭＨＤ１）を含む、発明２に記載の方法。
［発明４］
ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記ＳＡＭＨＤ１をＶｐｘタンパク質と接触させること、又は前記Ｖｐｘタンパク質を前記細胞内で発現させることを含む、発明３に記載の方法。
［発明５］
ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記ＳＡＭＨＤ１をＢＧＬＦ４タンパク質と接触させること、又は前記ＢＧＬＦ４タンパク質を前記細胞内で発現させることを含む、発明３に記載の方法。
［発明６］
ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記ＳＡＭＨＤ１をコードするｍＲＮＡを、前記ｍＲＮＡにハイブリダイズするマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡと接触させること、又は前記マイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡを前記細胞内で発現させることを含む、発明３に記載の方法。
［発明７］
ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記ＳＡＭＨＤ１を小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤と接触させることを含む、発明３に記載の方法。
［発明８］
前記細胞内の前記ｄＮＴＰ濃度を増加させることが、前記細胞にヌクレオシド又はヌクレオチドを投与することを含み、前記ヌクレオシド又はヌクレオチドが、任意選択的に、デオキシヌクレオシド（ｄＮ）、デオキシヌクレオシド一リン酸（ｄＮＭＰ）、又はヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含む、発明１に記載の方法。
［発明９］
前記細胞にヌクレオシド又はヌクレオチドを投与することが、前記細胞を含む対象に前記ヌクレオシド又はヌクレオチドを投与することを含む、発明８に記載の方法。
［発明１０］
前記投与が、経口であるか、又は注射による、発明９に記載の方法。
［発明１１］
前記細胞内の前記ｄＮＴＰ濃度を増加させることが、ｄＮＴＰ合成酵素を前記細胞に送達することを含む、発明１に記載の方法。
［発明１２］
前記ｄＮＴＰ合成酵素が、キナーゼを含む、発明１１に記載の方法。
［発明１３］
前記キナーゼが、ヌクレオシドキナーゼ、デオキシヌクレオシドキナーゼ、デオキシヌクレオシド一リン酸キナーゼ、又はデオキシヌクレオチド二リン酸キナーゼを含む、発明１２に記載の方法。
［発明１４］
前記ＤＮＡポリメラーゼが、逆転写酵素を含む、発明１に記載の方法。
［発明１５］
前記細胞が、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、又はそれらの組み合わせを更に含む、発明１に記載の方法。
［発明１６］
前記低いｄＮＴＰ濃度が、非分裂細胞内に見出されるｄＮＴＰ濃度を含む、発明１に記載の方法。
［発明１７］
前記低いｄＮＴＰ濃度が、活性化末梢血単核細胞内に見出されるｄＮＴＰ濃度未満である、発明１に記載の方法。
［発明１８］
前記低いｄＮＴＰ濃度が、１マイクロモル未満のｄＮＴＰ濃度を含む、発明１に記載の方法。
［発明１９］
前記ｄＮＴＰ濃度を前記増加させることが、前記ベースラインｄＮＴＰ測定値と比較して、前記ｄＮＴＰ濃度を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又はそれ以上、増加させることを含む、発明１に記載の方法。
［発明２０］
前記ｄＮＴＰ濃度が、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）濃度、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）濃度、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）濃度、若しくはデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）濃度、又はそれらの任意の組み合わせを含む、発明１～１９のいずれか一つに記載の方法。
［発明２１］
Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素を含む組成物であって、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素のうちの少なくとも一部が、別個のポリペプチド鎖に含まれ、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素が、Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体を形成する、組成物。
［発明２２］
前記Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体が、前記Ｃａｓニッカーゼに融合した第１のヘテロ二量体ドメインと、前記逆転写酵素に融合した第２のヘテロ二量体ドメインと、を含み、前記第１のヘテロ二量体ドメインが、前記第２のヘテロ二量体ドメインに結合して、前記Ｃａｓ－逆転写酵素ヘテロ二量体を形成する、発明２１に記載の組成物。
［発明２３］
前記第１のヘテロ二量体ドメインが、ロイシンジッパーであり、前記第２のヘテロ二量体ドメインが、ロイシンジッパーである、発明２２に記載の組成物。
［発明２４］
前記逆転写酵素が、配列番号３～配列番号２２若しくは配列番号４０～配列番号８０のうちのいずれか１つのものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、又はその断片を含む、発明２１～２３のいずれか一つに記載の組成物。
［発明２５］
前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓニッカーゼの一部に融合した非長末端反復レトロトランスポーザブル（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ）エレメントからのドメインを含む、発明２１～２４のいずれか一つに記載の組成物。
［発明２６］
前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓニッカーゼの一部に融合した細菌性グループＩＩイントロンからの配列を含む、発明２１～２４のいずれか一つに記載の組成物。
［発明２７］
前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓニッカーゼの一部に融合したレトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含む、発明２１～２４のいずれか一つに記載の組成物。
［発明２８］
Ｃａｓニッカーゼと、逆転写酵素と、ガイド核酸と、を含む、組成物であって、第１のポリペプチドが、前記Ｃａｓニッカーゼを含み、第２のポリペプチドが、前記逆転写酵素を含み、前記ガイド核酸が、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素に結合する、組成物。
［発明２９］
前記逆転写酵素が、ｍｃｐペプチドを含む、発明２１～２８のいずれか一つに記載の組成物。
［発明３０］
前記逆転写酵素が、ループ領域を含む、発明２１～２９のいずれか一つに記載の組成物。
［発明３１］
前記ループ領域が、２ａループ又は３ａループである、発明３０に記載の組成物。
［発明３２］
前記ガイド核酸が、ＭＳ２ヘアピンを含む、発明２８～３１のいずれか一つに記載の組成物。
［発明３３］
配列番号３～配列番号２２若しくは配列番号４０～配列番号８０のうちのいずれか１つのものに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、又はＣａｓニッカーゼに融合したその断片を有する逆転写酵素を含む、組成物。
［発明３４］
Ｃａｓニッカーゼに融合した非長末端反復レトロトランスポーザブルエレメントからのドメインを含む逆転写酵素を含む、組成物。
［発明３５］
Ｃａｓニッカーゼに融合した細菌性グループＩＩイントロンからの配列を含む逆転写酵素を含む、組成物。
［発明３６］
Ｃａｓニッカーゼに融合したレトロウイルスｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質からのドメインを含む逆転写酵素を含む、組成物。
［発明３７］
Ｃａｓニッカーゼと、逆転写酵素と、を含む、組成物であって、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素が、別個のポリペプチド鎖を含み、前記Ｃａｓニッカーゼ及び逆転写酵素が、ヘテロ二量体化するように操作されていない、組成物。
［発明３８］
前記Ｃａｓニッカーゼと複合体を形成するガイド核酸を含み、複合体形成時に、前記Ｃａｓニッカーゼが、標的核酸中の標的部位に一本鎖切断を導入することができる、発明２１～３７のいずれか一つに記載の組成物。
［発明３９］
前記標的核酸が、ＣＦＴＲ核酸、ＵＳＨ２Ａ核酸、ＡＢＣＡ４核酸、ＡＴＰ７Ｂ核酸、又はＨＴＴ核酸を含む、発明２１～３８のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４０］
前記Ｃａｓニッカーゼ又は前記逆転写酵素に融合した核局在化シグナルを含む、発明２１～３９のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４１］
前記逆転写酵素が、切断された逆転写酵素である、発明２１～４０のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４２］
前記逆転写酵素が、天然の逆転写酵素と比較して増加した処理能力を有する、発明２１～４１のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４３］
前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴと比較して増加した処理能力を有する、発明２１～４２のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４４］
前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴと比較して標的配列におけるより長いウィンドウ長を編集する、発明２１～４３のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４５］
前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴと比較して減少した免疫原性を有する、発明２１～４４のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４６］
前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴと比較して細胞への送達が改善されている、発明２１～４５のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４７］
前記逆転写酵素が、単一の結合事象において、２０個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、６０個以上、８１個以上、１００個以上、５００個以上、又は１０００個以上のヌクレオチドを重合する、発明２１～４６のいずれか一つに記載の組成物。
［発明４８］
ガイド核酸であって、
標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、
Ｃａｓニッカーゼに結合するように構成された足場と、
前記標的核酸に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、
前記標的核酸の第２の領域に逆相補的な第１の鎖プライマー結合部位と、を含む、ガイド核酸。
［発明４９］
前記逆転写酵素鋳型の領域の配列を含む第２の鎖プライマーを更に含む、発明４８に記載のガイド核酸。
［発明５０］
前記標的核酸の前記第１の領域が、前記標的核酸の第１の鎖上にあり、前記標的核酸の前記第２の領域が、前記標的核酸の第２の鎖上にある、発明４８又は４９に記載のガイド核酸。
［発明５１］
前記標的核酸の前記第１の領域のうちの全て又は一部が、前記標的核酸の前記第２の領域のうちの全て又は一部に逆相補的である、発明４８～５０のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明５２］
前記ガイド核酸の３’末端に切断可能な配列を更に含む、発明４８～５１のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明５３］
前記切断可能な配列が、リボザイム切断可能な配列である、発明５２に記載のガイド核酸。
［発明５４］
前記切断可能な配列が、ｔＲＮＡ切断可能な配列である、発明５２に記載のガイド核酸。
［発明５５］
前記第１の鎖プライマー結合部位が、前記標的核酸の前記第２の領域にハイブリダイズするように構成され、前記逆転写酵素鋳型が、前記標的核酸の前記第２の領域の３’末端からの逆転写のための鋳型として機能するように構成される、発明４８～５４のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明５６］
前記第２の鎖プライマーが、前記逆転写酵素鋳型に逆相補的な鋳型からの転写のためのプライマーとして機能するように構成される、発明４８～５５のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明５７］
第１の合成鎖が、前記第２の鎖プライマーからの第２の鎖の合成のための鋳型として機能する、発明４８～５６のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明５８］
Ｖｅｌｃｒｏ結合部位にハイブリダイズするＶｅｌｃｒｏ領域を更に含む、発明４８～５７のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明５９］
前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位が、前記Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して１００％逆相補的であり、前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位が、前記Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、逆相補的であり、かつ／又は前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位が、前記Ｖｅｌｃｒｏ領域に対して、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９１％以下、９２％以下、９３％以下、９４％以下、９５％以下、９６％以下、９７％以下、９８％以下、９９％以下、逆相補的である、発明５８に記載のガイド核酸。
［発明６０］
前記逆転写酵素鋳型領域が、前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位を含む、発明５８又は５９に記載のガイド核酸。
［発明６１］
前記Ｖｅｌｃｒｏ結合部位が、前記第１の鎖プライマー結合部位の３’である、発明５８又は５９に記載のガイド核酸。
［発明６２］
前記Ｖｅｌｃｒｏ領域が、前記逆転写酵素鋳型の３’である、発明４８～６１のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明６３］
前記Ｖｅｌｃｒｏ領域が、前記足場の５’である、発明４８～６２のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明６４］
前記標的核酸が、ＣＦＴＲ核酸、ＵＳＨ２Ａ核酸、ＡＢＣＡ４核酸、ＡＴＰ７Ｂ核酸、又はＨＴＴ核酸を含む、発明４８～６３のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明６５］
前記スペーサーが、配列番号９６～１１９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％同一の核酸配列を含む、発明４８～６４のいずれか一つに記載のガイド核酸。
［発明６６］
発明２８～３２又は３７～６５のいずれか一つに記載のガイドを含む第１のガイド核酸、及び第２のガイド核酸を含む、組成物。
［発明６７］
前記第２のガイド核酸が、発明２８、３２若しくは３７、又は４８～６５のいずれか一つに記載のガイド核酸を含む、発明６６に記載の組成物。
［発明６８］
前記第２のガイド核酸の前記逆転写酵素鋳型が、前記第１のガイド核酸の前記逆転写酵素鋳型のうちの少なくとも一部に相補的（又は少なくとも部分的に相補的）である、発明６７に記載の組成物。
［発明６９］
前記第１のガイド核酸が、第１のＣａｓニッカーゼに結合し、前記第２のガイド核酸が、第２のＣａｓニッカーゼに結合する、発明６６～６８のいずれか一つに記載の組成物。
［発明７０］
前記第１のガイド核酸の第１のスペーサーが、第１のＣａｓニッカーゼに結合し、前記第２のガイド核酸の第２のスペーサーが、第２のＣａｓニッカーゼに結合し、前記第１のガイド核酸の第１の足場が、前記第２のＣａｓニッカーゼに結合し、前記第２のガイド核酸の第２の足場が、前記第１のＣａｓニッカーゼに結合する、発明６６～６８のいずれか一つに記載の組成物。
［発明７１］
前記第１のガイド核酸が、第１のリンカーを含み、前記第２のガイド核酸が、第２のリンカーを含み、前記第１のリンカーが、前記第２のリンカーにハイブリダイズする、発明６６～６８又は７０のいずれか一つに記載の組成物。
［発明７２］
発明２１～４７若しくは６６～７１のいずれか一つに記載の組成物、又は発明３８～４５のいずれか一つに記載のガイド核酸を発現する細胞に、Ｏｒｆ１ｐを送達することを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法。
［発明７３］
発明２１～４７若しくは６６～７１のいずれか一つに記載の組成物をコードするか、又は発明４８～６５のいずれか一つに記載のガイド核酸を含む、１つ以上の核酸。
［発明７４］
発明７３に記載の核酸を含む、ウイルスベクター。
［発明７５］
発明２１～４７若しくは６６～７１のいずれか一つに記載の組成物、発明４８～６５のいずれか一つに記載のガイド核酸、発明７３に記載の核酸、又は発明７４に記載のウイルスベクターを含む、細胞。
［発明７６］
前記細胞が、原核細胞である、発明７２に記載の方法又は発明７５に記載の細胞。
［発明７７］
前記細胞が、真核細胞である、発明７２に記載の方法又は発明７５に記載の細胞。
［発明７８］
細胞内でＶｐｘタンパク質を発現させることを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法。
［発明７９］
前記細胞が、発明２１～４７若しくは６６～７１のいずれか一つに記載の組成物、又は発明４８～６５のいずれか一つに記載のガイド核酸を発現する、発明７８に記載の方法。
［発明８０］
細胞内のｄＮＴＰ濃度を増加させることによってゲノム編集効率を増加させる方法、例えば、細胞内のＳＡＭＨＤ１を阻害することを含む、ゲノム編集効率を増加させる方法。
［発明８１］
前記細胞が、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼ、逆転写酵素、及びガイド核酸を発現する、発明８０に記載の方法。
［発明８２］
ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記細胞内でＶｐｘタンパク質を発現させることを含む、発明８０又は８１に記載の方法。
［発明８３］
ＳＡＭＨＤ１を阻害することが、前記細胞内でＳＡＭＨＤ１に対するマイクロＲＮＡを発現させることを含むか、又は前記細胞を小分子ＳＡＭＨＤ１阻害剤で処理することを含む、発明８０又は８１に記載の方法。
［発明８４］
インテイン触媒作用を可能にするか、又は改善する１つ以上の点変異又は挿入変異を含む、Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼを含む、組成物。
［発明８５］
前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端半分に位置する点変異若しくは挿入変異を含むか、又は前記点変異若しくは挿入変異が、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのアミノ酸位置５７４の後の任意の場所に位置する、発明８４に記載の組成物。
［発明８６］
前記点変異が、システイン点変異、セリン点変異、スレオニン点変異、若しくはアラニン点変異を含むか、又は前記挿入変異が、システイン挿入変異、セリン挿入変異、スレオニン挿入変異、若しくはアラニン挿入変異を含む、発明８５に記載の組成物。
［発明８７］
前記点変異が、システイン点変異を含むか、又は前記挿入変異が、システイン挿入変異を含む、発明８５に記載の組成物。
［発明８８］
前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ニッカーゼである、発明８４～８７のいずれか一つに記載の組成物。
［発明８９］
前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、発明８４～８８のいずれか一つに記載の組成物。
［発明９０］
前記点変異が、前記Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、若しくはＲ１２１２に位置するか、又は前記挿入変異が、前記Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のＤ１０７９、Ｄ１１２５、Ｄ１１３０、Ｇ１１３３、Ａ１１４０、Ｉ１１６８、Ｓ１１７３、Ｄ１１８０、Ｇ１１８６、Ｌ１２０３、若しくはＲ１２１２のすぐ上流に位置する、発明８９に記載の組成物。
［発明９１］
前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、配列番号８５～配列番号８７又は配列番号９０～配列番号９２のうちのいずれか１つの配列を含む、発明８４～９０のいずれか一つに記載の組成物。
［発明９２］
前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼが、２つ以上のセグメントとして発現される、発明８４～９１のいずれか一つに記載の組成物。
［発明９３］
前記２つ以上のセグメントのうちの第１のセグメントが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＮ末端部分及び第１のインテインを含み、前記２つ以上のセグメントのうちの第２のセグメントが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼのＣ末端部分及び第２のインテインを含む、発明９２に記載の組成物。
［発明９４］
前記システイン点変異が、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃ末端部分のＮ末端に位置する、発明９３に記載の組成物。
［発明９５］
前記第１のインテインが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｎ末端部分のＣ末端に融合され、前記第２のインテインが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃ末端部分の前記Ｎ末端に融合される、発明９３又は９４に記載の組成物。
［発明９６］
前記第１のセグメントが、配列番号９０の配列を含み、前記第２のセグメントが、配列番号９１の配列を含む、発明９３～９５のいずれか一つに記載の組成物。
［発明９７］
前記２つ以上のセグメントのうちの前記第２のセグメントが、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃ末端部分に融合した逆転写酵素を含む、発明９３～９６のいずれか一つに記載の組成物。
［発明９８］
前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓ９プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃ末端部分のＣ末端に融合したＮ末端を含む、発明９７に記載の組成物。
［発明９９］
前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴ、又はそのバリアントを含む、発明９７又は９８に記載の組成物。
［発明１００］
ゲノム編集効率を最適化する方法であって、低いｄＮＴＰ濃度でその触媒効率を増加させるように修飾される（例えば、ｄＮＴＰに対するそのＫｍを減少させるように修飾される）、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）を用いてゲノム編集を実施することを含む、方法。
［発明１０１］
限定的なｄＮＴＰ条件においてゲノム編集効率を最適化する方法であって、逆転写酵素の位置２２１又は２２３に点変異を含む、Ｍｏｌｏｎｅｙ白血病ウイルス逆転写酵素（ｍｌｖＲＴ）、又はそのバリアントを用いてゲノム編集を実施することを含む、方法。
［発明１０２］
前記ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントが、位置２２１に点変異を含む、発明１００又は１０１に記載の方法。
［発明１０３］
位置２２１の前記点変異が、Ｑ２２１Ｒを含む、発明１０２に記載の方法。
［発明１０４］
前記ｍｌｖＲＴ又はそのバリアントが、位置２２３に点変異を含む、発明１００又は１０１に記載の方法。
［発明１０５］
位置２２３の前記点変異が、Ｖ２２３Ａを含む、発明１０４に記載の方法。
［発明１０６］
位置２２３の前記点変異が、Ｖ２２３Ｍを含む、発明１０４に記載の方法。
［発明１０７］
前記逆転写酵素が、位置Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、又はＤ５２４に点変異を含む、発明２１～４７又は６６～７１のいずれか一つに記載の組成物。
［発明１０８］
前記逆転写酵素が、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｈ２０４Ｒ、又はＤ５２４Ａを含む点変異を含む、発明２１～４７又は６６～７１のいずれか一つに記載の組成物。
［発明１０９］
前記逆転写酵素が、アミノ酸位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、又はＬ６７１に点変異を含む、発明２１～４７又は６６～７１のいずれか一つに記載の組成物。
［発明１１０］
前記逆転写酵素が、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、又はＤ５２４Ａを含む点変異を含む、発明２１～４７又は６６～７１のいずれか一つに記載の組成物。
［発明１１１］
前記Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴが、ポリヌクレオチドによってコードされる、発明２１～４７のいずれか一つに記載の組成物。
［発明１１２］
発明１１１に記載のポリヌクレオチドを含む、ＡＡＶ。
［発明１１３］
前記Ｃａｓニッカーゼ及びＲＴのうちの少なくとも一部が、別個のＡＡＶによって包含される、発明１１２に記載のＡＡＶ。
［発明１１４］
Ｃａｓニッカーゼのうちの少なくとも一部をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶと、逆転写酵素をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶと、を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
［発明１１５］
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ８－ＰＨＰ．ｅＢ、若しくはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓ、又はそれらの組み合わせを含む、発明１１２～１１４のいずれか一つに記載のＡＡＶ。
［発明１１６］
前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素が、互いにヘテロ二量体を形成する、発明１１４又は１１５に記載のＡＡＶ。
［発明１１７］
前記第１又は第２のポリヌクレオチドが、前記Ｃａｓニッカーゼ及び前記逆転写酵素に結合して、複合体を形成するガイド核酸を更にコードし、前記複合体の前記Ｃａｓニッカーゼが、標的核酸中の標的部位に一本鎖切断を導入する、発明１１４～１１６のいずれか一つに記載のＡＡＶ。
［発明１１８］
前記Ｃａｓニッカーゼが、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓ９ニッカーゼを含み、前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴ、又はそのバリアントを含み、前記逆転写酵素が、Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、又はＤ５２４に点変異を含む、発明１１４～１１７のいずれか一つに記載のＡＡＶ。
［発明１１９］
前記点変異が、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｑ８４Ａ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｖ２２３Ａ、Ｖ２２３Ｍ、Ｔ１９７Ａ、Ｄ６５３Ｎ、Ｔ６６４Ｎ、Ｌ６７１Ｐ、Ｌ４３５Ｇ、Ｈ２０４Ｒ、又はＤ５２４Ａを含む、発明１１８に記載のＡＡＶ。
［発明１２０］
前記Ｃａｓ９ニッカーゼが、Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ニッカーゼを含み、前記逆転写酵素が、ｍｌｖＲＴ、又はそのバリアントを含み、前記逆転写酵素が、Ｐ５１、Ｓ６７、Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ１９７、Ｄ６５３、Ｔ６６４、Ｌ６７１、Ｌ４３５、Ｈ２０４、又はＤ５２４のすぐ上流の挿入変異を含む、発明１１４～１１９のいずれか一つに記載のＡＡＶ。
［発明１２１］
発明１１４～１２０のいずれか一つに記載の第１又は第２のＡＡＶを含む組成物を、対象又は細胞に投与することを含む、ゲノムを編集する方法。
［発明１２２］
発明１１２～１２０のいずれか一つに記載のＡＡＶを含む組成物を、対象又は細胞に投与することを含む、ゲノムを編集する方法。
［発明１２３］
前記対象又は細胞内のゲノム編集を測定することを更に含む、発明１２１又は１２２に記載の方法。
［発明１２４］
低いデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）濃度を有する細胞内の遺伝子編集効率を増加させる方法であって、
前記細胞を、前記低いｄＮＴＰ濃度において効率的な触媒作用のために修飾された遺伝子編集酵素と接触させること、又は前記遺伝子編集酵素を前記細胞内で発現させること、を含む、方法。
［発明１２５］
前記遺伝子編集酵素が、位置Ｑ８４、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｖ２２３、Ｔ６６４、又はＬ６７１に点変異を導入することによって修飾される逆転写酵素を含む、発明１２４に記載の方法。
［発明１２６］
改善された逆転写酵素（ＲＴ）をスクリーニング又は識別するための方法であって、
細胞内で、ＳＡＭＨＤ１を過剰発現させるか、又は変異体ＳＡＭＨＤ１の残基のリン酸化を防止するように変異した変異体ＳＡＭＨＤ１を発現させることと、
前記細胞内のＲＴ活性を識別することと、
前記ＲＴ活性に基づいて、前記ＲＴを改善されたＲＴとして識別することと、を含む、方法。
［発明１２７］
スペーサー、所望の編集を含む逆転写酵素鋳型、及びプライマー結合部位を含む、ＲＮＡ又はポリヌクレオチドを含むシステムであって、前記プライマー結合部位が、前記スペーサーによって標的化若しくは結合された核酸の領域のいずれの部分も含まない核酸、又は前記スペーサーによって標的化若しくは結合された前記核酸に逆相補的な前記核酸に結合する、システム。
［発明１２８］
システムであって、
第１のガイド核酸であって、
標的核酸の第１の領域に逆相補的なスペーサーと、
Ｃａｓヌクレアーゼに結合するように構成された足場と、
前記標的核酸に挿入される配列をコードする逆転写酵素鋳型と、
前記第１の領域のいずれの部分も含まず、かつ前記第１の領域の逆相補体のいずれの部分も含まない、前記標的核酸の領域に結合する第１の鎖プライマー結合部位と、
第２のガイド核酸上のＧＰＳ結合部位にハイブリダイズするＧＰＳ領域と、を含む、第１のガイド核酸を含む、システム。
［発明１２９］
前記ＧＰＳ結合部位を含む前記第２のガイド核酸を更に含む、発明１２８に記載のシステム。
［発明１３０］
前記第２のガイド核酸が、前記標的核酸の別の領域に逆相補的な第２のスペーサーを含む、発明１２９に記載のシステム。
［発明１３１］
前記第２のガイド核酸が、前記プライマー結合部位をゲノムフラップと近接させる、発明１２９又は１３０に記載のシステム。
While preferred embodiments of the disclosure are shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, modifications, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from this disclosure. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the disclosure described herein may be used in implementing the disclosure. It is intended that the following claims define the scope of the disclosure and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.
The inventions described in the original claims of this application are listed below.
[Invention 1]
A method of increasing gene editing efficiency in cells having low deoxynucleoside triphosphate (dNTP) concentrations and comprising a DNA polymerase for gene editing, the method comprising:
A method comprising increasing the dNTP concentration within the cell compared to a baseline dNTP concentration.
[Invention 2]
2. The method of invention 1, wherein increasing the dNTP concentration within the cell comprises inhibiting deoxynucleotide triphosphate triphosphohydrolase within the cell.
[Invention 3]
The method according to invention 2, wherein the deoxynucleotide triphosphate triphosphohydrolase comprises SAM domain and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1).
[Invention 4]
4. The method of invention 3, wherein inhibiting SAMHD1 comprises contacting said SAMHD1 with a Vpx protein or expressing said Vpx protein in said cell.
[Invention 5]
4. The method of invention 3, wherein inhibiting SAMHD1 comprises contacting the SAMHD1 with a BGLF4 protein or expressing the BGLF4 protein in the cell.
[Invention 6]
Invention 3, wherein inhibiting SAMHD1 comprises contacting the mRNA encoding SAMHD1 with a microRNA or siRNA that hybridizes to the mRNA, or expressing the microRNA or siRNA in the cell. Method described.
[Invention 7]
4. The method of invention 3, wherein inhibiting SAMHD1 comprises contacting said SAMHD1 with a small molecule SAMHD1 inhibitor.
[Invention 8]
Increasing the dNTP concentration within the cell comprises administering to the cell a nucleoside or nucleotide, optionally wherein the nucleoside or nucleotide is deoxynucleoside (dN), deoxynucleoside monophosphate (dNMP). ), or a nucleoside triphosphate (NTP).
[Invention 9]
9. The method of invention 8, wherein administering the nucleoside or nucleotide to the cell comprises administering the nucleoside or nucleotide to a subject containing the cell.
[Invention 10]
The method according to invention 9, wherein said administration is oral or by injection.
[Invention 11]
2. The method of invention 1, wherein increasing the dNTP concentration within the cell comprises delivering a dNTP synthase to the cell.
[Invention 12]
The method according to invention 11, wherein the dNTP synthase includes a kinase.
[Invention 13]
13. The method of invention 12, wherein the kinase comprises a nucleoside kinase, a deoxynucleoside kinase, a deoxynucleoside monophosphate kinase, or a deoxynucleotide diphosphate kinase.
[Invention 14]
The method according to invention 1, wherein the DNA polymerase comprises reverse transcriptase.
[Invention 15]
The method of invention 1, wherein the cell further comprises a Cas9 programmable nuclease, a guide nucleic acid, or a combination thereof.
[Invention 16]
2. The method of invention 1, wherein the low dNTP concentration comprises a dNTP concentration found in non-dividing cells.
[Invention 17]
2. The method of invention 1, wherein the low dNTP concentration is less than the dNTP concentration found in activated peripheral blood mononuclear cells.
[Invention 18]
2. The method of invention 1, wherein the low dNTP concentration comprises a dNTP concentration of less than 1 micromolar.
[Invention 19]
the increasing the dNTP concentration increases the dNTP concentration by at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, compared to the baseline dNTP measurement; The method of invention 1, comprising increasing by at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, or more.
[Invention 20]
The dNTP concentration is a deoxyadenosine triphosphate (dATP) concentration, a deoxycytidine triphosphate (dCTP) concentration, a deoxyguanosine triphosphate (dGTP) concentration, or a deoxythymidine triphosphate (dTTP) concentration, or any of these. The method according to any one of inventions 1 to 19, comprising a combination of.
[Invention 21]
A composition comprising a Cas nickase and a reverse transcriptase, wherein at least a portion of the Cas nickase and the reverse transcriptase are contained in separate polypeptide chains; - A composition that forms a reverse transcriptase heterodimer.
[Invention 22]
The Cas-reverse transcriptase heterodimer comprises a first heterodimer domain fused to the Cas nickase and a second heterodimer domain fused to the reverse transcriptase, 22. The composition of invention 21, wherein one heterodimer domain binds to said second heterodimer domain to form said Cas-reverse transcriptase heterodimer.
[Invention 23]
23. The composition of invention 22, wherein the first heterodimer domain is a leucine zipper and the second heterodimer domain is a leucine zipper.
[Invention 24]
The invention, wherein the reverse transcriptase comprises a sequence having at least 80% sequence identity to any one of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 40 to SEQ ID NO: 80, or a fragment thereof. 24. The composition according to any one of 21 to 23.
[Invention 25]
25. The composition according to any one of inventions 21 to 24, wherein said reverse transcriptase comprises a domain from a non-long terminal repeat retrotransposable element fused to a portion of said Cas nickase.
[Invention 26]
25. A composition according to any one of inventions 21 to 24, wherein said reverse transcriptase comprises a sequence from a bacterial group II intron fused to a portion of said Cas nickase.
[Invention 27]
25. The composition according to any one of inventions 21 to 24, wherein said reverse transcriptase comprises a domain from a retroviral gag-pol polyprotein fused to a portion of said Cas nickase.
[Invention 28]
A composition comprising a Cas nickase, a reverse transcriptase, and a guide nucleic acid, wherein a first polypeptide comprises the Cas nickase, a second polypeptide comprises the reverse transcriptase, and the composition comprises a Cas nickase, a reverse transcriptase, and a guide nucleic acid. A composition, wherein a guide nucleic acid binds to the Cas nickase and the reverse transcriptase.
[Invention 29]
The composition according to any one of inventions 21 to 28, wherein the reverse transcriptase comprises an mcp peptide.
[Invention 30]
The composition according to any one of inventions 21 to 29, wherein the reverse transcriptase comprises a loop region.
[Invention 31]
The composition according to invention 30, wherein the loop region is a 2a loop or a 3a loop.
[Invention 32]
The composition according to any one of inventions 28 to 31, wherein the guide nucleic acid comprises an MS2 hairpin.
[Invention 33]
A reverse transcriptase having a sequence having at least 80% sequence identity to any one of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 40 to SEQ ID NO: 80, or a fragment thereof fused to Cas nickase. A composition comprising.
[Invention 34]
A composition comprising a reverse transcriptase comprising a domain from a non-long terminal repeat retrotransposable element fused to a Cas nickase.
[Invention 35]
A composition comprising a reverse transcriptase comprising a sequence from a bacterial group II intron fused to a Cas nickase.
[Invention 36]
A composition comprising a reverse transcriptase comprising a domain from a retroviral gag-pol polyprotein fused to a Cas nickase.
[Invention 37]
A composition comprising a Cas nickase and a reverse transcriptase, the Cas nickase and the reverse transcriptase comprising separate polypeptide chains, the Cas nickase and the reverse transcriptase being heterodimerized. The composition has not been manipulated to do so.
[Invention 38]
Any one of Inventions 21 to 37, comprising a guide nucleic acid that forms a complex with the Cas nickase, and when forming the complex, the Cas nickase can introduce a single-strand break into a target site in a target nucleic acid. The composition described in.
[Invention 39]
The composition according to any one of inventions 21 to 38, wherein the target nucleic acid comprises a CFTR nucleic acid, a USH2A nucleic acid, an ABCA4 nucleic acid, an ATP7B nucleic acid, or an HTT nucleic acid.
[Invention 40]
Composition according to any one of inventions 21 to 39, comprising a nuclear localization signal fused to said Cas nickase or said reverse transcriptase.
[Invention 41]
The composition according to any one of inventions 21 to 40, wherein the reverse transcriptase is a cleaved reverse transcriptase.
[Invention 42]
42. The composition according to any one of inventions 21 to 41, wherein said reverse transcriptase has an increased processing capacity compared to native reverse transcriptase.
[Invention 43]
Composition according to any one of inventions 21 to 42, wherein said reverse transcriptase has increased processing capacity compared to mlvRT.
[Invention 44]
Composition according to any one of inventions 21 to 43, wherein said reverse transcriptase edits a longer window length in the target sequence compared to mlvRT.
[Invention 45]
Composition according to any one of inventions 21 to 44, wherein said reverse transcriptase has reduced immunogenicity compared to mlvRT.
[Invention 46]
Composition according to any one of inventions 21 to 45, wherein said reverse transcriptase has improved delivery to cells compared to mlvRT.
[Invention 47]
The reverse transcriptase has 20 or more, 40 or more, 45 or more, 50 or more, 60 or more, 81 or more, 100 or more, 500 or more, or 1000 or more in a single binding event. The composition according to any one of inventions 21 to 46, which polymerizes nucleotides.
[Invention 48]
A guide nucleic acid,
a spacer that is reverse complementary to the first region of the target nucleic acid;
a scaffold configured to bind to a Cas nickase;
a reverse transcriptase template encoding a sequence to be inserted into the target nucleic acid;
a first strand primer binding site that is reverse complementary to a second region of the target nucleic acid.
[Invention 49]
49. The guide nucleic acid according to invention 48, further comprising a second strand primer comprising a sequence of a region of the reverse transcriptase template.
[Invention 50]
Invention 48 or 49, wherein the first region of the target nucleic acid is on a first strand of the target nucleic acid, and the second region of the target nucleic acid is on a second strand of the target nucleic acid. Guide nucleic acid as described in.
[Invention 51]
Any one of inventions 48 to 50, wherein all or part of the first region of the target nucleic acid is reverse complementary to all or part of the second region of the target nucleic acid. Guide nucleic acid as described in.
[Invention 52]
The guide nucleic acid according to any one of inventions 48 to 51, further comprising a cleavable sequence at the 3' end of the guide nucleic acid.
[Invention 53]
53. The guide nucleic acid according to invention 52, wherein the cleavable sequence is a ribozyme cleavable sequence.
[Invention 54]
The guide nucleic acid according to invention 52, wherein the cleavable sequence is a tRNA cleavable sequence.
[Invention 55]
The first strand primer binding site is configured to hybridize to the second region of the target nucleic acid, and the reverse transcriptase template is configured to hybridize to the second region of the target nucleic acid. Guide nucleic acid according to any one of inventions 48 to 54, configured to function as a template for reverse transcription.
[Invention 56]
56. The guide nucleic acid according to any one of inventions 48-55, wherein the second strand primer is configured to function as a primer for transcription from a template that is reverse complementary to the reverse transcriptase template.
[Invention 57]
Guide nucleic acid according to any one of inventions 48 to 56, wherein the first synthetic strand functions as a template for the synthesis of a second strand from said second strand primer.
[Invention 58]
Guide nucleic acid according to any one of inventions 48 to 57, further comprising a Velcro region that hybridizes to a Velcro binding site.
[Invention 59]
said Velcro binding site is 100% reverse complementary to said Velcro region, said Velcro binding site is at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% , at least 99% reverse complementary, and/or the Velcro binding site is 55% or less, 60% or less, 65% or less, 70% or less, 75% or less, 80% or less to the Velcro region. , 85% or less, 90% or less, 91% or less, 92% or less, 93% or less, 94% or less, 95% or less, 96% or less, 97% or less, 98% or less, 99% or less, reverse complementary , the guide nucleic acid according to Invention 58.
[Invention 60]
60. The guide nucleic acid according to invention 58 or 59, wherein the reverse transcriptase template region includes the Velcro binding site.
[Invention 61]
60. The guide nucleic acid according to invention 58 or 59, wherein the Velcro binding site is 3' of the first strand primer binding site.
[Invention 62]
62. The guide nucleic acid according to any one of inventions 48 to 61, wherein the Velcro region is 3' of the reverse transcriptase template.
[Invention 63]
The guide nucleic acid according to any one of inventions 48 to 62, wherein the Velcro region is 5' of the scaffold.
[Invention 64]
The guide nucleic acid according to any one of inventions 48 to 63, wherein the target nucleic acid comprises a CFTR nucleic acid, a USH2A nucleic acid, an ABCA4 nucleic acid, an ATP7B nucleic acid, or an HTT nucleic acid.
[Invention 65]
Guide nucleic acid according to any one of inventions 48-64, wherein said spacer comprises a nucleic acid sequence at least 85% identical to any one of SEQ ID NOs: 96-119.
[Invention 66]
A composition comprising a first guide nucleic acid comprising the guide according to any one of Inventions 28 to 32 or 37 to 65, and a second guide nucleic acid.
[Invention 67]
The composition according to invention 66, wherein the second guide nucleic acid comprises the guide nucleic acid according to any one of inventions 28, 32 or 37, or 48-65.
[Invention 68]
According to invention 67, the reverse transcriptase template of the second guide nucleic acid is complementary (or at least partially complementary) to at least a portion of the reverse transcriptase template of the first guide nucleic acid. Compositions as described.
[Invention 69]
69. The composition according to any one of inventions 66-68, wherein the first guide nucleic acid binds to a first Cas nickase and the second guide nucleic acid binds to a second Cas nickase.
[Invention 70]
A first spacer of the first guide nucleic acid binds to a first Cas nickase, and a second spacer of the second guide nucleic acid binds to a second Cas nickase, and a second spacer of the second guide nucleic acid binds to a second Cas nickase. according to any one of inventions 66 to 68, wherein the first scaffold of the second guide nucleic acid binds to the second Cas nickase, and the second scaffold of the second guide nucleic acid binds to the first Cas nickase. Compositions as described.
[Invention 71]
Invention 66-, wherein the first guide nucleic acid includes a first linker, the second guide nucleic acid includes a second linker, and the first linker hybridizes to the second linker. 70. The composition according to any one of 68 and 70.
[Invention 72]
Genome editing comprising delivering Orf1p to a cell expressing the composition according to any one of Inventions 21-47 or 66-71 or the guide nucleic acid according to any one of Inventions 38-45. How to increase efficiency.
[Invention 73]
One or more nucleic acids encoding a composition according to any one of inventions 21-47 or 66-71, or comprising a guide nucleic acid according to any one of inventions 48-65.
[Invention 74]
A viral vector comprising the nucleic acid according to invention 73.
[Invention 75]
The composition according to any one of Inventions 21 to 47 or 66 to 71, the guide nucleic acid according to any one of Inventions 48 to 65, the nucleic acid according to Invention 73, or the viral vector according to Invention 74. Including, cells.
[Invention 76]
The method according to invention 72 or the cell according to invention 75, wherein the cell is a prokaryotic cell.
[Invention 77]
The method according to invention 72 or the cell according to invention 75, wherein the cell is a eukaryotic cell.
[Invention 78]
A method of increasing genome editing efficiency comprising expressing Vpx protein in a cell.
[Invention 79]
The method according to invention 78, wherein the cell expresses the composition according to any one of inventions 21-47 or 66-71, or the guide nucleic acid according to any one of inventions 48-65.
[Invention 80]
A method of increasing genome editing efficiency by increasing the concentration of dNTPs in a cell, including, for example, inhibiting SAMHD1 in a cell.
[Invention 81]
81. The method of invention 80, wherein the cell expresses Cas9 programmable nuclease, reverse transcriptase, and guide nucleic acid.
[Invention 82]
82. The method of invention 80 or 81, wherein inhibiting SAMHD1 comprises expressing Vpx protein in the cell.
[Invention 83]
82. The method of invention 80 or 81, wherein inhibiting SAMHD1 comprises expressing a microRNA for SAMHD1 in said cell or comprising treating said cell with a small molecule SAMHD1 inhibitor.
[Invention 84]
A composition comprising a Cas9 programmable nuclease comprising one or more point or insertion mutations that enable or improve intein catalysis.
[Invention 85]
The Cas9 programmable nuclease comprises a point mutation or insertion mutation located in the C-terminal half of the Cas9 programmable nuclease, or the point mutation or insertion mutation is located anywhere after amino acid position 574 of the Cas9 programmable nuclease. 85. The composition according to invention 84, located at:
[Invention 86]
The point mutation includes a cysteine point mutation, a serine point mutation, a threonine point mutation, or an alanine point mutation, or the insertion mutation includes a cysteine insertion mutation, a serine insertion mutation, a threonine insertion mutation, or an alanine insertion mutation, Composition according to invention 85.
[Invention 87]
86. The composition of invention 85, wherein the point mutation comprises a cysteine point mutation or the insertion mutation comprises a cysteine insertion mutation.
[Invention 88]
88. The composition according to any one of inventions 84 to 87, wherein the Cas9 programmable nuclease is a Cas9 nickase.
[Invention 89]
The Cas9 programmable nuclease is derived from S. The composition according to any one of inventions 84 to 88, which is Pyogenes Cas9.
[Invention 90]
The point mutation may be caused by the S. Pyogenes Cas9 is located at D1079, D1125, D1130, G1133, A1140, I1168, S1173, D1180, G1186, L1203, or R1212, or the insertion mutation is located in the S. The composition according to invention 89, located immediately upstream of D1079, D1125, D1130, G1133, A1140, I1168, S1173, D1180, G1186, L1203, or R1212 of Pyogenes Cas9.
[Invention 91]
The composition according to any one of inventions 84 to 90, wherein the Cas9 programmable nuclease comprises any one of SEQ ID NO: 85 to SEQ ID NO: 87 or SEQ ID NO: 90 to SEQ ID NO: 92.
[Invention 92]
92. The composition according to any one of inventions 84-91, wherein said Cas9 programmable nuclease is expressed as two or more segments.
[Invention 93]
A first segment of the two or more segments comprises an N-terminal portion of the Cas9 programmable nuclease and a first intein, and a second segment of the two or more segments comprises a first intein of the Cas9 programmable nuclease. and a second intein.
[Invention 94]
94. The composition of invention 93, wherein said cysteine point mutation is located at the N-terminus of said C-terminal portion of said Cas9 programmable nuclease.
[Invention 95]
Invention 93, wherein the first intein is fused to the C-terminus of the N-terminal portion of the Cas9 programmable nuclease, and the second intein is fused to the N-terminus of the C-terminal portion of the Cas9 programmable nuclease. or the composition described in 94.
[Invention 96]
96. The composition according to any one of inventions 93-95, wherein said first segment comprises the sequence SEQ ID NO: 90 and said second segment comprises the sequence SEQ ID NO: 91.
[Invention 97]
97. The composition of any one of inventions 93-96, wherein said second segment of said two or more segments comprises a reverse transcriptase fused to said C-terminal portion of said Cas9 programmable nuclease.
[Invention 98]
98. The composition of invention 97, wherein the reverse transcriptase comprises an N-terminus fused to the C-terminus of the C-terminal portion of the Cas9 programmable nuclease.
[Invention 99]
99. The composition according to invention 97 or 98, wherein the reverse transcriptase comprises mlvRT or a variant thereof.
[Invention 100]
A method of optimizing genome editing efficiency, wherein Moloney leukemia virus reverse transcriptase is modified to increase its catalytic efficiency (e.g., modified to decrease its Km for dNTPs) at low dNTP concentrations. A method comprising performing genome editing using (mlvRT).
[Invention 101]
A method for optimizing genome editing efficiency under restrictive dNTP conditions, the method comprising genome editing using Moloney leukemia virus reverse transcriptase (mlvRT), or a variant thereof, containing a point mutation at position 221 or 223 of the reverse transcriptase. A method, including carrying out.
[Invention 102]
102. The method of invention 100 or 101, wherein the mlvRT or variant thereof comprises a point mutation at position 221.
[Invention 103]
103. The method of invention 102, wherein said point mutation at position 221 comprises Q221R.
[Invention 104]
102. The method of invention 100 or 101, wherein the mlvRT or variant thereof comprises a point mutation at position 223.
[Invention 105]
105. The method of invention 104, wherein said point mutation at position 223 comprises V223A.
[Invention 106]
105. The method of invention 104, wherein said point mutation at position 223 comprises V223M.
[Invention 107]
Any of Inventions 21-47 or 66-71, wherein the reverse transcriptase contains a point mutation at position P51, S67, Q84, L139, Q221, V223, T197, D653, T664, L671, L435, H204, or D524. The composition described in one.
[Invention 108]
Inventions 21-47 or 66-71, wherein the reverse transcriptase contains a point mutation containing P51L, S67R, Q84A, L139P, Q221R, V223A, V223M, T197A, D653N, T664N, L671P, L435G, H204R, or D524A. A composition according to any one of the above.
[Invention 109]
The composition according to any one of inventions 21-47 or 66-71, wherein the reverse transcriptase comprises a point mutation at amino acid position Q84, L139, Q221, V223, T664, or L671.
[Invention 110]
The composition according to any one of inventions 21-47 or 66-71, wherein the reverse transcriptase comprises a point mutation comprising S67R, Q84A, L139P, Q221R, V223A, V223M, T664N, L671P, or D524A.
[Invention 111]
48. The composition according to any one of inventions 21-47, wherein said Cas nickase and RT are encoded by a polynucleotide.
[Invention 112]
An AAV comprising the polynucleotide according to invention 111.
[Invention 113]
113. The AAV of invention 112, wherein at least a portion of the Cas nickase and RT are encompassed by separate AAVs.
[Invention 114]
an adeno-associated virus ( AAV).
[Invention 115]
The AAV is AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV-Rh10, AAV-Rh74, AAV-retro, AAV-PHP. B. AAV8-PHP. eB or AAV-PHP. The AAV according to any one of inventions 112 to 114, comprising S, or a combination thereof.
[Invention 116]
The AAV according to invention 114 or 115, wherein the Cas nickase and the reverse transcriptase form a heterodimer with each other.
[Invention 117]
The first or second polynucleotide further encodes a guide nucleic acid that binds to the Cas nickase and the reverse transcriptase to form a complex, wherein the Cas nickase of the complex targets a target in a target nucleic acid. The AAV according to any one of inventions 114 to 116, wherein a single-strand break is introduced at the site.
[Invention 118]
The Cas nickase is derived from S. Pyogenes Cas9 nickase, the reverse transcriptase comprises mlvRT, or a variant thereof, and the reverse transcriptase comprises P51, S67, Q84, L139, Q221, V223, T197, D653, T664, L671, The AAV according to any one of inventions 114 to 117, comprising a point mutation at L435, H204, or D524.
[Invention 119]
The AAV of invention 118, wherein the point mutation comprises P51L, S67R, Q84A, L139P, Q221R, V223A, V223M, T197A, D653N, T664N, L671P, L435G, H204R, or D524A.
[Invention 120]
The Cas9 nickase is derived from S. Pyogenes Cas9 nickase, the reverse transcriptase comprises mlvRT, or a variant thereof, the reverse transcriptase comprises P51, S67, Q84, L139, Q221, V223, T197, D653, T664, L671, L435, H204, or an insertion mutation immediately upstream of D524, the AAV according to any one of inventions 114 to 119.
[Invention 121]
A method of editing a genome, comprising administering to a subject or a cell a composition comprising the first or second AAV according to any one of inventions 114 to 120.
[Invention 122]
A method of editing a genome, comprising administering to a subject or a cell a composition comprising the AAV according to any one of inventions 112 to 120.
[Invention 123]
123. The method according to invention 121 or 122, further comprising measuring genome editing in the subject or cell.
[Invention 124]
A method of increasing gene editing efficiency in cells with low deoxynucleoside triphosphate (dNTP) concentrations, the method comprising:
A method comprising contacting said cell with a gene editing enzyme modified for efficient catalysis at said low dNTP concentration, or expressing said gene editing enzyme in said cell.
[Invention 125]
125. The method of invention 124, wherein the gene editing enzyme comprises a reverse transcriptase modified by introducing a point mutation at position Q84, L139, Q221, V223, T664, or L671.
[Invention 126]
A method for screening or identifying improved reverse transcriptase (RT) comprising:
overexpressing SAMHD1 or expressing a mutant SAMHD1 mutated to prevent phosphorylation of residues of the mutant SAMHD1 in the cell;
identifying RT activity within the cell;
identifying the RT as an improved RT based on the RT activity.
[Invention 127]
A system comprising an RNA or polynucleotide comprising a spacer, a reverse transcriptase template containing the desired edit, and a primer binding site, wherein the primer binding site is directed to any region of the nucleic acid targeted or bound by the spacer. or a nucleic acid that is reverse complementary to said nucleic acid targeted or bound by said spacer.
[Invention 128]
A system,
A first guide nucleic acid,
a spacer that is reverse complementary to the first region of the target nucleic acid;
a scaffold configured to bind to a Cas nuclease;
a reverse transcriptase template encoding a sequence to be inserted into the target nucleic acid;
a first strand primer binding site that binds to a region of the target nucleic acid that does not include any portion of the first region and does not include any portion of the reverse complement of the first region;
a GPS region that hybridizes to a GPS binding site on a second guide nucleic acid.
[Invention 129]
129. The system of invention 128, further comprising said second guide nucleic acid comprising said GPS binding site.
[Invention 130]
130. The system of invention 129, wherein the second guide nucleic acid includes a second spacer that is reverse complementary to another region of the target nucleic acid.
[Invention 131]
131. The system of invention 129 or 130, wherein the second guide nucleic acid brings the primer binding site into close proximity to a genomic flap.