JPWO2021055369A5

JPWO2021055369A5 -

Info

Publication number: JPWO2021055369A5
Application number: JP2022517134A
Authority: JP
Publication date: 2023-09-26

Description

次の詳細な開示によって、さらなる態様および実施形態が提供される。本発明は、本概要によって限定されるものではない。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと
を含み、
ｉ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
ｉｉ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
（項目２）
前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記ＮＣＴ阻害剤が、ウイルスタンパク質である、項目２に記載のシステム。
（項目４）
前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される、項目１～３のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５）
前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質またはその機能的バリアントである、項目４に記載のシステム。
（項目６）
前記ＮＣＴ阻害剤が、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼまたはその機能的バリアントである、項目４に記載のシステム。
（項目７）
前記ＮＣＴ阻害剤が、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼまたはその機能的バリアントである、項目４に記載のシステム。
（項目８）
前記ＮＣＴ阻害剤が、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質またはその機能的バリアントである、項目４に記載のシステム。
（項目９）
前記ＮＣＴ阻害剤が、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質またはその機能的バリアントである、項目４に記載のシステム。
（項目１０）
前記ＮＣＴ阻害剤が、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質またはその機能的バリアントである、項目４に記載のシステム。
（項目１１）
前記ＮＣＴ阻害剤が、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質またはその機能的バリアントである、項目４に記載のシステム。
（項目１２）
前記ＮＣＴ阻害剤が、ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質またはその機能的バリアントである、項目４に記載のシステム。
（項目１３）
前記Ｌタンパク質が、タイラーウイルスのＬタンパク質またはその機能的バリアントである、項目５に記載のシステム。
（項目１４）
前記Ｌタンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有する、項目５に記載のシステム。
（項目１５）
前記Ｌタンパク質が、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＬタンパク質またはその機能的バリアントである、項目５に記載のシステム。
（項目１６）
前記Ｌタンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を共有する、項目５に記載のシステム。
（項目１７）
前記Ｌタンパク質が、ポリオウイルスのＬタンパク質、ＨＲＶ１６のＬタンパク質、メンゴウイルスのＬタンパク質およびサフォルドウイルス２のＬタンパク質、またはそれらの機能的バリアントからなる群から選択される、項目５に記載のシステム。
（項目１８）
前記システムが、発現カセットを含む単一のベクターを含み、前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含む、項目１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１９）
前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む、項目１８に記載のシステム。
（項目２０）
前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有されたプロモーターを含む、項目１８に記載のシステム。
（項目２１）
前記発現カセットが、リボソームスキッピング部位をコードするポリヌクレオチドによって連結された前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドを含むコードポリヌクレオチドを含み、前記コードポリヌクレオチドが、前記共有されたプロモーターに作動可能に連結されている、項目２０に記載のシステム。
（項目２２）
前記発現カセットが、コードポリヌクレオチドを含み、前記コードポリヌクレオチドが、リボソームスキッピング部位によって連結された前記エンハンサータンパク質および前記標的タンパク質をコードし、前記コードポリヌクレオチドが、前記共有されたプロモーターに作動可能に連結されている、項目２０に記載のシステム。
（項目２３）
前記発現カセットが、リボソームスキッピング部位によって連結された、前記標的タンパク質および前記エンハンサータンパク質の両方をコードする単一のメッセンジャーＲＮＡの転写のために構成されており、前記メッセンジャーＲＮＡの翻訳が、別個のポリペプチドとしての前記標的タンパク質および前記Ｌタンパク質の発現をもたらす、項目１８～２２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２４）
１種のベクターを含む、項目１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２５）
ａ）第１のプロモーターに作動可能に連結された前記第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、
ｂ）第２のプロモーターに作動可能に連結された前記第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターと
を含む、項目１～１７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２６）
２種のベクターを含む、項目１～１７または項目２５のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２７）
前記第１のポリヌクレオチドもしくは前記第２のポリヌクレオチドのいずれか一方またはその両方が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている、項目１～２６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２８）
前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドのいずれか一方または両方の転写のために構成されたＴ７プロモーターを含む、項目１～２７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２９）
前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む、項目１～２８のいずれか一項に記載のシステム。
（項目３０）
ａ）標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）エンハンサータンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと
を含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのベクターであって、
ｉ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
ｉｉ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１種のプロモーターに作動可能に連結されている、ベクター。
（項目３１）
発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーターと、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーターとを含む、項目３０に記載のベクター。
（項目３２）
前記発現カセットが、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドの両方に作動可能に連結された共有されたプロモーターを含む、項目３０に記載のベクター。
（項目３３）
エンハンサータンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、標的タンパク質の発現のための真核細胞であって、
ａ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
ｂ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択され、
前記外因性ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、真核細胞。
（項目３４）
前記ポリヌクレオチドが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されている、項目３３に記載の真核細胞。
（項目３５）
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、項目３３または項目３４に記載の真核細胞。
（項目３６）
標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、プロモーターに作動可能に連結された、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、項目３３～３５のいずれか一項に記載の細胞に導入するステップを含む方法。
（項目３７）
標的タンパク質の組換え発現のための方法であって、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクターを真核細胞に導入するステップを含む方法。
（項目３８）
前記標的タンパク質が、膜タンパク質である、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記膜タンパク質が、前記エンハンサータンパク質なしで発現された場合に観察される局在化と比較して、細胞膜への前記膜タンパク質の局在化が増加される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
項目１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクターの導入によって産生された真核細胞。
（項目４１）
真核細胞への項目１～２９のいずれか一項に記載のシステムまたは項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクターの導入によって発現された標的タンパク質。
（項目４２）
真核細胞において標的タンパク質を発現させるための方法であって、プロモーターに作動可能に連結された、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記真核細胞に導入するステップを含み、
前記方法が、エンハンサータンパク質の共発現を利用して、前記標的タンパク質の発現レベル、溶解度および／または活性を増強し、
ａ）前記エンハンサータンパク質が、核細胞質間輸送（ＮＣＴ）の阻害剤である、および／または
ｂ）前記エンハンサータンパク質が、ピコルナウイルスリーダー（Ｌ）タンパク質、ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、コロナウイルスＯＲＦ６タンパク質、エボラウイルスＶＰ２４タンパク質、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）カプシドタンパク質、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ２７タンパク質およびラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質からなる群から選択される、方法。
（項目４３）
エンハンサータンパク質の前記共発現が、プロモーターに作動可能に連結された、前記エンハンサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記真核細胞に導入するステップを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記導入するステップ（単数または複数）が、１種もしくは複数のＤＮＡ分子による前記真核細胞のトランスフェクション、単一のウイルスベクターによる前記真核細胞の形質導入、および／または２種のウイルスベクターによる前記真核細胞の形質導入を含む、項目４２または項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記標的タンパク質が、可溶性タンパク質である、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、項目３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、項目３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、項目４０に記載の真核細胞、ならびに項目４１に記載の標的タンパク質。
（項目４６）
前記標的タンパク質が、分泌タンパク質である、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、項目３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、または項目３６～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記標的タンパク質が、膜タンパク質である、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、項目３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、項目３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、項目４０に記載の真核細胞、ならびに項目４１に記載の標的タンパク質。
（項目４８）
前記標的タンパク質が、ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）であり、必要に応じて、前記ＤＲＤ１が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、項目３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、項目３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、項目４０に記載の真核細胞、ならびに項目４１に記載の標的タンパク質。
（項目４９）
前記標的タンパク質が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）であり、必要に応じて、前記ＣＦＴＲが、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、項目３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、項目３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、項目４０に記載の真核細胞、ならびに項目４１に記載の標的タンパク質。
（項目５０）
前記標的タンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－Ｉｎｈ）であり、必要に応じて、前記Ｃ１－Ｉｎｈが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、項目３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、項目３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、項目４０に記載の真核細胞、ならびに項目４１に記載の標的タンパク質。
（項目５１）
前記標的タンパク質が、ＩＴＫであり、必要に応じて、前記ＩＴＫが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、項目３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、項目３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、項目４０に記載の真核細胞、ならびに項目４１に記載の標的タンパク質。
（項目５２）
前記標的タンパク質が、ＮＡＤａｓｅであり、必要に応じて、前記ＮＡＤａｓｅが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～２９のいずれか一項に記載のシステム、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター、項目３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、項目３６～３９および４２～４４のいずれか一項に記載の方法、項目４０に記載の真核細胞、ならびに項目４１に記載の標的タンパク質。
（項目５３）
標的タンパク質に対する抗体を生成するための方法であって、項目３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、項目４０に記載の細胞、または項目４１に記載の標的タンパク質で対象を免疫化するステップを含む方法。
（項目５４）
前記標的タンパク質に特異的な免疫グロブリンタンパク質を発現する１つまたは複数の免疫細胞を単離するステップをさらに含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記１つまたは複数の免疫細胞から１つまたは複数のハイブリドーマを生成するステップを含む、項目５３または項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記１つまたは複数の免疫細胞から１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子をクローニングするステップを含む、項目５３～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
細胞選別による抗体発見のための方法であって、
ａ）前記細胞または標的タンパク質が標識されている、項目３３～３５のいずれか一項に記載の細胞、項目４０に記載の真核細胞、または項目４１に記載の標的タンパク質と、
ｂ）組換え細胞が、抗体またはその抗原結合性断片をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリーを発現する、組換え細胞の集団と
を含む溶液を用意するステップと、
前記標識された細胞または前記標識された標的タンパク質に結合された組換え細胞について選別することにより、前記溶液から１つまたは複数の組換え細胞を単離するステップとを含む方法。
（項目５８）
ファージディスプレイライブラリーをパニングするための方法であって、
ａ）ファージディスプレイライブラリーを、項目３３～３５のいずれか一項に記載の真核細胞、項目４０に記載の真核細胞、または項目４１に記載の標的タンパク質と混合するステップと、
ｂ）前記細胞または標的タンパク質に結合する前記ファージディスプレイライブラリーのメンバーを精製および／または富化するステップと
を含む方法。
（項目５９）
ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞である、項目３３～３５および４０のいずれか一項に記載の真核細胞。
（項目６０）
真核細胞株である、項目３３～３５、４０および５９のいずれか一項に記載の真核細胞。
（項目６１）
ＢｃＨＲＯＣ２７７、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、５Ｐ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ、ｐｅｒＣ６細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞、Ｐｉｃｈｉａ細胞またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ細胞である、項目３３～３５、４０、５９および６０のいずれか一項に記載の真核細胞。
（項目６２）
前記真核細胞株が、安定した細胞株である、項目６０に記載の真核細胞。
（項目６３）
前記１種または複数種のベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドからなる群から選択される、項目１～２９および４５～５２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６４）
前記１種または複数種のベクターのうち少なくとも１種が、ＡＡＶベクターである、項目６３に記載のシステム。
（項目６５）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、複製コンピテントアデノウイルスベクター、複製欠損アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドである、項目３０～３２のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６６）
ＡＡＶベクターである、項目６５に記載のベクター。
（項目６７）
前記ラブドウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質が、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＭタンパク質である、項目４に記載のシステム。
（項目６８）
前記Ｍタンパク質が、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を共有する、項目６７に記載のシステム。
（項目６９）
１種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＬタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｌタンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
（項目７０）
１種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）タイラーウイルスのＬタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｌタンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
（項目７１）
１種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼをコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記ピコルナウイルス２Ａプロテアーゼが、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
（項目７２）
１種または複数種のベクターを含む、真核細胞における標的タンパク質の組換え発現のためのシステムであって、前記１種または複数種のベクターが、
ａ）前記標的タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＭタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、必要に応じて、前記Ｍタンパク質が、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を共有する、第２のポリヌクレオチドと
を含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、１種または複数種のプロモーターに作動可能に連結されている、システム。
（項目７３）
前記標的タンパク質が、ドーパミン受容体１（ＤＲＤ１）であり、必要に応じて、前記ＤＲＤ１が、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７４）
前記標的タンパク質が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）であり、必要に応じて、前記ＣＦＴＲが、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７５）
前記標的タンパク質が、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－Ｉｎｈ）であり、必要に応じて、前記Ｃ１－Ｉｎｈが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７６）
前記標的タンパク質が、ＩＴＫであり、必要に応じて、前記ＩＴＫが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７７）
前記標的タンパク質が、ＮＡＤａｓｅであり、必要に応じて、前記ＮＡＤａｓｅが、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目６９～７２のいずれか一項に記載のシステム。 Further aspects and embodiments are provided by the following detailed disclosure. The invention is not limited by this summary.
In the embodiment of the present invention, the following items are provided, for example.
(Item 1)
A system for recombinant expression of a target protein in eukaryotic cells comprising one or more vectors, the one or more vectors comprising:
a) a first polynucleotide encoding the target protein;
b) a second polynucleotide encoding an enhancer protein;
including;
i) said enhancer protein is an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT), and/or
ii) said enhancer protein is selected from the group consisting of picornavirus leader (L) protein, picornavirus 2A protease, rhinovirus 3C protease, herpes simplex virus (HSV) ICP27 protein and rhabdovirus matrix (M) protein;
A system wherein the first polynucleotide and the second polynucleotide are operably linked to one or more promoters.
(Item 2)
The system according to item 1, wherein the enhancer protein is an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT).
(Item 3)
The system according to item 2, wherein the NCT inhibitor is a viral protein.
(Item 4)
The NCT inhibitor may include picornavirus leader (L) protein, picornavirus 2A protease, rhinovirus 3C protease, coronavirus ORF6 protein, Ebola virus VP24 protein, Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) capsid protein, herpes simplex virus ( 4. The system according to any one of items 1 to 3, selected from the group consisting of HSV) ICP27 protein and rhabdovirus matrix (M) protein.
(Item 5)
5. The system according to item 4, wherein the NCT inhibitor is a picornavirus leader (L) protein or a functional variant thereof.
(Item 6)
5. The system according to item 4, wherein the NCT inhibitor is Picornavirus 2A protease or a functional variant thereof.
(Item 7)
5. The system according to item 4, wherein the NCT inhibitor is rhinovirus 3C protease or a functional variant thereof.
(Item 8)
5. The system according to item 4, wherein the NCT inhibitor is coronavirus ORF6 protein or a functional variant thereof.
(Item 9)
5. The system according to item 4, wherein the NCT inhibitor is Ebola virus VP24 protein or a functional variant thereof.
(Item 10)
5. The system of item 4, wherein the NCT inhibitor is a Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) capsid protein or a functional variant thereof.
(Item 11)
5. The system according to item 4, wherein the NCT inhibitor is a herpes simplex virus (HSV) ICP27 protein or a functional variant thereof.
(Item 12)
5. The system according to item 4, wherein the NCT inhibitor is a rhabdovirus matrix (M) protein or a functional variant thereof.
(Item 13)
6. The system according to item 5, wherein the L protein is the Tyler virus L protein or a functional variant thereof.
(Item 14)
6. The system of item 5, wherein the L protein shares at least 90% identity with SEQ ID NO:1.
(Item 15)
The system according to item 5, wherein the L protein is the L protein of encephalomyocarditis virus (EMCV) or a functional variant thereof.
(Item 16)
6. The system of item 5, wherein the L protein shares at least 90% identity with SEQ ID NO:2.
(Item 17)
The system according to item 5, wherein the L protein is selected from the group consisting of poliovirus L protein, HRV16 L protein, Mengovirus L protein and Saffold virus 2 L protein, or functional variants thereof. .
(Item 18)
18. The system of any one of items 1-17, wherein the system comprises a single vector comprising an expression cassette, the expression cassette comprising the first polynucleotide and the second polynucleotide.
(Item 19)
19. The expression cassette comprises a first promoter operably linked to the first polynucleotide and a second promoter operably linked to the second polynucleotide. system.
(Item 20)
19. The system of item 18, wherein the expression cassette includes a shared promoter operably linked to both the first polynucleotide and the second polynucleotide.
(Item 21)
The expression cassette includes a coding polynucleotide comprising the first polynucleotide and the second polynucleotide linked by a polynucleotide encoding a ribosome skipping site, and the coding polynucleotide is linked to the shared promoter. 21. The system of item 20, operably coupled.
(Item 22)
the expression cassette comprises a coding polynucleotide encoding the enhancer protein and the target protein linked by a ribosome skipping site, the coding polynucleotide operably linked to the shared promoter; 21. The system of item 20, wherein the system is coupled.
(Item 23)
The expression cassette is configured for the transcription of a single messenger RNA encoding both the target protein and the enhancer protein, linked by a ribosomal skipping site, and translation of the messenger RNA is performed in separate polypeptides. 23. The system according to any one of items 18 to 22, resulting in the expression of said target protein and said L protein as a peptide.
(Item 24)
24. The system according to any one of items 1 to 23, comprising one vector.
(Item 25)
a) a first vector comprising said first polynucleotide operably linked to a first promoter;
b) a second vector comprising said second polynucleotide operably linked to a second promoter;
The system according to any one of items 1 to 17, comprising:
(Item 26)
The system according to any one of items 1-17 or item 25, comprising two vectors.
(Item 27)
27. The method according to any one of items 1-26, wherein either the first polynucleotide or the second polynucleotide, or both, is operably linked to an internal ribosome entry site (IRES). system.
(Item 28)
At least one of the one or more vectors includes a T7 promoter configured for transcription of either or both of the first polynucleotide and the second polynucleotide by T7 RNA polymerase. , the system according to any one of items 1 to 27.
(Item 29)
29. The system of any one of items 1-28, wherein at least one of the one or more vectors comprises a polynucleotide sequence encoding T7 RNA polymerase.
(Item 30)
a) a first polynucleotide encoding a target protein;
b) a second polynucleotide encoding an enhancer protein;
A vector for recombinant expression of a target protein in eukaryotic cells, comprising:
i) said enhancer protein is an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT), and/or
ii) The enhancer protein is Picornavirus leader (L) protein, Picornavirus 2A protease, Rhinovirus 3C protease, Coronavirus ORF6 protein, Ebola virus VP24 protein, Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) capsid protein, Herpes simplex virus. (HSV) ICP27 protein and rhabdovirus matrix (M) protein;
A vector, wherein the first polynucleotide and the second polynucleotide are operably linked to at least one promoter.
(Item 31)
The vector of item 30, wherein the expression cassette comprises a first promoter operably linked to the first polynucleotide and a second promoter operably linked to the second polynucleotide. .
(Item 32)
31. The vector of item 30, wherein said expression cassette comprises a shared promoter operably linked to both said first polynucleotide and said second polynucleotide.
(Item 33)
A eukaryotic cell for expression of a target protein comprising an exogenous polynucleotide encoding an enhancer protein, the eukaryotic cell comprising:
a) said enhancer protein is an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT), and/or
b) The enhancer protein is Picornavirus leader (L) protein, Picornavirus 2A protease, Rhinovirus 3C protease, Coronavirus ORF6 protein, Ebola virus VP24 protein, Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) capsid protein, Herpes simplex virus. (HSV) ICP27 protein and rhabdovirus matrix (M) protein;
A eukaryotic cell, wherein said exogenous polynucleotide is operably linked to a promoter.
(Item 34)
34. The eukaryotic cell of item 33, wherein the polynucleotide is operably linked to an internal ribosome entry site (IRES).
(Item 35)
The eukaryotic cell according to item 33 or item 34, wherein the promoter is an inducible promoter.
(Item 36)
A method for recombinant expression of a target protein, comprising introducing a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a promoter into a cell according to any one of items 33 to 35. method including.
(Item 37)
A method for recombinant expression of a target protein, comprising introducing a system according to any one of items 1 to 29 or a vector according to any one of items 30 to 32 into a eukaryotic cell. How to include.
(Item 38)
The method according to item 36 or item 37, wherein the target protein is a membrane protein.
(Item 39)
39. The method of item 38, wherein localization of the membrane protein to the cell membrane is increased compared to the localization observed when the membrane protein is expressed without the enhancer protein.
(Item 40)
A eukaryotic cell produced by introducing the system according to any one of items 1 to 29 or the vector according to any one of items 30 to 32.
(Item 41)
A target protein expressed by introducing the system according to any one of items 1 to 29 or the vector according to any one of items 30 to 32 into a eukaryotic cell.
(Item 42)
A method for expressing a target protein in a eukaryotic cell, the method comprising the step of introducing into the eukaryotic cell a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a promoter,
the method utilizes co-expression of an enhancer protein to enhance the expression level, solubility and/or activity of the target protein;
a) said enhancer protein is an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT), and/or
b) The enhancer protein is Picornavirus leader (L) protein, Picornavirus 2A protease, Rhinovirus 3C protease, Coronavirus ORF6 protein, Ebola virus VP24 protein, Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) capsid protein, Herpes simplex virus. (HSV) ICP27 protein and rhabdovirus matrix (M) protein.
(Item 43)
43. The method of item 42, wherein said co-expression of an enhancer protein comprises introducing into said eukaryotic cell a polynucleotide encoding said enhancer protein operably linked to a promoter.
(Item 44)
Said introducing step(s) comprises transfection of said eukaryotic cell with one or more DNA molecules, transduction of said eukaryotic cell with a single viral vector, and/or with two viral vectors. 44. The method of item 42 or item 43, comprising transducing said eukaryotic cells.
(Item 45)
The system according to any one of items 1 to 29, the vector according to any one of items 30 to 32, the vector according to any one of items 33 to 35, wherein the target protein is a soluble protein. A eukaryotic cell, a method according to any one of items 36-39 and 42-44, a eukaryotic cell according to item 40, and a target protein according to item 41.
(Item 46)
The system according to any one of items 1 to 29, the vector according to any one of items 30 to 32, or the system according to any one of items 33 to 35, wherein the target protein is a secreted protein. a cell, or a method according to any one of items 36-44.
(Item 47)
The system according to any one of items 1 to 29, the vector according to any one of items 30 to 32, the vector according to any one of items 33 to 35, wherein the target protein is a membrane protein. A eukaryotic cell, a method according to any one of items 36-39 and 42-44, a eukaryotic cell according to item 40, and a target protein according to item 41.
(Item 48)
Any of items 1 to 29, wherein said target protein is dopamine receptor 1 (DRD1), and optionally said DRD1 comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. The system according to any one of items 30 to 32, the eukaryotic cell according to any one of items 33 to 35, the system according to any one of items 36 to 39 and 42 to 44 The method according to item 40, the eukaryotic cell according to item 40, and the target protein according to item 41.
(Item 49)
Item 1, wherein the target protein is cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), and optionally, the CFTR comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. -29, the vector according to any one of items 30-32, the eukaryotic cell according to any one of items 33-35, items 36-39 and 42-44. The method according to any one of Item 40, the eukaryotic cell according to Item 40, and the target protein according to Item 41.
(Item 50)
Item 1, wherein the target protein is a C1 esterase inhibitor (C1-Inh), and optionally, the C1-Inh comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. -29, the vector according to any one of items 30-32, the eukaryotic cell according to any one of items 33-35, items 36-39 and 42-44. The method according to any one of Item 40, the eukaryotic cell according to Item 40, and the target protein according to Item 41.
(Item 51)
29. The target protein is an ITK, and optionally the ITK comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. a system, a vector according to any one of items 30-32, a eukaryotic cell according to any one of items 33-35, a method according to any one of items 36-39 and 42-44, The eukaryotic cell according to item 40 and the target protein according to item 41.
(Item 52)
30. According to any one of items 1 to 29, the target protein is a NADase, and optionally the NADase comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. a system, a vector according to any one of items 30-32, a eukaryotic cell according to any one of items 33-35, a method according to any one of items 36-39 and 42-44, The eukaryotic cell according to item 40 and the target protein according to item 41.
(Item 53)
A method for producing an antibody against a target protein, the step of immunizing a subject with a cell according to any one of items 33 to 35, a cell according to item 40, or a target protein according to item 41. method including.
(Item 54)
54. The method of item 53, further comprising isolating one or more immune cells expressing an immunoglobulin protein specific for the target protein.
(Item 55)
55. The method of item 53 or item 54, comprising generating one or more hybridomas from the one or more immune cells.
(Item 56)
56. The method of any one of items 53-55, comprising cloning one or more immunoglobulin genes from said one or more immune cells.
(Item 57)
A method for antibody discovery by cell sorting, the method comprising:
a) the cell according to any one of items 33 to 35, the eukaryotic cell according to item 40, or the target protein according to item 41, wherein the cell or target protein is labeled;
b) a population of recombinant cells, wherein the recombinant cells express a library of polypeptides each comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof;
providing a solution containing;
isolating one or more recombinant cells from the solution by sorting for the labeled cells or recombinant cells bound to the labeled target protein.
(Item 58)
A method for panning a phage display library, the method comprising:
a) mixing the phage display library with a eukaryotic cell according to any one of items 33 to 35, a eukaryotic cell according to item 40, or a target protein according to item 41;
b) purifying and/or enriching members of said phage display library that bind to said cells or target proteins;
method including.
(Item 59)
Eukaryotic cell according to any one of items 33 to 35 and 40, which is a human cell, animal cell, insect cell, plant cell or fungal cell.
(Item 60)
The eukaryotic cell according to any one of items 33-35, 40 and 59, which is a eukaryotic cell line.
(Item 61)
Bc HROC277, COS, CHO, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV, VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NSO, 5P2/0 - Ag14, HeLa, HEK293, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T, perC6 cells, Sf9 cells, Saccharomyces cells, Pichia cells or Schizosaccharomyces cells, of items 33-35, 40, 59 and 60; any one Eukaryotic cells as described in section.
(Item 62)
61. The eukaryotic cell according to item 60, wherein the eukaryotic cell line is a stable cell line.
(Item 63)
The one or more vectors may be adeno-associated virus (AAV) vectors, lentivirus vectors, retrovirus vectors, replication competent adenovirus vectors, replication defective adenovirus vectors, herpes virus vectors, baculovirus vectors or non-viral plasmids. The system according to any one of items 1-29 and 45-52, selected from the group consisting of.
(Item 64)
64. The system according to item 63, wherein at least one of the one or more vectors is an AAV vector.
(Item 65)
Any of items 30 to 32, which is an adeno-associated virus (AAV) vector, a lentiviral vector, a retroviral vector, a replication-competent adenoviral vector, a replication-deficient adenoviral vector, a herpesvirus vector, a baculovirus vector, or a non-viral plasmid. The vector described in paragraph 1.
(Item 66)
The vector according to item 65, which is an AAV vector.
(Item 67)
5. The system according to item 4, wherein the rhabdovirus matrix (M) protein is the M protein of vesicular stomatitis virus (VSV).
(Item 68)
68. The system of item 67, wherein said M protein shares at least 90% identity with SEQ ID NO:9.
(Item 69)
A system for recombinant expression of a target protein in eukaryotic cells comprising one or more vectors, the one or more vectors comprising:
a) a first polynucleotide encoding the target protein;
b) a second polynucleotide encoding the L protein of encephalomyocarditis virus (EMCV), optionally said L protein sharing at least 90% identity with SEQ ID NO: 2; polynucleotide and
wherein the first polynucleotide and the second polynucleotide are operably linked to one or more promoters.
(Item 70)
A system for recombinant expression of a target protein in eukaryotic cells comprising one or more vectors, the one or more vectors comprising:
a) a first polynucleotide encoding the target protein;
b) a second polynucleotide encoding the L protein of Tyler virus, optionally said L protein sharing at least 90% identity with SEQ ID NO: 1;
wherein the first polynucleotide and the second polynucleotide are operably linked to one or more promoters.
(Item 71)
A system for recombinant expression of a target protein in eukaryotic cells comprising one or more vectors, the one or more vectors comprising:
a) a first polynucleotide encoding the target protein;
b) a second polynucleotide encoding a Picornavirus 2A protease, optionally said Picornavirus 2A protease sharing at least 90% identity with SEQ ID NO: 7; nucleotide and
wherein the first polynucleotide and the second polynucleotide are operably linked to one or more promoters.
(Item 72)
A system for recombinant expression of a target protein in eukaryotic cells comprising one or more vectors, the one or more vectors comprising:
a) a first polynucleotide encoding the target protein;
b) a second polynucleotide encoding the M protein of vesicular stomatitis virus (VSV), optionally said M protein sharing at least 90% identity with SEQ ID NO: 9; polynucleotide and
wherein the first polynucleotide and the second polynucleotide are operably linked to one or more promoters.
(Item 73)
Any of items 69 to 72, wherein said target protein is dopamine receptor 1 (DRD1), and optionally said DRD1 comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19. The system described in item 1.
(Item 74)
Item 69, wherein said target protein is cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), and optionally said CFTR comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18. 73. The system according to any one of items 1 to 72.
(Item 75)
Item 69, wherein said target protein is a C1 esterase inhibitor (C1-Inh), and optionally said C1-Inh comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. 73. The system according to any one of items 1 to 72.
(Item 76)
73, wherein said target protein is an ITK, optionally said ITK comprising an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. system.
(Item 77)
73, wherein said target protein is NADase, and optionally said NADase comprises an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. system.

Claims

A system for recombinant expression of a target protein in eukaryotic cells, the system comprising :
a ) a first polynucleotide encoding the target protein;
b) a second polynucleotide encoding an enhancer protein, the enhancer protein being an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT inhibitor).

A system for recombinant expression of a target protein in eukaryotic cells comprising one or more vectors, the one or more vectors comprising:
a) a first polynucleotide encoding the target protein;
b) a second polynucleotide encoding an enhancer protein, the enhancer protein being an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT inhibitor);
wherein the first polynucleotide and the second polynucleotide are operably linked to one or more promoters.

3. The system of claim 1 or 2 , wherein the NCT inhibitor is a picornavirus leader (L) protein , a picornavirus 2A protease, a rhabdovirus matrix (M) protein, or a functional variant thereof.

The NCT inhibitor is a picornavirus leader (L) protein,
a) the L protein is the L protein of encephalomyocarditis virus (EMCV) or a functional variant thereof;
b) said L protein shares at least 90% identity with SEQ ID NO: 2;
c) said L protein is the L protein of Tyler virus or a functional variant thereof; or
d) said L protein shares at least 90% identity with SEQ ID NO: 1;
The system according to claim 3 .

5. The system of any one of claims 1 to 4 , wherein the system comprises a vector comprising an expression cassette, the expression cassette comprising the first polynucleotide and the second polynucleotide.

the expression cassette comprises a first promoter operably linked to the first polynucleotide and a second promoter operably linked to the second polynucleotide, or
The expression cassette includes a promoter operably linked to both the first polynucleotide and the second polynucleotide, and optionally the first polynucleotide and the second polynucleotide are linked by a polynucleotide encoding a ribosome skipping site,
The system according to claim 5 .

a) a first vector comprising said first polynucleotide operably linked to a first promoter;
b) a second vector comprising the second polynucleotide operably linked to a second promoter.

8. The system of any one of claims 1 to 7 , wherein the first polynucleotide and/ or the second polynucleotide are operably linked to an internal ribosome entry site (IRES).

9. The method of claims 2 to 8 , wherein the one or more vectors comprises a T7 promoter configured for transcription of the first polynucleotide and /or the second polynucleotide by T7 RNA polymerase. A system according to any one of the clauses.

A system according to any one of claims 2 to 9 , wherein the one or more vectors comprise a polynucleotide sequence encoding T7 RNA polymerase.

The one or more vectors may be adeno-associated virus (AAV) vectors, lentivirus vectors, retrovirus vectors, replication competent adenovirus vectors, replication defective adenovirus vectors, herpes virus vectors, baculovirus vectors or non-viral plasmids. A system according to any one of claims 2 to 10, selected from the group consisting of.

6. The system of any one of the preceding claims, wherein the target protein is a secreted protein, an intracellular protein, an enzyme or a membrane protein.

A eukaryotic cell for the expression of a target protein, comprising a system according to any one of claims 1 to 12.

A eukaryotic cell for the expression of a target protein comprising an exogenous polynucleotide encoding an enhancer protein , the enhancer protein being an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT); A eukaryotic cell in which the nucleotide is operably linked to a promoter.

A method for recombinant expression of a target protein, comprising the step of introducing a system according to any one of claims 1 to 12 into eukaryotic cells in vitro or ex vivo.

A method for recombinant expression of an enhancer protein, the method comprising introducing into a eukaryotic cell a polynucleotide encoding an enhancer protein operably linked to a promoter, in vitro or ex vivo, the method comprising: is an inhibitor of nucleocytoplasmic transport (NCT inhibitor),
Optionally, the method comprises transfection of said eukaryotic cells with one or more DNA molecules, transduction of said eukaryotic cells with a single viral vector, and/or two or more. transducing said eukaryotic cells with a viral vector;
Method.