JPWO2021011936A5 - - Google Patents

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JPWO2021011936A5
JPWO2021011936A5 JP2022502832A JP2022502832A JPWO2021011936A5 JP WO2021011936 A5 JPWO2021011936 A5 JP WO2021011936A5 JP 2022502832 A JP2022502832 A JP 2022502832A JP 2022502832 A JP2022502832 A JP 2022502832A JP WO2021011936 A5 JPWO2021011936 A5 JP WO2021011936A5
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さらに別の態様は、条件付きで免疫保護された細胞を作製する方法に関する。この方法は、増加したレベルの1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質を条件付きで発現するように細胞を改変する工程、1つまたは複数の内因性HLAタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質を条件付きで発現するように細胞を改変する工程、あるいは増加したレベルの1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質を条件付きで発現し、1つまたは複数の内因性HLAタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質を条件付きで発現するように細胞を改変する工程を含む。
[本発明1001]
細胞型特異的に発現される第1の遺伝子配列、
該第1の遺伝子配列の3'側に位置する、1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列、および
該免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列の3'側に位置する、細胞型特異的に発現される第2の遺伝子配列
を含む、組換え遺伝子構築物。
[本発明1002]
1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするヌクレオチド配列であって、1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列に連結されたヌクレオチド配列
をさらに含む、本発明1001の組換え遺伝子構築物。
[本発明1003]
細胞型特異的に発現される第1の遺伝子配列、
該第1の細胞特異的遺伝子配列の3'側に位置する、1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするヌクレオチド配列、および
1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードする該ヌクレオチド配列の3'側に位置する、細胞型特異的に発現される第2の遺伝子配列
を含む、組換え遺伝子構築物。
[本発明1004]
1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質が、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、CD47、CD200、CTLA-4、HLA-E、およびそれらの任意の組合せから選択される、本発明1001または本発明1002の組換え遺伝子構築物。
[本発明1005]
1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、shRNA、miRNA、およびsiRNAからなる群より選択される、本発明1002～1004のいずれかの組換え遺伝子構築物。
[本発明1006]
1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、ヌクレアーゼ欠損Cas9またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、本発明1002～1004のいずれかの組換え遺伝子構築物。
[本発明1007]
1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、β 2 Mの発現を低下させる物質である、本発明1002～1006のいずれかの組換え遺伝子構築物。
[本発明1008]
1つまたは複数のHLA-I分子が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、およびそれらの組合せからなる群より選択される、本発明1002～1006のいずれかの組換え遺伝子構築物。
[本発明1009]
組換え遺伝子構築物の第1および第2の遺伝子配列が、1つまたは複数の最終分化細胞において限定的に発現される遺伝子に由来する、本発明1001～1008のいずれかの組換え遺伝子構築物。
[本発明1010]
最終分化細胞が乏突起膠細胞である、本発明1009の組換え遺伝子構築物。
[本発明1011]
第1および第2の遺伝子配列が、SOX10、MYRF、MAG、およびMBPからなる群より選択される遺伝子に由来する、本発明1010の組換え遺伝子構築物。
[本発明1012]
最終分化細胞が星状膠細胞である、本発明1009の組換え遺伝子構築物。
[本発明1013]
第1および第2の遺伝子配列が、GFAPおよびAQP4から選択される遺伝子に由来する、本発明1012の組換え遺伝子構築物。
[本発明1014]
最終分化細胞がニューロンである、本発明1009の組換え遺伝子構築物。
[本発明1015]
第1および第2の遺伝子配列が、SYN1、MAP2、およびELAV4からなる群より選択される遺伝子に由来する、本発明1014の組換え遺伝子構築物。
[本発明1016]
最終分化細胞が、ドーパミン作動性ニューロンであり、第1および第2の遺伝子配列が、THおよびDDCから選択される遺伝子に由来する、本発明1014の組換え遺伝子構築物。
[本発明1017]
最終分化細胞が、中型有棘ニューロンおよび皮質介在ニューロンであり、第1および第2の遺伝子配列が、GAD65およびGAD67から選択される遺伝子に由来する、本発明1014の組換え遺伝子構築物。
[本発明1018]
最終分化細胞がコリン作動性ニューロンであり、第1および第2の遺伝子配列がCHATに由来する、本発明1014の組換え遺伝子構築物。
[本発明1017]
1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするさらなるヌクレオチド配列であって、1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列および/あるいは1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするヌクレオチド配列に連結されたさらなるヌクレオチド配列
をさらに含む、本発明1001～1016のいずれかの組換え遺伝子構築物。
[本発明1018]
1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、shRNA、miRNA、およびsiRNAからなる群より選択される、本発明1017の組換え遺伝子構築物。
[本発明1019]
1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、ヌクレアーゼ欠損Cas9タンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、本発明1017の組換え遺伝子構築物。
[本発明1020]
1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、クラスII主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（CIITA）の発現を低下させる物質である、本発明1017の組換え遺伝子構築物。
[本発明1021]
1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質の翻訳を媒介するのに有効な様式で構築物内に配置されている、1つまたは複数の自己切断ペプチドコードヌクレオチド配列
をさらに含む、本発明1001～1020のいずれかの組換え遺伝子構築物。
[本発明1022]
自己切断ペプチドが、ブタテスコウイルス1 2A（P2A）、トセア・アシグナウイルス（thosea asigna virus）2A（T2A）、ウマ鼻炎Aウイルス2A（E2A）、細胞質多角体病ウイルス（BmCPV 2A）、および軟化病ウイルス（BmIFV 2A）からなる群より選択される、本発明1021の組換え遺伝子構築物。
[本発明1023]
誘導性細胞自殺を達成するのに有効な様式で構築物内に配置された誘導性細胞死遺伝子
をさらに含む、本発明1001～1022のいずれかの組換え遺伝子構築物。
[本発明1024]
誘導性細胞死遺伝子が、カスパーゼ3、カスパーゼ9、およびチミジンキナーゼから選択される、本発明1022の組換え遺伝子構築物。
[本発明1025]
1つまたは複数の細胞の調製物であって、該調製物の細胞が、本発明1001～1024のいずれかの組換え遺伝子構築物を含む、調製物。
[本発明1026]
調製物の細胞が哺乳動物細胞である、本発明1025の調製物。
[本発明1027]
調製物の細胞がヒト細胞である、本発明1025の調製物。
[本発明1028]
調製物の細胞が多能性細胞である、本発明1025の調製物。
[本発明1029]
多能性細胞が人工多能性幹細胞である、本発明1028の調製物。
[本発明1030]
多能性細胞が胚性幹細胞である、本発明1028の調製物。
[本発明1031]
調製物の細胞が前駆細胞である、本発明1025の調製物。
[本発明1032]
前駆細胞がグリア前駆細胞である、本発明1031の調製物。
[本発明1033]
前駆細胞が、乏突起膠細胞に偏った前駆細胞である、本発明1031の調製物。
[本発明1034]
前駆細胞が、星状膠細胞に偏った前駆細胞である、本発明1031の調製物。
[本発明1035]
前駆細胞がニューロン前駆細胞である、本発明1031の調製物。
[本発明1036]
調製物の細胞が最終分化細胞である、本発明1025の調製物。
[本発明1037]
最終分化細胞が、ニューロン、乏突起膠細胞、または星状膠細胞である、本発明1036の調製物。
[本発明1038]
本発明1025～1037のいずれかの調製物を、それを必要とする対象に投与する工程
を含む、方法。
[本発明1039]
ミエリンの減少または乏突起膠細胞の機能不全もしくは減少が媒介する状態を有する対象を治療する方法であって、
該状態を治療するのに有効な条件下で、本発明1032または本発明1033の調製物を対象に投与する工程
を含む、方法。
[本発明1040]
星状膠細胞の機能不全または減少が媒介する状態を有する対象を治療する方法であって、
該状態を治療するのに有効な条件下で、本発明1032または本発明1034の調製物を対象に投与する工程
を含む、方法。
[本発明1041]
ニューロンの機能不全または減少が媒介する状態を有する対象を治療する方法であって、
該状態を治療するのに有効な条件下で、本発明1031または本発明1035の調製物を対象に投与する工程
を含む、方法。
[本発明1042]
調製物を、脳、脳幹、脊髄、またはそれらの組合せの1つまたは複数の部位に投与する、本発明1039～1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
調製物を、脳室内、脳梁内、または実質内に投与する、本発明1042の方法。
[本発明1044]
1つまたは複数の細胞の調製物であって、該調製物の細胞が、
（i）対応する野生型細胞と比較して増加したレベルの1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質、
（ii）対応する野生型細胞と比較して低下したレベルの1つまたは複数のHLA-Iタンパク質、あるいは
（iii）（i）と（ii）の組合せ
を条件付きで発現するように改変されている、調製物。
[本発明1045]
調製物の改変された細胞が最終分化細胞である、本発明1044の調製物。
[本発明1046]
1つまたは複数のHLA-Iタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、およびそれらの組合せからなる群より選択される、本発明1044の調製物。
[本発明1047]
1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質が、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、CD47、CD200、CTL4A、HLE-1、およびそれらの任意の組合せから選択される、本発明1044の調製物。
[本発明1048]
調製物の改変された細胞が、対応する野生型細胞と比較して低下したレベルの1つまたは複数のHLA-IIタンパク質を条件付きで発現する、本発明1044～1047のいずれかの調製物。
[本発明1049]
1つまたは複数のHLA-IIタンパク質が、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、およびそれらの組合せからなる群より選択される、本発明1048の細胞の調製物。
[本発明1050]
（i）増加したレベルの1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質、
（ii）1つまたは複数のHLA-Iタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質、あるいは
（iii）（i）と（ii）の両方
を条件付きで発現するように細胞を改変する工程
を含む、条件付きで免疫保護された細胞を作製する方法。
[本発明1051]
1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質の条件付き発現および1つまたは複数のHLA-1分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質の条件付き発現が、最終分化細胞において限定的に発現される遺伝子に機能的に連結される、本発明1050の方法。
[本発明1052]
最終分化細胞が乏突起膠細胞である、本発明1051の方法。
[本発明1053]
乏突起膠細胞において限定的に発現される遺伝子が、SOX10、MYRF、MAG、およびMBPからなる群より選択される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
最終分化細胞が星状膠細胞である、本発明1051の方法。
[本発明1055]
星状膠細胞において限定的に発現される遺伝子がGFAPまたはAQP4である、本発明1054の方法。
[本発明1056]
最終分化細胞がニューロンである、本発明1051の方法。
[本発明1057]
ニューロンにおいて限定的に発現される遺伝子が、SYN1、MAP2、およびELAV4からなる群より選択される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
最終分化細胞がドーパミン作動性ニューロンであり、ドーパミン作動性ニューロンにおいて限定的に発現される遺伝子がTHまたはDDCである、本発明1051の組換え遺伝子構築物。
[本発明1059]
最終分化細胞が中型有棘ニューロンおよび皮質介在ニューロンであり、中型有棘ニューロンおよび皮質介在ニューロンにおいて限定的に発現される遺伝子がGAD65またはGAD67である、本発明1051の組換え遺伝子構築物。
[本発明1060]
最終分化細胞がコリン作動性ニューロンであり、コリン作動性ニューロンにおいて限定的に発現される遺伝子がアセチルコリントランスフェラーゼである、本発明1051の組換え遺伝子構築物。
[本発明1061]
1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質が、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、CD47、CD200、CTLA4、HLE-A、およびそれらの任意の組合せから選択される、本発明1050の方法。
[本発明1062]
1つまたは複数のHLA-Iタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、およびそれらの組合せからなる群より選択される、本発明1050の方法。
[本発明1063]
1つまたは複数のHLA-Iタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、shRNA、miRNA、およびsiRNAからなる群より選択される、本発明1050の方法。
[本発明1064]
1つまたは複数のHLA-Iタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、ヌクレアーゼ欠損CRISPR-Cas9タンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、本発明1050の方法。
[本発明1065]
1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、β 2 Mの発現を低下させる物質である、本発明1050の方法。
[本発明1066]
1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質を条件付きで発現するように細胞を改変する工程
をさらに含む、本発明1050の方法。
[本発明1067]
1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、クラスII主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（CIITA）の発現を低下させる物質である、本発明1066の方法。
[本発明1068]
1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、shRNA、miRNA、およびsiRNAからなる群より選択される、本発明1062の方法。
[本発明1069]
1つまたは複数のHLA-IIタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、ヌクレアーゼ欠損CRISPR-Cas9タンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、本発明1062の方法。
[本発明1070]
条件付きで免疫保護された細胞が哺乳動物細胞である、本発明1050～1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
条件付きで免疫保護された哺乳動物細胞がヒト細胞である、本発明1070の方法。
[本発明1072]
条件付きで免疫保護された細胞が多能性細胞である、本発明1050～1069のいずれかの方法。
[本発明1073]
条件付きで免疫保護された多能性細胞が人工多能性幹細胞である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
条件付きで免疫保護された多能性細胞が胚性幹細胞である、本発明1073の方法。
[本発明1075]
条件付きで免疫保護された細胞が前駆細胞である、本発明1050～1069のいずれかの方法。
[本発明1076]
条件付きで免疫保護された前駆細胞がグリア前駆細胞である、本発明1075の方法。
[本発明1077]
条件付きで免疫保護された前駆細胞が、乏突起膠細胞に偏った前駆細胞である、本発明1075の方法。
[本発明1078]
条件付きで免疫保護された前駆細胞が、星状膠細胞に偏った前駆細胞である、本発明1075の方法。
[本発明1079]
改変が、
（i）標的遺伝子をその3'非翻訳領域（UTR）の上流の位置で切断する配列特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することであって、該標的遺伝子が細胞特異的に発現される遺伝子である、こと、および
（ii）（a）1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列、
（b）1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするヌクレオチド配列、あるいは
（c）（a）と（b）の両方
を含む組換え遺伝子構築物を該細胞に導入すること
を含み、該組換え遺伝子構築物が、相同組換えによってヌクレアーゼ切断部位で該標的遺伝子に挿入される、本発明1050の方法。
[本発明1080]
配列特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、およびRNAガイドヌクレアーゼからなる群より選択される、本発明1079の方法。
[本発明1081]
配列特異的ヌクレアーゼが、Cas9の形態のRNAガイドヌクレアーゼである、本発明1080の方法。
[本発明1082]
配列特異的ヌクレアーゼが、タンパク質、mRNA、またはcDNAとして細胞に導入される、本発明1079の方法。
Yet another aspect relates to a method of making conditionally immunoprotected cells. The method comprises the steps of: modifying a cell to conditionally express increased levels of one or more immune checkpoint proteins; reducing expression of one or more endogenous HLA proteins; Altering a cell to conditionally express a substance or conditionally express increased levels of one or more immune checkpoint proteins and reduce expression of one or more endogenous HLA proteins. Including modifying the cell to conditionally express one or more substances.
[Invention 1001]
a first gene sequence that is cell-type-specifically expressed;
one or more immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequences located 3' to said first gene sequence; and
a second cell-type-specifically expressed gene sequence located 3' to said immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequence
A recombinant gene construct comprising:
[Invention 1002]
A nucleotide sequence encoding one or more substances that reduce expression of one or more HLA-I molecules, the nucleotide sequence linked to one or more immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequences
The recombinant genetic construct of the invention 1001, further comprising:
[Invention 1003]
a first gene sequence that is cell-type-specifically expressed;
a nucleotide sequence encoding one or more substances that reduce expression of one or more HLA-I molecules located 3' to said first cell-specific gene sequence; and
a second cell type-specifically expressed gene sequence located 3′ to said nucleotide sequence encoding one or more substances that reduce expression of one or more HLA-I molecules
A recombinant gene construct comprising.
[Invention 1004]
one or more immune checkpoint proteins from programmed death ligand 1 (PD-L1), programmed death ligand 2 (PD-L2), CD47, CD200, CTLA-4, HLA-E, and any combination thereof The recombinant gene construct of invention 1001 or invention 1002 that is selected.
[Invention 1005]
1004. The recombinant gene construct of any of inventions 1002-1004, wherein the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-I molecules are selected from the group consisting of shRNAs, miRNAs, and siRNAs.
[Invention 1006]
1004. The recombinant gene construct of any of inventions 1002-1004, wherein the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-I molecules is a nuclease-deficient Cas9 or a zinc finger nuclease.
[Invention 1007]
The recombinant gene construct of any of inventions 1002-1006, wherein the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-I molecules is an agent that reduces expression of β 2 M.
[Invention 1008]
1002 of the invention, wherein the one or more HLA-I molecules are selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, and combinations thereof The recombinant gene construct of any of -1006.
[Invention 1009]
1008. The recombinant gene construct of any of inventions 1001-1008, wherein the first and second gene sequences of the recombinant gene construct are derived from genes that are restrictedly expressed in one or more terminally differentiated cells.
[Invention 1010]
The recombinant gene construct of the invention 1009, wherein the terminally differentiated cell is an oligodendrocyte.
[Invention 1011]
The recombinant gene construct of invention 1010, wherein the first and second gene sequences are derived from a gene selected from the group consisting of SOX10, MYRF, MAG and MBP.
[Invention 1012]
The recombinant genetic construct of the invention 1009, wherein the terminally differentiated cells are astrocytes.
[Invention 1013]
The recombinant gene construct of the invention 1012, wherein the first and second gene sequences are derived from genes selected from GFAP and AQP4.
[Invention 1014]
The recombinant gene construct of the invention 1009, wherein the terminally differentiated cells are neurons.
[Invention 1015]
1014. The recombinant gene construct of the invention 1014, wherein the first and second gene sequences are derived from a gene selected from the group consisting of SYN1, MAP2 and ELAV4.
[Invention 1016]
1014. The recombinant gene construct of the invention 1014, wherein the terminally differentiated cell is a dopaminergic neuron and the first and second gene sequences are derived from a gene selected from TH and DDC.
[Invention 1017]
1014. The recombinant gene construct of the invention 1014, wherein the terminally differentiated cells are medium spiny neurons and cortical interneurons and the first and second gene sequences are derived from genes selected from GAD65 and GAD67.
[Invention 1018]
1014. The recombinant gene construct of the invention 1014, wherein the terminally differentiated cell is a cholinergic neuron and the first and second gene sequences are derived from CHAT.
[Invention 1017]
Further nucleotide sequences encoding one or more substances that reduce expression of one or more HLA-II molecules, comprising one or more immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequences and/or one or more Additional nucleotide sequences linked to nucleotide sequences encoding one or more substances that reduce expression of HLA-I molecules
The recombinant genetic construct of any of inventions 1001-1016, further comprising:
[Invention 1018]
1017. The recombinant gene construct of the invention 1017, wherein the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II molecules are selected from the group consisting of shRNAs, miRNAs, and siRNAs.
[Invention 1019]
The recombinant gene construct of invention 1017, wherein the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II molecules is a nuclease deficient Cas9 protein or a zinc finger nuclease.
[Invention 1020]
1017 of the present invention, wherein the one or more agents that decrease expression of one or more HLA-II molecules is an agent that decreases expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) Recombinant gene construct.
[Invention 1021]
One or more self-cleaving peptide-encoding nucleotide sequences arranged within the construct in a manner effective to mediate translation of one or more immune checkpoint proteins
The recombinant genetic construct of any of inventions 1001-1020, further comprising:
[Invention 1022]
Self-cleaving peptides were isolated from porcine tescovirus 1 2A (P2A), thosea asigna virus 2A (T2A), equine rhinitis A virus 2A (E2A), cytoplasmic polyhedrosis virus (BmCPV 2A), and softening A recombinant gene construct of the invention 1021 selected from the group consisting of disease viruses (BmIFV 2A).
[Invention 1023]
An inducible cell death gene positioned within the construct in a manner effective to effect inducible cell suicide
The recombinant genetic construct of any of inventions 1001-1022, further comprising:
[Invention 1024]
1022. The recombinant gene construct of the invention 1022, wherein the inducible cell death gene is selected from caspase 3, caspase 9, and thymidine kinase.
[Invention 1025]
A preparation of one or more cells, wherein the cells of the preparation comprise the recombinant genetic construct of any of inventions 1001-1024.
[Invention 1026]
A preparation of the invention 1025, wherein the cells of the preparation are mammalian cells.
[Invention 1027]
A preparation of the invention 1025, wherein the cells of the preparation are human cells.
[Invention 1028]
A preparation of the invention 1025, wherein the cells of the preparation are pluripotent cells.
[Invention 1029]
A preparation of the invention 1028, wherein the pluripotent cells are induced pluripotent stem cells.
[Invention 1030]
A preparation of the invention 1028, wherein the pluripotent cells are embryonic stem cells.
[Invention 1031]
A preparation of the invention 1025, wherein the cells of the preparation are progenitor cells.
[Invention 1032]
A preparation of invention 1031, wherein the progenitor cells are glial progenitor cells.
[Invention 1033]
A preparation of invention 1031, wherein the progenitor cells are oligodendrocyte-biased progenitor cells.
[Invention 1034]
A preparation of invention 1031, wherein the progenitor cells are astrocyte-biased progenitor cells.
[Invention 1035]
A preparation of invention 1031, wherein the progenitor cells are neuronal progenitor cells.
[Invention 1036]
A preparation of the invention 1025, wherein the cells of the preparation are terminally differentiated cells.
[Invention 1037]
The preparation of invention 1036, wherein the terminally differentiated cells are neurons, oligodendrocytes, or astrocytes.
[Invention 1038]
administering the preparation of any of the inventions 1025-1037 to a subject in need thereof
A method, including
[Invention 1039]
A method of treating a subject having a condition mediated by loss of myelin or dysfunction or loss of oligodendrocytes, comprising:
administering a preparation of the invention 1032 or invention 1033 to a subject under conditions effective to treat said condition
A method, including
[Invention 1040]
1. A method of treating a subject having a condition mediated by astrocyte dysfunction or depletion, comprising:
administering a preparation of the invention 1032 or invention 1034 to a subject under conditions effective to treat said condition
A method, including
[Invention 1041]
A method of treating a subject having a condition mediated by neuronal dysfunction or loss comprising:
administering a preparation of Invention 1031 or Invention 1035 to a subject under conditions effective to treat said condition
A method, including
[Invention 1042]
The method of any of inventions 1039-1041, wherein the preparation is administered to one or more sites of the brain, brain stem, spinal cord, or combinations thereof.
[Invention 1043]
The method of invention 1042, wherein the preparation is administered intracerebroventricularly, intracorporally, or intraparenchymally.
[Invention 1044]
one or more preparations of cells, the cells of the preparation comprising:
(i) increased levels of one or more immune checkpoint proteins compared to corresponding wild-type cells;
(ii) reduced levels of one or more HLA-I proteins compared to corresponding wild-type cells, or
(iii) a combination of (i) and (ii)
A preparation that has been modified to conditionally express
[Invention 1045]
A preparation of the invention 1044, wherein the modified cells of the preparation are terminally differentiated cells.
[Invention 1046]
The invention 1044 wherein the one or more HLA-I proteins are selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, and combinations thereof preparations.
[Invention 1047]
the one or more immune checkpoint proteins are selected from programmed death ligand 1 (PD-L1), programmed death ligand 2 (PD-L2), CD47, CD200, CTL4A, HLE-1, and any combination thereof A preparation of the invention 1044.
[Invention 1048]
The preparation of any of inventions 1044-1047, wherein the modified cells of the preparation conditionally express reduced levels of one or more HLA-II proteins compared to corresponding wild-type cells.
[Invention 1049]
Preparation of cells of the invention 1048, wherein one or more HLA-II proteins are selected from the group consisting of HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, and combinations thereof thing.
[Invention 1050]
(i) increased levels of one or more immune checkpoint proteins;
(ii) one or more substances that reduce expression of one or more HLA-I proteins, or
(iii) both (i) and (ii)
modifying the cell to conditionally express
A method of making a conditionally immunoprotected cell, comprising:
[Invention 1051]
Conditional expression of one or more immune checkpoint proteins and conditional expression of one or more substances that reduce expression of one or more HLA-1 molecules are expressed exclusively in terminally differentiated cells The method of the invention 1050, which is operably linked to the gene.
[Invention 1052]
The method of invention 1051, wherein the terminally differentiated cell is an oligodendrocyte.
[Invention 1053]
1052. The method of invention 1052, wherein the gene restrictedly expressed in oligodendrocytes is selected from the group consisting of SOX10, MYRF, MAG, and MBP.
[Invention 1054]
1051. The method of invention 1051, wherein the terminally differentiated cells are astrocytes.
[Invention 1055]
1054. The method of invention 1054, wherein the gene that is restrictedly expressed in astrocytes is GFAP or AQP4.
[Invention 1056]
The method of invention 1051, wherein the terminally differentiated cell is a neuron.
[Invention 1057]
1056. The method of invention 1056, wherein the gene restrictedly expressed in neurons is selected from the group consisting of SYN1, MAP2, and ELAV4.
[Invention 1058]
The recombinant gene construct of invention 1051, wherein the terminally differentiated cells are dopaminergic neurons and the gene that is restrictedly expressed in dopaminergic neurons is TH or DDC.
[Invention 1059]
The recombinant gene construct of invention 1051, wherein the terminally differentiated cells are medium spiny neurons and cortical interneurons and the gene that is restrictedly expressed in medium spiny neurons and cortical interneurons is GAD65 or GAD67.
[Invention 1060]
The recombinant gene construct of invention 1051, wherein the terminally differentiated cells are cholinergic neurons and the gene restrictedly expressed in cholinergic neurons is acetylcholine transferase.
[Invention 1061]
the one or more immune checkpoint proteins are selected from programmed death ligand 1 (PD-L1), programmed death ligand 2 (PD-L2), CD47, CD200, CTLA4, HLE-A, and any combination thereof The method of the present invention 1050.
[Invention 1062]
The present invention 1050 wherein the one or more HLA-I proteins are selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, and combinations thereof the method of.
[Invention 1063]
The method of invention 1050, wherein the one or more agents that decrease expression of one or more HLA-I proteins are selected from the group consisting of shRNA, miRNA, and siRNA.
[Invention 1064]
The method of invention 1050, wherein the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-I proteins is a nuclease-deficient CRISPR-Cas9 protein or a zinc finger nuclease.
[Invention 1065]
The method of invention 1050, wherein the one or more agents that decrease expression of one or more HLA-I molecules is an agent that decreases β2M expression .
[Invention 1066]
Modifying the cell to conditionally express one or more substances that reduce expression of one or more HLA-II molecules
The method of the invention 1050, further comprising:
[Invention 1067]
1066 of the invention, wherein the one or more agents that decrease expression of one or more HLA-II molecules is an agent that decreases expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA) Method.
[Invention 1068]
The method of invention 1062, wherein the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II molecules are selected from the group consisting of shRNA, miRNA, and siRNA.
[Invention 1069]
The method of invention 1062, wherein the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II proteins is a nuclease-deficient CRISPR-Cas9 protein or a zinc finger nuclease.
[Invention 1070]
The method of any of inventions 1050-1069, wherein the conditionally immunoprotected cells are mammalian cells.
[Invention 1071]
The method of invention 1070, wherein the conditionally immunoprotected mammalian cells are human cells.
[Invention 1072]
The method of any of inventions 1050-1069, wherein the conditionally immunoprotected cells are pluripotent cells.
[Invention 1073]
The method of invention 1072, wherein the conditionally immunoprotected pluripotent cells are induced pluripotent stem cells.
[Invention 1074]
1073. The method of invention 1073, wherein the conditionally immunoprotected pluripotent cells are embryonic stem cells.
[Invention 1075]
The method of any of inventions 1050-1069, wherein the conditionally immunoprotected cells are progenitor cells.
[Invention 1076]
1075. The method of invention 1075, wherein the conditionally immunoprotected progenitor cells are glial progenitor cells.
[Invention 1077]
1075. The method of invention 1075, wherein the conditionally immunoprotected progenitor cells are oligodendrocyte-biased progenitor cells.
[Invention 1078]
1075. The method of invention 1075, wherein the conditionally immunoprotected progenitor cells are astrocyte-biased progenitor cells.
[Invention 1079]
the modification is
(i) introducing into the cell a sequence-specific nuclease that cleaves the target gene at a position upstream of its 3' untranslated region (UTR), wherein the target gene is a cell-specifically expressed gene; , that, and
(ii) (a) one or more immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequences;
(b) a nucleotide sequence encoding one or more substances that reduce expression of one or more HLA-I molecules, or
(c) both (a) and (b)
introducing into the cell a recombinant gene construct comprising
wherein said recombinant gene construct is inserted into said target gene at a nuclease cleavage site by homologous recombination.
[Invention 1080]
1079. The method of the invention 1079, wherein the sequence-specific nuclease is selected from the group consisting of zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and RNA-guided nucleases.
[Invention 1081]
1080. The method of the invention 1080, wherein the sequence-specific nuclease is an RNA-guided nuclease in the form of Cas9.
[Invention 1082]
1079. The method of invention 1079, wherein the sequence-specific nuclease is introduced into the cell as a protein, mRNA, or cDNA.

Claims (22)

細胞型特異的に発現される第1の遺伝子配列と、
該第1の遺伝子配列の3'側に位置する、1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列、および／または該第1の遺伝子配列の3'側に位置する、1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするヌクレオチド配列と、
該免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列列および／または該1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするヌクレオチド配列の3'側に位置する、細胞型特異的に発現される第2の遺伝子配と、
を含む、組換え遺伝子構築物であって、
任意で、該組換え遺伝子構築物の第1および第2の遺伝子配列が、1つまたは複数の最終分化細胞において限定的に発現される遺伝子に由来する、
組換え遺伝子構築物。 a first gene sequence that is cell-type-specifically expressed;
one or more immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequences located 3' to said first gene sequence and/or one or more HLA located 3' to said first gene sequence -a nucleotide sequence encoding one or more substances that reduce the expression of the I molecule;
located 3′ to said immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequence and/or a nucleotide sequence encoding one or more substances that reduce expression of said one or more HLA-I molecules, cell-type specific a second gene sequence expressed in
A recombinant genetic construct comprising
optionally, the first and second gene sequences of said recombinant gene construct are derived from genes that are restrictedly expressed in one or more terminally differentiated cells;
Recombinant gene construct . 最終分化細胞が、乏突起膠細胞、星状膠細胞、またはニューロンであり、任意で、該ニューロンが、ドーパミン作動性ニューロン、中型有棘ニューロン、皮質介在ニューロン、またはコリン作動性ニューロンであり、任意で、（i）最終分化細胞が乏突起膠細胞である場合に第1および第2の遺伝子配列が、SOX10、MYRF、MAG、およびMBPからなる群より選択される遺伝子に由来し、（ii）最終分化細胞が星状膠細胞である場合に第1および第2の遺伝子配列が、GFAPおよびAQP4から選択される遺伝子に由来し、（iii）最終分化細胞がニューロンである場合に第1および第2の遺伝子配列が、SYN1、MAP2、およびELAV4からなる群より選択される遺伝子に由来し、（iv）最終分化細胞がドーパミン作動性ニューロンである場合に第1および第2の遺伝子配列が、THおよびDDCから選択される遺伝子に由来し、（v）最終分化細胞が中型有棘ニューロンおよび皮質介在ニューロンである場合に第1および第2の遺伝子配列が、GAD65およびGAD67から選択される遺伝子に由来し、（vi）最終分化細胞がコリン作動性ニューロンである場合に第1および第2の遺伝子配列がCHATに由来する、請求項1記載の組換え遺伝子構築物。the terminally differentiated cell is an oligodendrocyte, astrocyte, or neuron, optionally the neuron is a dopaminergic neuron, a medium spiny neuron, a cortical interneuron, or a cholinergic neuron; wherein (i) the first and second gene sequences are derived from a gene selected from the group consisting of SOX10, MYRF, MAG, and MBP when the terminally differentiated cell is an oligodendrocyte; and (ii) (iii) the first and second gene sequences are derived from a gene selected from GFAP and AQP4 when the terminally differentiated cell is an astrocyte; 2 gene sequences are derived from a gene selected from the group consisting of SYN1, MAP2 and ELAV4, and (iv) when the terminally differentiated cell is a dopaminergic neuron, the first and second gene sequences are TH and DDC, and (v) the first and second gene sequences are derived from genes selected from GAD65 and GAD67 when the terminally differentiated cells are medium spiny neurons and cortical interneurons. and (vi) the first and second gene sequences are derived from CHAT when the terminally differentiated cell is a cholinergic neuron. （i）1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質が、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、CD47、CD200、CTLA-4、HLA-E、およびそれらの任意の組合せから選択される、
（ii）1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、（a）shRNA、miRNA、およびsiRNAからなる群より選択される、（b）ヌクレアーゼ欠損Cas9またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、および／または（c）β2Mの発現を低下させる物質である、および／または
（iii）1つまたは複数のHLA-I分子が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、およびそれらの組合せからなる群より選択される、
請求項1または2記載の組換え遺伝子構築物。 (i) one or more immune checkpoint proteins are programmed death ligand 1 (PD-L1), programmed death ligand 2 (PD-L2), CD47, CD200, CTLA-4, HLA-E, and any thereof selected from a combination of
(ii) the one or more agents that reduce the expression of one or more HLA-I molecules are (a) selected from the group consisting of shRNA, miRNA, and siRNA; (b) nuclease-deficient Cas9 or zinc is a finger nuclease, and/or (c) is a substance that reduces the expression of β2M , and/or
(iii) one or more HLA-I molecules are selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, and combinations thereof;
3. The recombinant gene construct of claim 1 or 2 . 1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするさらなるヌクレオチド配列であって、1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列および/あるいは1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするヌクレオチド配列に連結されたさらなるヌクレオチド配列
をさらに含む、請求項1～3のいずれか一項記載の組換え遺伝子構築物であって、任意で、
（i）1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、shRNA、miRNA、およびsiRNAからなる群より選択される、
（ii）1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、ヌクレアーゼ欠損Cas9タンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、および／または
（iii）1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、クラスII主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（CIITA）の発現を低下させる物質である、
組換え遺伝子構築物。 Further nucleotide sequences encoding one or more substances that reduce expression of one or more HLA-II molecules, comprising one or more immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequences and/or one or more 4. The recombinant genetic construct of any one of claims 1-3 , further comprising a further nucleotide sequence linked to the nucleotide sequence encoding one or more substances that reduce the expression of HLA-I molecules, , optionally,
(i) the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II molecules are selected from the group consisting of shRNAs, miRNAs, and siRNAs;
(ii) the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II molecules are nuclease-deficient Cas9 proteins or zinc finger nucleases, and/or
(iii) the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II molecules is an agent that reduces expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA);
Recombinant gene construct. 1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質の翻訳を媒介するのに有効な様式で構築物内に配置されている、1つまたは複数の自己切断ペプチドコードヌクレオチド配列
をさらに含む、請求項1～4のいずれか一項記載の組換え遺伝子構築物であって、任意で、自己切断ペプチドが、ブタテスコウイルス1 2A（P2A）、トセア・アシグナウイルス（thosea asigna virus）2A（T2A）、ウマ鼻炎Aウイルス2A（E2A）、細胞質多角体病ウイルス（BmCPV 2A）、および軟化病ウイルス（BmIFV 2A）からなる群より選択される、組換え遺伝子構築物。 5. Any of claims 1-4 , further comprising one or more self-cleaving peptide-encoding nucleotide sequences arranged within the construct in a manner effective to mediate translation of one or more immune checkpoint proteins. or the recombinant genetic construct of claim 1 , wherein optionally the self-cleaving peptide is porcine tescovirus 1 2A (P2A), thosea asigna virus 2A (T2A), equine rhinitis A virus 2A (E2A), cytoplasmic polyhedrosis virus (BmCPV 2A), and facile disease virus (BmIFV 2A). 誘導性細胞自殺を達成するのに有効な様式で構築物内に配置された誘導性細胞死遺伝子
をさらに含む、請求項1～5のいずれか一項記載の組換え遺伝子構築物であって、任意で、誘導性細胞死遺伝子が、カスパーゼ3、カスパーゼ9、およびチミジンキナーゼから選択される、組換え遺伝子構築物。 6. The recombinant gene construct of any one of claims 1-5 , further comprising an inducible cell death gene positioned within the construct in a manner effective to effect inducible cell suicide; , a recombinant gene construct wherein the inducible cell death gene is selected from caspase 3, caspase 9 and thymidine kinase. 1つまたは複数の細胞の調製物であって、該調製物の細胞が、請求項1～6のいずれか一項記載の組換え遺伝子構築物を含み、任意で、調製物の細胞が、（ヒト細胞のような）哺乳動物細胞、（人工多能性幹細胞または胚性幹細胞のような）多能性細胞、（グリア前駆細胞、乏突起膠細胞に偏った前駆細胞、星状膠細胞に偏った前駆細胞、またはニューロン前駆細胞のような）前駆細胞、または（ニューロン、乏突起膠細胞、または星状膠細胞のような）最終分化細胞である、調製物。 A preparation of one or more cells, the cells of the preparation comprising the recombinant gene construct of any one of claims 1-6 , and optionally the cells of the preparation comprising ( mammalian cells (such as human cells), pluripotent cells (such as induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells), glial progenitors, oligodendrocyte-biased progenitors, astrocyte-biased progenitor cells, or progenitor cells (such as neuronal progenitor cells), or terminally differentiated cells (such as neurons, oligodendrocytes, or astrocytes). 必要とする対象を治療する方法に用いるための請求項7記載の1つまたは複数の細胞の調製物。 8. A preparation of one or more cells according to claim 7 for use in a method of treating a subject in need thereof. 対象においてミエリンの減少または乏突起膠細胞の機能不全もしくは減少が媒介する状態を治療する方法に用いるための請求項7記載の1つまたは複数の細胞の調製物であって、該方法が、
ミエリンの減少または乏突起膠細胞の機能不全もしくは減少が媒介する状態を有する対象に、該対象において該状態を治療するのに有効な条件下で、該調製物を投与する工程であって、該調製物の細胞が、グリア前駆細胞または乏突起膠細胞に偏った前駆細胞である、工程
を含む、調製物。 8. A preparation of one or more cells according to claim 7 for use in a method of treating a condition mediated by myelin loss or oligodendrocyte dysfunction or loss in a subject , said method comprising:
administering said preparation to a subject having a condition mediated by myelin loss or oligodendrocyte dysfunction or loss under conditions effective to treat said condition in said subject , said wherein the cells of the preparation are glial progenitor cells or oligodendrocyte-biased progenitor cells
A preparation , comprising: 対象において星状膠細胞の機能不全または減少が媒介する状態を治療する方法に用いるための請求項7記載の1つまたは複数の細胞の調製物であって、該方法が、
星状膠細胞の機能不全または減少が媒介する状態を有する対象に、該対象において該状態を治療するのに有効な条件下で、該調製物を投与する工程であって、該調製物の細胞が、グリア前駆細胞または星状膠細胞に偏った前駆細胞である、工程
を含む、調製物。 8. A preparation of one or more cells according to claim 7 for use in a method of treating a condition mediated by astrocyte dysfunction or depletion in a subject, said method comprising :
administering the preparation to a subject having a condition mediated by astrocyte dysfunction or depletion under conditions effective to treat the condition in the subject , wherein the cells of the preparation are glial progenitor cells or astrocyte-biased progenitor cells
A preparation , comprising: 対象においてニューロンの機能不全または減少が媒介する状態を治療する方法に用いるための請求項7記載の1つまたは複数の細胞の調製物であって、該方法が、
ニューロンの機能不全または減少が媒介する状態を有する対象に、該対象において該状態を治療するのに有効な条件下で、該調製物を投与する工程であって、該調製物の細胞が、前駆細胞またはニューロン前駆細胞である、工程
を含む、調製物。 8. A preparation of one or more cells according to claim 7 for use in a method of treating a condition mediated by neuronal dysfunction or loss in a subject, said method comprising :
administering the preparation to a subject having a condition mediated by neuronal dysfunction or loss under conditions effective to treat the condition in the subject , wherein the cells of the preparation are progenitor is a cell or neuronal progenitor cell
A preparation , comprising: 調製物が、脳、脳幹、脊髄、またはそれらの組合せの1つまたは複数の部位に投与され、任意で、調製物が、脳室内、脳梁内、または実質内に投与される、請求項8～11のいずれか一項記載の調製物。 8. The preparation is administered to one or more sites in the brain, brainstem, spinal cord, or combinations thereof, optionally the preparation is administered intracerebroventricularly, intracorporally, or intraparenchymally. 12. The preparation of any one of -11 . 1つまたは複数の細胞の調製物であって、該調製物の細胞が最終的に分化した場合に、該細胞が、
（i）対応する野生型細胞と比較して増加したレベルの1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質であって、任意で、該1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質が、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、CD47、CD200、CTL4A、HLE-1、およびそれらの任意の組合せから選択される、1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質、
（ii）対応する野生型細胞と比較して低下したレベルの1つまたは複数のHLA-Iタンパク質であって、任意で、該1つまたは複数のHLA-Iタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、およびそれらの組合せからなる群より選択される、1つまたは複数のHLA-Iタンパク質、あるいは
（iii）（i）と（ii）の組合せ
を発現する、調製物。 A preparation of one or more cells, wherein when the cells of the preparation are terminally differentiated, the cells
(i) an increased level of one or more immune checkpoint proteins compared to a corresponding wild-type cell , optionally wherein said one or more immune checkpoint proteins are programmed death ligand 1 (PD -L1), one or more immune checkpoint proteins selected from programmed death ligand 2 (PD-L2), CD47, CD200, CTL4A, HLE-1, and any combination thereof;
(ii) reduced levels of one or more HLA-I proteins compared to a corresponding wild-type cell , optionally wherein the one or more HLA-I proteins are HLA-A, HLA- one or more HLA-I proteins selected from the group consisting of B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, and combinations thereof; or (iii) (i) and (ii) ) combination
A preparation that expresses 調製物の改変された細胞が最終分化細胞である、請求項13記載の調製物。 14. The preparation of claim 13 , wherein the modified cells of the preparation are terminally differentiated cells. 調製物の改変された細胞が、対応する野生型細胞と比較して低下したレベルの1つまたは複数のHLA-IIタンパク質を条件付きで発現し、任意で、該1つまたは複数のHLA-IIタンパク質が、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項13記載の調製物。 the modified cells of the preparation conditionally express reduced levels of one or more HLA-II proteins compared to corresponding wild-type cells; 14. The preparation of Claim 13 , wherein the protein is selected from the group consisting of HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR, and combinations thereof. 請求項13記載の1つまたは複数の細胞の調製物を作製する方法であって、該方法が、
（i）増加したレベルの1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質、
（ii）1つまたは複数のHLA-Iタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質、あるいは
（iii）（i）と（ii）の両方
を条件付きで発現するように細胞を改変する工程
を含み、任意で、該1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質の条件付き発現および1つまたは複数のHLA-1分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質の条件付き発現が、最終分化細胞において限定的に発現される遺伝子に機能的に連結される、方法。 14. A method of making a preparation of one or more cells according to claim 13 , said method comprising
(i) increased levels of one or more immune checkpoint proteins;
(ii) modifying the cell to conditionally express one or more substances that reduce expression of one or more HLA-I proteins, or (iii) both (i) and (ii). optionally conditional expression of said one or more immune checkpoint proteins and conditional expression of one or more substances that reduce expression of one or more HLA-1 molecules is terminally differentiated A method that is operably linked to a gene that is limitedly expressed in a cell. 最終分化細胞が、乏突起膠細胞、星状膠細胞、またはニューロンであり、任意で、該ニューロンが、ドーパミン作動性ニューロン、中型有棘ニューロン、皮質介在ニューロン、またはコリン作動性ニューロンであり、任意で、the terminally differentiated cell is an oligodendrocyte, astrocyte, or neuron, optionally the neuron is a dopaminergic neuron, a medium spiny neuron, a cortical interneuron, or a cholinergic neuron; and,
（i）最終分化細胞が乏突起膠細胞である場合に、乏突起膠細胞において限定的に発現される遺伝子が、SOX10、MYRF、MAG、およびMBPからなる群より選択される、(i) when the terminally differentiated cell is an oligodendrocyte, the gene that is restrictedly expressed in the oligodendrocyte is selected from the group consisting of SOX10, MYRF, MAG, and MBP;
（ii）最終分化細胞が星状膠細胞である場合に、星状膠細胞において限定的に発現される遺伝子がGFAPまたはAQP4である、(ii) when the terminally differentiated cell is an astrocyte, the gene that is restrictedly expressed in astrocytes is GFAP or AQP4;
（iii）最終分化細胞がニューロンである場合に、ニューロンにおいて限定的に発現される遺伝子が、SYN1、MAP2、およびELAV4からなる群より選択される、(iii) when the terminally differentiated cell is a neuron, the gene restrictedly expressed in the neuron is selected from the group consisting of SYN1, MAP2, and ELAV4;
（iv）最終分化細胞がドーパミン作動性ニューロンである場合に、ドーパミン作動性ニューロンにおいて限定的に発現される遺伝子がTHまたはDDCである、(iv) when the terminally differentiated cells are dopaminergic neurons, the gene that is restrictedly expressed in dopaminergic neurons is TH or DDC;
（v）最終分化細胞が中型有棘ニューロンおよび皮質介在ニューロンである場合に、中型有棘ニューロンおよび皮質介在ニューロンにおいて限定的に発現される遺伝子がGAD65またはGAD67である、または(v) when the terminally differentiated cells are medium spiny neurons and cortical interneurons, the gene that is restrictedly expressed in medium spiny neurons and cortical interneurons is GAD65 or GAD67, or
（vi）最終分化細胞がコリン作動性ニューロンである場合に、コリン作動性ニューロンにおいて限定的に発現される遺伝子がアセチルコリントランスフェラーゼである、(vi) when the terminally differentiated cell is a cholinergic neuron, the gene that is restrictedly expressed in cholinergic neurons is acetylcholine transferase;
請求項16記載の方法。17. The method of claim 16. （i）1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質が、CD47、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、CD200、CTLA4、HLE-A、およびそれらの任意の組合せから選択される、
（ii）1つまたは複数のHLA-Iタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、（a）shRNA、miRNA、およびsiRNAからなる群より選択される、（b）ヌクレアーゼ欠損CRISPR-Cas9タンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、および／またはβ2Mの発現を低下させる物質である、および／または
（iii）1つまたは複数のHLA-I分子が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、およびそれらの組合せからなる群より選択される、
請求項16または17記載の方法。 (i) one or more immune checkpoint proteins are CD47, programmed death ligand 1 (PD-L1), programmed death ligand 2 (PD-L2), CD200, CTLA4, HLE-A, and any combination thereof selected from
(ii) the one or more agents that reduce the expression of one or more HLA-I proteins are (a) selected from the group consisting of shRNAs, miRNAs and siRNAs, (b) nuclease-deficient CRISPR-Cas9 is a protein or zinc finger nuclease, and/or is a substance that reduces the expression of β2M , and/or
(iii) one or more HLA-I molecules are selected from the group consisting of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, and combinations thereof;
18. A method according to claim 16 or 17 . 1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質を条件付きで発現するように細胞を改変する工程
をさらに含む、請求項16～18のいずれか一項記載の方法であって、任意で、
（i）1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、shRNA、miRNA、およびsiRNAからなる群より選択される、
（ii）1つまたは複数のHLA-IIタンパク質の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、ヌクレアーゼ欠損CRISPR-Cas9タンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、および／または
（iii）1つまたは複数のHLA-II分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質が、クラスII主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（CIITA）の発現を低下させる物質である、
請求項16～18のいずれか一項記載の方法。 19. The method of any one of claims 16-18 , further comprising modifying the cell to conditionally express one or more substances that reduce expression of one or more HLA-II molecules. and optionally
(i) the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II molecules are selected from the group consisting of shRNAs, miRNAs, and siRNAs;
(ii) the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II proteins are nuclease-deficient CRISPR-Cas9 proteins or zinc finger nucleases, and/or
(iii) the one or more agents that reduce expression of one or more HLA-II molecules is an agent that reduces expression of class II major histocompatibility complex transactivator (CIITA);
The method according to any one of claims 16-18 . 条件付きで免疫保護された細胞が、（ヒト細胞のような）哺乳動物細胞、（人工多能性幹細胞または胚性幹細胞のような）多能性細胞、または（グリア前駆細胞、乏突起膠細胞に偏った前駆細胞、星状膠細胞に偏った前駆細胞、またはニューロン前駆細胞のような）前駆細胞である、16～19のいずれか一項記載の方法。 The conditionally immunoprotected cells are mammalian cells (such as human cells), pluripotent cells (such as induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells), or (glial progenitor cells, oligodendrocytes) 20. The method of any one of claims 16-19, wherein the progenitor cell is an astrocyte-biased progenitor cell, an astrocyte-biased progenitor cell, or a neuronal progenitor cell). 改変が、
（i）標的遺伝子をその3'非翻訳領域（UTR）の上流の位置で切断する配列特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することであって、該標的遺伝子が細胞特異的に発現される遺伝子である、こと、および
（ii）（a）1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質コードヌクレオチド配列、
（b）1つまたは複数のHLA-I分子の発現を低下させる1つまたは複数の物質をコードするヌクレオチド配列、あるいは
（c）（a）と（b）の両方
を含む組換え遺伝子構築物を該細胞に導入すること
を含み、該組換え遺伝子構築物が、相同組換えによってヌクレアーゼ切断部位で該標的遺伝子に挿入される、請求項16記載の方法。 the modification is
(i) introducing into the cell a sequence-specific nuclease that cleaves the target gene at a position upstream of its 3' untranslated region (UTR), wherein the target gene is a cell-specifically expressed gene; and (ii) (a) one or more immune checkpoint protein-encoding nucleotide sequences,
(b) a nucleotide sequence encoding one or more agents that reduce expression of one or more HLA-I molecules; or (c) a recombinant genetic construct comprising both (a) and (b). 17. The method of claim 16 , comprising introducing into a cell, wherein said recombinant gene construct is inserted into said target gene at a nuclease cleavage site by homologous recombination. 配列特異的ヌクレアーゼが、
（i）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、およびRNAガイドヌクレアーゼからなる群より選択される、
（ii）Cas9の形態のRNAガイドヌクレアーゼである、または
（iii）タンパク質、mRNA、またはcDNAとして細胞に導入される、
請求項21記載の方法。 A sequence-specific nuclease is
(i) selected from the group consisting of zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and RNA-guided nucleases;
(ii) is an RNA-guided nuclease in the form of Cas9, or
(iii) introduced into the cell as protein, mRNA, or cDNA;
22. The method of claim 21 .
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