ベクターのコピー数を、さまざまな器官においてさらに測定し、片側ＩＣＶによってＡＡＶ９が投与された場合に、身体全体にわたる組織中のＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａの形質導入を評価した。ｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写物レベルも、ｄｄＰＣＲによって測定して、片側ＩＣＶによってＡＡＶ９が投与された場合に、身体全体にわたる組織中のＧＡＢＡ選択的調節エレメントのＲＥＧＡＢＡの制御下のｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写活性を評価した。両方の方法を、上記に一般に記載されるようにして行った。脊髄（ＳＣ）および後根神経節（ＤＲＧ）中のＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａ形質導入およびｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写は、脳中で観察されたレベルと同等であった。肝臓を除いて、ＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａ形質導入は、脳の外側の末梢組織において、より低かった（図１３）。肝臓におけるＲＥＧＡＢＡ－ｅＴＦＳＣＮ１Ａの形質導入は、脳中よりも高かった。ｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写は、心臓、肺および生殖腺を含む末梢組織において検出されなかった。しかしながら、肝臓におけるｅＴＦＳＣＮ１Ａ転写物レベルは、脳において測定されたｅＴＦＳＣＮ１Ａのレベルと同等であった。さらにまた、肝臓におけるｅＴＦＳＣＮ１Ａ転写は、存在するベクターコピー数に対して正規化された場合に、極めて低かった（脳におけるｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写と比較して、およそ１０００倍低い）。全体として、これは、ＧＡＢＡ選択的調節エレメントのＲＥＧＡＢＡの制御下のｅＴＦＳＣＮ１Ａの転写が、ＣＮＳに限定されることを実証した。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、前記天然に存在しない転写因子が、少なくとも２つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）に、以下の様式：ＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ、ＤＢＤ－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４またはＴＡＤ１－ＴＡＤ２－ＤＢＤ－ＴＡＤ３－ＴＡＤ４で作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む、発現カセット。
(項目２)
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、独立して、以下：ＶＰ１６、ＶＰ６４、Ｖｉｐｅｒ、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４、ＣＲＥＢ３、またはそれらの機能的断片から選択される、項目１に記載の発現カセット。
(項目３)
ＴＡＤ１およびＴＡＤ２が、同じＴＡＤである、項目１または２に記載の発現カセット。
(項目４)
ＴＡＤ１およびＴＡＤ２が、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である、項目３に記載の発現カセット。
(項目５)
ＴＡＤ１およびＴＡＤ２が、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である、項目３に記載の発現カセット。
(項目６)
ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、同じＴＡＤである、項目１～５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目７)
ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である、項目６に記載の発現カセット。
(項目８)
ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である、項目６に記載の発現カセット。
(項目９)
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、同じＴＡＤである、項目１または２に記載の発現カセット。
(項目１０)
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、ＣＩＴＥＤ２またはその機能的断片である、項目９に記載の発現カセット。
(項目１１)
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２、ＴＡＤ３およびＴＡＤ４が、ＣＩＴＥＤ４またはその機能的断片である、項目９に記載の発現カセット。
(項目１２)
少なくとも２つのＴＡＤドメインの間にリンカーが存在しない、項目１～１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１３)
少なくとも２つのＴＡＤドメインの間にリンカーが存在する、項目１～１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１４)
前記リンカーが、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７７）またはＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１７８）である、項目１３に記載の発現カセット。
(項目１５)
前記ＤＢＤが、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１～１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１６)
前記ＤＢＤが、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１７)
前記ＤＢＤが、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目１６に記載の発現カセット。
(項目１８)
前記ＤＢＤおよび前記少なくとも２つのＴＡＤが、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性をそれぞれ含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１９)
前記ＤＢＤおよび前記少なくとも２つのＴＡＤが、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性をそれぞれ含む、項目１８に記載の発現カセット。
(項目２０)
前記ＤＢＤが、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目２１)
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、項目２０に記載の発現カセット。
(項目２２)
前記ＤＢＤが、ジンクフィンガードメインを含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目２３)
前記ＤＢＤが、６～９個のジンクフィンガードメインを含む、項目２２に記載の発現カセット。
(項目２４)
前記ＤＢＤが、６個のジンクフィンガーを含む、項目２３に記載の発現カセット。
(項目２５)
前記ＤＢＤが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目２４に記載の発現カセット。
(項目２６)
前記ＤＢＤが、９個のジンクフィンガーを含む、項目２３に記載の発現カセット。
(項目２７)
前記ＤＢＤが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目２６に記載の発現カセット。
(項目２８)
前記ＤＢＤが、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１～１９または２２～２７のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目２９)
前記ＤＢＤが、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む、項目２８に記載の発現カセット。
(項目３０)
前記ＤＢＤが、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する、項目１～１９または２２～２９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目３１)
前記ＤＢＤが、配列番号７７～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１～１９または２２～３０のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目３２)
前記ＤＢＤが、配列番号７７～９８を含む、項目３１に記載の発現カセット。
(項目３３)
前記ＤＢＤが、配列番号９２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１に記載の発現カセット。
(項目３４)
前記ＤＢＤが、配列番号９２を含む、項目３３に記載の発現カセット。
(項目３５)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１３０または１３１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１に記載の発現カセット。
(項目３６)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１３０または１３１を含む、項目３５に記載の発現カセット。
(項目３７)
配列番号７２または７３のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の発現カセット。
(項目３８)
配列番号７２または７３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、項目３７に記載の発現カセット。
(項目３９)
前記発現カセットが、他の細胞型におけるよりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルで前記転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、項目１～３８のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目４０)
前記調節エレメントが、配列番号１～４のいずれか１つを含む、項目３９に記載の発現カセット。
(項目４１)
前記調節エレメントが、配列番号２または３を含む、項目４０に記載の発現カセット。
(項目４２)
前記発現カセットが、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む、項目１～４１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目４３)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を含む、項目４２に記載の発現カセット。
(項目４４)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つを含む、項目４３に記載の発現カセット。
(項目４５)
前記発現カセットが、ウイルスベクターの一部である、項目１～４４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目４６)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶウイルスである、項目４５に記載の発現カセット。
(項目４７)
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、項目４６に記載の発現カセット。
(項目４８)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目４５に記載の発現カセット。
(項目４９)
細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、前記天然に存在しない転写因子が、転写活性化ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質であり、前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの間にＨＡタグ（配列番号１７１）が存在しない、発現カセット。
(項目５０)
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰＲもしくはＶＰ６４配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目４９のいずれか一項に記載の発現カセット
(項目５１)
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ６４を含む、項目５０に記載の発現カセット
(項目５２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目４９～５１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目５３)
ｎ＝６～９である、項目４９～５２のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目５４)
ｎ＝６である、項目５３に記載の発現カセット。
(項目５５)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目５４に記載の発現カセット。
(項目５６)
ｎ＝９である、項目５３に記載の発現カセット。
(項目５７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目５６に記載の発現カセット。
(項目５８)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目４９～５７のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目５９)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む、項目５８に記載の発現カセット。
(項目６０)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目４９～５９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目６１)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む、項目６０に記載の発現カセット。
(項目６２)
前記発現カセットが、他の細胞型におけるよりもＰＶニューロンにおいてより高いレベルで前記転写因子の発現を駆動する調節エレメントをさらに含む、項目４９～６１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目６３)
前記調節エレメントが、配列番号１～４のいずれか１つを含む、項目６２に記載の発現カセット。
(項目６４)
前記調節エレメントが、配列番号２または３を含む、項目６３に記載の発現カセット。
(項目６５)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１２７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目４９に記載の発現カセット。
(項目６６)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１２７を含む、項目６５に記載の発現カセット。
(項目６７)
配列番号７０または７１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目４９に記載の発現カセット。
(項目６８)
配列番号７０または７１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、項目６７に記載の発現カセット。
(項目６９)
前記発現カセットが、ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む、項目１～６８のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目７０)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を含む、項目６９に記載の発現カセット。
(項目７１)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つを含む、項目７０に記載の発現カセット。
(項目７２)
前記発現カセットが、ウイルスベクターの一部である、項目４９～７１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目７３)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶウイルスである、項目７２に記載の発現カセット。
(項目７４)
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、項目７３に記載の発現カセット。
(項目７５)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目７２に記載の発現カセット。
(項目７６)
配列番号１４または１５と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドであって、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける導入遺伝子の発現を低減させる、ポリヌクレオチド。
(項目７７)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１４を含む、項目７６に記載のポリヌクレオチド。
(項目７８)
前記ＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１５を含む、項目７６に記載のポリヌクレオチド。
(項目７９)
項目７６～７８のいずれか一項に記載のＰＶ選択的マイクロＲＮＡ結合部位、ならびにプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む発現カセット。
(項目８０)
前記プロモーターおよび／またはエンハンサーが、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで前記導入遺伝子の発現を駆動するＰＶ選択的調節エレメントである、項目７９に記載の発現カセット。
(項目８１)
前記ＰＶ選択的調節エレメントが、導入遺伝子に作動可能に連結されている、項目８０に記載の発現カセット。
(項目８２)
導入遺伝子および少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位に作動可能に連結された調節エレメントを含む発現カセットであって、前記調節エレメントが、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで前記導入遺伝子の発現を駆動し、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける前記導入遺伝子の発現を低減させ、前記発現カセットが、配列番号６７を含まない、発現カセット。
(項目８３)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２に記載の発現カセット。
(項目８４)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２または８３に記載の発現カセット。
(項目８５)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２～８４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目８６)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２に記載の発現カセット。
(項目８７)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目８２に記載の発現カセット。
(項目８８)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目８２～８４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目８９)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７を含む、項目８８に記載の発現カセット。
(項目９０)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１４を含む、項目８９に記載の発現カセット。
(項目９１)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１５を含む、項目８９に記載の発現カセット。
(項目９２)
前記導入遺伝子が、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子を含むポリペプチドをコードする、項目８１～９１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９３)
前記転写因子が、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目９２に記載の発現カセット。
(項目９４)
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインを含む、項目９２または９３のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９５)
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、項目９２～９４のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９６)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目９２～９５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目９６に記載の発現カセット。
(項目９８)
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの両方が、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目９２～９６のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目９９)
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの両方が、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目９８に記載の発現カセット。
(項目１００)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む、項目９２～９５のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１０１)
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、項目１００に記載の発現カセット。
(項目１０２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインを含む、項目９２～９９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１０３)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６～９個のジンクフィンガードメインを含む、項目１０２に記載の発現カセット。
(項目１０４)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含む、項目１０３に記載の発現カセット。
(項目１０５)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１０４に記載の発現カセット。
(項目１０６)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、９個のジンクフィンガーを含む、項目１０３に記載の発現カセット。
(項目１０７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１０６に記載の発現カセット。
(項目１０８)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目９２～９９または１０２～１０７のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１０９)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む、項目１０８に記載の発現カセット。
(項目１１０)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９２～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目９２～９９または１０２～１０９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１１)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９２～９８のいずれか１つを含む、項目１１０に記載の発現カセット。
(項目１１２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質である、項目９２～９９または１０２～１１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１３)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１１１または１１２に記載の発現カセット。
(項目１１４)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む、項目１１３のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１５)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する、項目９２～９９または１０２～１１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１６)
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目９５～９９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１７)
前記転写活性化ドメインが、ヒトＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目９２～９９のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１８)
前記調節エレメントが、配列番号１～４のいずれか１つを有する配列を含む、項目８１～１１７のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１１９)
前記調節エレメントが、配列番号２または３を有する配列を含む、項目１１８に記載の発現カセット。
(項目１２０)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目８１または８２に記載の発現カセット。
(項目１２１)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つを含む、項目１２０に記載の発現カセット。
(項目１２２)
前記導入遺伝子が、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目８１、８２または１２０に記載の発現カセット。
(項目１２３)
前記導入遺伝子が、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つを含む、項目１２２に記載の発現カセット。
(項目１２４)
前記発現カセットが、ウイルスベクターの一部である、項目８１～１２３のいずれか一項に記載の発現カセット。
(項目１２５)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶウイルスである、項目１２４に記載の発現カセット。
(項目１２６)
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、項目１２５に記載の発現カセット。
(項目１２７)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目１２４に記載の発現カセット。
(項目１２８)
霊長類のパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現のための方法であって、霊長類に、導入遺伝子および少なくとも１つのマクロＲＮＡ結合部位を含むウイルスベクターを投与するステップを含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、興奮性ニューロンにおける前記導入遺伝子の発現を低減させる、方法。
(項目１２９)
前記ウイルスベクターが、前記導入遺伝子に作動可能に連結された調節エレメントをさらに含み、前記調節エレメントが、他の細胞型におけるよりもパルブアルブミン（ＰＶ）ニューロンにおいてより高いレベルで前記導入遺伝子の発現を駆動する、項目１２８に記載の方法。
(項目１３０)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８または１２９に記載の方法。
(項目１３１)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８～１３０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３２)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８～１３１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３３)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８に記載の方法。
(項目１３４)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＭＩＲ１２８（配列番号９）に対する少なくとも１つの結合部位、ＭＩＲ２２１（配列番号１１）に対する少なくとも１つの結合部位、およびＭＩＲ２２２（配列番号１３）に対する少なくとも１つの結合部位を含む、項目１２８に記載の方法。
(項目１３５)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７、１４または１５のいずれかと少なくとも９０％の同一性である配列を含む、項目１２８～１３４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３６)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号７を含む、項目１３５に記載の方法。
(項目１３７)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１４を含む、項目１３５に記載の方法。
(項目１３８)
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１５を含む、項目１３５に記載の方法。
(項目１３９)
前記導入遺伝子が、細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む、項目１２８～１３８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４０)
前記転写因子が、１８～２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１３９に記載の方法。
(項目１４１)
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインを含む、項目１３９または１４０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４２)
前記転写因子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む、項目１３９～１４１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４３)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目１３９～１４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４４)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、その最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目１４３に記載の方法。
(項目１４５)
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの両方が、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも８０％の配列同一性を含む、項目１４２または１４３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４６)
前記ＤＮＡ結合ドメインおよび前記転写活性化ドメインの両方が、それらの最も近いヒト対応物と少なくとも９０％の配列同一性を含む、項目１４５に記載の方法。
(項目１４７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質を含む、項目１３９～１４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４８)
前記ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓタンパク質が、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９である、項目１４７に記載の方法。
(項目１４９)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガードメインを含む、項目１３９～１４６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５０)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６～９個のジンクフィンガードメインを含む、項目１４９に記載の方法。
(項目１５１)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含む、項目１５０に記載の方法。
(項目１５２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１８ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１５１に記載の方法。
(項目１５３)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、９個のジンクフィンガーを含む、項目１５０に記載の方法。
(項目１５４)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、２７ヌクレオチドを有するゲノム領域に結合する、項目１５３に記載の方法。
(項目１５５)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、１４８～１５１のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、項目１３９～１４６または１４９～１５４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５６)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１４８～１５１のいずれか１つを有する配列を含む、項目１５５に記載の方法。
(項目１５７)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトＥＧＲ１またはヒトＥＧＲ３に由来する、項目１３９～１４６または１４９～１５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５８)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９２～９８のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１３９～１４６または１４９～１５７のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５９)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号９２～９８のいずれか１つを含む、項目１５８に記載の方法。
(項目１６０)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ ＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ Ｘ ＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（配列番号１４７）を含むジンクフィンガータンパク質である、項目１３９～１４６または１４９～１５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６１)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１６０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６２)
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号７７～９１のいずれか１つを含む、項目１６１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６３)
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰＲ、ＶＰ６４、ＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目１４２～１６２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６４)
前記転写活性化ドメインが、ヒトＣＩＴＥＤ２、ＣＩＴＥＤ４もしくはＣＲＥＢ３配列、またはそれらの機能的断片を含む、項目１６３に記載の方法。
(項目１６５)
前記調節エレメントが、配列番号１～４のいずれか１つを有する配列を含む、項目１２８～１６４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６６)
前記調節エレメントが、配列番号２または３を有する配列を含む、項目１６５に記載の方法。
(項目１６７)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１３９に記載の方法。
(項目１６８)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１０５、１０６および１２７～１２９のいずれか１つを含む、項目１６７に記載の方法。
(項目１６９)
前記導入遺伝子が、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１３９に記載の方法。
(項目１７０)
前記導入遺伝子が、配列番号７１、７４、７５、７６または１８４のいずれか１つを含む、項目１６９に記載の方法。
(項目１７１)
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶウイルスである、項目１２８～１７０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７２)
前記ＡＡＶウイルスが、ＡＡＶ９ウイルスまたはｓｃＡＡＶ９ウイルスである、項目１７１に記載の方法。
(項目１７３)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスである、項目１２８～１７０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７４)
前記霊長類が、ヒトである、項目１２８～１７３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７５)
前記霊長類が、非ヒト霊長類である、項目１２８～１７３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７６)
前記非ヒト霊長類が、旧世界ザル、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー、マーモセット、カニクイザル、アカゲザルまたはブタオザルである、項目１７５に記載の方法。
(項目１７７)
細胞におけるＳＣＮ１Ａ遺伝子の発現を増加させる天然に存在しない転写因子をコードする配列を含む発現カセットであって、前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１２８または１２９と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、発現カセット。
(項目１７８)
前記天然に存在しない転写因子が、配列番号１２８または１２９を含む、項目１７７に記載の発現カセット。
(項目１７９)
項目１～１２７または１７７～１７８のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することによる、細胞におけるＳＣＮ１Ａの発現を増加させる方法。
(項目１８０)
前記細胞が、ＰＶニューロンである、項目１７９に記載の方法。
(項目１８１)
前記細胞が、対象内にある、項目１７９または１８０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８２)
前記対象が、哺乳動物である、項目１８１に記載の方法。
(項目１８３)
前記対象が、ヒトである、項目１８２に記載の方法。
(項目１８４)
ＳＣＮ１Ａの発現を増加させることが、疾患、障害または症状を処置する、項目１７９～１８３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８５)
前記障害が、中枢神経系障害である、項目１８４に記載の方法。
(項目１８６)
前記障害が、ＳＣＮ１Ａハプロ不全に関連するてんかんである、項目１８５に記載の方法。
(項目１８７)
前記ハプロ不全が、前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子の機能欠失変異についてヘテロ接合性である前記対象の結果である、項目１８６に記載の方法。
(項目１８８)
前記障害が、前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子における、挿入、欠失、逆位または置換に関連するてんかんである、項目１８７に記載の方法。
(項目１８９)
前記障害が、前記ＳＣＮ１Ａ遺伝子における点変異に関連するてんかんである、項目１８８に記載の方法。
(項目１９０)
前記障害が、ドラベ症候群である、項目１８６～１８９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９１)
前記中枢神経系障害の症状が、ニューロン活動亢進である、項目１８５～１９０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９２)
前記中枢神経系障害を処置することが、ニューロン活動亢進を低減させることを含む、項目１９１に記載の方法。
(項目１９３)
前記中枢神経系障害の症状が、発作である、項目１８５～１９０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９４)
前記中枢神経系障害を処置することが、発作の頻度を低減させることを含む、項目１９３に記載の方法。
(項目１９５)
前記中枢神経系障害を処置することが、発作の重症度を低減させることを含む、項目１９３または１９４のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９６)
前記細胞が、ニューロン細胞である、項目１７９に記載の方法。
(項目１９７)
前記ニューロン細胞が、単極ニューロン、双極ニューロン、多極ニューロンまたは偽単極ニューロンからなる群から選択される、項目１９６に記載の方法。
(項目１９８)
前記細胞が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである、項目１９６に記載の方法。
(項目１９９)
前記細胞が、非ニューロン細胞である、項目１７９に記載の方法。
(項目２００)
前記細胞が、グリア細胞である、項目１９９に記載の方法。
(項目２０１)
前記グリア細胞が、星状膠細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、シュワン細胞および衛星細胞からなる群から選択される、項目２００に記載の方法。
(項目２０２)
項目１～１２７または１７７～１７８のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することによる、前記ＣＮＳにおけるＳＣＮ１Ａの発現を増加させる方法。
(項目２０３)
ＳＣＮ１Ａの前記増加した発現が、脳において起こる、項目２０２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０４)
ＳＣＮ１Ａの前記増加した発現が、前頭皮質、頭頂皮質、側頭皮質、海馬、髄質および／または後頭皮質において起こる、項目２０３に記載の方法。
(項目２０５)
ＳＣＮ１Ａの前記増加した発現が、脊椎において起こる、項目２０２のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０６)
ＳＣＮ１Ａの前記増加した発現が、脊髄および／または後根神経節において起こる、項目２０５に記載の方法。
Vector copy number was further measured in various organs to assess transduction of RE GABA -eTF SCN1A in tissues throughout the body when AAV9 was administered by unilateral ICV. Transcript levels of eTF SCN1A were also measured by ddPCR to assess the transcriptional activity of eTF SCN1A under the control of the GABA-selective regulatory element RE GABA in tissues throughout the body when AAV9 was administered by unilateral ICV. did. Both methods were performed as generally described above. RE GABA -eTF SCN1A transduction and eTF SCN1A transcription in the spinal cord (SC) and dorsal root ganglion (DRG) were comparable to levels observed in the brain. With the exception of liver, RE GABA -eTF SCN1A transduction was lower in peripheral tissues outside the brain (FIG. 13). Transduction of RE GABA -eTF SCN1A in liver was higher than in brain. Transcription of eTF SCN1A was not detected in peripheral tissues, including heart, lung and gonad. However, eTF SCN1A transcript levels in liver were comparable to those of eTF SCN1A measured in brain. Furthermore, eTF SCN1A transcription in liver was extremely low (approximately 1000-fold lower compared to eTF SCN1A transcription in brain) when normalized to the vector copy number present. Altogether, this demonstrated that transcription of eTF SCN1A under the control of the GABA-selective regulatory element RE GABA is restricted to the CNS.
The present invention provides, for example, the following items.
(Item 1)
An expression cassette comprising a sequence encoding a non-naturally occurring transcription factor that increases expression of the SCN1A gene in a cell, said non-naturally occurring transcription factor having at least two transcriptional activation domains (TADs) comprising: Format: an expression cassette comprising DNA binding domains (DBDs) operably linked in TAD1-TAD2-DBD, DBD-TAD3-TAD4 or TAD1-TAD2-DBD-TAD3-TAD4.
(Item 2)
The expression cassette of item 1, wherein TAD1, TAD2, TAD3 and TAD4 are independently selected from: VP16, VP64, Viper, CITED2, CITED4, CREB3, or functional fragments thereof.
(Item 3)
3. The expression cassette of item 1 or 2, wherein TAD1 and TAD2 are the same TAD.
(Item 4)
4. The expression cassette of item 3, wherein TAD1 and TAD2 are CITED2 or a functional fragment thereof.
(Item 5)
4. The expression cassette of item 3, wherein TAD1 and TAD2 are CITED4 or a functional fragment thereof.
(Item 6)
Expression cassette according to any one of items 1-5, wherein TAD3 and TAD4 are the same TAD.
(Item 7)
7. The expression cassette of item 6, wherein TAD3 and TAD4 are CITED2 or a functional fragment thereof.
(Item 8)
7. The expression cassette of item 6, wherein TAD3 and TAD4 are CITED4 or a functional fragment thereof.
(Item 9)
3. The expression cassette of item 1 or 2, wherein TAD1, TAD2, TAD3 and TAD4 are the same TAD.
(Item 10)
10. The expression cassette of item 9, wherein TAD1, TAD2, TAD3 and TAD4 are CITED2 or functional fragments thereof.
(Item 11)
10. The expression cassette of item 9, wherein TAD1, TAD2, TAD3 and TAD4 are CITED4 or functional fragments thereof.
(Item 12)
Expression cassette according to any one of items 1-11, wherein no linker is present between at least two TAD domains.
(Item 13)
Expression cassette according to any one of items 1-11, wherein a linker is present between at least two TAD domains.
(Item 14)
14. The expression cassette of item 13, wherein the linker is GGSGGGSG (SEQ ID NO: 177) or GGSGGGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 178).
(Item 15)
15. The expression cassette of any one of items 1-14, wherein said DBD binds to a genomic region having 18-27 nucleotides.
(Item 16)
16. The expression cassette of any one of items 1-15, wherein said DBD comprises at least 80% sequence identity with its closest human counterpart.
(Item 17)
17. The expression cassette of item 16, wherein said DBD comprises at least 90% sequence identity with its closest human counterpart.
(Item 18)
16. The expression cassette of any one of items 1-15, wherein said DBD and said at least two TADs each contain at least 80% sequence identity with their closest human counterparts.
(Item 19)
19. The expression cassette of item 18, wherein said DBD and said at least two TADs each contain at least 90% sequence identity with their closest human counterparts.
(Item 20)
16. Expression cassette according to any one of items 1-15, wherein said DBD comprises a guide RNA and a nuclease-inactivating Cas protein.
(Item 21)
21. The expression cassette of item 20, wherein said nuclease-inactivated Cas protein is nuclease-inactivated Cas9.
(Item 22)
20. The expression cassette of any one of items 1-19, wherein said DBD comprises a zinc finger domain.
(Item 23)
23. The expression cassette of item 22, wherein said DBD comprises 6-9 zinc finger domains.
(Item 24)
24. The expression cassette of item 23, wherein said DBD comprises 6 zinc fingers.
(Item 25)
25. The expression cassette of item 24, wherein said DBD binds to a genomic region having 18 nucleotides.
(Item 26)
24. The expression cassette of item 23, wherein said DBD comprises 9 zinc fingers.
(Item 27)
27. The expression cassette of item 26, wherein said DBD binds to a genomic region having 27 nucleotides.
(Item 28)
The expression cassette of any one of items 1-19 or 22-27, wherein said DBD comprises a sequence having at least 95% sequence identity with any of SEQ ID NOS: 148-151.
(Item 29)
29. The expression cassette of item 28, wherein said DBD comprises a sequence having any one of SEQ ID NOS: 148-151.
(Item 30)
30. The expression cassette of any one of items 1-19 or 22-29, wherein said DBD is derived from human EGR1 or human EGR3.
(Item 31)
The expression cassette of any one of items 1-19 or 22-30, wherein said DBD comprises a sequence having at least 90% identity with any one of SEQ ID NOs:77-98.
(Item 32)
32. The expression cassette of item 31, wherein said DBD comprises SEQ ID NOs:77-98.
(Item 33)
2. The expression cassette of item 1, wherein said DBD comprises a sequence having at least 90% identity with SEQ ID NO:92.
(Item 34)
34. The expression cassette of item 33, wherein said DBD comprises SEQ ID NO:92.
(Item 35)
2. The expression cassette of item 1, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises a sequence having at least 90% identity to SEQ ID NO: 130 or 131.
(Item 36)
36. The expression cassette of item 35, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises SEQ ID NO: 130 or 131.
(Item 37)
2. The expression cassette of item 1, comprising a nucleotide sequence having at least 90% identity to either one of SEQ ID NO: 72 or 73.
(Item 38)
38. The expression cassette of item 37, comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 72 or 73.
(Item 39)
39. The expression cassette of any one of items 1-38, wherein said expression cassette further comprises a regulatory element driving expression of said transcription factor at a higher level in PV neurons than in other cell types.
(Item 40)
40. The expression cassette of item 39, wherein said regulatory element comprises any one of SEQ ID NOs: 1-4.
(Item 41)
41. The expression cassette of item 40, wherein said regulatory element comprises SEQ ID NO:2 or 3.
(Item 42)
42. The expression cassette of any one of items 1-41, wherein said expression cassette further comprises a PV-selective microRNA binding site.
(Item 43)
43. The expression cassette of item 42, wherein said PV-selective microRNA binding site comprises at least 90% identity to any one of SEQ ID NO: 7, 14 or 15.
(Item 44)
44. The expression cassette of item 43, wherein said PV-selective microRNA binding site comprises any one of SEQ ID NO: 7, 14 or 15.
(Item 45)
45. The expression cassette according to any one of items 1-44, wherein said expression cassette is part of a viral vector.
(Item 46)
46. The expression cassette of item 45, wherein said viral vector is an AAV virus.
(Item 47)
47. The expression cassette of item 46, wherein said AAV virus is AAV9 virus or scAAV9 virus.
(Item 48)
46. The expression cassette of item 45, wherein said viral vector is a lentivirus.
(Item 49)
An expression cassette comprising a sequence encoding a non-naturally occurring transcription factor that increases expression of the SCN1A gene in a cell, said non-naturally occurring transcription factor being operably linked to a transcriptional activation domain. wherein said DNA binding domain is a zinc finger protein comprising the sequence LEPGEKP-[YKCPECGKSFS X HQRTH TGEKP]n-YKCPECGKSFS X HQRTH-TGKKTS (SEQ ID NO: 147), wherein between said DNA binding domain and said transcriptional activation domain Expression cassette without HA tag (SEQ ID NO: 171).
(Item 50)
50. An expression cassette according to any one of items 49, wherein said transcriptional activation domain comprises a VP16, VPR or VP64 sequence, or a functional fragment thereof.
(Item 51)
51. The expression cassette of item 50, wherein said transcriptional activation domain comprises VP64.
(Item 52)
52. The expression cassette of any one of items 49-51, wherein said DNA binding domain binds to a genomic region having 18-27 nucleotides.
(Item 53)
53. The expression cassette according to any one of items 49-52, wherein n=6-9.
(Item 54)
54. Expression cassette according to item 53, wherein n=6.
(Item 55)
55. The expression cassette of item 54, wherein said DNA binding domain binds to a genomic region having 18 nucleotides.
(Item 56)
54. The expression cassette of item 53, wherein n=9.
(Item 57)
57. The expression cassette of item 56, wherein said DNA binding domain binds to a genomic region having 27 nucleotides.
(Item 58)
58. The expression cassette of any one of items 49-57, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having at least 95% sequence identity with any of SEQ ID NOS: 148-151.
(Item 59)
59. The expression cassette of item 58, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having any one of SEQ ID NOs: 148-151.
(Item 60)
59. The expression cassette of any one of items 49-59, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NOs:77-91.
(Item 61)
61. The expression cassette of item 60, wherein said DNA binding domain comprises any one of SEQ ID NOs:77-91.
(Item 62)
62. The expression cassette of any one of items 49-61, wherein said expression cassette further comprises a regulatory element driving expression of said transcription factor at a higher level in PV neurons than in other cell types.
(Item 63)
63. The expression cassette of item 62, wherein said regulatory element comprises any one of SEQ ID NOs: 1-4.
(Item 64)
64. The expression cassette of item 63, wherein said regulatory element comprises SEQ ID NO:2 or 3.
(Item 65)
50. The expression cassette of item 49, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises a sequence having at least 90% identity to SEQ ID NO:127.
(Item 66)
66. The expression cassette of item 65, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises SEQ ID NO:127.
(Item 67)
50. The expression cassette of item 49, comprising a nucleotide sequence having at least 90% identity to either one of SEQ ID NOs: 70 or 71.
(Item 68)
68. The expression cassette of item 67, comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO:70 or 71.
(Item 69)
69. The expression cassette of any one of items 1-68, wherein said expression cassette further comprises a PV-selective microRNA binding site.
(Item 70)
70. The expression cassette of item 69, wherein said PV-selective microRNA binding site comprises at least 90% identity to any one of SEQ ID NO: 7, 14 or 15.
(Item 71)
71. The expression cassette of item 70, wherein said PV-selective microRNA binding site comprises any one of SEQ ID NO: 7, 14 or 15.
(Item 72)
72. The expression cassette according to any one of items 49-71, wherein said expression cassette is part of a viral vector.
(Item 73)
73. The expression cassette of item 72, wherein said viral vector is an AAV virus.
(Item 74)
74. The expression cassette of item 73, wherein said AAV virus is AAV9 virus or scAAV9 virus.
(Item 75)
73. The expression cassette of item 72, wherein said viral vector is a lentivirus.
(Item 76)
A polynucleotide comprising a PV-selective microRNA binding site comprising a sequence having at least 80% sequence identity to SEQ ID NO: 14 or 15, wherein said microRNA binding site reduces transgene expression in excitatory neurons Polynucleotide.
(Item 77)
77. The polynucleotide of item 76, wherein said PV-selective microRNA binding site comprises SEQ ID NO:14.
(Item 78)
77. The polynucleotide of item 76, wherein said PV-selective microRNA binding site comprises SEQ ID NO:15.
(Item 79)
An expression cassette comprising a PV-selective microRNA binding site according to any one of items 76-78 and a promoter and/or enhancer.
(Item 80)
80. The expression cassette of item 79, wherein said promoter and/or enhancer is a PV-selective regulatory element that drives expression of said transgene at higher levels in parvalbumin (PV) neurons than in other cell types.
(Item 81)
81. The expression cassette of item 80, wherein said PV-selective regulatory element is operably linked to a transgene.
(Item 82)
An expression cassette comprising a regulatory element operably linked to a transgene and at least one microRNA binding site, wherein the regulatory element is at higher levels in parvalbumin (PV) neurons than in other cell types. An expression cassette driving expression of said transgene, wherein said microRNA binding site reduces expression of said transgene in excitatory neurons, said expression cassette does not comprise SEQ ID NO:67.
(Item 83)
83. The expression cassette of item 82, wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR128 (SEQ ID NO: 9).
(Item 84)
84. Expression cassette according to item 82 or 83, wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR221 (SEQ ID NO: 11).
(Item 85)
85. The expression cassette of any one of items 82-84, wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR222 (SEQ ID NO: 13).
(Item 86)
83. The expression cassette of item 82, wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR128 (SEQ ID NO:9) and at least one binding site for MIR221 (SEQ ID NO:11).
(Item 87)
wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR128 (SEQ ID NO:9), at least one binding site for MIR221 (SEQ ID NO:11), and at least one binding site for MIR222 (SEQ ID NO:13) The expression cassette according to 82.
(Item 88)
85. The expression cassette of any one of items 82-84, wherein said microRNA binding site comprises a sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NO: 7, 14 or 15.
(Item 89)
89. The expression cassette of item 88, wherein said microRNA binding site comprises SEQ ID NO:7.
(Item 90)
90. The expression cassette of item 89, wherein said microRNA binding site comprises SEQ ID NO:14.
(Item 91)
90. The expression cassette of item 89, wherein said microRNA binding site comprises SEQ ID NO:15.
(Item 92)
92. The expression cassette of any one of items 81-91, wherein said transgene encodes a polypeptide comprising a non-naturally occurring transcription factor that increases expression of the SCN1A gene in cells.
(Item 93)
93. The expression cassette of item 92, wherein said transcription factor binds to a genomic region having 18-27 nucleotides.
(Item 94)
94. The expression cassette of any one of items 92 or 93, wherein said transcription factor comprises a DNA binding domain.
(Item 95)
95. The expression cassette of any one of items 92-94, wherein said transcription factor comprises a DNA binding domain and a transcription activation domain.
(Item 96)
96. Expression cassette according to any one of items 92-95, wherein said DNA binding domain comprises at least 80% sequence identity with its closest human counterpart.
(Item 97)
97. The expression cassette of item 96, wherein said DNA binding domain comprises at least 90% sequence identity with its closest human counterpart.
(Item 98)
97. An expression cassette according to any one of items 92-96, wherein both said DNA binding domain and said transcriptional activation domain contain at least 80% sequence identity with their closest human counterparts.
(Item 99)
99. The expression cassette of item 98, wherein both said DNA binding domain and said transcriptional activation domain comprise at least 90% sequence identity with their closest human counterparts.
(Item 100)
96. Expression cassette according to any one of items 92-95, wherein said DNA binding domain comprises a guide RNA and a nuclease-inactivating Cas protein.
(Item 101)
101. Expression cassette according to item 100, wherein said nuclease-inactivated Cas protein is nuclease-inactivated Cas9.
(Item 102)
99. The expression cassette of any one of items 92-99, wherein said DNA binding domain comprises a zinc finger domain.
(Item 103)
103. The expression cassette of item 102, wherein said DNA binding domain comprises 6-9 zinc finger domains.
(Item 104)
104. The expression cassette of item 103, wherein said DNA binding domain comprises 6 zinc fingers.
(Item 105)
105. The expression cassette of item 104, wherein said DNA binding domain binds to a genomic region having 18 nucleotides.
(Item 106)
104. The expression cassette of item 103, wherein said DNA binding domain comprises 9 zinc fingers.
(Item 107)
107. The expression cassette of item 106, wherein said DNA binding domain binds to a genomic region having 27 nucleotides.
(Item 108)
The expression cassette of any one of items 92-99 or 102-107, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having at least 95% sequence identity with any of SEQ ID NOS:148-151.
(Item 109)
109. The expression cassette of item 108, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having any one of SEQ ID NOs: 148-151.
(Item 110)
The expression cassette of any one of items 92-99 or 102-109, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NOS:92-98.
(Item 111)
111. The expression cassette of item 110, wherein said DNA binding domain comprises any one of SEQ ID NOS:92-98.
(Item 112)
according to any one of items 92-99 or 102-111, wherein said DNA binding domain is a zinc finger protein comprising the sequence LEPGEKP-[YKCPECGKSFS X HQRTH TGEKP]n-YKCPECGKSFS X HQRTH-TGKKTS (SEQ ID NO: 147) expression cassette.
(Item 113)
113. The expression cassette of item 111 or 112, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NOs:77-91.
(Item 114)
114. The expression cassette of any one of items 113, wherein said DNA binding domain comprises any one of SEQ ID NOs:77-91.
(Item 115)
The expression cassette of any one of items 92-99 or 102-111, wherein said DNA binding domain is derived from human EGR1 or human EGR3.
(Item 116)
99. Expression cassette according to any one of items 95-99, wherein said transcriptional activation domain comprises a VP16, VPR, VP64, CITED2, CITED4 or CREB3 sequence, or a functional fragment thereof.
(Item 117)
99. Expression cassette according to any one of items 92-99, wherein said transcriptional activation domain comprises a human CITED2, CITED4 or CREB3 sequence, or a functional fragment thereof.
(Item 118)
Expression cassette according to any one of items 81-117, wherein said regulatory element comprises a sequence having any one of SEQ ID NOs: 1-4.
(Item 119)
119. The expression cassette of item 118, wherein said regulatory element comprises a sequence having SEQ ID NO:2 or 3.
(Item 120)
83. The expression cassette of item 81 or 82, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises a sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NOs: 105, 106 and 127-129.
(Item 121)
121. The expression cassette of item 120, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises any one of SEQ ID NOs: 105, 106 and 127-129.
(Item 122)
121. The expression cassette of items 81, 82 or 120, wherein said transgene comprises a nucleotide sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NOs: 71, 74, 75, 76 or 184.
(Item 123)
123. The expression cassette of item 122, wherein said transgene comprises any one of SEQ ID NOs: 71, 74, 75, 76 or 184.
(Item 124)
Expression cassette according to any one of items 81-123, wherein said expression cassette is part of a viral vector.
(Item 125)
125. The expression cassette of item 124, wherein said viral vector is an AAV virus.
(Item 126)
126. The expression cassette of item 125, wherein said AAV virus is an AAV9 virus or a scAAV9 virus.
(Item 127)
125. The expression cassette of item 124, wherein said viral vector is a lentivirus.
(Item 128)
1. A method for selective expression of a transgene in primate parvalbumin (PV) neurons, comprising administering to the primate a viral vector comprising the transgene and at least one macroRNA binding site, said A method, wherein the microRNA binding site reduces expression of said transgene in excitatory neurons.
(Item 129)
The viral vector further comprises a regulatory element operably linked to the transgene, wherein the regulatory element directs expression of the transgene at higher levels in parvalbumin (PV) neurons than in other cell types. 129. The method of item 128, wherein the method is driven.
(Item 130)
130. The method of item 128 or 129, wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR128 (SEQ ID NO: 9).
(Item 131)
131. The method of any one of items 128-130, wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR221 (SEQ ID NO: 11).
(Item 132)
132. The method of any one of items 128-131, wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR222 (SEQ ID NO: 13).
(Item 133)
129. The method of item 128, wherein said microRNA binding sites comprise at least one binding site for MIR128 (SEQ ID NO:9) and at least one binding site for MIR221 (SEQ ID NO:11).
(Item 134)
wherein said microRNA binding site comprises at least one binding site for MIR128 (SEQ ID NO:9), at least one binding site for MIR221 (SEQ ID NO:11), and at least one binding site for MIR222 (SEQ ID NO:13) 128. The method according to 128.
(Item 135)
135. The method of any one of items 128-134, wherein said microRNA binding site comprises a sequence that is at least 90% identical to any of SEQ ID NO: 7, 14 or 15.
(Item 136)
136. The method of item 135, wherein said microRNA binding site comprises SEQ ID NO:7.
(Item 137)
136. The method of item 135, wherein said microRNA binding site comprises SEQ ID NO:14.
(Item 138)
136. The method of item 135, wherein said microRNA binding site comprises SEQ ID NO:15.
(Item 139)
139. The method of any one of items 128-138, wherein said transgene comprises a sequence encoding a non-naturally occurring transcription factor that increases expression of the SCN1A gene in the cell.
(Item 140)
139. The method of item 139, wherein said transcription factor binds to a genomic region having 18-27 nucleotides.
(Item 141)
141. The method of any one of items 139 or 140, wherein said transcription factor comprises a DNA binding domain.
(Item 142)
142. The method of any one of items 139-141, wherein said transcription factor comprises a DNA binding domain and a transcription activation domain.
(Item 143)
143. The method of any one of items 139-142, wherein said DNA binding domain comprises at least 80% sequence identity with its closest human counterpart.
(Item 144)
144. The method of item 143, wherein said DNA binding domain comprises at least 90% sequence identity with its closest human counterpart.
(Item 145)
144. The method of any one of items 142 or 143, wherein both said DNA binding domain and said transcriptional activation domain comprise at least 80% sequence identity with their closest human counterparts.
(Item 146)
146. The method of item 145, wherein both said DNA binding domain and said transcriptional activation domain comprise at least 90% sequence identity with their closest human counterparts.
(Item 147)
143. The method of any one of items 139-142, wherein said DNA binding domain comprises a guide RNA and a nuclease-inactivating Cas protein.
(Item 148)
148. The method of item 147, wherein said nuclease-inactivated Cas protein is nuclease-inactivated Cas9.
(Item 149)
147. The method of any one of items 139-146, wherein said DNA binding domain comprises a zinc finger domain.
(Item 150)
149. The method of item 149, wherein said DNA binding domain comprises 6-9 zinc finger domains.
(Item 151)
151. The method of item 150, wherein said DNA binding domain comprises 6 zinc fingers.
(Item 152)
152. The method of item 151, wherein said DNA binding domain binds to a genomic region having 18 nucleotides.
(Item 153)
151. The method of item 150, wherein said DNA binding domain comprises nine zinc fingers.
(Item 154)
154. The method of item 153, wherein said DNA binding domain binds to a genomic region having 27 nucleotides.
(Item 155)
The method of any one of items 139-146 or 149-154, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having at least 95% sequence identity with any of 148-151.
(Item 156)
156. The method of item 155, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having any one of SEQ ID NOs: 148-151.
(Item 157)
The method of any one of items 139-146 or 149-156, wherein said DNA binding domain is derived from human EGR1 or human EGR3.
(Item 158)
The method of any one of items 139-146 or 149-157, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NOs:92-98.
(Item 159)
159. The method of item 158, wherein said DNA binding domain comprises any one of SEQ ID NOS:92-98.
(Item 160)
according to any one of items 139-146 or 149-156, wherein said DNA binding domain is a zinc finger protein comprising the sequence LEPGEKP-[YKCPECGKSFS X HQRTH TGEKP]n-YKCPECGKSFS X HQRTH-TGKKTS (SEQ ID NO: 147) the method of.
(Item 161)
161. The method of any one of items 160, wherein said DNA binding domain comprises a sequence having at least 90% identity to any of SEQ ID NOs:77-91.
(Item 162)
162. The method of any one of items 161, wherein said DNA binding domain comprises any one of SEQ ID NOs:77-91.
(Item 163)
163. The method of any one of items 142-162, wherein said transcriptional activation domain comprises a VP16, VPR, VP64, CITED2, CITED4 or CREB3 sequence, or a functional fragment thereof.
(Item 164)
164. The method of item 163, wherein said transcriptional activation domain comprises a human CITED2, CITED4 or CREB3 sequence, or a functional fragment thereof.
(Item 165)
165. The method of any one of items 128-164, wherein said regulatory element comprises a sequence having any one of SEQ ID NOS: 1-4.
(Item 166)
166. The method of item 165, wherein said regulatory element comprises a sequence having SEQ ID NO:2 or 3.
(Item 167)
139. The method of item 139, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises a sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NOs: 105, 106 and 127-129.
(Item 168)
168. The method of item 167, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises any one of SEQ ID NOs: 105, 106 and 127-129.
(Item 169)
140. The method of item 139, wherein said transgene comprises a nucleotide sequence having at least 90% identity to any one of SEQ ID NOS: 71, 74, 75, 76 or 184.
(Item 170)
169. The method of item 169, wherein said transgene comprises any one of SEQ ID NOS: 71, 74, 75, 76 or 184.
(Item 171)
171. The method of any one of items 128-170, wherein said viral vector is an AAV virus.
(Item 172)
172. The method of item 171, wherein said AAV virus is an AAV9 virus or a scAAV9 virus.
(Item 173)
171. The method of any one of items 128-170, wherein said viral vector is a lentivirus.
(Item 174)
174. The method of any one of items 128-173, wherein said primate is a human.
(Item 175)
174. The method of any one of items 128-173, wherein said primate is a non-human primate.
(Item 176)
176. The method of item 175, wherein the non-human primate is an Old World monkey, an orangutan, a gorilla, a chimpanzee, a marmoset, a cynomolgus monkey, a rhesus monkey, or a pig-tailed macaque.
(Item 177)
An expression cassette comprising a sequence encoding a non-naturally occurring transcription factor that increases expression of the SCN1A gene in a cell, said non-naturally occurring transcription factor having at least 90% identity to SEQ ID NO: 128 or 129 An expression cassette containing a sequence.
(Item 178)
178. The expression cassette of item 177, wherein said non-naturally occurring transcription factor comprises SEQ ID NO: 128 or 129.
(Item 179)
A method of increasing expression of SCN1A in a cell by administering the expression cassette of any one of items 1-127 or 177-178.
(Item 180)
179. The method of item 179, wherein said cells are PV neurons.
(Item 181)
181. The method of any one of items 179 or 180, wherein said cell is in a subject.
(Item 182)
182. The method of item 181, wherein the subject is a mammal.
(Item 183)
183. The method of item 182, wherein the subject is a human.
(Item 184)
184. The method of any one of items 179-183, wherein increasing expression of SCN1A treats the disease, disorder or condition.
(Item 185)
185. The method of item 184, wherein said disorder is a central nervous system disorder.
(Item 186)
186. The method of item 185, wherein said disorder is epilepsy associated with SCN1A haploinsufficiency.
(Item 187)
187. The method of item 186, wherein said haploinsufficiency is the result of said subject being heterozygous for a loss-of-function mutation of said SCN1A gene.
(Item 188)
188. The method of item 187, wherein said disorder is epilepsy associated with an insertion, deletion, inversion or substitution in said SCN1A gene.
(Item 189)
189. The method of item 188, wherein said disorder is epilepsy associated with point mutations in said SCN1A gene.
(Item 190)
189. The method of any one of items 186-189, wherein said disorder is Dravet Syndrome.
(Item 191)
191. The method of any one of items 185-190, wherein the symptom of central nervous system disorder is neuronal hyperactivity.
(Item 192)
192. The method of item 191, wherein treating the central nervous system disorder comprises reducing neuronal hyperactivity.
(Item 193)
191. The method of any one of items 185-190, wherein the symptom of central nervous system disorder is seizures.
(Item 194)
194. The method of item 193, wherein treating the central nervous system disorder comprises reducing seizure frequency.
(Item 195)
195. The method of any one of items 193 or 194, wherein treating the central nervous system disorder comprises reducing seizure severity.
(Item 196)
179. The method of item 179, wherein said cells are neuronal cells.
(Item 197)
197. The method of item 196, wherein said neuronal cells are selected from the group consisting of unipolar neurons, bipolar neurons, multipolar neurons or pseudounipolar neurons.
(Item 198)
197. The method of item 196, wherein said cells are GABAergic neurons.
(Item 199)
179. The method of item 179, wherein said cells are non-neuronal cells.
(Item 200)
199. The method of item 199, wherein said cells are glial cells.
(Item 201)
201. The method of item 200, wherein said glial cells are selected from the group consisting of astrocytes, oligodendrocytes, ependymal cells, Schwann cells and satellite cells.
(Item 202)
A method of increasing expression of SCN1A in said CNS by administering the expression cassette of any one of items 1-127 or 177-178.
(Item 203)
203. The method of any one of items 202, wherein said increased expression of SCN1A occurs in the brain.
(Item 204)
204. The method of item 203, wherein said increased expression of SCN1A occurs in the frontal cortex, parietal cortex, temporal cortex, hippocampus, medulla and/or occipital cortex.
(Item 205)
203. The method of any one of items 202, wherein said increased expression of SCN1A occurs in the spine.
(Item 206)
206. The method of paragraph 205, wherein said increased expression of SCN1A occurs in the spinal cord and/or dorsal root ganglia.