JPWO2020227100A5 - - Google Patents

Download PDF

Info

Publication number
JPWO2020227100A5
JPWO2020227100A5 JP2021565022A JP2021565022A JPWO2020227100A5 JP WO2020227100 A5 JPWO2020227100 A5 JP WO2020227100A5 JP 2021565022 A JP2021565022 A JP 2021565022A JP 2021565022 A JP2021565022 A JP 2021565022A JP WO2020227100 A5 JPWO2020227100 A5 JP WO2020227100A5
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
chain reaction
polymerase chain
oligonucleotide primer
nucleic acid
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021565022A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2022530920A (en
Publication date
Application filed filed Critical
Priority claimed from PCT/US2020/031044 external-priority patent/WO2020227100A1/en
Publication of JP2022530920A publication Critical patent/JP2022530920A/en
Publication of JPWO2020227100A5 publication Critical patent/JPWO2020227100A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Description

本出願は、自動化に適しておりかつ容易に入手可能な市販の機器で働くプロトコルを使用して、ｑＰＣＲまたはｄＰＣＲ読み出しのいずれかを使用して、がんのマーカー（変異、発現、スプライスバリアント、転座、コピー数、及び／またはメチル化変化）を検出するための堅牢なアプローチを提供する。このアプローチは、統合され、検査室のセットアップに便利であるという利点を提供し、コスト削減、拡張性、ならびにＣＬＩＡ適合性の自動設定における医療及び検査室の流れとの適合を可能にする。世界中で救われる人命における恩恵は、計り知れない価値があるだろう。
[本発明１００１]
試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親核酸分子の前記ヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）前記標的ヌクレオチド配列と隣接する前記親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記試料、前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、前記ポリメラーゼ伸長反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物を含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物、前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記反応混合物中の前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）５’標的配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、二次伸長産物の相補標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を、リガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドする段階と、
前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補配列にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１００２]
試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親核酸分子の前記ヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
修飾ヌクレオチドを含まない核酸分子を消化することができる１つ以上のヌクレアーゼを提供する段階と、
前記標的ヌクレオチド配列と隣接する前記親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー（複数可）を提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記試料、前記１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ヌクレアーゼ消化から伸長産物を保護するが標的ＤＮＡを保護しない１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、前記ポリメラーゼ伸長反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）第１の５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される一次伸長産物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）第２の５’プライマー特異的部分及び前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記１つ以上のヌクレアーゼ、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼを含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物をブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在する核酸分子を消化するが修飾ヌクレオチドを含む一次伸長産物を消化しない好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記第１の５’プライマー特異的部分、標的特異的ヌクレオチド配列またはその相補体、及び前記第２の５’プライマー特異的部分の相補体を含む１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の前記第１の５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の三次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１００３]
試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親核酸分子の前記ヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
修飾ヌクレオチドを含まない存在する核酸分子を消化することができる１つ以上のヌクレアーゼを提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）前記標的ヌクレオチド配列と隣接する前記親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記試料、前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ヌクレアーゼ消化から伸長産物を保護するが標的ＤＮＡを保護しない１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、前記ポリメラーゼ伸長反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記１つ以上のヌクレアーゼ、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼを含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物をブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在する核酸分子を消化するが修飾ヌクレオチドを含む一次伸長産物を消化しない好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１００４]
試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記１つ以上のメチル化残基を含む前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列と隣接する前記バイサルファイト処理親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記バイサルファイト処理試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために前記一次伸長産物を含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列特異的部分または相補配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに（ｂ）５’バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列特異的部分または相補配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の相補ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を、リガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドする段階と、
前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを、相補配列にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列特異的部分または相補配列特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１００５]
試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記１つ以上のメチル化残基を含む前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列と隣接する前記バイサルファイト処理親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー（複数可）を提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記バイサルファイト処理試料、前記１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される前記ポリメラーゼ伸長反応産物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼを含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物をブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在する核酸分子を消化するが修飾ヌクレオチドを含む一次伸長産物を消化しない好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列特異的部分または相補配列特異的部分、及び前記第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分の相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の三次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１００６]
試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記１つ以上のメチル化残基を含む前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列と隣接する前記バイサルファイト処理親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記バイサルファイト処理試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物を含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記反応混合物中の前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１００７]
試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び前記１つ以上のメチル化残基を含む前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列と隣接する前記バイサルファイト処理親核酸分子の配列と相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記バイサルファイト処理試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物を含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記反応混合物中の前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物またはそれらの相補体の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物またはそれらの相補体の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１００８]
損傷したＤＮＡ、前記ＤＮＡ中の脱塩基部位、酸化塩基、またはニックを修復するために、前記試料をＤＮＡ修復酵素と接触させる段階をさらに含む、本発明１００１～１００７のいずれかの方法。
[本発明１００９]
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するための前記ブレンドする段階の前またはそれと同時に、制限酵素反応混合物を形成するために、前記試料を少なくとも第１のメチル化感受性酵素と接触させる段階であって、前記第１のメチル化感受性酵素が、少なくとも１つのメチル化感受性酵素認識配列内に１つ以上の非メチル化残基を含む前記試料中の核酸分子を切断し、それによって、前記検出する段階が、前記標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の検出を伴い、ここで、前記親核酸分子が、１つ以上のメチル化残基を元々含む、前記試料を少なくとも第１のメチル化感受性酵素と接触させる段階
をさらに含む、本発明１００４～１００７のいずれかの方法。
[本発明１０１０]
前記試料中のメチル化核酸に選択的に結合させ、それを濃縮するために、前記試料を、固定化されたメチル化核酸結合タンパク質または抗体と接触させる段階をさらに含む、本発明１００４～１００７のいずれかの方法。
[本発明１０１１]
前記１つ以上の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーセット由来のプライマーが、前記標的核酸配列またはバイサルファイト変換メチル化核酸配列もしくはその相補配列に、塩基特異的な様式でハイブリダイズした場合、ヌクレオチド配列ミスマッチを有しないかまたは１つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、野生型核酸配列またはバイサルファイト変換非メチル化核酸配列もしくはその相補配列の対応するヌクレオチド配列部分に、塩基特異的な様式でハイブリダイズした場合、ポリメラーゼ伸長を妨害する１つ以上の追加のヌクレオチド配列ミスマッチを有する部分を含む、本発明１００１～１００７のいずれかの方法。
[本発明１０１２]
前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の一次オリゴヌクレオチドプライマー及び／または前記二次オリゴヌクレオチドプライマーセットの一方もしくは両方の二次オリゴヌクレオチドプライマーが、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロッキング基を含む３’部分を有し、そのため、前記プライマー（複数可）の前記３’末端がポリメラーゼ伸長に好適ではなく、
前記方法が、前記ハイブリダイゼーション処理中に、一方もしくは両方のオリゴヌクレオチドプライマーの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を切断し、それによって、前記伸長処理の前に、一方もしくは両方のオリゴヌクレオチドプライマー上の遊離３’ＯＨ末端を遊離させる段階をさらに含む、本発明１００１～１００７のいずれかの方法。
[本発明１０１３]
前記１つ以上の一次または二次オリゴヌクレオチドプライマーセット由来のプライマーが、前記標的核酸配列またはバイサルファイト変換メチル化核酸配列もしくはその相補配列とは異なる配列を含み、前記差異が、前記遊離された遊離３’ＯＨ末端から２番目または３番目のヌクレオチド塩基に位置する、本発明１０１２の方法。
[本発明１０１４]
前記切断可能なヌクレオチドが、１つ以上のＲＮＡ塩基を含む、本発明１０１２の方法。
[本発明１０１５]
１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階であって、前記３’末端に１つ以上のミスマッチ塩基または前記３’末端に１つ以上のヌクレオチド類似体及びブロッキング基を含み、そのため、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーの前記３’末端が、野生型核酸配列またはバイサルファイト変換非メチル化核酸配列もしくはその相補配列に塩基特異的な様式でハイブリダイズされた場合、ポリメラーゼ伸長に好適ではなく、ここで、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーが、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする前記野生型核酸配列またはバイサルファイト変換非メチル化核酸配列もしくはその相補配列のヌクレオチド配列部分と同じヌクレオチド配列を有する部分を含むが、前記標的核酸配列またはバイサルファイト変換メチル化核酸配列もしくはその相補配列の対応するヌクレオチド配列部分に１つ以上のヌクレオチド配列ミスマッチを有する、前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを提供する段階と、
ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、またはライゲーション反応の前に、前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを、前記試料またはその後の産物とブレンドする段階であって、それによって、ハイブリダイゼーション中に、前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーが、野生型核酸配列またはバイサルファイト変換非メチル化核酸配列もしくはその相補配列に、塩基特異的な様式で優先的にハイブリダイズし、それによって、前記野生型配列またはバイサルファイト変換非メチル化配列もしくはその相補配列に塩基特異的な様式でハイブリダイズされるプライマーまたはプローブの反応中に、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションを妨害する、前記１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを、前記試料またはその後の産物とブレンドする段階と
をさらに含む、本発明１００１～１００７のいずれかの方法。
[本発明１０１６]
前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーが、５’プライマー特異的部分を有し、前記第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーが、５’プライマー特異的部分を有し、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第３の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｄ）前記第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第４の二次オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、本発明１００３または１００６のいずれかの方法。
[本発明１０１７]
試料中で、前記試料中の他の親リボ核酸分子のリボ核酸配列とは、選択的スプライシング、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、またはゲノムレベルでの他の再編成に起因して異なる標的リボ核酸配列を含む１つ以上の親リボ核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親リボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる標的リボ核酸分子を含む１つ以上の親リボ核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記標的リボヌクレオチド配列と隣接する前記親リボ核酸分子のＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される前記ｃＤＮＡ伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記接触させた試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、逆転写酵素、及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記標的リボ核酸に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、１つ以上の異なる逆転写／ポリメラーゼ生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）５’標的配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、前記標的リボ核酸分子配列に対応する逆転写酵素／ポリメラーゼ生成物の相補部分上でハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記逆転写酵素／ポリメラーゼ生成物をリガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させる段階と、
前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のプローブが、それらの相補体にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他の親リボ核酸分子のリボ核酸配列とは、選択的スプライシング、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、またはゲノムレベルでの他の再編成に起因して異なる標的リボ核酸配列を含む１つ以上の親リボ核酸分子の存在を特定する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１０１８]
試料中で、前記試料中の他の親リボ核酸分子のリボ核酸配列とは、選択的スプライシング、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、またはゲノムレベルでの他の再編成に起因して異なる標的リボ核酸配列を含む１つ以上の親リボ核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親リボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる標的リボ核酸分子を含む１つ以上の親リボ核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記標的ヌクレオチド配列と隣接する前記親リボ核酸分子のＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される前記ｃＤＮＡ伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記接触させた試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、逆転写酵素、及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記標的ＲＮＡに相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、１つ以上の異なる逆転写／一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される逆転写／一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される逆転写／一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記逆転写／一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他の親リボ核酸分子のリボ核酸配列とは、選択的スプライシング、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、またはゲノムレベルでの他の再編成に起因して異なる標的リボ核酸配列を含む１つ以上の親リボ核酸分子の存在を特定する段階と
を含む、前記方法。
[本発明１０１９]
試料中で、前記試料中の他のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
１つ以上の第１のライゲーション反応混合物を形成するために、前記接触させた試料を、リガーゼならびに５’リン酸、５’ステムループ部分、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロッキング基、及び前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む１つ以上の第１のオリゴヌクレオチド予備プローブとブレンドする段階と、
前記試料中に存在する場合には前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチド予備プローブに付加される、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成するために、前記１つ以上の第１のライゲーション反応混合物中で、前記１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を、それらの３’末端で、前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチド予備プローブの前記５’リン酸にライゲーションする段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、（ａ）前記第１のオリゴヌクレオチド予備プローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び３’部分を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、他のセットの他の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、キメラ核酸分子を含む前記１つ以上の第１のライゲーション反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記試料中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる前記１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、ならびに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、前記キメラ核酸分子に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の相補体、及びその相補体を含む１つ以上の異なる一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに（ｂ）５’標的配列特異的部分、一次伸長産物に相補的な部分、及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応する一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物の相補部分上でハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のライゲーション反応混合物を形成するために、前記一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物をリガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させる段階と、
前記１つ以上の第２のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、それらの相補体にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上の第２のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列及び前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記１つ以上の反応物中の前記二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定する段階と
含む、前記方法。
[本発明１０２０]
試料中で、前記試料中の他のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記接触させた試料を、リガーゼならびに５’リン酸、５’ステムループ部分、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロッキング基、及び前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブとブレンドする段階と、
前記試料中に存在する場合には前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブに付加される、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成するために、前記１つ以上のライゲーション反応混合物中で、前記１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を、それらの３’末端で、前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’リン酸にライゲーションする段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、（ａ）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び３’部分を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、他のセットの他の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、キメラ核酸分子を含む前記１つ以上のライゲーション反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、ならびに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記キメラ核酸分子に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の相補体、及びそれらの相補体を含む１つ以上の異なる一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応するヌクレオチド配列、及び他の５’プライマー特異的部分の相補体、第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物またはそれらの相補体の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の三次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物またはそれらの相補体の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応プロセス生成物、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定する段階と
含む、前記方法。
[本発明１０２１]
試料中で、前記試料中の他のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物を形成するために、前記接触させた試料を、ＡＴＰ及びポリ（Ａ）ポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物を、前記試料中に潜在的に存在する前記１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の前記３’末端にホモポリマーＡを付加するのに好適な条件に供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、（ａ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーであって、５’プライマー特異的部分、内部ポリｄＴ部分、及び前記標的ｍｉＲＮＡの前記３’末端に相補的な１～１０塩基を含む３’部分を含み、他のセットの他の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーであって、５’プライマー特異的部分及び３’部分を含み、他のセットの他の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記試料中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる前記１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、ならびに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、次いで、３’ポリＡテールを有する前記標的ｍｉＲＮＡ配列に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、ポリｄＡ領域、及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分の相補体、及びその相補体を含む１つ以上の異なる逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）５’標的配列特異的部分、前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物に相補的な部分、及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応する前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物の相補部分にハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物をリガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させる段階と、
前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、それらの相補体にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上の第２のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列及び前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定する段階と
含む、前記方法。
[本発明１０２２]
試料中で、前記試料中の他のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物を形成するために、前記接触させた試料をＡＴＰ及びポリ（Ａ）ポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物を、ホモポリマーＡを前記試料中に潜在的に存在する前記１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の前記３’末端に付加するのに好適な条件に供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、（ａ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーであって、５’プライマー特異的部分、内部ポリｄＴ部分、及び前記標的ｍｉＲＮＡの前記３’末端に相補的な１～１０塩基を含む３’部分を含み、他のセットの他の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーであって、５’プライマー特異的部分及び３’部分を含み、他のセットの他の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、３’ポリＡテールを有する標的ｍｉＲＮＡ配列を潜在的に含む前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、ならびに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、３’ポリＡテールを有する前記標的ｍｉＲＮＡ配列に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、ポリｄＡ領域、及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分の相補体、及びその相補体を含む１つ以上の異なる逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応するヌクレオチド配列、及び他の５’プライマー特異的部分の相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の三次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記１つ以上の反応物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定する段階と
含む、前記方法。
[本発明１０２３]
前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記３’部分が、リボＧ及び／またはＧヌクレオチド類似体を含み、前記逆転写酵素が、前記標的ｍｉＲＮＡの前記相補デオキシリボ核酸産物の前記３’末端に２つまたは３つのシトシンヌクレオチドを付加し、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記３’末端への一過的なハイブリダイゼーションを可能にし、前記逆転写酵素が鎖の切り替えを起こすことを可能にし、前記相補デオキシリボ核酸産物を伸長させて、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分の相補配列を含ませて、５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応するヌクレオチド配列部分、さらなる部分、及び他の５’プライマー特異的部分の相補体を含む前記１つ以上の異なる第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する、本発明１０１９～１０２２のいずれかの方法。
[本発明１０２４]
前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記３’部分が、５’から３’へ、３個のリボＧまたはＧ塩基、続いて前記標的ｍｉＲＮＡ配列の５’末端と同じ追加の塩基を含む６～１４個の塩基を含み、前記逆転写酵素が、２つまたは３つのシトシン残基を、前記標的ｍｉＲＮＡの初期相補デオキシリボ核酸伸長産物の３’末端に付加し、前記ポリメラーゼ連鎖反応の前記変性処理が始まるとその後、前記条件が、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記３’末端から前記相補デオキシリボ核酸伸長産物の前記３’末端への一過的なハイブリダイゼーションを可能にするように調節され、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー及び前記相補デオキシリボ核酸伸長産物のいずれか一方または両方を伸長させて、５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補部分に対応するヌクレオチド配列部分、さらなる部分、及び他の５’プライマー特異的部分の相補体を含む前記１つ以上の異なる一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する、本発明１０１９～１０２２のいずれかの方法。
[本発明１０２５]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、ｕｎｉｔａｑ検出部分をさらに含み、それによって、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、前記ｕｎｉｔａｑ検出部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含むライゲーション産物配列を形成し、
前記方法が、
１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ｕｎｉｔａｑ検出プローブが、相補ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイズし、前記検出プローブが、クエンチャー分子及び前記クエンチャー分子から分離された検出可能な標識を含む、前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを提供する段階と、
前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物に添加する段階と、
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供する前記段階の間、前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補体上の相補ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイズさせる段階であって、前記クエンチャー分子及び前記検出可能な標識が、前記伸長処理中に、前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブから切断され、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を伴う、前記ハイブリダイズさせる段階と
をさらに含む、本発明１００１、１００４または１０１７のいずれかの方法。
[本発明１０２６]
１つの一次オリゴヌクレオチドプライマーまたは１つの二次オリゴヌクレオチドプライマーが、ｕｎｉｔａｑ検出部分をさらに含み、それによって、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、前記ｕｎｉｔａｑ検出部分、及び他の５’プライマー特異的部分の相補体、及びそれらの相補体を含む伸長産物配列を形成し、
前記方法が、
１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを提供する段階であって、各ｕｎｉｔａｑ検出プローブが、相補ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイズし、前記検出プローブが、クエンチャー分子及び前記クエンチャー分子から分離された検出可能な標識を含む、前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを提供する段階と、
前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを、前記１つ以上の第１または第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物に添加する段階と、
前記第１の重合連鎖反応後のポリメラーゼ連鎖反応サイクル中に、前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブを、前記ライゲーション産物配列またはその相補体上の相補ｕｎｉｔａｑ検出部分にハイブリダイズさせる段階であって、前記伸長処理中に、前記クエンチャー分子及び前記検出可能な標識が、前記１つ以上のｕｎｉｔａｑ検出プローブから切断され、前記検出する段階が、前記切断された検出可能な標識の検出を伴う、前記ハイブリダイズさせる段階と
をさらに含む、本発明１００２、１００３、１００５、１００６、１００７、または１０１８のいずれかの方法。
[本発明１０２７]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの一方または両方のオリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸配列またはバイサルファイト変換メチル化核酸配列もしくはその相補配列に、塩基特異的な様式でハイブリダイズした場合、ヌクレオチド配列ミスマッチを有しないかまたは１つのヌクレオチド配列ミスマッチを有するが、前記野生型核酸配列またはバイサルファイト変換非メチル化核酸配列もしくはその相補配列の対応するヌクレオチド配列部分に、塩基特異的な様式でハイブリダイズした場合、ライゲーションを妨害する１つ以上の追加のヌクレオチド配列ミスマッチを有する部分を含む、本発明１００１、１００４、１０１７、１０１９、または１０２１のいずれかの方法。
[本発明１０２８]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’部分が、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体及びブロッキング基を含み、そのため、前記３’末端がポリメラーゼ伸長またはライゲーションに好適ではなく、
前記方法が、前記ライゲーションする段階の前に、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を、前記プローブが前記一次伸長産物のその相補標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズされたときに、切断し、それによって、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブ上の３’ＯＨを遊離する段階をさらに含む、本発明１００１、１００４、または１０１７のいずれかの方法。
[本発明１０２９]
前記オリゴヌクレオチドプローブセットの前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸配列またはバイサルファイト変換メチル化核酸配列もしくはその相補配列とは異なる配列を含み、前記差異が、前記遊離された３’ＯＨ末端から２番目または３番目のヌクレオチド塩基に位置する、本発明１０２８の方法。
[本発明１０３０]
前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが、その５’末端に前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記３’末端と重複した同一のヌクレオチドを有し、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、一次伸長産物の相補標的ヌクレオチド配列上の隣接位置でハイブリダイズして接合部を形成すると、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記重複した同一のヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブとの前記接合部でフラップを形成し、
前記方法が、前記ライゲーションする段階の前に、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記重複した同一のヌクレオチドを、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素で切断し、それによって、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’末端のリン酸を遊離させる段階をさらに含む、本発明１００１、１００４、または１０１７のいずれかの方法。
[本発明１０３１]
前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的部分を有する第３のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、プローブセットの前記第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブが、それら間の接合部を有する前記標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズして、前記第２及び第３のオリゴヌクレオチドプローブ間のライゲーションを可能にして、プローブセットの前記第１、第２、及び第３のオリゴヌクレオチドプローブを含むライゲーション産物配列を形成するように構成されている、本発明１００１、１００４、または１０１７のいずれかの方法。
[本発明１０３２]
前記試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、無細胞循環核酸、無細胞循環腫瘍核酸、妊婦の無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料、及びエキソソームからなる群から選択される、本発明１００１～１０３１のいずれかの方法。
[本発明１０３３]
前記１つ以上の標的ヌクレオチド配列が、低存在量の核酸分子であり、１つ以上のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、選択的スプライシング、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、もしくはゲノムレベルでの他の再編成、及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基を含む、本発明１００１～１０３１のいずれかの方法。
[本発明１０３４]
１つ以上のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、選択的スプライシング、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、もしくはゲノムレベルでの他の再編成、及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基を有する前記低存在量の核酸分子が、前記低存在量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが１つ以上のヌクレオチド塩基変異、挿入、欠失、転座、スプライスバリアント、ｍｉＲＮＡバリアント、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、選択的スプライシング、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、もしくはゲノムレベルでの他の再編成、及び／またはメチル化ヌクレオチド塩基を有しない前記試料中の高存在量の核酸分子から特定及び識別される、本発明１０３３の方法。
[本発明１０３５]
１つ以上の低存在量標的ヌクレオチド配列のコピー数が、前記試料中の高存在量の核酸分子のコピー数と比較して定量される、本発明１０３４の方法。
[本発明１０３６]
前記１つ以上の標的ヌクレオチド配列が、定量または列挙される、本発明１００１～１０３１のいずれかの方法。
[本発明１０３７]
前記１つ以上の標的ヌクレオチド配列が、前記試料中の他のヌクレオチド配列または同一のその後のステップを受ける他の試料と比較して定量または列挙される、本発明１０３６の方法。
[本発明１０３８]
１つ以上の標的ヌクレオチド配列の相対コピー数が、定量または列挙される、本発明１０３７の方法。
[本発明１０３９]
前記特定に基づいて、疾患状態を診断または予測する段階をさらに含む、本発明１００１～１０３１のいずれかの方法。
[本発明１０４０]
前記特定に基づいて、遺伝子型または疾患素因を識別する段階をさらに含む、本発明１００１～１０３１のいずれかの方法。
[本発明１０４１]
個体の生体試料中の複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づいて、細胞または組織の疾患状態を診断または予測する方法であって、
前記複数のマーカーが、６～１２個のマーカー、１２～２４個のマーカー、２４～３６個のマーカー、３６～４８個のマーカー、４８～７２個のマーカー、７２～９６個のマーカー、または９６個超のマーカーを含むセット中にあり、所与のセットの各マーカーが、以下の基準：
前記疾患状態と診断された個体由来の疾患細胞または組織の生体試料の５０％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
前記疾患状態を有しない個体由来の正常細胞または組織の生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
前記疾患状態と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の５０％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
前記疾患状態を有しない個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
前記疾患状態と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む前記生体試料中に１．６５超のｚ値で存在すること
のうちのいずれか１つ以上を有することによって選択され、
前記疾患状態と診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む前記生体試料において、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、１つ以上のメチル化残基を含み、及び／あるいは、存在する、もしくはカットオフレベルを上回る、または１．６５超のｚ値で存在する、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、１つ以上のメチル化残基を含み、
前記方法が、
前記細胞もしくは組織、及び１つ以上の他の組織もしくは細胞に由来する無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに／またはタンパク質を含む生体試料を得る段階であって、前記生体試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、及び体排泄物、またはそれらの画分からなる群から選択される、前記生体試料を得る段階と、
前記試料を、１つ以上の画分に分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エキソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、または無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／もしくはタンパク質を含む、前記画分に分画する段階と、
前記１つ以上の画分中の核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
５０％以上の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーに対して、前記分画中に、及び／または核酸増幅ステップを実施することによって、少なくとも２回の濃縮ステップを実施する段階と、
前記複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーを検出及び識別するために、１つ以上のアッセイを行う段階であって、それによって、前記試料中のそれらの存在またはレベルを特定し、ここで、６～１２個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも２または３個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは１２～２４個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも３、４、または５個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは２４～３６個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも３、４、５、または６個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは３６～４８個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも４、５、６、７、または８個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは４８～７２個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも６、７、８、９、１０、１１、または１２個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは７２～９６個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは９６個～「ｎ」個のマーカー（ここで、「ｎ」＞１６８）のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、または「ｎ」／１２個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、個体が前記疾患状態と診断または予測される、前記アッセイを行う段階と
を含む、前記方法。
[本発明１０４２]
個体の生体試料中の複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づいて、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌の疾患状態を診断または予測する方法であって、
前記複数のマーカーが、４８～７２個の総癌マーカー、７２～９６個の総癌マーカー、または９６個以上の総癌マーカーを含むセット中にあり、所与のセットのかかるマーカーの平均で４分の１超が、試験される前述の主要ながんの各々をカバーし、所与の固形組織癌用の所与のセットの各マーカーが、その固形組織癌用の以下の基準：
所与の固形組織癌と診断された個体由来の所与のがん組織の生体試料の５０％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の正常組織の生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の５０％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料に１．６５超のｚ値で存在すること
のうちのいずれか１つ以上を有することによって選択され、
所与の固形組織と診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む前記生体試料において、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、１つ以上のメチル化残基を含み、及び／あるいは、存在する、もしくはカットオフレベルを上回る、または１．６５超のｚ値で存在する、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、１つ以上のメチル化残基を含み、
前記方法が、
前記細胞もしくは組織、及び１つ以上の他の組織もしくは細胞に由来する無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに／またはタンパク質を含む生体試料を得る段階であって、前記生体試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、及び体排泄物、またはそれらの画分からなる群から選択される、前記生体試料を得る段階と、
前記試料を、１つ以上の画分に分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エキソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、または無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／もしくはタンパク質を含む、前記画分に分画する段階と、
前記１つ以上の画分中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
５０％以上の前記所与の固形組織癌特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーに対して、前記分画中に、及び／または核酸増幅ステップを実施することによって、少なくとも２回の濃縮ステップを実施する段階と、
前記複数の癌特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーを検出及び識別するために、１つ以上のアッセイを行う段階であって、それによって、前記試料中のそれらの存在またはレベルを特定し、ここで、４８～７２個の総癌マーカーを含むマーカーセットに少なくとも４個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、または７２～９６個の総癌マーカーを含むマーカーセットに少なくとも５個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、または９６個～「ｎ」個の総癌マーカー（ここで、「ｎ」＞９６の総癌マーカー）を含むマーカーセットに少なくとも６または「ｎ」／１８個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、個体が前記固形組織癌と診断または予測される、前記１つ以上のアッセイを行う段階と
を含む、前記方法。
[本発明１０４３]
所与の固形組織癌用の所与のセットの各マーカーが、その固形組織癌用の以下の基準：
所与の固形組織癌と診断された個体由来の所与のがん組織の生体試料の６６％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の正常組織の生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の６６％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料に１．６５超のｚ値で存在すること
のうちのいずれか１つ以上を有することによって選択される、本発明１０４２の方法。
[本発明１０４４]
個体の生体試料中の複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づいて、以下の群の固形組織癌：（第１群（結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌）、第２群（乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫）、第３群（肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌）、第４群（前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌）、及び／または第５群（肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌）、の最も可能性の高い特定の原発組織（複数可）の疾患状態を診断または予測し、及び特定する方法であって、
前記複数のマーカーが、３６～４８個の群特異的癌マーカー、４８～６４個の群特異的癌マーカー、または６４個以上の群特異的癌マーカーを含むセット中にあり、所与のセットのかかるマーカーの平均で３分の１超が、そのグループ内で試験される前述の癌の各々をカバーし、所与の固形組織癌用の所与のセットの各マーカーが、その固形組織癌用の以下の基準：
所与の固形組織癌と診断された個体由来の所与のがん組織の生体試料の５０％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の正常組織の生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の５０％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料に１．６５超のｚ値で存在すること
のうちのいずれか１つ以上を有することによって選択され、
所与の固形組織癌と診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む前記生体試料において、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、１つ以上のメチル化残基を含み、及び／あるいは、存在する、もしくはカットオフレベルを上回る、または１．６５超のｚ値で存在する、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、１つ以上のメチル化残基を含み、
前記方法が、
前記細胞もしくは組織、及び１つ以上の他の組織もしくは細胞に由来する無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに／またはタンパク質を含む前記生体試料を得る段階であって、前記生体試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、及び体排泄物、またはそれらの画分からなる群から選択される、前記生体試料を得る段階と、
前記試料を、１つ以上の画分に分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エキソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、または無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／もしくはタンパク質を含む、前記画分に分画する段階と、
前記１つ以上の画分中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
５０％以上の前記所与の固形組織癌特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーに対して、前記分画中に、及び／または核酸増幅ステップを実施することによって、少なくとも２回の濃縮ステップを実施する段階と、
前記複数の癌特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーを検出及び識別するために、１つ以上のアッセイを行う段階であって、それによって、前記試料中のそれらの存在またはレベルを特定し、３６～４８個の群特異的癌マーカーを含むマーカーセットに少なくとも４個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、または４８～６４個の群特異的癌マーカーを含むマーカーセットに少なくとも５個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、または６４個～「ｎ」個の総癌マーカー（ここで、「ｎ」＞６４の群特異的癌マーカー）を含むマーカーセットに６または「ｎ」／１２個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、個体が固形組織癌と診断または予測される、前記１つ以上のアッセイを行う段階と
を含む、前記方法。
[本発明１０４５]
所与の固形組織癌用の所与のセットの各マーカーが、その固形組織癌用の以下の基準：
所与の固形組織癌と診断された個体由来の所与のがん組織の生体試料の６６％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の正常組織の生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の６６％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料に１．６５超のｚ値で存在すること
のうちのいずれか１つ以上を有することによって選択される、本発明１０４４の方法。
[本発明１０４６]
前記少なくとも２回の濃縮ステップが、以下のステップのうちの２つ以上を含む、本発明１０４１～１０４５のいずれかの方法：
エキソソームまたは細胞外小胞または他の保護された状態のマーカーを捕捉もしくは分離すること、血小板画分を捕捉もしくは分離すること、循環腫瘍細胞を捕捉もしくは分離すること、ＲＮＡ含有複合体を捕捉もしくは分離すること、ｃｆＤＮＡヌクレオソームまたは差異的修飾ｃｆＤＮＡ－ヒストン複合体を捕捉もしくは分離すること、タンパク質標的またはタンパク質標的複合体を捕捉もしくは分離すること、自己抗体を捕捉もしくは分離すること、サイトカインを捕捉もしくは分離すること、メチル化ｃｆＤＮＡを捕捉もしくは分離すること、マーカー特異的ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡ、または増幅された相補体を、溶液中、磁気ビーズ上、またはマイクロアレイ上での、相補的な捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによって、捕捉もしくは分離すること、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅＨ２、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイト－メチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、バイサルファイト－メチル特異的ライゲーション反応、及び／またはライゲーション反応を介して、ｍｉＲＮＡマーカー、非コードＲＮＡマーカー（ｌｎｃＲＮＡマーカー及びｎｃＲＮＡマーカー）、ｍＲＮＡマーカー、エキソンマーカー、スプライスバリアントマーカー、転座マーカー、またはコピー数バリエーションマーカーを、線形的または指数的に増幅すること、変異マーカーまたはバイサルファイト変換ＤＮＡメチル化マーカーを含む１つ以上の標的領域を、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅＨ２、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイト－メチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、バイサルファイト－メチル特異的ライゲーション反応、及び／またはライゲーション反応を介して、野生型配列またはバイサルファイト変換非メチル化配列もしくはその相補配列を含む標的領域の増幅を抑制しながら、線形的または指数的に、選択的に増幅すること、３’－ＯＨ末端が酵素及び配列依存的プロセスで遊離している１つ以上のプライマーもしくはプローブを、優先的に伸長、ライゲーション、または増幅すること、標的特異的プライマーもしくはプローブが塩基特異的な様式で野生型配列またはバイサルファイト変換非メチル化配列もしくはその相補配列にハイブリダイズされる前記反応中に、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションが妨害される条件下で、３’末端に１つ以上のミスマッチ塩基を含むまたは３’末端に１つ以上のヌクレオチド類似体及びブロッキング基を含む１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること。
[本発明１０４７]
前記複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質マーカーを検出及び識別するための前記１つ以上のアッセイが、以下のうちの１つ以上を含む、本発明１０４１～１０４６のいずれかの方法：
定量的リアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）法、バイサルファイトｑＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）法、バイサルファイトｄＰＣＲ法、ライゲーション検出法、リガーゼ連鎖反応、制限エンドヌクレアーゼ切断法、ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレアーゼ切断法、マイクロアレイハイブリダイゼーション法、ペプチドアレイ結合法、抗体アレイ法、質量分析法、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法、キャピラリーまたはゲル電気泳動法、化学発光法、蛍光法、ＤＮＡ配列決定法、バイサルファイト変換－ＤＮＡ配列決定法、ＲＮＡ配列決定法、近接ライゲーション法、近接ＰＣＲ法、抗体－標的複合体の固定化を含む方法、アプタマー－標的複合体の固定化を含む方法、免疫アッセイ法、ウエスタンブロットアッセイを含む方法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法、ハイスループットマイクロアレイベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法、またはハイスループットフローサイトメトリーベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法。
[本発明１０４８]
前記複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質マーカーを検出及び識別するための前記１つ以上のアッセイの前記１つ以上のカットオフレベルが、前記疾患個体対正常個体由来の試料を比較する前記１つ以上のマーカーアッセイにおいて、以下の計算、比較、または決定のうちの１つ以上を含む、本発明１０４１～１０４７のいずれかの方法：
マーカーのΔＣｔ値が２超であること、マーカーのΔＣｔ値が４超であること、検出されたマーカー特異的シグナルの比率が１．５超であること、検出されたマーカー特異的シグナルの比率が３超であること、マーカー濃度の比率が１．５超であること、マーカー濃度の比率が３超であること、列挙されたマーカー特異的シグナルが２０％超異なること、列挙されたマーカー特異的シグナルが５０％超異なること、所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルの８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、もしくは９８％超であること、または所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルと比較して、１．０３超、１．２８超、１．６５超、１．７５超、１．８８超、もしくは２．０５超のｚスコアを有すること。
[本発明１０４９]
個体の生体試料中の複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づいて、細胞または組織の疾患状態を診断または予測する２ステップの方法であって、
前記２ステップの方法が、
生体試料を取得する段階であって、前記生体試料が、潜在的な疾患状態の細胞または組織、及び１つ以上の他の組織または細胞に由来する、エキソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態内のマーカー、無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質を含み、前記生体試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体液、体分泌物、及び体排泄物、またはそれらの画分からなる群から選択される、前記生体試料を取得する段階と、
前記疾患状態と診断または予測される可能性がより高い個体を特定するために、第１のステップを、全体的な感度が８０％超、全体的な特異性が９０％超、または全体的なＺスコアが１．２８超の前記生体試料に適用する段階と、
個体を前記疾患状態と診断または予測するために、第２のステップを、前記第１のステップで特定された、全体的な特異性が９５％超または全体的なＺスコアが１．６５超の個体由来の生体試料に適用する段階と
を含み、
前記第１のステップを適用する段階及び／または前記第２のステップを適用する段階が、本発明１０４１～１０４４のいずれかの方法を使用して実施される、前記方法。
[本発明１０５０]
前記疾患状態が、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図５６のリストからから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０５１]
前記疾患状態が、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図５７のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０５２]
前記疾患状態が、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、以下（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－２１，ＭＩＲ２１、ｈｓａ－ｍｉｒ－１８２，ＭＩＲ１８２、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５４，ＭＩＲ４５４、ｈｓａ－ｍｉｒ－９６，ＭＩＲ９６、ｈｓａ－ｍｉｒ－１８３，ＭＩＲ１８３、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４９，ＭＩＲ５４９、ｈｓａ－ｍｉｒ－３０１ ａ ，ＭＩＲ３０１Ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ｆ－１，ＭＩＲ５４８Ｆ１、ｈｓａ－ｍｉｒ－３０１ｂ，ＭＩＲ３０１Ｂ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１０３－１，ＭＩＲ１０３１、ｈｓａ－ｍｉｒ－１８ ａ ，ＭＩＲ１８Ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１４７ｂ，ＭＩＲ１４７Ｂ、ｈｓａ－ｍｉｒ－４３２６，ＭＩＲ４３２６、ａｎｄｈｓａ－ｍｉｒ－５７３，ＭＩＲ５７３、または図５３のリストから選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０５３]
前記疾患状態が、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、図５４のリストから選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０５４]
前記疾患状態が、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、図５５のリストから、または以下からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法：（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）特徴付けられていないタンパク質Ｃ１９ｏｒｆ４８，Ｑ６ＲＵＩ８、タンパク質ＦＡＭ７２Ｂ，Ｑ８６Ｘ６０、タンパク質ＦＡＭ７２Ｄ，Ｑ６Ｌ９Ｔ８、ヒドロキシアシルグルタチオンヒドロラーゼ様タンパク質，Ｑ６ＰＩＩ５、推定メチルトランスフェラーゼＮＳＵＮ５，Ｑ９６Ｐ１１、ＲＮＡプソイドウリジル酸シンターゼドメイン含有タンパク質１，Ｑ９ＵＪＪ７、コラーゲン三重らせんリピート含有タンパク質１，Ｑ９６ＣＧ８、インターロイキン－１１，Ｐ２０８０９、ストロメライシン－２，Ｐ０９２３８、マトリックスメタロプロテイナーゼ－９，Ｐ１４７８０、ポドカン様タンパク質１，Ｑ６ＰＥＺ８、推定ペプチドＹＹ－２，Ｑ９ＮＲＩ６、オステオポンチン，Ｐ１０４５１、スルフヒドリルオキシダーゼ２，Ｑ６ＺＲＰ７、グリピカン－２，Ｑ８Ｎ１５８、マクロファージ遊走阻害因子，Ｐ１４１７４、ペプチジル－プロリル シス－トランスイソメラーゼＡ，Ｐ６２９３７、及びカルレティキュリン，Ｐ２７７９７。
[本発明１０５５]
前記疾患状態が、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（タイチン）、ＭＵＣ１６（ムチン１６）、及びＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２ カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）からなる群から選択される遺伝子の、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０５６]
前記疾患状態が、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、または食道癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図４４または図５９のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０５７]
前記疾患状態が、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、または食道癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図４５または図６０のリストから選択される、１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０５８]
前記疾患状態が、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、または食道癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、図３９のリストから選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列、ｈｓａ－ｍｉｒ－６２４，ＭＩＲ６２４、または図４０のリストもしくは以下からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法：［遺伝子ＩＤ，座標（ＧＲＣｈ３８）］ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ：ＬＩＮＣ０１５５８，ｃｈｒ６：１６７７８４５３７－１６７７９６８５９及びＥＮＳＧ０００００１４６５２１．８。
[本発明１０５９]
前記疾患状態が、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、または食道癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、図４１または図５８のリストから選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０６０]
前記疾患状態が、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、または食道癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、図４２、図４３のリスト、または以下からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法：（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ＳＥＬＥ，１ｑ２２－ｑ２５，セレクチンＥ，Ｐ１６５８１、ＯＴＵＤ４，４ｑ３１．２１，ＯＴＵドメイン含有４，Ｑ０１８０４、ＢＰＩ，２０ｑ１１．２３，殺菌性／透過性増強タンパク質，Ｐ１７２１３、ＡＳＢ４，７ｑ２１－ｑ２２，アンキリンリピート及びＳＯＣＳボックス含有４，Ｑ９Ｙ５７４、Ｃ６ｏｒｆ１２３，６ｑ２７，染色体６オープンリーディングフレーム１２３，Ｑ９Ｙ６Ｚ２、ＫＰＮＡ３，１３ｑ１４．３，カリオフェリンα３（インポーチンα４），Ｏ００５０５、及びＮＵＰ９８，１１ｐ１５，ヌクレオポリン９８ｋＤａ，Ｐ５２９４８、または（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）殺菌性透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）（ＣＡＰ５７），Ｐ１７２１３。
[本発明１０６１]
前記疾患状態が、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、または食道癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、ＡＰＣ（ＡＰＣ、ＷＮＴシグナル伝達経路の調節因子）、ＡＴＭ（ＡＴＭセリン／スレオニンキナーゼ）、ＣＳＭＤ１（ＣＵＢ及びＳｕｓｈｉ複数ドメイン１）、ＤＮＡＨ１１（ダイニン軸糸重鎖１１）、ＤＳＴ（ジストニン）、ＥＰ４００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ４００）、ＦＡＴ３（ＦＡＴ非定型カドヘリン３）、ＦＡＴ４（ＦＡＴ非定型カドヘリン４）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＧＬＩ３（ＧＬＩファミリー亜鉛フィンガー３）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＯＢＳＣＮ（オブスキュリン、細胞骨格カルモジュリン及びタイチン相互作用ＲｈｏＧＥＦ）、ＰＣＬＯ（ピッコロ、シナプス前細胞基質タンパク質）、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸３－キナーゼ触媒サブユニットα）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＳＹＮＥ１（スペクトリンリピート含有核膜タンパク質１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質５３）、ＴＴＮ（タイチン）、及びＵＮＣ１３Ｃ（ｕｎｃ－１３ホモログＣ）からなる群から選択される遺伝子における、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０６２]
前記疾患状態が、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、または子宮癌肉腫であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図６１のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０６３]
前記疾患状態が、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、または子宮癌肉腫であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図６２のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０６４]
前記疾患状態が、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、または子宮癌肉腫であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、以下（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－１２６５，ＭＩＲ１２６５からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０６５]
前記疾患状態が、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、または子宮癌肉腫であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、以下（エキソン位置，遺伝子）：ｃｈｒ２：１７９２０９０１３－１７９２０９０８７：＋，ＯＳＢＰＬ６、ｃｈｒ２：１７９２５１７８８－１７９２５１８６６：＋，ＯＳＢＰＬ６、及びｃｈｒ２：１７９２５３７３６－１７９２５３８８０：＋，ＯＳＢＰＬ６からなる群から選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０６６]
前記疾患状態が、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、または子宮癌肉腫であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、以下からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法：（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ＲＳＰＯ２，８ｑ２３．１，Ｒ－スポンジン２，Ｑ６ＵＸＸ９、ＫＬＣ４，６ｐ２１．１，キネシン軽鎖４，Ｑ９ＮＳＫ０、及びＧＬＲＸ，５ｑ１４，グルタレドキシン（チオールトランスフェラーゼ），Ｐ３５７５４、または（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）Ｒ－スポンジン－２（蓋板特異的スポンジン－２）（ｈＲｓｐｏ２），Ｑ６ＵＸＸ９。
[本発明１０６７]
前記疾患状態が、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、または子宮癌肉腫であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸３－キナーゼ触媒サブユニットα）及びＴＴＮ（タイチン）からなる群から選択される遺伝子における、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０６８]
前記疾患状態が、肺腺癌、肺扁平上皮癌、または頭頸部扁平上皮癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図６３のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０６９]
前記疾患状態が、肺腺癌、肺扁平上皮癌、または頭頸部扁平上皮癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図６４のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７０]
前記疾患状態が、肺腺癌、肺扁平上皮癌、または頭頸部扁平上皮癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）ｈｓａ－ｍｉｒ－２８，ＭＩＲ２８から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７１]
前記疾患状態が、肺腺癌、肺扁平上皮癌、または頭頸部扁平上皮癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、以下（エキソン位置，遺伝子）：ｃｈｒ２：ｃｈｒ１：９３３０７７２１－９３３０９７５２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３１２７４０－９３３１２９１６：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３１６４０５－９３３１６５１２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３４１８５３－９３３４２１５２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３４２６９３３－９３４２７０７９：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ７：４０２２１５５４－４０２２１６２７：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ７：４０２３４５３９－４０２３４６５９：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ８：２２２６５８２３－２２２６６００９：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ８：２２２７２２９３－２２２７２４１５：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ１４：３９５０９９３６－３９５１００９１：－，ＳＥＣ２３Ａ、及びｃｈｒ１４：３９５１１９９０－３９５１２０７６：－，ＳＥＣ２３Ａからなる群から選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７２]
前記疾患状態が、肺腺癌、肺扁平上皮癌、または頭頸部扁平上皮癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、以下からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法：（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ＳＴＲＮ３，１４ｑ１３－ｑ２１，ストリアチン，カルモジュリン結合タンパク質３，Ｑ１３０３３、ＬＲＲＣ１７，７ｑ２２．１，ロイシンリッチリピート含有１７，Ｑ８Ｎ６Ｙ２、ＦＡＭ６９Ａ，１ｐ２２，配列類似性を有するファミリー６９，メンバーＡ，Ｑ５Ｔ７Ｍ９、ＡＴＦ２，２ｑ３２，活性化転写因子２，Ｐ１５３３６、ＢＨＭＴ，５ｑ１４．１，ベタイン－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ，Ｑ９３０８８、ＯＤＺ３／ＴＥＮＭ３，４ｑ３４．３－ｑ３５．１，テニューリン膜貫通タンパク質３，Ｑ９Ｐ２７３、及びＺＦＨＸ４，８ｑ２１．１１，亜鉛フィンガーホメオボックス４，Ｑ８６ＵＰ３、または（タンパク質名称、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ロイシンリッチリピート含有タンパク質１７（ｐ３７ＮＢ），Ｑ８Ｎ６Ｙ２。
[本発明１０７３]
前記疾患状態が、肺腺癌、肺扁平上皮癌、または頭頸部扁平上皮癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、ＣＳＭＤ３（ＣＵＢ及びＳｕｓｈｉ複数ドメイン３）、ＤＮＡＨ５（ダイニン軸糸重鎖５）、ＦＡＴ１（ＦＡＴ非定型カドヘリン１）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＰＣＬＯ（ピッコロシナプス前細胞基質タンパク質）、ＰＫＨＤ１Ｌ１（ＰＫＨＤ１様１）、ＲＥＬＮ（リーリン）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＳＩ（スクラーゼ－イソマルターゼ）、ＳＹＮＥ１（スペクトリンリピート含有核膜タンパク質１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（タイチン）、ＵＳＨ２Ａ（アッシャリン）、及びＸＩＲＰ２（ｘｉｎアクチン結合リピート含有２）からなる群から選択される遺伝子における、１つ以上の変異、挿入、欠失、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７４]
前記疾患状態が、前立腺腺癌または浸潤性膀胱尿路上皮癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図６５のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７５]
前記疾患状態が、前立腺腺癌または浸潤性膀胱尿路上皮癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図６６のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７６]
前記疾患状態が、前立腺腺癌または浸潤性膀胱尿路上皮癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、以下（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－４９１，ＭＩＲ４９１及びｈｓａ－ｍｉｒ－１４６８，ＭＩＲ１４６８からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列、または以下［遺伝子ＩＤ，座標（ＧＲＣｈ３８），ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ］：ＡＣ００７３８３．３，ｃｈｒ２：２０６０８４６０５－２０６０８６５６４，ＥＮＳＧ０００００２２７９４６．１、及びＬＩＮＣ００３２４，ｃｈｒ１７：８２２０６４２－８２２４０４３，ＥＮＳＧ０００００１７８９７７．３からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７７]
前記疾患状態が、前立腺腺癌または浸潤性膀胱尿路上皮癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、（エキソン位置，遺伝子）ｃｈｒ２１：４５５５５９４２－４５５５６０５５：＋，Ｃ２１ｏｒｆ３３から選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７８]
前記疾患状態が、前立腺腺癌または浸潤性膀胱尿路上皮癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ＰＭＭ１，２２ｑ１３，ホスホマンノムターゼ１，Ｑ９２８７１から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０７９]
前記疾患状態が、前立腺腺癌または浸潤性膀胱尿路上皮癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、ＢＡＧＥ２（ＢＡＧＥファミリーメンバー２）、ＤＮＭ１Ｐ４７（ダイナミン１偽遺伝子４７）、ＦＲＧ１ＢＰ（領域遺伝子１ファミリーメンバーＢ、偽遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＲＰ１１－１５６Ｐ１．３、ＴＴＮ（タイチン）、及びＴＵＢＢ８Ｐ７（チューブリンβ８クラスＶＩＩＩ偽遺伝子７）からなる群から選択される遺伝子の、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０８０]
前記疾患状態が、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図７０のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０８１]
前記疾患状態が、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌であり、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図７１のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０８２]
前記疾患状態が、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）ｈｓａ－ｍｉｒ－１３２，ＭＩＲ１３２から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列、または図６７のリストから選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０８３]
前記疾患状態が、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、図６８のリストから選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０８４]
前記疾患状態が、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、図６９のリストから選択される、または以下（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ゲルソリン（ＡＧＥＬ）（アクチン脱重合因子）（ＡＤＦ）（ブレビン），Ｐ０６３９６、プロニューレグリン－２，Ｏ１４５１１、ＣＤ５９糖タンパク質（１Ｆ５抗原）（２０ｋＤａ相同制限因子）（ＨＲＦ－２０）（ＨＲＦ２０）（ＭＡＣ－抑制タンパク質）（ＭＡＣ－ＩＰ）（ＭＥＭ４３抗原）（膜侵襲複合体抑制因子）（ＭＡＣＩＦ）（反応性溶解の膜阻害剤）（ＭＩＲＬ）（プロテクチン）（ＣＤ抗原ＣＤ５９），Ｐ１３９８７、及び分岐プロテインキナーゼ２Ｂ（自閉症関連タンパク質１で欠損），Ｑ９Ｈ７Ｙ０からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
[本発明１０８５]
前記疾患状態が、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌であり、セットの前記１つ以上のマーカーが、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＭＵＣ４（ムチン４、細胞表面結合）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、及びＴＴＮ（タイチン）からなる群から選択される遺伝子における、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、本発明１０４１～１０４９のいずれかの方法。
The present application uses either qPCR or dPCR readouts to identify cancer markers (mutations, expression, splice variants, provide a robust approach for detecting translocations, copy number and/or methylation changes). This approach offers the advantages of being integrated and convenient for laboratory set-up, allowing for cost savings, scalability, and compatibility with medical and laboratory flows in CLIA-compatible automated settings. The benefits in lives saved around the world would be of immeasurable value.
[Invention 1001]
In a sample, one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues with the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample A method for identifying one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by
said target nucleotide sequence differing from said nucleotide sequence of another parent nucleic acid molecule by one or more nucleotides, one or more copy number, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues; providing a sample containing one or more parent nucleic acid molecules potentially containing
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to a sequence of said parent nucleic acid molecule that flanks said target nucleotide sequence; one primary oligonucleotide primer; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer. providing a primary oligonucleotide primer set of
digesting the sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the primary oligonucleotide primer set, the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules to form one or more polymerase extension reaction mixtures; blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
comprising conditions suitable for digesting the one or more polymerase extension reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase extension reaction mixture, and a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase extension reaction cycles, thereby forming a primary extension product comprising a nucleotide sequence complementary to said target nucleotide sequence;
said one or more polymerase extension reaction mixtures comprising said primary extension products, one or more second primary oligonucleotides of said primary oligonucleotide primer set, to form one or more first polymerase chain reaction mixtures blending a primer, one or more enzymes capable of digesting the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule in the reaction mixture, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase chain reaction mixture, as well as denaturation, hybridization, and extension Subjecting to conditions suitable for carrying out one or more polymerase chain reaction cycles comprising treatment, thereby forming one or more first polymerase chain reaction products comprising said target nucleotide sequence or its complement stages and
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set comprising (a) a first oligonucleotide probe having a 5′ primer-specific portion and a 3′ target sequence-specific portion; and (b) ) a second oligonucleotide probe having a 5′ target sequence-specific portion and a 3′ primer-specific portion, wherein the first and second oligonucleotide probes of the probe set are secondary in a base-specific manner; providing said one or more oligonucleotide probe sets configured to hybridize on complementary target nucleotide sequences of extension products;
blending the one or more first polymerase chain reaction products with a ligase and the one or more oligonucleotide probe sets to form one or more ligation reaction mixtures;
subjecting said one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, thereby converting said first and second oligonucleotide probes of said one or more oligonucleotide probe sets into ligated together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer-specific portion, said target-specific subjecting the one or more ligation reaction mixtures comprising the target portion and the 3′ primer specific portion to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
said ligation product sequence, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecule can be digested to form one or more second polymerase chain reaction mixtures. blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming one or more second polymerase chain reaction products;
a target nucleotide that differs from the nucleotide sequence of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues detecting and identifying said one or more second polymerase chain reaction products in said one or more second polymerase chain reaction mixtures to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules containing the sequences; stage and
The above method, comprising
[Invention 1002]
In a sample, one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues with the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample A method for identifying one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by
said target nucleotide sequence differing from said nucleotide sequence of another parent nucleic acid molecule by one or more nucleotides, one or more copy number, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues; providing a sample containing one or more parent nucleic acid molecules potentially containing
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
providing one or more nucleases capable of digesting nucleic acid molecules that do not contain modified nucleotides;
providing one or more first primary oligonucleotide primer(s) comprising a nucleotide sequence complementary to a sequence of said parent nucleic acid molecule that flanks said target nucleotide sequence;
one or more enzymes capable of digesting said sample, said one or more first primary oligonucleotide primers, and said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules to form one or more polymerase extension reaction mixtures , a deoxynucleotide mix containing one or more modified nucleotides that protect the extension products but not the target DNA from nuclease digestion, and a DNA polymerase;
comprising conditions suitable for digesting the one or more polymerase extension reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase extension reaction mixture, and a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase extension reaction cycles, thereby forming a primary extension product comprising the complement of said target nucleotide sequence;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set formed from (a) a first 5′ primer-specific portion and said first primary oligonucleotide primer; (b) a second 5' primer-specific portion and from said first secondary oligonucleotide primer; providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of the extension product formed;
comprising said primary extension product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said one or more nucleases, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more first polymerase chain reaction mixtures blending the one or more polymerase extension reaction mixtures;
subjecting said one or more first polymerase chain reaction mixtures to suitable conditions that digest nucleic acid molecules present in said first polymerase chain reaction mixture but not primary extension products comprising modified nucleotides, and a denaturation treatment; Subjecting to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, including a hybridization treatment and an extension treatment, whereby the first 5′ primer-specific portion, target-specific nucleotide sequence or its complement and forming one or more first polymerase chain reaction products comprising the second 5' primer-specific portion complement;
providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets, each tertiary oligonucleotide primer set comprising: (a) the first 5' primer specific of the one or more first polymerase chain reaction products; (b) a first tertiary oligonucleotide primer comprising the same nucleotide sequence as the target portion; providing said one or more tertiary oligonucleotide primer sets comprising two tertiary oligonucleotide primers;
said one or more first polymerase chain reaction products, said one or more tertiary oligonucleotide primer sets, and said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid to form one or more second polymerase chain reaction mixtures; blending one or more enzymes capable of digesting a molecule, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming one or more second polymerase chain reaction products;
a target nucleotide that differs from the nucleotide sequence of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues detecting and identifying said one or more second polymerase chain reaction products in said one or more second polymerase chain reaction mixtures to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules containing the sequences; stage and
The above method, comprising
[Invention 1003]
In a sample, one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues with the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample A method for identifying one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by
said target nucleotide sequence differing from said nucleotide sequence of another parent nucleic acid molecule by one or more nucleotides, one or more copy number, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues; providing a sample containing one or more parent nucleic acid molecules potentially containing
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
providing one or more nucleases capable of digesting existing nucleic acid molecules that do not contain modified nucleotides;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to a sequence of said parent nucleic acid molecule that flanks said target nucleotide sequence; one primary oligonucleotide primer; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer. providing a primary oligonucleotide primer set of
digesting the sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the primary oligonucleotide primer set, the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules to form one or more polymerase extension reaction mixtures; blending one or more enzymes capable of deoxynucleotides, a deoxynucleotide mix containing one or more modified nucleotides that protect extension products but not target DNA from nuclease digestion, and a DNA polymerase;
comprising conditions suitable for digesting the one or more polymerase extension reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase extension reaction mixture, and a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase extension reaction cycles, thereby forming a primary extension product comprising the complement of said target nucleotide sequence;
said primary extension product, one or more second primary oligonucleotide primers of said one or more primary oligonucleotide primer sets, said one or more blending the one or more polymerase extension reaction mixtures comprising a nuclease, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
The one or more first polymerase chain reaction mixtures are subjected to suitable conditions that digest nucleic acid molecules present in the polymerase chain reaction mixture but not primary extension products containing modified nucleotides, and a denaturation treatment, a hybridization treatment. and subjecting it to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles comprising elongation, thereby forming a first polymerase chain reaction product comprising said target nucleotide sequence or its complement. and,
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set (a) complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer; and (b) a 3' portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of an extension product formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer;
digesting said first polymerase chain reaction product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and extension, to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
a target nucleotide that differs from the nucleotide sequence of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues detecting and identifying said second polymerase chain reaction products in said one or more second polymerase chain reaction mixtures to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules containing sequences;
The above method, comprising
[Invention 1004]
A method for identifying in a sample one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more methylated residues, comprising: said method comprising:
providing a sample comprising one or more parent nucleic acid molecules potentially comprising said target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence of said other parent nucleic acid molecule by one or more methylated residues;
subjecting the nucleic acid molecules in the sample to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set (a) flanking said bisulfite treated target nucleotide sequence comprising said one or more methylated residues; a first primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the sequence of the bisulfite treated parental nucleic acid molecule; and (b) nucleotides complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer. providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising a second primary oligonucleotide primer comprising the sequence;
the bisulfite-treated sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more polymerase extension reaction mixtures and blending
subjecting the one or more polymerase extension reaction mixtures to conditions suitable for one or more polymerase extension reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby complementing the bisulfite-treated target nucleotide sequence; forming a primary extension product comprising a body;
said one or more polymerase extension reaction mixtures comprising said primary extension products to form one or more first polymerase chain reaction mixtures, one or more second of said one or more primary oligonucleotide primer sets; blending a primary oligonucleotide primer, one or more enzymes capable of digesting the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments and one or more polymerase chain reaction cycles comprising elongation, thereby producing a first polymerase chain reaction product comprising said bisulfite-treated target nucleotide sequence or its complement. forming;
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set having (a) a 5′ primer-specific portion and a 3′ bisulfite treated target nucleotide sequence-specific portion or complementary sequence-specific portion; a first oligonucleotide probe and (b) a second oligonucleotide probe having a 5′ bisulfite treated target nucleotide sequence-specific portion or a complementary sequence-specific portion and a 3′ primer-specific portion, said probe set comprising: The one or more oligonucleotide probes, wherein the first and second oligonucleotide probes are configured to hybridize in a base-specific manner on complementary nucleotide sequences of the first polymerase chain reaction product. providing a set;
blending the first polymerase chain reaction product with a ligase and the one or more oligonucleotide probe sets to form one or more ligation reaction mixtures;
subjecting the one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, thereby complementing the first and second oligonucleotide probes of the one or more oligonucleotide probe sets; when hybridized to the sequences ligate together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer specific portion, said bisulfite treated target; subjecting said one or more ligation reaction mixtures comprising a nucleotide sequence specific portion or complementary sequence specific portion and said 3′ primer specific portion to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
said ligation product sequence, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecule can be digested to form one or more second polymerase chain reaction mixtures. blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
to identify the presence of one or more nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by one or more methylated residues from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample; detecting and identifying the second polymerase chain reaction product in the polymerase chain reaction mixture of
The above method, comprising
[Invention 1005]
A method for identifying in a sample one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more methylated residues, comprising: said method comprising:
providing a sample comprising one or more parent nucleic acid molecules potentially comprising said target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence of said other parent nucleic acid molecule by one or more methylated residues;
subjecting the nucleic acid molecules in the sample to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
one or more first primary oligonucleotide primers comprising a nucleotide sequence complementary to a sequence of said bisulfite-treated parent nucleic acid molecule that flanks said bisulfite-treated target nucleotide sequence comprising said one or more methylated residues; providing the(s);
blending the bisulfite-treated sample, the one or more first primary oligonucleotide primers, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more polymerase extension reaction mixtures;
subjecting the one or more polymerase extension reaction mixtures to conditions suitable for one or more polymerase extension reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby complementing the bisulfite-treated target nucleotide sequence; forming a primary extension product comprising a body;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set formed from (a) a 5′ primer specific portion and said first primary oligonucleotide primer; a first secondary oligonucleotide primer having a 3' portion complementary to a portion of a polymerase extension reaction product; and (b) a 5' primer-specific portion and an extension formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of the product;
said primary extension product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, and said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule can be digested to form one or more first polymerase chain reaction mixtures. blending the one or more polymerase extension reaction mixtures comprising one or more enzymes, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
subjecting said one or more first polymerase chain reaction mixtures to suitable conditions that digest nucleic acid molecules present in said first polymerase chain reaction mixture but not primary extension products comprising modified nucleotides, and a denaturation treatment; Subjecting to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, including a hybridization treatment and an extension treatment, whereby the 5′ primer-specific portion of said first secondary oligonucleotide primer, said bisal forming a first polymerase chain reaction product comprising a phyto-treated target nucleotide sequence-specific portion or complementary sequence-specific portion and the complement of said 5′ primer-specific portion of said second secondary oligonucleotide primer; and,
providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets, each tertiary oligonucleotide primer set (a) having the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said first polymerase chain reaction product; and (b) a second tertiary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to said 3′ primer-specific portion of said first polymerase chain reaction product sequence. providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets;
digesting said first polymerase chain reaction product, said one or more tertiary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes capable of deoxynucleotide mix, dUTP, and DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a secondary polymerase chain reaction product;
to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by one or more methylated residues from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample; detecting and identifying said secondary polymerase chain reaction product in the polymerase chain reaction mixture of 2;
The above method, comprising
[Invention 1006]
A method for identifying in a sample one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more methylated residues, comprising: said method comprising:
providing a sample comprising one or more parent nucleic acid molecules potentially comprising said target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence of said other parent nucleic acid molecule by one or more methylated residues;
subjecting the nucleic acid molecules in the sample to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set (a) flanking said bisulfite treated target nucleotide sequence comprising said one or more methylated residues; a first primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the sequence of the bisulfite treated parental nucleic acid molecule; and (b) nucleotides complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer. providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising a second primary oligonucleotide primer comprising the sequence;
the bisulfite-treated sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more polymerase extension reaction mixtures and blending
subjecting the one or more polymerase extension reaction mixtures to conditions suitable for one or more polymerase extension reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby complementing the bisulfite-treated target nucleotide sequence; forming a primary extension product comprising a body;
said one or more polymerase extension reaction mixtures comprising said primary extension products, one or more second of said one or more primary oligonucleotide primer sets, to form one or more first polymerase chain reaction mixtures blending a primary oligonucleotide primer of, one or more enzymes capable of digesting the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule in the reaction mixture, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments and one or more polymerase chain reaction cycles comprising elongation, thereby producing a first polymerase chain reaction product comprising said bisulfite-treated target nucleotide sequence or its complement. forming;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising: (a) a first polymerase chain reaction product formed from said first primary oligonucleotide primer; and (b) a portion of a first polymerase chain reaction product formed from said first secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion complementary to a portion of providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3' portion comprising a complementary nucleotide sequence;
digesting said first polymerase chain reaction product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and extension, to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by one or more methylated residues from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample; detecting and identifying the second polymerase chain reaction product in the polymerase chain reaction mixture of 2;
The above method, comprising
[Invention 1007]
A method for identifying in a sample one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more methylated residues, comprising: said method comprising:
providing a sample comprising one or more parent nucleic acid molecules potentially comprising said target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence of said other parent nucleic acid molecule by one or more methylated residues;
subjecting the nucleic acid molecules in the sample to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a 5′ primer specific portion and said one or more methylated residues; a first primary oligonucleotide primer having a 3' portion comprising a nucleotide sequence complementary to a sequence of said bisulfite treated parental nucleic acid molecule flanked by a target nucleotide sequence; and (b) a 5' primer specific portion and said first providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising a second primary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of the extension products formed from the primary oligonucleotide primers of stages and
the bisulfite-treated sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more polymerase extension reaction mixtures and blending
subjecting the one or more polymerase extension reaction mixtures to conditions suitable for one or more polymerase extension reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby complementing the bisulfite-treated target nucleotide sequence; forming a primary extension product comprising a body;
said one or more polymerase extension reaction mixtures comprising said primary extension products, one or more second of said one or more primary oligonucleotide primer sets, to form one or more first polymerase chain reaction mixtures blending a primary oligonucleotide primer of, one or more enzymes capable of digesting the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule in the reaction mixture, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase chain reaction mixture, as well as denaturation, hybridization, and extension subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles comprising the treatment, thereby forming a first polymerase chain reaction product comprising said bisulfite-treated target nucleotide sequence or its complement. and,
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising: (a) the 5′ primer specific for the first polymerase chain reaction product or their complement; (b) a nucleotide sequence complementary to said 3′ primer specific portion of said first polymerase chain reaction product or their complement; providing the one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer comprising
digesting said primary polymerase chain reaction product sequence, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes capable of deoxynucleotide mix, dUTP, and DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by one or more methylated residues from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample; detecting and identifying the second polymerase chain reaction product in the polymerase chain reaction mixture of 2;
The above method, comprising
[Invention 1008]
1007. The method of any of inventions 1001-1007, further comprising contacting said sample with a DNA repair enzyme to repair damaged DNA, abasic sites, oxidized bases, or nicks in said DNA.
[Invention 1009]
prior to or concurrently with said blending to form one or more polymerase extension reaction mixtures, contacting said sample with at least a first methylation sensitive enzyme to form a restriction enzyme reaction mixture; wherein said first methylation-sensitive enzyme cleaves nucleic acid molecules in said sample that contain one or more unmethylated residues within at least one methylation-sensitive enzyme recognition sequence, thereby said detecting A step involves detecting one or more parent nucleic acid molecules comprising said target nucleotide sequence, wherein said parent nucleic acid molecules naturally comprise one or more methylated residues, said sample being subjected to at least a first methylation contacting with a sensitizing enzyme
The method of any of inventions 1004-1007, further comprising:
[Invention 1010]
of inventions 1004-1007, further comprising contacting said sample with an immobilized methylated nucleic acid binding protein or antibody to selectively bind and enrich methylated nucleic acids in said sample. either way.
[Invention 1011]
A nucleotide sequence mismatch when a primer from said one or more primary or secondary oligonucleotide primer sets hybridizes in a base-specific manner to said target nucleic acid sequence or bisulfite converted methylated nucleic acid sequence or its complementary sequence or has one nucleotide sequence mismatch, but hybridizes in a base-specific manner to the corresponding nucleotide sequence portion of the wild-type nucleic acid sequence or the bisulfite-converted unmethylated nucleic acid sequence or its complement, The method of any of inventions 1001-1007, comprising a portion with one or more additional nucleotide sequence mismatches that interfere with polymerase extension.
[Invention 1012]
one or both primary oligonucleotide primers of said primary oligonucleotide primer set and/or one or both secondary oligonucleotide primers of said secondary oligonucleotide primer set comprise a cleavable nucleotide or nucleotide analogue and a blocking group has a 3' portion so that the 3' end of the primer(s) is not suitable for polymerase extension;
The method cleaves the cleavable nucleotides or nucleotide analogues of one or both oligonucleotide primers during the hybridization process, thereby, prior to the extension process, on one or both oligonucleotide primers. 1007. The method of any of inventions 1001-1007, further comprising releasing the free 3'OH end of
[Invention 1013]
a primer from said one or more primary or secondary oligonucleotide primer sets comprises a sequence different from said target nucleic acid sequence or a bisulfite conversion methylated nucleic acid sequence or its complementary sequence, said difference being said released The method of invention 1012 located at the second or third nucleotide base from the 3'OH terminus.
[Invention 1014]
1013. The method of invention 1012, wherein said cleavable nucleotide comprises one or more RNA bases.
[Invention 1015]
providing one or more blocking oligonucleotide primers comprising one or more mismatched bases at said 3′ end or one or more nucleotide analogues and blocking groups at said 3′ end, so that said blocking said 3′ end of an oligonucleotide primer is not suitable for polymerase extension when hybridized in a base-specific manner to a wild-type nucleic acid sequence or a bisulfite-converted unmethylated nucleic acid sequence or its complementary sequence, wherein The blocking oligonucleotide primer includes a portion having the same nucleotide sequence as that of the wild-type nucleic acid sequence or the bisulfite-converted unmethylated nucleic acid sequence or its complementary sequence to which the blocking oligonucleotide primer hybridizes, but the providing said one or more blocking oligonucleotide primers having one or more nucleotide sequence mismatches to corresponding nucleotide sequence portions of the target nucleic acid sequence or the bisulfite-converted methylated nucleic acid sequence or its complementary sequence;
Blending said one or more blocking oligonucleotide primers with said sample or subsequent product prior to a polymerase extension reaction, polymerase chain reaction, or ligation reaction, whereby during hybridization, said one One or more blocking oligonucleotide primers preferentially hybridize in a base-specific manner to the wild-type nucleic acid sequence or the bisulfite-converted unmethylated nucleic acid sequence or its complementary sequence, thereby rendering the wild-type or bisulfite sequence said one or more blocking oligonucleotide primers that interfere with polymerase extension or ligation during the reaction of primers or probes hybridized in a base-specific manner to a phytoconverted unmethylated sequence or its complementary sequence; or a subsequent step of blending with the product and
The method of any of inventions 1001-1007, further comprising:
[Invention 1016]
said first secondary oligonucleotide primer having a 5′ primer-specific portion; said second secondary oligonucleotide primer having a 5′ primer-specific portion; and said one or more secondary oligos a third secondary oligonucleotide primer whose nucleotide primer set comprises the same nucleotide sequence as said 5′ primer-specific portion of said first secondary oligonucleotide primer; and (d) said second secondary oligonucleotide primer. 1006. The method of any of claims 1003 or 1006, further comprising a fourth secondary oligonucleotide primer comprising the same nucleotide sequence as said 5' primer specific portion of.
[Invention 1017]
In a sample, ribonucleic acid sequences of other parental ribonucleic acid molecules in said sample include alternative splicing, alternative transcripts, alternative initiation sites, alternative coding sequences, alternative non-coding sequences, exon insertions, exon deletions, introns A method for identifying one or more parent ribonucleic acid molecules that contain a target ribonucleic acid sequence that differs due to an insertion, translocation, mutation, or other rearrangement at the genomic level, said method comprising:
providing a sample comprising one or more parent ribonucleic acid molecules comprising a target ribonucleic acid molecule that potentially differs in sequence from other parent ribonucleic acid molecules;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to an RNA sequence of said parent ribonucleic acid molecule that flanks said target ribonucleotide sequence; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of said cDNA extension product formed from said first primary oligonucleotide primer , providing said one or more primary oligonucleotide primer sets;
said contacted sample, said one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix comprising dUTP, a reverse transcriptase, and a DNA polymerase or reverse to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures; blending a DNA polymerase with transcriptase activity;
the one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures under suitable conditions to produce deoxyribonucleic acid (cDNA) molecules complementary to the target ribonucleic acid, and denaturation, hybridization, and extension treatments. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming one or more different reverse transcription/polymerase products;
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set comprising (a) a first oligonucleotide probe having a 5′ primer-specific portion and a 3′ target sequence-specific portion; and (b) ) a second oligonucleotide probe having a 5′ target sequence-specific portion and a 3′ primer-specific portion, wherein said first and second oligonucleotide probes of a probe set are in a base-specific manner, said target providing said one or more oligonucleotide probe sets configured to hybridize on a complementary portion of a reverse transcriptase/polymerase product corresponding to a ribonucleic acid molecule sequence;
contacting the reverse transcriptase/polymerase product with a ligase and the one or more oligonucleotide probe sets to form one or more ligation reaction mixtures;
subjecting said one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, whereby said first and second probes of said one or more oligonucleotide probe sets are converted to their complements ligated together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer-specific portion, said target-specific portion and the 3′ primer-specific portion, subjecting the one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
The ligation product sequence, the one or more secondary oligonucleotide primer sets, can be digested with a deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecule to form one or more first polymerase chain reaction mixtures. blending with one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a first polymerase chain reaction product;
detecting and distinguishing said first polymerase chain reaction product, whereby ribonucleic acid sequences of other parental ribonucleic acid molecules in said sample include: alternative splicing, alternative transcripts, alternative initiation sites, alternative coding sequences; , of one or more parent ribonucleic acid molecules comprising target ribonucleic acid sequences that differ due to alternative non-coding sequences, exon insertions, exon deletions, intron insertions, translocations, mutations, or other rearrangements at the genomic level identifying the existence and
The above method, comprising
[Invention 1018]
In a sample, ribonucleic acid sequences of other parental ribonucleic acid molecules in said sample include alternative splicing, alternative transcripts, alternative initiation sites, alternative coding sequences, alternative non-coding sequences, exon insertions, exon deletions, introns A method for identifying one or more parent ribonucleic acid molecules that contain a target ribonucleic acid sequence that differs due to an insertion, translocation, mutation, or other rearrangement at the genomic level, said method comprising:
providing a sample comprising one or more parent ribonucleic acid molecules comprising a target ribonucleic acid molecule that potentially differs in sequence from other parent ribonucleic acid molecules;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to an RNA sequence of said parent ribonucleic acid molecule that flanks said target nucleotide sequence; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of said cDNA extension product formed from said first primary oligonucleotide primer, providing said one or more primary oligonucleotide primer sets;
said contacted sample, said one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, a reverse transcriptase, and a DNA polymerase or reverse transcriptase activity to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures and blending a DNA polymerase having
the one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures under suitable conditions to produce deoxyribonucleic acid (cDNA) molecules complementary to the target RNA, and denaturation, hybridization, and extension treatments. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming one or more different reverse transcription/primary polymerase chain reaction products;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set (a) reverse transcription/primary polymerase chain reaction generation formed from said first primary oligonucleotide primers; and (b) one of the reverse transcription/primary polymerase chain reaction products formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to said portion;
said reverse transcription/primary polymerase chain reaction product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, and said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more first polymerase chain reaction mixtures; blending one or more enzymes capable of digestion, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and extension, to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a first polymerase chain reaction product;
detecting and distinguishing said first polymerase chain reaction product, whereby ribonucleic acid sequences of other parental ribonucleic acid molecules in said sample include: alternative splicing, alternative transcripts, alternative initiation sites, alternative coding sequences; , of one or more parent ribonucleic acid molecules comprising target ribonucleic acid sequences that differ due to alternative non-coding sequences, exon insertions, exon deletions, intron insertions, translocations, mutations, or other rearrangements at the genomic level identifying the existence and
The above method, comprising
[Invention 1019]
A method for identifying one or more target miRNA molecules in a sample that differ in sequence by one or more bases from other microribonucleic acid (miRNA) molecules in the sample, the method comprising:
providing a sample comprising one or more target miRNA molecules that potentially differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
To form one or more first ligation reaction mixtures, the contacted sample is combined with a ligase and a 5′ phosphate, a 5′ stem loop portion, an internal primer specific portion within the loop region, a blocking group, and blending with one or more first oligonucleotide preprobes comprising a 3′ nucleotide sequence complementary to the 3′ portion of the target miRNA molecule sequence;
to generate a chimeric nucleic acid molecule comprising the target miRNA molecule sequence, appended to the one or more first oligonucleotide preprobes when present in the sample; ligating the one or more target miRNA molecules at their 3′ ends to the 5′ phosphates of the one or more first oligonucleotide preprobes in a ligation reaction mixture;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to said internal primer specific portion of said first oligonucleotide preliminary probe; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion and a 3′ portion, said second primary oligonucleotide primer being linked to another set of other second providing said one or more primary oligonucleotide primer sets, which may be the same or different than the primary oligonucleotide primers of
said one or more first ligation reaction mixtures comprising chimeric nucleic acid molecules; said one or more primary oligonucleotide primer sets; blending the one or more enzymes capable of digesting uracil (dU)-containing nucleic acid molecules, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a reverse transcriptase and a DNA polymerase or a DNA polymerase having reverse transcriptase activity;
conditions suitable for digesting said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures to deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said reverse transcription/polymerase chain reaction mixture, complementary to said chimeric nucleic acid molecules; and conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles comprising denaturation, hybridization, and extension treatments, thereby forming the 5' forming one or more different primary reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising a primer-specific portion, a nucleotide sequence corresponding to said target miRNA molecule sequence, and the complement of said internal primer-specific portion, and the complement thereof stages and
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set comprising (a) a first oligonucleotide probe having a 5′ primer-specific portion and a 3′ target sequence-specific portion; ) a second oligonucleotide probe having a 5′ target sequence-specific portion, a portion complementary to the primary extension product, and a 3′ primer-specific portion, wherein said first and second oligonucleotide probes of the probe set are , said one or more oligos configured to hybridize in a base-specific manner on a complementary portion of a primary reverse transcription/polymerase chain reaction product corresponding to said target miRNA molecule sequence or its complement providing a nucleotide probe set;
contacting said primary reverse transcription/polymerase chain reaction product with a ligase and said one or more oligonucleotide probe sets to form one or more second ligation reaction mixtures;
subjecting said one or more second ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, whereby said first and second oligonucleotide probes of said one or more oligonucleotide probe sets are when hybridized to their complements, ligate together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer-specific portion, subjecting the one or more second ligation reaction mixtures comprising the target-specific portion and the 3′ primer-specific portion to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
The ligation product sequences and the one or more secondary oligonucleotide primer sets can be digested with deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecules to form one or more second polymerase chain reaction mixtures. blending with one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a secondary polymerase chain reaction product;
detecting and identifying said secondary polymerase chain reaction products in said one or more reactions, thereby one or more targets differing in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in said sample; identifying miRNA molecules;
The method above.
[Invention 1020]
A method for identifying one or more target miRNA molecules in a sample that differ in sequence by one or more bases from other microribonucleic acid (miRNA) molecules in the sample, the method comprising:
providing a sample comprising one or more target miRNA molecules that potentially differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
To form one or more ligation reaction mixtures, the contacted sample is combined with a ligase and a 5' phosphate, a 5' stem loop portion, an internal primer specific portion within the loop region, a blocking group, and the target miRNA. blending with one or more first oligonucleotide probes comprising a 3′ nucleotide sequence complementary to the 3′ portion of the molecular sequence;
in said one or more ligation reaction mixtures to generate a chimeric nucleic acid molecule comprising said target miRNA molecule sequence, appended to said one or more first oligonucleotide probes when present in said sample; and ligating the one or more target miRNA molecules at their 3' ends to the 5' phosphates of the one or more first oligonucleotide probes;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to said internal primer specific portion of said first oligonucleotide probe; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion and a 3′ portion, said second primary oligonucleotide primer being linked to another set of other second providing said one or more primary oligonucleotide primer sets, which may be the same as or different from the primary oligonucleotide primers;
said one or more ligation reaction mixtures comprising a chimeric nucleic acid molecule, said one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, and a reverse transcriptase to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures and blending a DNA polymerase or a DNA polymerase with reverse transcriptase activity;
applying said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable for producing deoxyribonucleic acid (cDNA) molecules complementary to said chimeric nucleic acid molecules, and denaturation, hybridization and extension treatments. subjecting to conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles whereby the 5′ primer-specific portion, the nucleotide sequence corresponding to the target miRNA molecule sequence, and the complement of the internal primer-specific portion, and forming one or more different primary reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising the complement of
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set having an extension formed from (a) a 5′ primer specific portion and said first primary oligonucleotide primer; a first secondary oligonucleotide primer having a 3' portion complementary to a portion of the product; and (b) a 5' primer-specific portion and one of the extension products formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to said portion;
Blending said primary reverse transcription/polymerase chain reaction product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, deoxynucleotide mix, and DNA polymerase to form one or more first polymerase chain reaction mixtures stages and
subjecting the one or more first polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable for two or more polymerase chain reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby a second oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion of an oligonucleotide primer, a nucleotide sequence corresponding to said target miRNA molecule sequence or its complement, and the complement of the other 5′ primer-specific portion, a second secondary oligonucleotide primer; forming a polymerase chain reaction product of 1;
providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets, each tertiary oligonucleotide primer set comprising: (a) the 5' primer-specific portion of the first polymerase chain reaction product or their complement; and (b) a second tertiary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to said 3′ primer-specific portion of said first polymerase chain reaction product or their complement. providing said one or more tertiary oligonucleotide primer sets comprising tertiary oligonucleotide primers of
digesting said first polymerase chain reaction process product, said one or more tertiary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
detecting and identifying the second polymerase chain reaction product, thereby identifying one or more target miRNA molecules that differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
The method above.
[Invention 1021]
A method for identifying one or more target miRNA molecules in a sample that differ in sequence by one or more bases from other microribonucleic acid (miRNA) molecules in the sample, the method comprising:
providing a sample comprising one or more target miRNA molecules that potentially differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
blending the contacted sample with ATP and poly(A) polymerase to form a poly(A) polymerase reaction mixture;
subjecting the poly(A) polymerase reaction mixture to conditions suitable for adding homopolymer A to the 3' ends of the one or more target miRNA molecules potentially present in the sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primer set comprising (a) a first primary oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion, an internal poly dT portion, and said said first primary oligonucleotide primer comprising a 3′ portion comprising 1-10 bases complementary to said 3′ end of the target miRNA, which may be the same or different from other first primary oligonucleotide primers of the other sets; 1 primary oligonucleotide primer, and (b) a second primary oligonucleotide primer, comprising a 5′ primer-specific portion and a 3′ portion, the same as other second primary oligonucleotide primers in other sets providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising said second primary oligonucleotide primers, which may be different from or
said poly(A) polymerase reaction mixture, said one or more primary oligonucleotide primer sets, deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules in said sample to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures; blending the one or more enzymes capable of digestion, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a reverse transcriptase and a DNA polymerase or a DNA polymerase having reverse transcriptase activity;
subjecting said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable for digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said reverse transcription/polymerase chain reaction mixture; and conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles comprising denaturation, hybridization, and extension treatments. thereby providing the 5′ primer-specific portion of the second primary oligonucleotide primer, a nucleotide sequence corresponding to the target miRNA molecule sequence, a poly dA region, and the 5 of the first primary oligonucleotide primer. 'forming the complement of the primer specific portion and one or more different reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising the complement;
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set comprising (a) a first oligonucleotide probe having a 5′ primer-specific portion and a 3′ target sequence-specific portion; and (b) ) a second oligonucleotide probe having a 5′ target sequence-specific portion, a portion complementary to said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction products, and a 3′ primer-specific portion; First and second oligonucleotide probes hybridize in a base-specific manner to complementary portions of said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction products corresponding to said target miRNA molecule sequence or its complement. providing the one or more oligonucleotide probe sets configured to;
contacting said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction products with a ligase and said one or more oligonucleotide probe sets to form one or more ligation reaction mixtures;
subjecting the one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, whereby the first and second oligonucleotide probes of the one or more oligonucleotide probe sets are ligated together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer-specific portion, said target-specific subjecting the one or more second ligation reaction mixtures comprising the target portion and the 3′ primer specific portion to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
The ligation product sequences and the one or more secondary oligonucleotide primer sets can be digested with deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecules to form one or more first polymerase chain reaction mixtures. blending with one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a secondary polymerase chain reaction product;
detecting and identifying said secondary polymerase chain reaction products, thereby identifying one or more target miRNA molecules that differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in said sample;
The method above.
[Invention 1022]
A method for identifying one or more target miRNA molecules in a sample that differ in sequence by one or more bases from other microribonucleic acid (miRNA) molecules in the sample, the method comprising:
providing a sample comprising one or more target miRNA molecules that potentially differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
blending the contacted sample with ATP and poly(A) polymerase to form a poly(A) polymerase reaction mixture;
subjecting the poly(A) polymerase reaction mixture to conditions suitable for adding homopolymer A to the 3' ends of the one or more target miRNA molecules potentially present in the sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primer set comprising (a) a first primary oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion, an internal poly dT portion, and said said first primary oligonucleotide primer comprising a 3′ portion comprising 1-10 bases complementary to said 3′ end of the target miRNA, which may be the same or different from other first primary oligonucleotide primers of the other sets; 1 primary oligonucleotide primer, and (b) a second primary oligonucleotide primer, comprising a 5′ primer-specific portion and a 3′ portion, the same as other second primary oligonucleotide primers in other sets providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising said second primary oligonucleotide primers, which may be different from or
said poly(A) polymerase reaction mixture potentially containing a target miRNA sequence with a 3′ poly A tail, said one or more primary oligonucleotide primers, to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures blending a set, a deoxynucleotide mix, and a reverse transcriptase and a DNA polymerase or a DNA polymerase with reverse transcriptase activity;
subjecting said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable to produce deoxyribonucleic acid (cDNA) molecules complementary to said target miRNA sequences with 3' poly A tails, and denaturation, hybridization, subject to conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles, including treatment and extension, thereby said 5' primer-specific portion of said second primary oligonucleotide primer, corresponding to said target miRNA molecule sequence. forming one or more different reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising a nucleotide sequence, a poly dA region, and the complement of said 5' primer-specific portion of said first primary oligonucleotide primer and its complement stages and
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set formed from (a) a 5′ primer-specific portion and the first primary oligonucleotide primer; a first secondary oligonucleotide primer having a 3' portion complementary to a portion of the transcription/polymerase chain reaction product; and (b) a 5' primer-specific portion and formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of the reverse transcription/polymerase chain reaction product to be and
blending the reverse transcription/polymerase chain reaction product, the one or more secondary oligonucleotide primer sets, the deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more first polymerase chain reaction mixtures; and,
subjecting the one or more first polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable for two or more polymerase chain reaction cycles comprising denaturation, hybridization, and extension treatments, whereby the 5' primer-specific portion is , forming a first polymerase chain reaction product comprising a nucleotide sequence corresponding to said target miRNA molecule sequence or its complement, and the complement of another 5′ primer-specific portion;
providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets, each tertiary oligonucleotide primer set (a) having the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said first polymerase chain reaction product sequence; and (b) a second tertiary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to said 3′ primer-specific portion of said first polymerase chain reaction product sequence; providing said one or more tertiary oligonucleotide primer sets;
digesting said first polymerase chain reaction product, said one or more tertiary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes capable of deoxynucleotide mix, dUTP, and DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixture, as well as denaturation treatments, hybridization treatments and one or more polymerase chain reaction cycles comprising elongation, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
detecting and identifying said second polymerase chain reaction product in said one or more reactions, thereby producing one or more miRNA molecules that differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in said sample; identifying a target miRNA molecule;
The method above.
[Invention 1023]
said 3' portion of said second primary oligonucleotide primer comprises a ribo G and/or G nucleotide analogue, and said reverse transcriptase binds to said 3' end of said complementary deoxyribonucleic acid product of said target miRNA; or adding three cytosine nucleotides to allow transient hybridization to the 3′ end of the second primary oligonucleotide primer to allow the reverse transcriptase to undergo a strand switch, and extending a complementary deoxyribonucleic acid product to include a complementary sequence of said 5' primer-specific portion of said second primary oligonucleotide primer to a 5' primer-specific portion, said target miRNA molecule sequence or its complement; 1023. Forming said one or more different first polymerase chain reaction products comprising the complement of corresponding nucleotide sequence portions, further portions, and other 5' primer specific portions. Method.
[Invention 1024]
6- said 3' portion of said second primary oligonucleotide primer comprises, 5' to 3', three ribo G or G bases followed by an additional base identical to the 5' end of said target miRNA sequence; comprising 14 bases, said reverse transcriptase adding 2 or 3 cytosine residues to the 3′ end of the initial complementary deoxyribonucleic acid extension product of said target miRNA, said denaturing treatment of said polymerase chain reaction once initiated, said conditions are adjusted to allow transient hybridization from said 3' end of said second primary oligonucleotide primer to said 3' end of said complementary deoxyribonucleic acid extension product; extending either or both of said second primary oligonucleotide primer and said complementary deoxyribonucleic acid extension product to provide a 5′ primer specific portion, a nucleotide sequence portion corresponding to said target miRNA molecule sequence or a complementary portion thereof; 1023. The method of any of inventions 1019-1022, forming said one or more different primary reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising complements of moieties and other 5' primer-specific moieties.
[Invention 1025]
Said second oligonucleotide probe of said oligonucleotide probe set further comprises a unitaq detection portion, whereby said 5′ primer-specific portion, said target-specific portion, said unitaq detection portion, and said 3′ primer-specific forming a ligation product sequence comprising a target portion;
said method comprising:
providing one or more unitaq detection probes, each unitaq detection probe hybridized to a complementary unitaq detection moiety, said detection probe comprising a quencher molecule and a detectable molecule separated from said quencher molecule. providing said one or more unitaq detection probes comprising a label;
adding the one or more unitaq detection probes to the second polymerase chain reaction mixture;
During said step of subjecting said second polymerase chain reaction mixture to conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles, said one or more unitaq detection probes are coupled to the complement on said ligation product sequence or its complement. hybridizing to a unitaq detection moiety, wherein the quencher molecule and the detectable label are cleaved from the one or more unitaq detection probes during the extension process; said hybridizing with detection of the detected detectable label;
The method of any of the inventions 1001, 1004 or 1017, further comprising:
[Invention 1026]
One primary oligonucleotide primer or one secondary oligonucleotide primer further comprises a unitaq detection portion, whereby said 5′ primer specific portion, said target specific portion, said unitaq detection portion and the other 5′ forming extension product sequences comprising the complements of the primer-specific portions and their complements;
said method comprising:
providing one or more unitaq detection probes, each unitaq detection probe hybridized to a complementary unitaq detection moiety, said detection probe comprising a quencher molecule and a detectable molecule separated from said quencher molecule. providing said one or more unitaq detection probes comprising a label;
adding the one or more unitaq detection probes to the one or more first or second polymerase chain reaction mixtures;
hybridizing the one or more unitaq detection probes to complementary unitaq detection moieties on the ligation product sequence or its complement during a polymerase chain reaction cycle after the first polymerization chain reaction; wherein the quencher molecule and the detectable label are cleaved from the one or more unitaq detection probes during an extension process, and wherein the detecting step involves detecting the cleaved detectable label; and
The method of any of the inventions 1002, 1003, 1005, 1006, 1007, or 1018, further comprising:
[Invention 1027]
One or both oligonucleotide probes of said oligonucleotide probe set do not have a nucleotide sequence mismatch when hybridized in a base-specific manner to said target nucleic acid sequence or bisulfite converted methylated nucleic acid sequence or its complementary sequence or has one nucleotide sequence mismatch, but hybridizes in a base-specific manner to the corresponding nucleotide sequence portion of the wild-type nucleic acid sequence or the bisulfite-converted unmethylated nucleic acid sequence or its complementary sequence. The method of any of invention 1001, 1004, 1017, 1019, or 1021, comprising a portion with one or more additional interfering nucleotide sequence mismatches.
[Invention 1028]
said 3' portion of said first oligonucleotide probe of said oligonucleotide probe set comprises a cleavable nucleotide or nucleotide analogue and a blocking group such that said 3' end is not suitable for polymerase extension or ligation;
when the probe is hybridized to its complementary target nucleotide sequence of the primary extension product, prior to the ligating step, the cleavable nucleotide or nucleotide analogue of the first oligonucleotide probe; 1017. The method of any of claims 1001, 1004, or 1017, further comprising cleaving to , thereby releasing the 3'OH on said first oligonucleotide probe.
[Invention 1029]
The one or more first oligonucleotide probes of the oligonucleotide probe set comprise a sequence different from the target nucleic acid sequence or a bisulfite conversion methylated nucleic acid sequence or a complementary sequence thereof, and the difference is the released The method of invention 1028 located at the second or third nucleotide base from the 3'OH terminus.
[Invention 1030]
wherein the second oligonucleotide probe has at its 5′ end an identical nucleotide that overlaps with the 3′ end of the first oligonucleotide probe, and the first and second oligonucleotide probes of the probe set are , hybridizing at adjacent positions on the complementary target nucleotide sequence of the primary extension product to form a junction, the overlapping identical nucleotides of the second oligonucleotide probe are combined with the first oligonucleotide probe. form a flap at the junction,
The method comprises, prior to the ligating step, cleaving the duplicated identical nucleotides of the second oligonucleotide probe with an enzyme having 5' nuclease activity, thereby cleaving the second oligonucleotide probe. The method of any of claims 1001, 1004, or 1017, further comprising releasing said 5' terminal phosphate.
[Invention 1031]
said one or more oligonucleotide probe sets further comprising a third oligonucleotide probe having a target specific portion, said second and third oligonucleotide probes of said probe set having a junction therebetween; said first, second and third oligonucleotide probes of a probe set hybridized adjacent to each other on a target nucleotide sequence to allow ligation between said second and third oligonucleotide probes; The method of any of inventions 1001, 1004, or 1017, configured to form a ligation product sequence comprising:
[Invention 1032]
The sample comprises tissue, cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, bodily fluid, bodily secretions, bodily excretions, cell-free circulating nucleic acids, cell-free circulating tumor nucleic acids, cell-free circulating fetal nucleic acids in pregnant women, circulating The method of any of inventions 1001-1031 selected from the group consisting of tumor cells, tumors, tumor biopsies, and exosomes.
[Invention 1033]
said one or more target nucleotide sequences is a low abundance nucleic acid molecule and one or more nucleotide base mutations, insertions, deletions, translocations, splice variants, miRNA variants, alternative transcripts, alternative start sites, alternative Any of the inventions 1001-1031 comprising coding sequences, alternative non-coding sequences, alternative splicing, exon insertions, exon deletions, intron insertions, or other rearrangements at the genomic level, and/or methylated nucleotide bases. the method of.
[Invention 1034]
one or more nucleotide base mutations, insertions, deletions, translocations, splice variants, miRNA variants, alternative transcripts, alternative start sites, alternative coding sequences, alternative non-coding sequences, alternative splicing, exon insertions, exon deletions, said low abundance nucleic acid molecule having intronic insertions, or other rearrangements at the genomic level, and/or methylated nucleotide bases has nucleotide sequence similarity to said low abundance nucleic acid molecule but one or more nucleotide base mutations, insertions, deletions, translocations, splice variants, miRNA variants, alternative transcripts, alternative start sites, alternative coding sequences, alternative non-coding sequences, alternative splicing, exon insertions, exon deletions, intron insertions, or The method of the invention 1033 which is identified and distinguished from other rearrangements at the genomic level and/or high abundance nucleic acid molecules in said sample that do not have methylated nucleotide bases.
[Invention 1035]
1034. The method of invention 1034, wherein the copy number of one or more low abundance target nucleotide sequences is quantified relative to the copy number of a high abundance nucleic acid molecule in said sample.
[Invention 1036]
The method of any of inventions 1001-1031, wherein said one or more target nucleotide sequences are quantified or enumerated.
[Invention 1037]
The method of invention 1036, wherein said one or more target nucleotide sequences are quantified or enumerated relative to other nucleotide sequences in said sample or other samples subjected to the same subsequent steps.
[Invention 1038]
The method of invention 1037, wherein the relative copy number of one or more target nucleotide sequences is quantified or enumerated.
[Invention 1039]
The method of any of inventions 1001-1031, further comprising diagnosing or predicting a disease state based on said identification.
[Invention 1040]
1031. The method of any of the inventions 1001-1031, further comprising identifying a genotype or disease predisposition based on said identification.
[Invention 1041]
Diagnosing or diagnosing a disease state in a cell or tissue based on identifying the presence or level of multiple disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers in a biological sample of an individual A method of predicting,
said plurality of markers is 6-12 markers, 12-24 markers, 24-36 markers, 36-48 markers, 48-72 markers, 72-96 markers, or 96 in a set containing more than one marker, where each marker in a given set meets the following criteria:
present in greater than 50% of a biological sample of diseased cells or tissue from an individual diagnosed with said disease state, or above the cut-off level;
Absent or below the cut-off level in greater than 95% of normal cell or tissue biosamples from individuals without said disease state;
present in greater than 50% of biological samples comprising cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with said disease state or above the cut-off level,
is present in greater than 95% of biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals without said disease state , or below the cut-off level,
greater than 1.65 in said biological sample comprising cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from an individual diagnosed with said disease state be present with a z-value of
selected by having any one or more of
in said biological sample comprising cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from at least 50% of individuals diagnosed with said disease state; a set wherein at least 50% of said markers in the set each contain one or more methylated residues and/or are present or above a cutoff level or present with a z-score greater than 1.65 at least 50% of said markers of contain one or more methylated residues;
said method comprising:
obtaining a biological sample comprising cell-free DNA, RNA, and/or protein from said cells or tissue and one or more other tissues or cells, said biological sample comprising cells, serum, blood, obtaining said biological sample selected from the group consisting of plasma, amniotic fluid, sputum, urine, bodily fluids, bodily secretions, and bodily excretions, or fractions thereof;
Fractionating the sample into one or more fractions, wherein at least one fraction contains exosomes, tumor-associated vesicles, other protected states, or cell-free DNA, RNA, and/or fractionating into said fractions comprising proteins;
subjecting the nucleic acid molecules in said one or more fractions to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
50% or more of disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers during said fractionation and/or by performing a nucleic acid amplification step at least twice performing a concentration step of
performing one or more assays to detect and identify the plurality of disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers, thereby wherein at least 2 or 3 markers are present or above the cutoff level in a marker set comprising 6-12 markers, or 12-24 if at least 3, 4, or 5 markers are present or above the cutoff level in the marker set containing the markers, or at least 3, 4, 5, or 6 in the marker set containing 24-36 markers markers are present or above the cutoff level, or at least 4, 5, 6, 7, or 8 markers in a marker set containing 36-48 markers are present or above the cutoff level above the level, or if there are at least 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 markers in a marker set comprising 48-72 markers, or above the cutoff level, or 72 if at least 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 13 markers are present in a marker set containing ~96 markers or above the cutoff level; There are at least 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 'n'/12 markers in a marker set containing markers (where 'n'> 168), or the cutoff level is If so, performing said assay, wherein said individual is diagnosed or predicted to have said disease state;
The above method, comprising
[Invention 1042]
colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophagus, based on identifying the presence or level of multiple disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers in a biological sample of an individual cancer, lobular and ductal carcinoma of the breast, endometrial endometrial cancer, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, 1. A method of diagnosing or predicting the disease state of a solid tissue cancer comprising head and neck squamous cell carcinoma, prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma, comprising:
The plurality of markers is in a set comprising 48-72 total cancer markers, 72-96 total cancer markers, or 96 or more total cancer markers, with an average of 4 such markers in a given set. More than one-third cover each of the aforementioned major cancers tested, and each marker in a given set for a given solid tissue cancer has the following criteria for that solid tissue cancer:
present in or above the cut-off level in greater than 50% of a given cancer tissue biosample from an individual diagnosed with a given solid tissue cancer;
Absent or below the cut-off level in greater than 95% of normal tissue biosamples from individuals who do not have the given solid tissue cancer;
Greater than 50% of biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present at or above the cut-off level,
Greater than 95% of a biological sample containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals who do not have the given solid tissue cancer not present at or below the cut-off level,
1.65 in biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present with z-values greater than
selected by having any one or more of
Said biological sample comprising cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from at least 50% of individuals diagnosed with a given solid tissue. at least 50% of said markers in the set each contain one or more methylated residues and/or are present or above cutoff levels or present with a z-score greater than 1.65 , at least 50% of said markers in the set comprise one or more methylated residues;
the method comprising:
obtaining a biological sample comprising cell-free DNA, RNA, and/or protein from said cells or tissue and one or more other tissues or cells, said biological sample comprising cells, serum, blood, obtaining said biological sample selected from the group consisting of plasma, amniotic fluid, sputum, urine, bodily fluids, bodily secretions, and bodily excretions, or fractions thereof;
Fractionating the sample into one or more fractions, wherein at least one fraction contains exosomes, tumor-associated vesicles, other protected states, or cell-free DNA, RNA, and/or fractionating into said fractions comprising proteins;
subjecting the nucleic acid molecules in the one or more fractions to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
performing a nucleic acid amplification step during said fractionation and/or for 50% or more of said given solid tissue cancer-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA and/or protein markers thereby performing at least two concentration steps;
performing one or more assays to detect and identify the plurality of cancer-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers, thereby wherein at least 4 markers are present or above the cutoff level in a marker set comprising 48-72 total cancer markers, or 72-96 If at least 5 markers are present in the marker set containing total cancer markers or above the cutoff level, or 96 to 'n' total cancer markers, where 'n'> 96 total cancer markers said one or more assays, wherein an individual is diagnosed or predicted to have said solid tissue cancer if at least 6 or "n"/18 markers are present or above a cutoff level in the marker set comprising and
The above method, comprising
[Invention 1043]
Each marker in a given set for a given solid tissue cancer meets the following criteria for that solid tissue cancer:
present in or above the cut-off level in greater than 66% of a given cancer tissue biosample from an individual diagnosed with a given solid tissue cancer;
Absent or below the cut-off level in greater than 95% of normal tissue biosamples from individuals who do not have the given solid tissue cancer;
Greater than 66% of biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present at or above the cut-off level,
Greater than 95% of a biological sample containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals who do not have the given solid tissue cancer not present at or below the cut-off level,
1.65 in biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present with z-values greater than
The method of the present invention 1042 selected by having any one or more of
[Invention 1044]
Based on identifying the presence or level of multiple disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers in an individual's biological sample, the following groups of solid tissue cancers: Group 1 (colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal carcinoma), Group 2 (lobular and ductal carcinoma of the breast, uterine endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and uterus cervical adenocarcinoma, uterine carcinosarcoma), group 3 (lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma), group 4 (prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma), and/or A method of diagnosing or prognosticating and identifying the most probable specific tissue(s) of primary tissue(s) disease state of Group 5 (hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma), comprising:
the plurality of markers is in a set comprising 36-48 group-specific cancer markers, 48-64 group-specific cancer markers, or 64 or more group-specific cancer markers, and the given set of On average more than one-third of such markers cover each of the aforementioned cancers tested within that group, and each marker in a given set for a given solid tissue cancer of the following criteria:
present in or above the cut-off level in greater than 50% of a given cancer tissue biosample from an individual diagnosed with a given solid tissue cancer;
Absent or below the cut-off level in greater than 95% of normal tissue biosamples from individuals who do not have the given solid tissue cancer;
Greater than 50% of biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present at or above the cut-off level,
Greater than 95% of a biological sample containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals who do not have the given solid tissue cancer not present at or below the cut-off level,
1.65 in biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present with z-values greater than
selected by having any one or more of
said organism comprising cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from at least 50% of individuals diagnosed with a given solid tissue cancer in the sample at least 50% of said markers in the set each contain one or more methylated residues and/or are present or above a cutoff level or present with a z-score greater than 1.65 at least 50% of said markers in the set comprise one or more methylated residues;
said method comprising:
obtaining said biological sample comprising cell-free DNA, RNA, and/or protein from said cells or tissue and one or more other tissues or cells, said biological sample comprising cells, serum, blood , plasma, amniotic fluid, sputum, urine, bodily fluids, bodily secretions, and bodily excretions, or fractions thereof;
Fractionating the sample into one or more fractions, wherein at least one fraction contains exosomes, tumor-associated vesicles, other protected states, or cell-free DNA, RNA, and/or fractionating into said fractions comprising proteins;
subjecting the nucleic acid molecules in the one or more fractions to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
performing a nucleic acid amplification step during said fractionation and/or for 50% or more of said given solid tissue cancer-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA and/or protein markers thereby performing at least two concentration steps;
performing one or more assays to detect and identify the plurality of cancer-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers, thereby and if at least 4 markers are present or above the cutoff level in a marker set comprising 36-48 group-specific cancer markers, or 48-64 group-specific cancer markers If at least 5 markers are present in the marker set containing the specific cancer markers or are above the cutoff level, or 64 to 'n' total cancer markers (where 'n'>64 group The individual is diagnosed or predicted to have solid tissue cancer if 6 or "n"/12 markers are present or above the cutoff level in the marker set comprising said one or more specific cancer markers). performing the assay and
The above method, comprising
[Invention 1045]
Each marker in a given set for a given solid tissue cancer meets the following criteria for that solid tissue cancer:
present in or above the cut-off level in greater than 66% of a given cancer tissue biosample from an individual diagnosed with a given solid tissue cancer;
Absent or below the cut-off level in greater than 95% of normal tissue biosamples from individuals who do not have the given solid tissue cancer;
Greater than 66% of biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present at or above the cut-off level,
Greater than 95% of a biological sample containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals who do not have the given solid tissue cancer not present at or below the cut-off level,
1.65 in biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present with z-values greater than
The method of the present invention 1044 selected by having any one or more of
[Invention 1046]
The method of any of Inventions 1041-1045, wherein said at least two enrichment steps comprise two or more of the following steps:
trapping or separating exosomes or extracellular vesicles or other markers of the protected state; trapping or separating platelet fractions; trapping or separating circulating tumor cells; capturing or separating cfDNA nucleosomes or differentially modified cfDNA-histone complexes; capturing or separating protein targets or protein target complexes; capturing or separating autoantibodies; capturing or isolating methylated cfDNA; complementing marker-specific DNA, cDNA, miRNA, lncRNA, ncRNA, or mRNA, or amplified complements in solution, on magnetic beads, or on microarrays; DNA polymerase, reverse transcriptase, DNA ligase, RNA ligase, DNA repair enzyme, RNase, RNaseH2, endonuclease, restriction endonuclease, exonuclease, CRISPR, DNA via polymerase extension reaction, polymerase chain reaction, bisulfite-methyl-specific polymerase chain reaction, reverse transcription reaction, bisulfite-methyl-specific ligation reaction, and/or ligation reaction using glycosylases, or combinations thereof linearly or exponentially amplifying , miRNA markers, noncoding RNA markers (lncRNA markers and ncRNA markers), mRNA markers, exon markers, splice variant markers, translocation markers, or copy number variation markers, mutation markers or One or more target regions containing bisulfite-converting DNA methylation markers are treated with DNA polymerase, reverse transcriptase, DNA ligase, RNA ligase, DNA repair enzyme, RNase, RNaseH2, endonuclease, restriction endonuclease, exonuclease, CRISPR, via polymerase extension reaction, polymerase chain reaction, bisulfite-methyl-specific polymerase chain reaction, reverse transcription reaction, bisulfite-methyl-specific ligation reaction, and/or ligation reaction using DNA glycosylases, or combinations thereof either the wild-type sequence or the bisulfite-converted non-methyl selective amplification, either linearly or exponentially, while inhibiting amplification of target regions containing lysed sequences or their complementary sequences, the 3′-OH ends of which are liberated in an enzyme- and sequence-dependent process1 Preferentially extending, ligating, or amplifying one or more primers or probes, the target-specific primers or probes hybridizing in a base-specific manner to the wild-type sequence or the bisulfite-converted unmethylated sequence or its complementary sequence. containing one or more mismatched bases at the 3' end or containing one or more nucleotide analogues and blocking groups at the 3' end under conditions that prevent polymerase extension or ligation during the reaction that is lysed Use more than one blocking oligonucleotide primer.
[Invention 1047]
The present invention 1041, wherein said one or more assays for detecting and distinguishing said plurality of disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, or protein markers comprises one or more of to 1046 any method:
Quantitative real-time PCR (qPCR), reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RTPCR), bisulfite qPCR, digital PCR (dPCR), bisulfite dPCR, ligation detection, ligase chain reaction, restriction endonuclease cleavage method, DNA or RNA nuclease cleavage method, microarray hybridization method, peptide array binding method, antibody array method, mass spectrometry method, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method, capillary or gel electrophoresis method, Chemiluminescence, fluorescence, DNA sequencing, bisulfite conversion-DNA sequencing, RNA sequencing, proximity ligation, proximity PCR, methods involving immobilization of antibody-target complexes, aptamer-target complexes methods involving immobilization of bodies; methods involving immunoassays; methods involving Western blot assays; methods involving enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA); Methods involving throughput flow cytometry-based enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA).
[Invention 1048]
the one or more cutoff levels of the one or more assays for detecting and distinguishing the plurality of disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, or protein markers is The method of any of inventions 1041-1047, wherein said one or more marker assays comparing samples from normal individuals comprises one or more of the following calculations, comparisons, or determinations:
A ΔCt value for the marker greater than 2, a ΔCt value for the marker greater than 4, a ratio of marker-specific signals detected greater than 1.5, a ratio of marker-specific signals detected greater than 3; ratio of marker concentrations greater than 1.5; ratio of marker concentrations greater than 3; >50% difference in signal, >85%, >90%, >95%, >96%, 97 %, or greater than 98%, or the marker-specific signal from a given disease sample is greater than 1.03, greater than 1.28 compared to the same marker-specific signal from a set of normal samples , greater than 1.65, greater than 1.75, greater than 1.88, or greater than 2.05.
[Invention 1049]
Diagnosing or diagnosing a disease state in a cell or tissue based on identifying the presence or level of multiple disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers in a biological sample of an individual A two-step method of predicting, comprising:
The two-step method includes:
obtaining a biological sample, wherein the biological sample contains exosomes, tumor-associated vesicles, other protected cells derived from potentially diseased cells or tissues and one or more other tissues or cells; said biological sample comprises cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, bodily fluids, bodily fluids, bodily secretions, and bodily excretions. or a fraction thereof;
To identify individuals who are more likely to be diagnosed or predicted with said disease state, a first step may be performed with an overall sensitivity greater than 80%, an overall specificity greater than 90%, or an overall applying to said biological sample with a Z-score greater than 1.28;
For diagnosing or predicting an individual with said disease state, a second step is performed using the applying to a biological sample derived from an individual;
including
The method above, wherein applying the first step and/or applying the second step is performed using the method of any of the inventions 1041-1044.
[Invention 1050]
said disease state is colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal carcinoma, breast lobular carcinoma and ductal carcinoma, uterine endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma in solid tissue cancers, including uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma and wherein at least 50% of said markers in the set are each one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence, or one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the list in FIG. The method of any of Inventions 1041-1049, comprising the complement.
[Invention 1051]
said disease state is colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal carcinoma, breast lobular carcinoma and ductal carcinoma, uterine endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma in solid tissue cancers, including uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma any of inventions 1041-1049, wherein at least 50% of said markers in the set each comprise one or more methylated residues of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. Method.
[Invention 1052]
said disease state is colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal carcinoma, breast lobular carcinoma and ductal carcinoma, uterine endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma in solid tissue cancers, including uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma Yes, wherein said one or more markers of the set are the following (mir ID, gene ID): hsa-mir-21, MIR21, hsa-mir-182, MIR182, hsa-mir-454, MIR454, hsa-mir-96 , MIR96, hsa-mir-183, MIR183, hsa-mir-549, MIR549, hsa-mir-301 a , MIR301A, hsa-mir-548f-1, MIR548F1, hsa-mir-301b, MIR301B, hsa-mir-103-1, MIR1031, hsa-mir-18 a , MIR18A, hsa-mir-147b, MIR147B, hsa-mir-4326, MIR4326, andhsa-mir-573, MIR573, or one or more lncRNA or ncRNA sequences selected from the list in FIG. 1049. The method of any of the inventions 1041-1049, comprising one or more miRNA sequences that
[Invention 1053]
said disease state is colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal carcinoma, breast lobular carcinoma and ductal carcinoma, uterine endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma in solid tissue cancers, including uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma A. The method of any of inventions 1041-1049, wherein said one or more markers of the set comprise one or more exonic RNA sequences selected from the list in FIG.
[Invention 1054]
said disease state is colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal carcinoma, breast lobular carcinoma and ductal carcinoma, uterine endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma in solid tissue cancers, including uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma A, wherein said one or more markers of the set are selected from the list of FIG. 55 or from the group consisting of: The method of any of the invention 1041-1049, comprising an antibody: (protein name, UniProt ID) uncharacterized protein C19orf48, Q6RUI8, protein FAM72B, Q86X60, protein FAM72D, Q6L9T8, hydroxyacylglutathione hydrolase-like protein, Q6PII5 , putative methyltransferase NSUN5, Q96P11, RNA pseudouridylate synthase domain-containing protein 1, Q9UJJ7, collagen triple helix repeat-containing protein 1, Q96CG8, interleukin-11, P20809, stromelysin-2, P09238, matrix metalloproteinase-9, P14780, Podocane-like protein 1, Q6PEZ8, Putative peptide YY-2, Q9NRI6, Osteopontin, P10451, Sulfhydryl oxidase 2, Q6ZRP7, Glypican-2, Q8N158, Macrophage migration inhibitor, P14174, Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A, P62937 , and Calreticulin, P27797.
[Invention 1055]
said disease state is colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal carcinoma, breast lobular carcinoma and ductal carcinoma, uterine endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma in solid tissue cancers, including uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma and wherein said one or more markers of the set are selected from the group consisting of TP53 (tumor protein p53), TTN (titin), MUC16 (mucin 16), and KRAS (Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog). 1049. The method of any of the inventions 1041-1049, comprising one or more mutations, insertions, deletions, copy number changes, or expression changes of the gene.
[Invention 1056]
said disease state is colon adenocarcinoma, rectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, or esophageal cancer, and at least 50% of said markers in the set each have one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence, or or the method of any of inventions 1041-1049, comprising the complement of one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the list in FIG.
[Invention 1057]
one or more, wherein said disease state is colon adenocarcinoma, rectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, or esophageal cancer, and at least 50% of said markers in the set are selected from the list in FIG. 45 or FIG. 60, respectively; The method of any of inventions 1041-1049, comprising one or more methylated residues of a chromosomal subregion.
[Invention 1058]
said disease state is colon adenocarcinoma, rectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, or esophageal cancer, and said one or more markers in the set are one or more miRNA sequences selected from the list in FIG. 39, hsa-mir -624, MIR624, or one or more lncRNA or ncRNA sequences selected from the list of Figure 40 or the group consisting of: [Gene ID, coordinates (GRCh38)]. ENSEMBL ID: LINC01558, chr6: 167784537-167796859 and ENSG00000146521.8.
[Invention 1059]
said disease state is colon adenocarcinoma, rectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, or esophageal cancer, and said one or more markers in the set are one or more exonic RNA sequences selected from the list in FIG. The method of any of Inventions 1041-1049, comprising
[Invention 1060]
said disease state is colon adenocarcinoma, rectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, or esophageal cancer, and said one or more markers of the set are selected from the list of Figure 42, Figure 43, or the group consisting of: The method of any of the inventions 1041-1049 comprising one or more mRNA sequences, protein expression levels, protein product concentrations, cytokines, or autoantibodies against protein products: (gene symbol, chromosome band, gene title, UniProt ID) SELE, 1q22-q25, selectin E, P16581, OTUD4, 4q31.21, OTU domain containing 4, Q01804, BPI, 20q11.23, bactericidal/permeability enhancing protein, P17213, ASB4, 7q21-q22, ankyrin repeats and SOCS Box containing 4, Q9Y574, C6orf123, 6q27, Chromosome 6 open reading frame 123, Q9Y6Z2, KPNA3, 13q14.3, Karyopherin α3 (importin α4), O00505, and NUP98, 11p15, Nucleoporin 98kDa, P52948, or (protein name , UniProt ID) bactericidal permeability enhancing protein (BPI) (CAP57), P17213.
[Invention 1061]
The disease state is colon adenocarcinoma, rectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, or esophageal cancer, and the one or more markers of the set are APC (APC, regulator of WNT signaling pathway), ATM (ATM serine/ threonine kinase), CSMD1 (CUB and Sushi multiple domains 1), DNAH11 (dynein axone heavy chain 11), DST (dystonin), EP400 (E1A binding protein p400), FAT3 (FAT atypical cadherin 3), FAT4 (FAT non- typical cadherin 4), FLG (filaggrin), GLI3 (GLI family zinc finger 3), KRAS (Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog), LRP1B (LDL receptor-associated protein 1B), MUC16 (mucin 16, cell surface binding), OBSCN (obscurin, cytoskeletal calmodulin and titin interacting RhoGEF), PCLO (piccolo, presynaptic cytomatrix protein), PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha), RYR2 (ryanodine receptor 2), SYNE1 (spectrin repeat-containing nuclear membrane protein 1), TP53 (tumor protein 53), TTN (titin), and UNC13C (unc-13 homolog C) in a gene selected from the group consisting of The method of any of inventions 1041-1049 comprising one or more mutations, insertions, deletions, copy number changes, or expression changes.
[Invention 1062]
said disease state is breast lobular and ductal carcinoma, endometrial endometrial cancer, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, or uterine carcinosarcoma of the set at least 50% of the markers each comprise one or more methylated cytosine residues of the CpG sequence or the complement of one or more methylated cytosine residues of the CpG sequence selected from the list of FIG. The method of any of Inventions 1041-1049.
[Invention 1063]
said disease state is breast lobular and ductal carcinoma, endometrial endometrial cancer, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, or uterine carcinosarcoma of the set The method of any of inventions 1041-1049, wherein at least 50% of the markers each comprise one or more methylated residues of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG.
[Invention 1064]
said disease state is breast lobular and ductal carcinoma, endometrial endometrial cancer, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, or uterine carcinosarcoma of the set The method of any of invention 1041-1049, wherein the one or more markers comprise one or more miRNA sequences selected from the group consisting of (mir ID, gene ID): hsa-mir-1265, MIR1265.
[Invention 1065]
said disease state is breast lobular and ductal carcinoma, endometrial endometrial cancer, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, or uterine carcinosarcoma of the set One or more markers selected from the group consisting of (exon location, gene): chr2: 179209013-179209087: +, OSBPL6, chr2: 179251788-179251866: +, OSBPL6, and chr2: 179253736-179253880: +, OSBPL6 1049. The method of any of the inventions 1041-1049, comprising one or more exonic RNA sequences that are
[Invention 1066]
said disease state is breast lobular and ductal carcinoma, endometrial endometrial cancer, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, or uterine carcinosarcoma of the set Any of the inventions 1041-1049, wherein the one or more markers comprise one or more mRNA sequences, protein expression levels, protein product concentrations, cytokines, or autoantibodies to protein products selected from the group consisting of Method of: (gene symbol, chromosome band, gene title, UniProt ID) RSPO2, 8q23.1, R-spondin 2, Q6UXX9, KLC4, 6p21.1, kinesin light chain 4, Q9NSK0, and GLRX, 5q14, glutaredoxin (thiol transferase), P35754, or (protein name, UniProt ID) R-spondin-2 (operculum-specific spondin-2) (hRspo2), Q6UXX9.
[Invention 1067]
said disease state is breast lobular and ductal carcinoma, endometrial endometrial cancer, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, or uterine carcinosarcoma of the set one or more mutations, insertions, in a gene in which one or more markers are selected from the group consisting of PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha) and TTN (titin); The method of any of Inventions 1041-1049 comprising deletions, copy number alterations, or expression alterations.
[Invention 1068]
said disease state is lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, or head and neck squamous cell carcinoma, and at least 50% of said markers in the set each have one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence; The method of any of inventions 1041-1049 comprising the complement of one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the 63 list.
[Invention 1069]
said disease state is lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, or head and neck squamous cell carcinoma, and at least 50% of said markers in the set are each one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. The method of any of Inventions 1041-1049, comprising one or more methylated residues of
[Invention 1070]
said disease state is lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, or head and neck squamous cell carcinoma, and said one or more markers of the set are selected from (mir ID, gene ID) hsa-mir-28, MIR28 1049. The method of any of the inventions 1041-1049, comprising one or more miRNA sequences that
[Invention 1071]
said disease state is lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, or head and neck squamous cell carcinoma, and said one or more markers in a set comprises the following (exon location, gene): chr2: chr1: 93307721-93309752:- ，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３１２７４０－９３３１２９１６：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３１６４０５－９３３１６５１２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３４１８５３－９３３４２１５２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３４２６９３３－９３４２７０７９：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ７：４０２２１５５４－４０２２１６２７：＋ ，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ７：４０２３４５３９－４０２３４６５９：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ８：２２２６５８２３－２２２６６００９：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ８：２２２７２２９３－２２２７２４１５：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ１４：３９５０９９３６－３９５１００９１：－，ＳＥＣ２３Ａ、及びｃｈｒ１４：３９５１１９９０－３９５１２０７６： -, SEC23A.
[Invention 1072]
one or more mRNA sequences, proteins, wherein the disease state is lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, or head and neck squamous cell carcinoma, and the one or more markers in the set are selected from the group consisting of The method of any of the inventions 1041-1049 comprising expression levels, protein product levels, cytokines, or autoantibodies against protein products: (Gene Symbol, Chromosome Band, Gene Title, UniProt ID) STRN3, 14q13-q21, Striatin, calmodulin-binding protein 3, Q13033, LRRC17, 7q22.1, leucine-rich repeat-containing 17, Q8N6Y2, FAM69A, 1p22, family 69 with sequence similarity, member A, Q5T7M9, ATF2, 2q32, activating transcription factor 2, P15336, BHMT, 5q14.1, betaine-homocysteine S-methyltransferase, Q93088, ODZ3/TENM3, 4q34.3-q35.1, tenurin transmembrane protein 3, Q9P273, and ZFHX4, 8q21.11, zinc finger homeobox 4, Q86UP3, or (protein name, UniProt ID) leucine-rich repeat-containing protein 17 (p37NB), Q8N6Y2.
[Invention 1073]
The disease state is lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, or head and neck squamous cell carcinoma, and the one or more markers of the set are CSMD3 (CUB and Sushi multiple domain 3), DNAH5 (dynein axone heavy chain 5), FAT1 (FAT atypical cadherin 1), FLG (filagrin), KRAS (Ki-ras2, Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog), LRP1B (LDL receptor-related protein 1B), MUC16 (mucin 16, cell surface binding ), PCLO (piccolo presynaptic cytosolic protein), PKHD1L1 (PKHD1-like 1), RELN (reelin), RYR2 (ryanodine receptor 2), SI (sucrase-isomaltase), SYNE1 (spectrin repeat-containing nuclear membrane protein 1 ), TP53 (tumor protein p53), TTN (titin), USH2A (asshalin), and XIRP2 (xin actin binding repeat containing 2) one or more mutations, insertions, deletions in a gene selected from the group consisting of The method of any of Inventions 1041-1049 comprising deletions, copy number alterations, or expression alterations.
[Invention 1074]
The disease state is prostate adenocarcinoma or invasive bladder urothelial carcinoma and at least 50% of the markers in the set each have one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence or from the list in FIG. The method of any of inventions 1041-1049 comprising the complement of one or more methylated cytosine residues of the selected CpG sequence.
[Invention 1075]
said disease state is prostate adenocarcinoma or invasive bladder urothelial carcinoma and at least 50% of said markers in the set are each one or more of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. The method of any of Inventions 1041-1049, comprising a methylated residue of
[Invention 1076]
said disease state is prostate adenocarcinoma or invasive bladder urothelial carcinoma and said one or more markers of the set are the following (mir ID, gene ID): hsa-mir-491, MIR491 and hsa-mir- 1468, MIR1468, or the following [Gene ID, Coordinates (GRCh38), ENSEMBL ID]: AC007383.3, chr2:206084605-206086564, ENSG00000227946.1, and LINC00324, chr17 :8220642-8224043, ENSG00000178977.3, comprising one or more lncRNA or ncRNA sequences selected from the group consisting of: 1041-1049.
[Invention 1077]
said disease state is prostate adenocarcinoma or invasive bladder urothelial carcinoma and said one or more markers of the set are one selected from (exon location, gene) chr21:45555942-45556055:+, C21orf33 The method of any of inventions 1041-1049 comprising the above exonic RNA sequences.
[Invention 1078]
The disease state is prostate adenocarcinoma or invasive bladder urothelial carcinoma, and the one or more markers of the set are (gene symbol, chromosome band, gene title, UniProt ID) PMM1, 22q13, phosphomannnomutase The method of any of the inventions 1041-1049, comprising one or more mRNA sequences, protein expression levels, protein product concentrations, cytokines, or autoantibodies to protein products selected from 1, Q92871.
[Invention 1079]
The disease state is prostate adenocarcinoma or invasive bladder urothelial carcinoma and the one or more markers of the set are BAGE2 (BAGE family member 2), DNM1P47 (dynamin 1 pseudogene 47), FRG1BP (regional gene 1 family member B, pseudogene), KRAS (Ki-ras2, Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog), RP11-156P1.3, TTN (titin), and TUBB8P7 (tubulin β8 class VIII pseudogene 7) 1049. The method of any of the inventions 1041-1049, comprising one or more mutations, insertions, deletions, copy number changes, or expression changes of genes selected from.
[Invention 1080]
The disease state is hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma, and at least 50% of the markers in the set each have one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence, or the list of FIG. The method of any of inventions 1041-1049, comprising the complement of one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from.
[Invention 1081]
said disease state is hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma, and at least 50% of said markers in the set are each one of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. The method of any of Inventions 1041-1049, comprising the above methylated residues.
[Invention 1082]
said disease state is hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma, and said one or more markers of the set are one selected from (mir ID, gene ID) hsa-mir-132, MIR132 The method of any of the inventions 1041-1049, comprising the above miRNA sequences, or one or more lncRNA or ncRNA sequences selected from the list in FIG.
[Invention 1083]
The present invention, wherein said disease state is hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma, and said one or more markers of the set comprise one or more exonic RNA sequences selected from the list in FIG. The method of any one of 1041-1049.
[Invention 1084]
The disease state is hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma, and the one or more markers of the set are selected from the list in FIG. 69 or the following (protein name, UniProt ID): gelsolin (AGEL) (actin depolymerizing factor) (ADF) (Brevin), P06396, proneuregulin-2, O14511, CD59 glycoprotein (1F5 antigen) (20 kDa homologous restriction factor) (HRF-20) (HRF20) (MAC- inhibitory protein) (MAC-IP) (MEM43 antigen) (membrane attack complex inhibitor) (MACIF) (membrane inhibitor of reactive lysis) (MIRL) (protectin) (CD antigen CD59), P13987, and branched protein kinases 1041 of the invention comprising an autoantibody to one or more mRNA sequences, protein expression levels, protein product levels, cytokines, or protein products selected from the group consisting of: 2B (deficient in autism-associated protein 1), Q9H7Y0 1049.
[Invention 1085]
the disease state is hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma, and the one or more markers of the set are KRAS (Ki-ras2, Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), MUC16 (mucin 16, one or more mutations, insertions, deletions, copy number in a gene selected from the group consisting of cell surface binding), MUC4 (mucin 4, cell surface binding), TP53 (tumor protein p53), and TTN (titin) The method of any of inventions 1041-1049, comprising alteration, or altered expression.

Claims (25)

(a) 個体の生体試料中の複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づいて、細胞または組織の疾患状態を予測する方法であって、
前記複数のマーカーが、６～１２個のマーカー、１２～２４個のマーカー、２４～３６個のマーカー、３６～４８個のマーカー、４８～７２個のマーカー、７２～９６個のマーカー、または９６個超のマーカーを含むセット中にある、前記方法; または
(b) 個体の生体試料中の複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づいて、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌の疾患状態を予測する方法であって、
前記複数のマーカーが、４８～７２個の総癌マーカー、７２～９６個の総癌マーカー、または９６個以上の総癌マーカーを含むセット中にあり、所与のセットのかかるマーカーの平均で４分の１超が、試験される前述の主要ながんの各々をカバーする、前記方法; または
(c) 個体の生体試料中の複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づいて、以下の群の固形組織癌：（第１群（結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌）、第２群（乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫）、第３群（肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌）、第４群（前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌）、及び／または第５群（肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌）、の最も可能性の高い特定の原発組織（複数可）の疾患状態を予測し、及び特定する方法であって、
前記複数のマーカーが、３６～４８個の群特異的癌マーカー、４８～６４個の群特異的癌マーカー、または６４個以上の群特異的癌マーカーを含むセット中にあり、所与のセットのかかるマーカーの平均で３分の１超が、そのグループ内で試験される前述の癌の各々をカバーする、前記方法、
ここで、(a)について、所与のセットの各マーカーが、以下の基準、あるいは(b)または(c)について、所与の固形組織癌用の所与のセットの各マーカーが、その固形組織癌用の以下の基準：
前記疾患状態あるいは所与の固形組織癌と診断された個体由来の疾患細胞または組織あるいは所与のがん組織の生体試料の５０％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
前記疾患状態あるいはその所与の固形組織癌を有しない個体由来の正常細胞または組織の生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
前記疾患状態あるいは所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の５０％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
前記疾患状態あるいはその所与の固形組織癌を有しない個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
前記疾患状態あるいは所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む前記生体試料中に１．６５超のｚ値で存在すること
のうちのいずれか１つ以上を有することによって選択され、
前記疾患状態あるいは所与の固形組織癌と診断された個体の少なくとも５０％からの細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む前記生体試料において、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、１つ以上のメチル化残基を含み、及び／あるいは、存在する、もしくはカットオフレベルを上回る、または１．６５超のｚ値で存在する、セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、１つ以上のメチル化残基を含み、
前記方法は、
前記細胞もしくは組織、及び１つ以上の他の組織もしくは細胞に由来する無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびに／またはタンパク質を含む生体試料を得る段階であって、前記生体試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、及び体排泄物、またはそれらの画分からなる群から選択される、前記生体試料を得る段階と、
前記試料を、１つ以上の画分に分画する段階であって、少なくとも１つの画分が、エキソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態、または無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／もしくはタンパク質を含む、前記画分に分画する段階と、
前記１つ以上の画分中の核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
５０％以上の疾患特異的あるいは前記所与の固形組織癌特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーに対して、前記分画中に、及び／または核酸増幅ステップを実施することによって、少なくとも２回の濃縮ステップを実施する段階と、
前記複数の疾患特異的あるいは癌特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーを検出及び識別するために、１つ以上のアッセイを行う段階であって、それによって、前記試料中のそれらの存在またはレベルを特定し、ここで、
(a)について、６～１２個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも２または３個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは１２～２４個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも３、４、または５個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは２４～３６個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも３、４、５、または６個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは３６～４８個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも４、５、６、７、または８個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは４８～７２個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも６、７、８、９、１０、１１、または１２個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは７２～９６個のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、あるいは９６個～「ｎ」個のマーカー（ここで、「ｎ」＞１６８）のマーカーを含むマーカーセットに少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、または「ｎ」／１２個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、個体が細胞または組織の前記疾患状態と予測されるか、または、
(b)について、４８～７２個の総癌マーカーを含むマーカーセットに少なくとも４個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、または７２～９６個の総癌マーカーを含むマーカーセットに少なくとも５個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、または９６個～「ｎ」個の総癌マーカー（ここで、「ｎ」＞９６の総癌マーカー）を含むマーカーセットに少なくとも６または「ｎ」／１８個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、個体が前記固形組織癌と予測されるか、または
(c)について、３６～４８個の群特異的癌マーカーを含むマーカーセットに少なくとも４個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、または４８～６４個の群特異的癌マーカーを含むマーカーセットに少なくとも５個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、または６４個～「ｎ」個の総癌マーカー（ここで、「ｎ」＞６４の群特異的癌マーカー）を含むマーカーセットに６または「ｎ」／１２個のマーカーが存在するか、もしくはカットオフレベルを上回る場合、固形組織癌の最も可能性の高い特定の原発組織（複数可）の疾患状態を予測し、及び特定する方法において、個体が固形組織癌と予測される、
前記アッセイを行う段階とを含む。 (a) a cell or tissue disease state based on identifying the presence or level of multiple disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers in a biological sample of an individual; A method of predicting
said plurality of markers is 6-12 markers, 12-24 markers, 24-36 markers, 36-48 markers, 48-72 markers, 72-96 markers, or 96 in a set comprising more than one marker ; or
(b) colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, based on identifying the presence or level of multiple disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers in an individual's biological sample; Cancer, esophageal cancer, lobular and ductal carcinoma of the breast, endometrial carcinoma of the uterus, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous 1. A method of predicting the disease status of a solid tissue cancer comprising epithelial carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, prostatic adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma, comprising:
The plurality of markers is in a set comprising 48-72 total cancer markers, 72-96 total cancer markers, or 96 or more total cancer markers, with an average of 4 such markers in a given set. said method, wherein more than one-third covers each of said major cancers tested; or
(c) Based on identifying the presence or level of multiple disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers in the individual's biological sample, the following groups of solid tissues: Cancer: (group 1 (colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal carcinoma), group 2 (breast lobular and ductal carcinoma, endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cancer and cervical adenocarcinoma, uterine carcinosarcoma), group 3 (lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma), group 4 (prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma), and/or Group 5 (hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma), a method of predicting and identifying the disease state of the most likely specific tissue(s) of origin, comprising:
the plurality of markers is in a set comprising 36-48 group-specific cancer markers, 48-64 group-specific cancer markers, or 64 or more group-specific cancer markers, and the given set of wherein on average more than one-third of such markers cover each of the aforementioned cancers tested within the group;
wherein for (a) each marker in a given set is determined by the following criteria , or for (b) or (c) each marker in a given set for a given solid tissue cancer is determined by the following criteria: The following criteria for tissue cancer :
present in greater than 50% of diseased cells or tissue from an individual diagnosed with said disease state or a given solid tissue cancer or a biological sample of a given cancerous tissue or above the cut-off level;
Absent or below the cut-off level in greater than 95% of biosamples of normal cells or tissues from individuals without said disease state or its given solid tissue cancer ;
A biological sample comprising cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from an individual diagnosed with said disease state or given solid tissue cancer. present in >50% of or above the cut-off level;
A biological sample comprising cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof, from an individual who does not have said disease state or a given solid tissue cancer thereof be absent or below the cut-off level in >95% of
Said organism comprising cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, bodily fluids, bodily secretions, bodily excretions, or fractions thereof from an individual diagnosed with said disease state or given solid tissue cancer present in the sample at a z value greater than 1.65;
Cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from at least 50% of individuals diagnosed with said disease state or given solid tissue cancer wherein at least 50% of the markers in the set each contain one or more methylated residues and/or are present or above a cutoff level or above 1.65 at least 50% of said markers in the set present at the z-value comprise one or more methylated residues;
The method includes :
obtaining a biological sample comprising cell-free DNA, RNA, and/or protein from said cells or tissue and one or more other tissues or cells, said biological sample comprising cells, serum, blood, obtaining said biological sample selected from the group consisting of plasma, amniotic fluid, sputum, urine, bodily fluids, bodily secretions, and bodily excretions, or fractions thereof;
Fractionating the sample into one or more fractions, wherein at least one fraction contains exosomes, tumor-associated vesicles, other protected states, or cell-free DNA, RNA, and/or fractionating into said fractions comprising proteins;
subjecting the nucleic acid molecules in said one or more fractions to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
50% or more of disease-specific or said given solid tissue cancer-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA and/or protein markers during said fractionation and/or nucleic acid amplification performing at least two enrichment steps by performing a step;
performing one or more assays to detect and identify the plurality of disease- specific or cancer-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers, thereby , identifying their presence or level in said sample, wherein
For (a), if at least 2 or 3 markers are present or above the cutoff level in a marker set containing 6-12 markers, or at least 3 markers in a marker set containing 12-24 markers , 4, or 5 markers are present or above the cutoff level, or at least 3, 4, 5, or 6 markers are present in a marker set comprising 24-36 markers; or above the cutoff level, or if at least 4, 5, 6, 7, or 8 markers are present in a marker set comprising 36-48 markers, or above the cutoff level, or 48- at least 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 markers in a marker set containing 72 markers or above the cutoff level, or markers containing 72-96 markers If there are at least 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 13 markers in the set or above the cutoff level, or 96 to 'n' markers, where 'n'>168) markers, or at least 8, 9, 10, 11, 12, 13, or 'n'/12 markers are present or above the cutoff level, the individual or is predicted to be the disease state of
For (b), if at least 4 markers are present or above the cutoff level in a marker set comprising 48-72 total cancer markers, or in a marker set comprising 72-96 total cancer markers at least if at least 5 markers are present or above the cutoff level, or in a marker set comprising 96 to 'n' total cancer markers (where 'n'>96 total cancer markers) the individual is predicted to have said solid tissue cancer if 6 or "n"/18 markers are present or above a cutoff level, or
For (c), if at least 4 markers are present or above the cutoff level in a marker set comprising 36-48 group-specific cancer markers, or 48-64 group-specific cancer markers If at least 5 markers are present in the included marker set or above the cutoff level, or 64 to 'n' total cancer markers (where 'n'> 64 group-specific cancer markers) Predicts the disease state of a particular tissue(s) most likely to be solid tissue cancer if 6 or 'n'/12 markers are present or above the cutoff level in the marker set comprising and in the method of identifying, the individual is predicted to have a solid tissue cancer,
and performing said assay. 請求項１記載の、(b) 固形組織癌の疾患状態を予測する方法、または(c) 固形組織癌の最も可能性の高い特定の原発組織（複数可）の疾患状態を予測し、及び特定する方法であって、
所与の固形組織癌用の所与のセットの各マーカーが、その固形組織癌用の以下の基準：
所与の固形組織癌と診断された個体由来の所与のがん組織の生体試料の６６％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の正常組織の生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の６６％超に存在するか、またはカットオフレベルを上回ること、
その所与の固形組織癌を有しない個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料の９５％超に存在しないか、またはカットオフレベルを下回ること、
所与の固形組織癌と診断された個体由来の細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体分泌物、体排泄物、またはそれらの画分を含む生体試料に１．６５超のｚ値で存在すること
のうちのいずれか１つ以上を有することによって選択される、前記方法。 2. The method of claim 1 for (b) predicting the disease state of solid tissue cancer, or (c) predicting and identifying the disease state of a particular tissue(s) of most likely origin of solid tissue cancer. a method for
Each marker in a given set for a given solid tissue cancer meets the following criteria for that solid tissue cancer:
present in or above the cut-off level in greater than 66% of a given cancer tissue biosample from an individual diagnosed with a given solid tissue cancer;
Absent or below the cut-off level in greater than 95% of normal tissue biosamples from individuals who do not have the given solid tissue cancer;
Greater than 66% of biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer be present at or above the cut-off level,
Greater than 95% of a biological sample containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals who do not have the given solid tissue cancer not present at or below the cut-off level,
1.65 in biological samples containing cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, body fluids, body secretions, body excretions, or fractions thereof from individuals diagnosed with a given solid tissue cancer The method is selected by having any one or more of present with a z value greater than. 前記少なくとも２回の濃縮ステップが、以下のステップのうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の方法：
エキソソームまたは細胞外小胞または他の保護された状態のマーカーを捕捉もしくは分離すること、血小板画分を捕捉もしくは分離すること、循環腫瘍細胞を捕捉もしくは分離すること、ＲＮＡ含有複合体を捕捉もしくは分離すること、ｃｆＤＮＡヌクレオソームまたは差異的修飾ｃｆＤＮＡ－ヒストン複合体を捕捉もしくは分離すること、タンパク質標的またはタンパク質標的複合体を捕捉もしくは分離すること、自己抗体を捕捉もしくは分離すること、サイトカインを捕捉もしくは分離すること、メチル化ｃｆＤＮＡを捕捉もしくは分離すること、マーカー特異的ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡ、または増幅された相補体を、溶液中、磁気ビーズ上、またはマイクロアレイ上での、相補的な捕捉プローブへのハイブリダイゼーションによって、捕捉もしくは分離すること、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅＨ２、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイト－メチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、バイサルファイト－メチル特異的ライゲーション反応、及び／またはライゲーション反応を介して、ｍｉＲＮＡマーカー、非コードＲＮＡマーカー（ｌｎｃＲＮＡマーカー及びｎｃＲＮＡマーカー）、ｍＲＮＡマーカー、エキソンマーカー、スプライスバリアントマーカー、転座マーカー、またはコピー数バリエーションマーカーを、線形的または指数的に増幅すること、変異マーカーまたはバイサルファイト変換ＤＮＡメチル化マーカーを含む１つ以上の標的領域を、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅＨ２、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＤＮＡグリコシラーゼ、またはそれらの組み合わせを使用して、ポリメラーゼ伸長反応、ポリメラーゼ連鎖反応、バイサルファイト－メチル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写反応、バイサルファイト－メチル特異的ライゲーション反応、及び／またはライゲーション反応を介して、野生型配列またはバイサルファイト変換非メチル化配列もしくはその相補配列を含む標的領域の増幅を抑制しながら、線形的または指数的に、選択的に増幅すること、３’－ＯＨ末端が酵素及び配列依存的プロセスで遊離している１つ以上のプライマーもしくはプローブを、優先的に伸長、ライゲーション、または増幅すること、標的特異的プライマーもしくはプローブが塩基特異的な様式で野生型配列またはバイサルファイト変換非メチル化配列もしくはその相補配列にハイブリダイズされる前記反応中に、ポリメラーゼ伸長またはライゲーションが妨害される条件下で、３’末端に１つ以上のミスマッチ塩基を含むまたは３’末端に１つ以上のヌクレオチド類似体及びブロッキング基を含む１つ以上のブロッキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること。 2. The method of claim 1 , wherein said at least two enrichment steps comprise two or more of the following steps:
trapping or separating exosomes or extracellular vesicles or other markers of the protected state; trapping or separating platelet fractions; trapping or separating circulating tumor cells; capturing or separating cfDNA nucleosomes or differentially modified cfDNA-histone complexes; capturing or separating protein targets or protein target complexes; capturing or separating autoantibodies; capturing or isolating methylated cfDNA; complementing marker-specific DNA, cDNA, miRNA, lncRNA, ncRNA, or mRNA, or amplified complements in solution, on magnetic beads, or on microarrays; DNA polymerase, reverse transcriptase, DNA ligase, RNA ligase, DNA repair enzyme, RNase, RNaseH2, endonuclease, restriction endonuclease, exonuclease, CRISPR, DNA via polymerase extension reaction, polymerase chain reaction, bisulfite-methyl-specific polymerase chain reaction, reverse transcription reaction, bisulfite-methyl-specific ligation reaction, and/or ligation reaction using glycosylases, or combinations thereof linearly or exponentially amplifying , miRNA markers, noncoding RNA markers (lncRNA markers and ncRNA markers), mRNA markers, exon markers, splice variant markers, translocation markers, or copy number variation markers, mutation markers or One or more target regions containing bisulfite-converting DNA methylation markers are treated with DNA polymerase, reverse transcriptase, DNA ligase, RNA ligase, DNA repair enzyme, RNase, RNaseH2, endonuclease, restriction endonuclease, exonuclease, CRISPR, via polymerase extension reaction, polymerase chain reaction, bisulfite-methyl-specific polymerase chain reaction, reverse transcription reaction, bisulfite-methyl-specific ligation reaction, and/or ligation reaction using DNA glycosylases, or combinations thereof either the wild-type sequence or the bisulfite-converted non-methyl selective amplification, either linearly or exponentially, while inhibiting amplification of target regions containing lysed sequences or their complementary sequences, the 3′-OH ends of which are liberated in an enzyme- and sequence-dependent process1 Preferentially extending, ligating, or amplifying one or more primers or probes, the target-specific primers or probes hybridizing in a base-specific manner to the wild-type sequence or the bisulfite-converted unmethylated sequence or its complementary sequence. containing one or more mismatched bases at the 3' end or containing one or more nucleotide analogues and blocking groups at the 3' end under conditions that prevent polymerase extension or ligation during the reaction that is lysed Use more than one blocking oligonucleotide primer. 前記複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質マーカーを検出及び識別するための前記１つ以上のアッセイが、以下のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法：
定量的リアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）法、バイサルファイトｑＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）法、バイサルファイトｄＰＣＲ法、ライゲーション検出法、リガーゼ連鎖反応、制限エンドヌクレアーゼ切断法、ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレアーゼ切断法、マイクロアレイハイブリダイゼーション法、ペプチドアレイ結合法、抗体アレイ法、質量分析法、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法、キャピラリーまたはゲル電気泳動法、化学発光法、蛍光法、ＤＮＡ配列決定法、バイサルファイト変換－ＤＮＡ配列決定法、ＲＮＡ配列決定法、近接ライゲーション法、近接ＰＣＲ法、抗体－標的複合体の固定化を含む方法、アプタマー－標的複合体の固定化を含む方法、免疫アッセイ法、ウエスタンブロットアッセイを含む方法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法、ハイスループットマイクロアレイベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法、またはハイスループットフローサイトメトリーベースの酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む方法。 10. The one or more assays for detecting and distinguishing the plurality of disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, or protein markers comprise one or more of the following : The method described in:
Quantitative real-time PCR (qPCR), reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RTPCR), bisulfite qPCR, digital PCR (dPCR), bisulfite dPCR, ligation detection, ligase chain reaction, restriction endonuclease cleavage method, DNA or RNA nuclease cleavage method, microarray hybridization method, peptide array binding method, antibody array method, mass spectrometry method, liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method, capillary or gel electrophoresis method, Chemiluminescence, fluorescence, DNA sequencing, bisulfite conversion-DNA sequencing, RNA sequencing, proximity ligation, proximity PCR, methods involving immobilization of antibody-target complexes, aptamer-target complexes methods involving immobilization of bodies; methods involving immunoassays; methods involving Western blot assays; methods involving enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA); Methods involving throughput flow cytometry-based enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). 前記複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質マーカーを検出及び識別するための前記１つ以上のアッセイの前記１つ以上のカットオフレベルが、前記疾患個体対正常個体由来の試料を比較する前記１つ以上のマーカーアッセイにおいて、以下の計算、比較、または決定のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法：
マーカーのΔＣｔ値が２超であること、マーカーのΔＣｔ値が４超であること、検出されたマーカー特異的シグナルの比率が１．５超であること、検出されたマーカー特異的シグナルの比率が３超であること、マーカー濃度の比率が１．５超であること、マーカー濃度の比率が３超であること、列挙されたマーカー特異的シグナルが２０％超異なること、列挙されたマーカー特異的シグナルが５０％超異なること、所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルの８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、もしくは９８％超であること、または所与の疾患試料からのマーカー特異的シグナルが、正常試料のセットからの同じマーカー特異的シグナルと比較して、１．０３超、１．２８超、１．６５超、１．７５超、１．８８超、もしくは２．０５超のｚスコアを有すること。 the one or more cutoff levels of the one or more assays for detecting and distinguishing the plurality of disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, or protein markers is 2. The method of claim 1 , wherein said one or more marker assays comparing samples from normal individuals comprises one or more of the following calculations, comparisons, or determinations:
A ΔCt value for the marker greater than 2, a ΔCt value for the marker greater than 4, a ratio of marker-specific signals detected greater than 1.5, a ratio of marker-specific signals detected greater than 3; ratio of marker concentrations greater than 1.5; ratio of marker concentrations greater than 3; >50% difference in signal, >85%, >90%, >95%, >96%, 97 %, or greater than 98%, or the marker-specific signal from a given disease sample is greater than 1.03, greater than 1.28 compared to the same marker-specific signal from a set of normal samples , greater than 1.65, greater than 1.75, greater than 1.88, or greater than 2.05. 個体の生体試料中の複数の疾患特異的及び／または細胞／組織特異的なＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質マーカーの存在もしくはレベルを特定することに基づいて、細胞または組織の疾患状態を予測する２ステップの方法であって、
前記２ステップの方法が、
生体試料を取得する段階であって、前記生体試料が、潜在的な疾患状態の細胞または組織、及び１つ以上の他の組織または細胞に由来する、エキソソーム、腫瘍関連小胞、他の保護された状態内のマーカー、無細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質を含み、前記生体試料が、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、体液、体分泌物、及び体排泄物、またはそれらの画分からなる群から選択される、前記生体試料を取得する段階と、
前記疾患状態と予測される可能性がより高い個体を特定するために、第１のステップを、全体的な感度が８０％超、全体的な特異性が９０％超、または全体的なＺスコアが１．２８超の前記生体試料に適用する段階と、
個体を前記疾患状態と予測するために、第２のステップを、前記第１のステップで特定された、全体的な特異性が９５％超または全体的なＺスコアが１．６５超の個体由来の生体試料に適用する段階と
を含み、
前記第１のステップを適用する段階及び／または前記第２のステップを適用する段階が、請求項１に記載の方法を使用して実施される、前記方法。 Predicting a disease state of a cell or tissue based on identifying the presence or level of multiple disease-specific and/or cell/tissue-specific DNA, RNA, and/or protein markers in an individual's biological sample A two-step method for
The two-step method includes:
obtaining a biological sample, wherein the biological sample contains exosomes, tumor-associated vesicles, other protected cells derived from potentially diseased cells or tissues and one or more other tissues or cells; said biological sample comprises cells, serum, blood, plasma, amniotic fluid, sputum, urine, bodily fluids, bodily fluids, bodily secretions, and bodily excretions. or a fraction thereof;
To identify individuals who are more likely to be predicted with said disease state, the first step is to achieve an overall sensitivity greater than 80%, an overall specificity greater than 90%, or an overall Z applying to said biological sample with a score greater than 1.28;
To predict an individual with said disease state, a second step is performed on individuals identified in said first step with an overall specificity greater than 95% or an overall Z-score greater than 1.65 applying to the biological sample from which
2. The method, wherein applying the first step and/or applying the second step is performed using the method of claim 1 . (a)または(b)について、前記疾患状態が、結腸直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、子宮癌肉腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺腺癌、浸潤性膀胱尿路上皮癌、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌を含む固形組織癌であるか、あるいは(c)について、前記疾患状態が、第１群、第２群、第３群、第４群、または第５群であり、
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図５６のリストからから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含むか；または
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図５７のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、以下（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－２１，ＭＩＲ２１、ｈｓａ－ｍｉｒ－１８２，ＭＩＲ１８２、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５４，ＭＩＲ４５４、ｈｓａ－ｍｉｒ－９６，ＭＩＲ９６、ｈｓａ－ｍｉｒ－１８３，ＭＩＲ１８３、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４９，ＭＩＲ５４９、ｈｓａ－ｍｉｒ－３０１ ａ ，ＭＩＲ３０１Ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ｆ－１，ＭＩＲ５４８Ｆ１、ｈｓａ－ｍｉｒ－３０１ｂ，ＭＩＲ３０１Ｂ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１０３－１，ＭＩＲ１０３１、ｈｓａ－ｍｉｒ－１８ ａ ，ＭＩＲ１８Ａ、ｈｓａ－ｍｉｒ－１４７ｂ，ＭＩＲ１４７Ｂ、ｈｓａ－ｍｉｒ－４３２６，ＭＩＲ４３２６、およびｈｓａ－ｍｉｒ－５７３，ＭＩＲ５７３、または図５３のリストから選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、図５４のリストから選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、図５５のリストから、または（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）特徴付けられていないタンパク質Ｃ１９ｏｒｆ４８，Ｑ６ＲＵＩ８、タンパク質ＦＡＭ７２Ｂ，Ｑ８６Ｘ６０、タンパク質ＦＡＭ７２Ｄ，Ｑ６Ｌ９Ｔ８、ヒドロキシアシルグルタチオンヒドロラーゼ様タンパク質，Ｑ６ＰＩＩ５、推定メチルトランスフェラーゼＮＳＵＮ５，Ｑ９６Ｐ１１、ＲＮＡプソイドウリジル酸シンターゼドメイン含有タンパク質１，Ｑ９ＵＪＪ７、コラーゲン三重らせんリピート含有タンパク質１，Ｑ９６ＣＧ８、インターロイキン－１１，Ｐ２０８０９、ストロメライシン－２，Ｐ０９２３８、マトリックスメタロプロテイナーゼ－９，Ｐ１４７８０、ポドカン様タンパク質１，Ｑ６ＰＥＺ８、推定ペプチドＹＹ－２，Ｑ９ＮＲＩ６、オステオポンチン，Ｐ１０４５１、スルフヒドリルオキシダーゼ２，Ｑ６ＺＲＰ７、グリピカン－２，Ｑ８Ｎ１５８、マクロファージ遊走阻害因子，Ｐ１４１７４、ペプチジル－プロリル シス－トランスイソメラーゼＡ，Ｐ６２９３７、及びカルレティキュリン，Ｐ２７７９７からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（タイチン）、ＭＵＣ１６（ムチン１６）、及びＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２ カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）からなる群から選択される遺伝子の、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、
請求項１に記載の方法。 For (a) or (b), the disease state is colorectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, esophageal cancer, mammary lobular and ductal carcinoma, endometrial carcinoma, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical Squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, uterine carcinosarcoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, prostate adenocarcinoma, invasive bladder urothelial carcinoma, hepatocellular carcinoma, pancreatic ductal adenocarcinoma, or is solid tissue cancer, including gallbladder adenocarcinoma; or for (c), said disease state is Group 1, Group 2, Group 3, Group 4, or Group 5;
at least 50% of said markers in a set each comprise one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence or the complement of one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the list in FIG. contains ; or
at least 50% of said markers in the set each comprise one or more methylated residues of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. 57; or
The one or more markers of the set are (mir ID, gene ID): hsa-mir-21, MIR21, hsa-mir-182, MIR182, hsa-mir-454, MIR454, hsa-mir-96, MIR96 , hsa-mir-183, MIR183, hsa-mir-549, MIR549, hsa-mir-301 a , MIR301A, hsa-mir-548f-1, MIR548F1, hsa-mir-301b, MIR301B, hsa-mir-103- 1, MIR1031, hsa-mir-18 a , MIR18A, hsa-mir-147b, MIR147B, hsa-mir-4326, MIR4326, and hsa-mir-573, MIR573, or one or more selected from the list in FIG. one or more miRNA sequences selected from the group consisting of lncRNA or ncRNA sequences of;
said one or more markers of the set comprise one or more exonic RNA sequences selected from the list in FIG. 54; or
Protein C19orf48, Q6RUI8, Protein FAM72B, Q86X60, Protein FAM72D, Q6L9T8, Hydroxyacylglutathione hydrolase-like protein, wherein said one or more markers of the set are not characterized from the list in Figure 55 or (Protein Name, UniProt ID) , Q6PII5, putative methyltransferase NSUN5, Q96P11, RNA pseudouridylate synthase domain-containing protein 1, Q9UJJ7, collagen triple helix repeat-containing protein 1, Q96CG8, interleukin-11, P20809, stromelysin-2, P09238, matrix metalloproteinase- 9, P14780, Podocane-like protein 1, Q6PEZ8, Putative peptide YY-2, Q9NRI6, Osteopontin, P10451, Sulfhydryl oxidase 2, Q6ZRP7, Glypican-2, Q8N158, Macrophage migration inhibitor, P14174, Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A , P62937, and calreticulin, P27797; or
a gene wherein the one or more markers of the set are selected from the group consisting of TP53 (tumor protein p53), TTN (titin), MUC16 (mucin 16), and KRAS (Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) contains one or more mutations, insertions, deletions, copy number alterations, or expression alterations of
The method of claim 1 . (a)または(b)について、前記疾患状態が、結腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、または食道癌であり、あるいは(c)について、前記疾患状態が第１群であり、
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図４４または図５９のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含むか；
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図４５または図６０のリストから選択される、１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含むか；
セットの前記１つ以上のマーカーが、図３９のリストから選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列、ｈｓａ－ｍｉｒ－６２４，ＭＩＲ６２４、または図４０のリストもしくは［遺伝子ＩＤ，座標（ＧＲＣｈ３８）］ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ：ＬＩＮＣ０１５５８，ｃｈｒ６：１６７７８４５３７－１６７７９６８５９、及びＥＮＳＧ０００００１４６５２１．８からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、図４１または図５８のリストから選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、図４２、図４３のリスト、または（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ＳＥＬＥ，１ｑ２２－ｑ２５，セレクチンＥ，Ｐ１６５８１、ＯＴＵＤ４，４ｑ３１．２１，ＯＴＵドメイン含有４，Ｑ０１８０４、ＢＰＩ，２０ｑ１１．２３，殺菌性／透過性増強タンパク質，Ｐ１７２１３、ＡＳＢ４，７ｑ２１－ｑ２２，アンキリンリピート及びＳＯＣＳボックス含有４，Ｑ９Ｙ５７４、Ｃ６ｏｒｆ１２３，６ｑ２７，染色体６オープンリーディングフレーム１２３，Ｑ９Ｙ６Ｚ２、ＫＰＮＡ３，１３ｑ１４．３，カリオフェリンα３（インポーチンα４），Ｏ００５０５、及びＮＵＰ９８，１１ｐ１５，ヌクレオポリン９８ｋＤａ，Ｐ５２９４８、または（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）殺菌性透過性増強タンパク質（ＢＰＩ）（ＣＡＰ５７），Ｐ１７２１３からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含むか；
セットの前記１つ以上のマーカーが、ＡＰＣ（ＡＰＣ、ＷＮＴシグナル伝達経路の調節因子）、ＡＴＭ（ＡＴＭセリン／スレオニンキナーゼ）、ＣＳＭＤ１（ＣＵＢ及びＳｕｓｈｉ複数ドメイン１）、ＤＮＡＨ１１（ダイニン軸糸重鎖１１）、ＤＳＴ（ジストニン）、ＥＰ４００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ４００）、ＦＡＴ３（ＦＡＴ非定型カドヘリン３）、ＦＡＴ４（ＦＡＴ非定型カドヘリン４）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＧＬＩ３（ＧＬＩファミリー亜鉛フィンガー３）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＯＢＳＣＮ（オブスキュリン、細胞骨格カルモジュリン及びタイチン相互作用ＲｈｏＧＥＦ）、ＰＣＬＯ（ピッコロ、シナプス前細胞基質タンパク質）、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸３－キナーゼ触媒サブユニットα）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＳＹＮＥ１（スペクトリンリピート含有核膜タンパク質１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質５３）、ＴＴＮ（タイチン）、及びＵＮＣ１３Ｃ（ｕｎｃ－１３ホモログＣ）からなる群から選択される遺伝子における、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、
請求項１に記載の方法。 for (a) or (b), said disease state is colon adenocarcinoma, rectal adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, or esophageal cancer; or for (c), said disease state is Group 1;
at least 50% of said markers of the set each comprise one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence, or one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the lists in FIG. 44 or FIG. comprises a complement ;
at least 50% of said markers in the set comprise one or more methylated residues of one or more chromosomal subregions, each selected from the list in FIG. 45 or FIG. 60;
The one or more markers in the set is one or more miRNA sequences selected from the list in Figure 39, hsa-mir-624, MIR624, or the list in Figure 40 or [Gene ID, coordinates (GRCh38)] ENSEMBL ID or
said one or more markers of the set comprise one or more exonic RNA sequences selected from the list of FIG. 41 or FIG. 58; or
42, 43, or (Gene Symbol, Chromosome Band, Gene Title, UniProt ID) SELE, 1q22-q25, Selectin E, P16581, OTUD4, 4q31.21, OTU Domain containing 4, Q01804, BPI, 20q11.23, bactericidal/permeability enhancing protein, P17213, ASB4, 7q21-q22, ankyrin repeat and SOCS box containing 4, Q9Y574, C6orf123, 6q27, chromosome 6 open reading frame 123, Q9Y6Z2 , KPNA3, 13q14.3, karyopherin α3 (importin α4), O00505, and NUP98, 11p15, nucleoporin 98 kDa, P52948, or (protein name, UniProt ID) bactericidal permeability enhancing protein (BPI) (CAP57), P17213 contain autoantibodies against one or more mRNA sequences, protein expression levels, protein product concentrations, cytokines, or protein products selected from the group consisting of;
The one or more markers of the set are APC (APC, regulator of WNT signaling pathway), ATM (ATM serine/threonine kinase), CSMD1 (CUB and Sushi multiple domains 1), DNAH11 (dynein axone heavy chain 11 ), DST (dystonin), EP400 (E1A binding protein p400), FAT3 (FAT atypical cadherin 3), FAT4 (FAT atypical cadherin 4), FLG (filagrin), GLI3 (GLI family zinc finger 3), KRAS (Ki -ras2 Carsten rat sarcoma viral oncogene homolog), LRP1B (LDL receptor-related protein 1B), MUC16 (mucin 16, cell surface binding), OBSCN (obscurin, cytoskeletal calmodulin and titin interacting RhoGEF), PCLO (piccolo, synapse procellular matrix protein), PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α), RYR2 (ryanodine receptor 2), SYNE1 (spectrin repeat-containing nuclear membrane protein 1), TP53 (tumor one or more mutations, insertions, deletions, copy number changes, or expression changes in a gene selected from the group consisting of protein 53), TTN (titin), and UNC13C (unc-13 homolog C);
The method of claim 1 . (a)または(b)について、前記疾患状態が、乳小葉癌及び乳管癌、子宮体子宮内膜癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、子宮頸部扁平上皮癌及び子宮頸部腺癌、または子宮癌肉腫であり、あるいは(c)について、前記疾患状態が第２群であり、
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図６１のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含むか；または
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図６２のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、以下（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－１２６５，ＭＩＲ１２６５からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含むか；
セットの前記１つ以上のマーカーが、以下（エキソン位置，遺伝子）：ｃｈｒ２：１７９２０９０１３－１７９２０９０８７：＋，ＯＳＢＰＬ６、ｃｈｒ２：１７９２５１７８８－１７９２５１８６６：＋，ＯＳＢＰＬ６、及びｃｈｒ２：１７９２５３７３６－１７９２５３８８０：＋，ＯＳＢＰＬ６からなる群から選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含むか；
セットの前記１つ以上のマーカーが、（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ＲＳＰＯ２，８ｑ２３．１，Ｒ－スポンジン２，Ｑ６ＵＸＸ９、ＫＬＣ４，６ｐ２１．１，キネシン軽鎖４，Ｑ９ＮＳＫ０、及びＧＬＲＸ，５ｑ１４，グルタレドキシン（チオールトランスフェラーゼ），Ｐ３５７５４、または（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）Ｒ－スポンジン－２（蓋板特異的スポンジン－２）（ｈＲｓｐｏ２），Ｑ６ＵＸＸ９からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含むか；
セットの前記１つ以上のマーカーが、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール－４，５－二リン酸３－キナーゼ触媒サブユニットα）及びＴＴＮ（タイチン）からなる群から選択される遺伝子における、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、
請求項１に記載の方法。 For (a) or (b), said disease state is breast lobular and ductal carcinoma, endometrial endometrial cancer, ovarian serous cystadenocarcinoma, cervical squamous cell carcinoma and cervical adenocarcinoma, or is uterine carcinosarcoma, or for (c), said disease state is in Group 2;
at least 50% of said markers in a set each represent one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence or the complement of one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the list in FIG. contains ; or
at least 50% of said markers in the set each comprise one or more methylated residues of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. 62; or
whether the one or more markers of the set comprise one or more miRNA sequences selected from the group consisting of (mir ID, gene ID): hsa-mir-1265, MIR1265;
The one or more markers of the set consist of (exon location, gene): chr2: 179209013-179209087: +, OSBPL6, chr2: 179251788-179251866: +, OSBPL6, and chr2: 179253736-179253880: +, OSBPL6 comprises one or more exonic RNA sequences selected from the group;
the one or more markers of the set are (gene symbol, chromosomal band, gene title, UniProt ID) RSPO2, 8q23.1, R-spondin 2, Q6UXX9, KLC4, 6p21.1, kinesin light chain 4, Q9NSK0, and one or more selected from the group consisting of GLRX, 5q14, glutaredoxin (thioltransferase), P35754, or (protein name, UniProt ID) R-spondin-2 (operculum-specific spondin-2) (hRspo2), Q6UXX9 mRNA sequences, protein expression levels, protein product concentrations, cytokines, or autoantibodies to protein products of;
one or more mutations in a gene in which said one or more markers of the set are selected from the group consisting of PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha) and TTN (titin) , including insertions, deletions, copy number changes, or expression changes ;
The method of claim 1 . (a)または(b)について、前記疾患状態が、肺腺癌、肺扁平上皮癌、または頭頸部扁平上皮癌であり、あるいは(c)について、前記疾患状態が第３群であり、
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図６３のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含むか；または
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図６４のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ、遺伝子ＩＤ）ｈｓａ－ｍｉｒ－２８，ＭＩＲ２８から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列を含か；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、（エキソン位置，遺伝子）：ｃｈｒ２：ｃｈｒ１：９３３０７７２１－９３３０９７５２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３１２７４０－９３３１２９１６：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３１６４０５－９３３１６５１２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３３４１８５３－９３３４２１５２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３４２６９３３－９３４２７０７９：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ７：４０２２１５５４－４０２２１６２７：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ７：４０２３４５３９－４０２３４６５９：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ８：２２２６５８２３－２２２６６００９：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ８：２２２７２２９３－２２２７２４１５：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ１４：３９５０９９３６－３９５１００９１：－，ＳＥＣ２３Ａ、及びｃｈｒ１４：３９５１１９９０－３９５１２０７６：－，ＳＥＣ２３Ａからなる群から選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ＳＴＲＮ３，１４ｑ１３－ｑ２１，ストリアチン，カルモジュリン結合タンパク質３，Ｑ１３０３３、ＬＲＲＣ１７，７ｑ２２．１，ロイシンリッチリピート含有１７，Ｑ８Ｎ６Ｙ２、ＦＡＭ６９Ａ，１ｐ２２，配列類似性を有するファミリー６９，メンバーＡ，Ｑ５Ｔ７Ｍ９、ＡＴＦ２，２ｑ３２，活性化転写因子２，Ｐ１５３３６、ＢＨＭＴ，５ｑ１４．１，ベタイン－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ，Ｑ９３０８８、ＯＤＺ３／ＴＥＮＭ３，４ｑ３４．３－ｑ３５．１，テニューリン膜貫通タンパク質３，Ｑ９Ｐ２７３、及びＺＦＨＸ４，８ｑ２１．１１，亜鉛フィンガーホメオボックス４，Ｑ８６ＵＰ３、または（タンパク質名称、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ロイシンリッチリピート含有タンパク質１７（ｐ３７ＮＢ），Ｑ８Ｎ６Ｙ２からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、ＣＳＭＤ３（ＣＵＢ及びＳｕｓｈｉ複数ドメイン３）、ＤＮＡＨ５（ダイニン軸糸重鎖５）、ＦＡＴ１（ＦＡＴ非定型カドヘリン１）、ＦＬＧ（フィラグリン）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＬＲＰ１Ｂ（ＬＤＬ受容体関連タンパク質１Ｂ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＰＣＬＯ（ピッコロシナプス前細胞基質タンパク質）、ＰＫＨＤ１Ｌ１（ＰＫＨＤ１様１）、ＲＥＬＮ（リーリン）、ＲＹＲ２（リアノジン受容体２）、ＳＩ（スクラーゼ－イソマルターゼ）、ＳＹＮＥ１（スペクトリンリピート含有核膜タンパク質１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＴＴＮ（タイチン）、ＵＳＨ２Ａ（アッシャリン）、及びＸＩＲＰ２（ｘｉｎアクチン結合リピート含有２）からなる群から選択される遺伝子における、１つ以上の変異、挿入、欠失、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、
請求項１に記載の方法。 for (a) or (b), the disease state is lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, or head and neck squamous cell carcinoma; or for (c), the disease state is Group 3;
at least 50% of said markers in the set each represent one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence or the complement of one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the list in FIG. contains ; or
at least 50% of said markers in the set each comprise one or more methylated residues of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. 64; or
said one or more markers of the set comprises one or more miRNA sequences selected from (mir ID, gene ID) hsa-mir-28, MIR28; or
The one or more markers of the set are (exon location, gene): chr2: chr1: 93307721-93309752: -, FAM69A, chr1: 93312740-93312916: -, FAM69A, chr1: 93316405-93316512: -, FAM69A, chr1 ：９３３４１８５３－９３３４２１５２：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ１：９３４２６９３３－９３４２７０７９：－，ＦＡＭ６９Ａ、ｃｈｒ７：４０２２１５５４－４０２２１６２７：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ７：４０２３４５３９－４０２３４６５９：＋，Ｃ７ｏｒｆ１０、ｃｈｒ８：２２２６５８２３－２２２６６００９：＋，ＳＬＣ３９Ａ１４、ｃｈｒ８ or
the one or more markers of the set are (Gene Symbol, Chromosome Band, Gene Title, UniProt ID) STRN3, 14q13-q21, Striatin, Calmodulin Binding Protein 3, Q13033, LRRC17, 7q22.1, Leucine Rich Repeat Containing 17, Q8N6Y2, FAM69A, 1p22, family 69 with sequence similarity, member A, Q5T7M9, ATF2, 2q32, activating transcription factor 2, P15336, BHMT, 5q14.1, betaine-homocysteine S-methyltransferase, Q93088, ODZ3/ TENM3, 4q34.3-q35.1, tenurin transmembrane protein 3, Q9P273, and ZFHX4, 8q21.11, zinc finger homeobox 4, Q86UP3, or (protein name, UniProt ID) leucine-rich repeat-containing protein 17 (p37NB) , Q8N6Y2; or
the one or more markers of the set are CSMD3 (CUB and Sushi multiple domain 3), DNAH5 (dynein axone heavy chain 5), FAT1 (FAT atypical cadherin 1), FLG (filagrin), KRAS (Ki-ras2, Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), LRP1B (LDL receptor-related protein 1B), MUC16 (mucin 16, cell surface binding), PCLO (piccolo presynaptic cytosolic protein), PKHD1L1 (PKHD1-like 1), RELN (reelin) , RYR2 (ryanodine receptor 2), SI (sucrase-isomaltase), SYNE1 (spectrin repeat-containing nuclear membrane protein 1), TP53 (tumor protein p53), TTN (titin), USH2A (ashalin), and XIRP2 (xin one or more mutations, insertions, deletions, deletions, copy number changes, or expression changes in a gene selected from the group consisting of actin-binding repeat-containing 2);
The method of claim 1 . (a)または(b)について、前記疾患状態が、前立腺腺癌または浸潤性膀胱尿路上皮癌であり、あるいは(c)について、前記疾患状態が第４群であり、
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図６５のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含むか；または
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図６６のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）：ｈｓａ－ｍｉｒ－４９１，ＭＩＲ４９１及びｈｓａ－ｍｉｒ－１４６８，ＭＩＲ１４６８からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列、または以下［遺伝子ＩＤ，座標（ＧＲＣｈ３８），ＥＮＳＥＭＢＬ ＩＤ］：ＡＣ００７３８３．３，ｃｈｒ２：２０６０８４６０５－２０６０８６５６４，ＥＮＳＧ０００００２２７９４６．１、及びＬＩＮＣ００３２４，ｃｈｒ１７：８２２０６４２－８２２４０４３，ＥＮＳＧ０００００１７８９７７．３からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、（エキソン位置，遺伝子）ｃｈｒ２１：４５５５５９４２－４５５５６０５５：＋，Ｃ２１ｏｒｆ３３から選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、（遺伝子記号，染色体バンド，遺伝子タイトル，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）ＰＭＭ１，２２ｑ１３，ホスホマンノムターゼ１，Ｑ９２８７１から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、ＢＡＧＥ２（ＢＡＧＥファミリーメンバー２）、ＤＮＭ１Ｐ４７（ダイナミン１偽遺伝子４７）、ＦＲＧ１ＢＰ（領域遺伝子１ファミリーメンバーＢ、偽遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＲＰ１１－１５６Ｐ１．３、ＴＴＮ（タイチン）、及びＴＵＢＢ８Ｐ７（チューブリンβ８クラスＶＩＩＩ偽遺伝子７）からなる群から選択される遺伝子の、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、
請求項１に記載の方法。 for (a) or (b), said disease state is prostate adenocarcinoma or invasive bladder urothelial carcinoma; or for (c), said disease state is Group 4;
at least 50% of said markers in a set each represent one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence or the complement of one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the list in FIG. contains ; or
at least 50% of said markers in the set each comprise one or more methylated residues of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. 66; or
The one or more markers of the set are (mir ID, gene ID): one or more miRNA sequences selected from the group consisting of hsa-mir-491, MIR491 and hsa-mir-1468, MIR1468, or Gene ID, Coordinates (GRCh38), ENSEMBL ID]: AC007383.3, chr2: 206084605-206086564, ENSG00000227946.1, and LINC00324, chr17: 8220642-8224043, ENSG00000178977.3 or comprises an ncRNA sequence; or
said one or more markers of the set comprise one or more exonic RNA sequences selected from (exon position, gene) chr21:45555942-45556055:+, C21orf33; or
wherein said one or more markers of the set are selected from (gene symbol, chromosome band, gene title, UniProt ID) PMM1, 22q13, phosphomannommutase 1, Q92871, one or more mRNA sequences, protein expression levels, contains protein product levels, cytokines, or autoantibodies against the protein product; or
the one or more markers of the set are BAGE2 (BAGE family member 2), DNM1P47 (dynamin 1 pseudogene 47), FRG1BP (regional gene 1 family member B, pseudogene), KRAS (Ki-ras2, Kirsten rat sarcoma virus one or more mutations, insertions, deletions, copies of a gene selected from the group consisting of: Oncogene Homolog), RP11-156P1.3, TTN (Titin), and TUBB8P7 (Tubulin β8 Class VIII Pseudogene 7) including number changes, or expression changes ,
The method of claim 1 . (a)または(b)について、前記疾患状態が、肝細胞癌、膵管腺癌、または胆嚢腺癌であり、あるいは(c)について、前記疾患状態が第５群であり、
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、ＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基、または図７０のリストから選択されるＣｐＧ配列の１つ以上のメチル化シトシン残基の相補体を含むか；または
セットの前記マーカーの少なくとも５０％が、各々、図７１のリストから選択される１つ以上の染色体サブ領域の１つ以上のメチル化残基を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、（ｍｉｒ ＩＤ，遺伝子ＩＤ）ｈｓａ－ｍｉｒ－１３２，ＭＩＲ１３２から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ配列、または図６７のリストから選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡもしくはｎｃＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、図６８のリストから選択される１つ以上のエキソンＲＮＡ配列を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、図６９のリストから選択される、または（タンパク質名称，ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ）：ゲルソリン（ＡＧＥＬ）（アクチン脱重合因子）（ＡＤＦ）（ブレビン），Ｐ０６３９６、プロニューレグリン－２，Ｏ１４５１１、ＣＤ５９糖タンパク質（１Ｆ５抗原）（２０ｋＤａ相同制限因子）（ＨＲＦ－２０）（ＨＲＦ２０）（ＭＡＣ－抑制タンパク質）（ＭＡＣ－ＩＰ）（ＭＥＭ４３抗原）（膜侵襲複合体抑制因子）（ＭＡＣＩＦ）（反応性溶解の膜阻害剤）（ＭＩＲＬ）（プロテクチン）（ＣＤ抗原ＣＤ５９），Ｐ１３９８７、及び分岐プロテインキナーゼ２Ｂ（自閉症関連タンパク質１で欠損），Ｑ９Ｈ７Ｙ０からなる群から選択される、１つ以上のｍＲＮＡ配列、タンパク質発現レベル、タンパク質産物濃度、サイトカイン、またはタンパク質産物に対する自己抗体を含むか；または
セットの前記１つ以上のマーカーが、ＫＲＡＳ（Ｋｉ－ｒａｓ２、カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＭＵＣ１６（ムチン１６、細胞表面結合）、ＭＵＣ４（ムチン４、細胞表面結合）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、及びＴＴＮ（タイチン）からなる群から選択される遺伝子における、１つ以上の変異、挿入、欠失、コピー数変化、または発現変化を含む、
請求項１に記載の方法。 for (a) or (b), the disease state is hepatocellular carcinoma, pancreatic duct adenocarcinoma, or gallbladder adenocarcinoma; or for (c), the disease state is Group 5;
at least 50% of said markers in the set each represent one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence or the complement of one or more methylated cytosine residues of a CpG sequence selected from the list in FIG. contains ; or
at least 50% of said markers in the set each comprise one or more methylated residues of one or more chromosomal subregions selected from the list in FIG. 71; or
wherein the one or more markers of the set are one or more miRNA sequences selected from (mir ID, gene ID) hsa-mir-132, MIR132, or one or more lncRNAs selected from the list in FIG. comprises an ncRNA sequence; or
said one or more markers of the set comprise one or more exonic RNA sequences selected from the list in FIG. 68; or
The one or more markers of the set are selected from the list of FIG. 69 or (protein name, UniProt ID): gelsolin (AGEL) (actin depolymerizing factor) (ADF) (brevin), P06396, proneuregulin -2, O14511, CD59 glycoprotein (1F5 antigen) (20 kDa homologous restriction factor) (HRF-20) (HRF20) (MAC-inhibitory protein) (MAC-IP) (MEM43 antigen) (membrane attack complex inhibitor) ( MACIF) (membrane inhibitor of reactive lysis) (MIRL) (protectin) (CD antigen CD59), P13987, and branched protein kinase 2B (deficient in autism-related protein 1), Q9H7Y0, contains one or more mRNA sequences, protein expression levels, protein product concentrations, cytokines, or autoantibodies against protein products; or
The one or more markers of the set are KRAS (Ki-ras2, Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), MUC16 (mucin 16, cell surface binding), MUC4 (mucin 4, cell surface binding), TP53 (tumor protein p53) ), and one or more mutations, insertions, deletions, copy number changes, or expression changes in a gene selected from the group consisting of TTN (titin);
The method of claim 1 . 試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親核酸分子の前記ヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）前記標的ヌクレオチド配列と隣接する前記親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記試料、前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、前記ポリメラーゼ伸長反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物を含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物、前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記反応混合物中の前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）５’標的配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、二次伸長産物の相補標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を、リガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドする段階と、
前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを、それらの相補配列にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。 In a sample, one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues with the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample A method for identifying one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by
said target nucleotide sequence differing from said nucleotide sequence of another parent nucleic acid molecule by one or more nucleotides, one or more copy number, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues; providing a sample containing one or more parent nucleic acid molecules potentially containing
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to a sequence of said parent nucleic acid molecule that flanks said target nucleotide sequence; one primary oligonucleotide primer; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer. providing a primary oligonucleotide primer set of
digesting the sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the primary oligonucleotide primer set, the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules to form one or more polymerase extension reaction mixtures; blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
comprising conditions suitable for digesting the one or more polymerase extension reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase extension reaction mixture, and a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase extension reaction cycles, thereby forming a primary extension product comprising a nucleotide sequence complementary to said target nucleotide sequence;
said one or more polymerase extension reaction mixtures comprising said primary extension products, one or more second primary oligonucleotides of said primary oligonucleotide primer set, to form one or more first polymerase chain reaction mixtures blending a primer, one or more enzymes capable of digesting the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule in the reaction mixture, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase chain reaction mixture, as well as denaturation, hybridization, and extension Subjecting to conditions suitable for carrying out one or more polymerase chain reaction cycles comprising treatment, thereby forming one or more first polymerase chain reaction products comprising said target nucleotide sequence or its complement stages and
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set comprising (a) a first oligonucleotide probe having a 5′ primer-specific portion and a 3′ target sequence-specific portion; and (b) ) a second oligonucleotide probe having a 5′ target sequence-specific portion and a 3′ primer-specific portion, wherein the first and second oligonucleotide probes of the probe set are secondary in a base-specific manner; providing said one or more oligonucleotide probe sets configured to hybridize on complementary target nucleotide sequences of extension products;
blending the one or more first polymerase chain reaction products with a ligase and the one or more oligonucleotide probe sets to form one or more ligation reaction mixtures;
subjecting said one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, thereby converting said first and second oligonucleotide probes of said one or more oligonucleotide probe sets into ligated together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer-specific portion, said target-specific subjecting the one or more ligation reaction mixtures comprising the target portion and the 3′ primer specific portion to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
said ligation product sequence, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecule can be digested to form one or more second polymerase chain reaction mixtures. blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming one or more second polymerase chain reaction products;
a target nucleotide that differs from the nucleotide sequence of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues detecting and identifying said one or more second polymerase chain reaction products in said one or more second polymerase chain reaction mixtures to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules containing the sequences; and . 試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親核酸分子の前記ヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
修飾ヌクレオチドを含まない核酸分子を消化することができる１つ以上のヌクレアーゼを提供する段階と、
前記標的ヌクレオチド配列と隣接する前記親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー（複数可）を提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記試料、前記１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ヌクレアーゼ消化から伸長産物を保護するが標的ＤＮＡを保護しない１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、前記ポリメラーゼ伸長反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）第１の５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される一次伸長産物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）第２の５’プライマー特異的部分及び前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記１つ以上のヌクレアーゼ、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼを含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物をブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在する核酸分子を消化するが修飾ヌクレオチドを含む一次伸長産物を消化しない好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記第１の５’プライマー特異的部分、標的特異的ヌクレオチド配列またはその相補体、及び前記第２の５’プライマー特異的部分の相補体を含む１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の前記第１の５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の三次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。 In a sample, one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues with the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample A method for identifying one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by
said target nucleotide sequence differing from said nucleotide sequence of another parent nucleic acid molecule by one or more nucleotides, one or more copy number, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues; providing a sample containing one or more parent nucleic acid molecules potentially containing
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
providing one or more nucleases capable of digesting nucleic acid molecules that do not contain modified nucleotides;
providing one or more first primary oligonucleotide primer(s) comprising a nucleotide sequence complementary to a sequence of said parent nucleic acid molecule that flanks said target nucleotide sequence;
one or more enzymes capable of digesting said sample, said one or more first primary oligonucleotide primers, and said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules to form one or more polymerase extension reaction mixtures , a deoxynucleotide mix containing one or more modified nucleotides that protect the extension products but not the target DNA from nuclease digestion, and a DNA polymerase;
comprising conditions suitable for digesting the one or more polymerase extension reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase extension reaction mixture, and a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase extension reaction cycles, thereby forming a primary extension product comprising the complement of said target nucleotide sequence;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set formed from (a) a first 5′ primer-specific portion and said first primary oligonucleotide primer; (b) a second 5' primer-specific portion and from said first secondary oligonucleotide primer; providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of the extension product formed;
comprising said primary extension product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said one or more nucleases, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more first polymerase chain reaction mixtures blending the one or more polymerase extension reaction mixtures;
subjecting said one or more first polymerase chain reaction mixtures to suitable conditions that digest nucleic acid molecules present in said first polymerase chain reaction mixture but not primary extension products comprising modified nucleotides, and a denaturation treatment; Subjecting to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, including a hybridization treatment and an extension treatment, whereby the first 5′ primer-specific portion, target-specific nucleotide sequence or its complement and forming one or more first polymerase chain reaction products comprising the second 5' primer-specific portion complement;
providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets, each tertiary oligonucleotide primer set comprising: (a) the first 5' primer specific of the one or more first polymerase chain reaction products; (b) a first tertiary oligonucleotide primer comprising the same nucleotide sequence as the target portion; providing said one or more tertiary oligonucleotide primer sets comprising two tertiary oligonucleotide primers;
said one or more first polymerase chain reaction products, said one or more tertiary oligonucleotide primer sets, and said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid to form one or more second polymerase chain reaction mixtures; blending one or more enzymes capable of digesting a molecule, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming one or more second polymerase chain reaction products;
a target nucleotide that differs from the nucleotide sequence of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues detecting and identifying said one or more second polymerase chain reaction products in said one or more second polymerase chain reaction mixtures to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules containing the sequences; and . 試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親核酸分子の前記ヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
修飾ヌクレオチドを含まない存在する核酸分子を消化することができる１つ以上のヌクレアーゼを提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットは、（ａ）前記標的ヌクレオチド配列と隣接する前記親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記試料、前記一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ヌクレアーゼ消化から伸長産物を保護するが標的ＤＮＡを保護しない１つ以上の修飾ヌクレオチドを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、前記ポリメラーゼ伸長反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記１つ以上のヌクレアーゼ、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼを含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物をブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在する核酸分子を消化するが修飾ヌクレオチドを含む一次伸長産物を消化しない好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のヌクレオチド、１つ以上のコピー数、１つ以上の転写産物配列、及び／または１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。 In a sample, one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues with the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample A method for identifying one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by
said target nucleotide sequence differing from said nucleotide sequence of another parent nucleic acid molecule by one or more nucleotides, one or more copy number, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues; providing a sample containing one or more parent nucleic acid molecules potentially containing
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
providing one or more nucleases capable of digesting existing nucleic acid molecules that do not contain modified nucleotides;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to a sequence of said parent nucleic acid molecule that flanks said target nucleotide sequence; one primary oligonucleotide primer; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer. providing a primary oligonucleotide primer set of
digesting the sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the primary oligonucleotide primer set, the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules to form one or more polymerase extension reaction mixtures; blending one or more enzymes capable of deoxynucleotides, a deoxynucleotide mix containing one or more modified nucleotides that protect extension products but not target DNA from nuclease digestion, and a DNA polymerase;
comprising conditions suitable for digesting the one or more polymerase extension reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase extension reaction mixture, and a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase extension reaction cycles, thereby forming a primary extension product comprising the complement of said target nucleotide sequence;
said primary extension product, one or more second primary oligonucleotide primers of said one or more primary oligonucleotide primer sets, said one or more blending the one or more polymerase extension reaction mixtures comprising a nuclease, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
The one or more first polymerase chain reaction mixtures are subjected to suitable conditions that digest nucleic acid molecules present in the polymerase chain reaction mixture but not primary extension products containing modified nucleotides, and a denaturation treatment, a hybridization treatment. and subjecting it to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles comprising elongation, thereby forming a first polymerase chain reaction product comprising said target nucleotide sequence or its complement. and,
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set (a) complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer; and (b) a 3' portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of an extension product formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer;
digesting said first polymerase chain reaction product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and extension, to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
a target nucleotide that differs from the nucleotide sequence of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more nucleotides, one or more copy numbers, one or more transcript sequences, and/or one or more methylated residues detecting and identifying said second polymerase chain reaction products in said one or more second polymerase chain reaction mixtures to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules containing sequences. , said method. 試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記１つ以上のメチル化残基を含む前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列と隣接する前記バイサルファイト処理親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記バイサルファイト処理試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために前記一次伸長産物を含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列特異的部分または相補配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに（ｂ）５’バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列特異的部分または相補配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の相補ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を、リガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットとブレンドする段階と、
前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブを、相補配列にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列特異的部分または相補配列特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。 A method for identifying in a sample one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more methylated residues, comprising: the method comprising:
providing a sample comprising one or more parent nucleic acid molecules potentially comprising said target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence of said other parent nucleic acid molecule by one or more methylated residues;
subjecting the nucleic acid molecules in the sample to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set (a) flanking said bisulfite treated target nucleotide sequence comprising said one or more methylated residues; a first primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the sequence of the bisulfite treated parental nucleic acid molecule; and (b) nucleotides complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer. providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising a second primary oligonucleotide primer comprising the sequence;
the bisulfite-treated sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more polymerase extension reaction mixtures and blending
subjecting the one or more polymerase extension reaction mixtures to conditions suitable for one or more polymerase extension reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby complementing the bisulfite-treated target nucleotide sequence; forming a primary extension product comprising a body;
said one or more polymerase extension reaction mixtures comprising said primary extension products to form one or more first polymerase chain reaction mixtures, one or more second of said one or more primary oligonucleotide primer sets; blending a primary oligonucleotide primer, one or more enzymes capable of digesting the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments and one or more polymerase chain reaction cycles comprising elongation, thereby producing a first polymerase chain reaction product comprising said bisulfite-treated target nucleotide sequence or its complement. forming;
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set having (a) a 5′ primer-specific portion and a 3′ bisulfite treated target nucleotide sequence-specific portion or complementary sequence-specific portion; a first oligonucleotide probe and (b) a second oligonucleotide probe having a 5′ bisulfite treated target nucleotide sequence-specific portion or a complementary sequence-specific portion and a 3′ primer-specific portion, said probe set comprising: The one or more oligonucleotide probes, wherein the first and second oligonucleotide probes are configured to hybridize in a base-specific manner on complementary nucleotide sequences of the first polymerase chain reaction product. providing a set;
blending the first polymerase chain reaction product with a ligase and the one or more oligonucleotide probe sets to form one or more ligation reaction mixtures;
subjecting the one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, thereby complementing the first and second oligonucleotide probes of the one or more oligonucleotide probe sets; when hybridized to the sequences ligate together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer specific portion, said bisulfite treated target; subjecting said one or more ligation reaction mixtures comprising a nucleotide sequence specific portion or complementary sequence specific portion and said 3′ primer specific portion to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
said ligation product sequence, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecule can be digested to form one or more second polymerase chain reaction mixtures. blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
to identify the presence of one or more nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by one or more methylated residues from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample; detecting and identifying the second polymerase chain reaction product in the polymerase chain reaction mixture of . 試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記１つ以上のメチル化残基を含む前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列と隣接する前記バイサルファイト処理親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー（複数可）を提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記バイサルファイト処理試料、前記１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される前記ポリメラーゼ伸長反応産物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼを含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物をブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在する核酸分子を消化するが修飾ヌクレオチドを含む一次伸長産物を消化しない好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列特異的部分または相補配列特異的部分、及び前記第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分の相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の三次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。 A method for identifying in a sample one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more methylated residues, comprising: the method comprising:
providing a sample comprising one or more parent nucleic acid molecules potentially comprising said target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence of said other parent nucleic acid molecule by one or more methylated residues;
subjecting the nucleic acid molecules in the sample to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules;
one or more first primary oligonucleotide primers comprising a nucleotide sequence complementary to a sequence of said bisulfite-treated parent nucleic acid molecule that flanks said bisulfite-treated target nucleotide sequence comprising said one or more methylated residues; providing the(s);
blending the bisulfite-treated sample, the one or more first primary oligonucleotide primers, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more polymerase extension reaction mixtures;
subjecting the one or more polymerase extension reaction mixtures to conditions suitable for one or more polymerase extension reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby complementing the bisulfite-treated target nucleotide sequence; forming a primary extension product comprising a body;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set formed from (a) a 5′ primer specific portion and said first primary oligonucleotide primer; a first secondary oligonucleotide primer having a 3' portion complementary to a portion of a polymerase extension reaction product; and (b) a 5' primer-specific portion and an extension formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of the product;
said primary extension product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, and said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule can be digested to form one or more first polymerase chain reaction mixtures. blending the one or more polymerase extension reaction mixtures comprising one or more enzymes, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
subjecting said one or more first polymerase chain reaction mixtures to suitable conditions that digest nucleic acid molecules present in said first polymerase chain reaction mixture but not primary extension products comprising modified nucleotides, and a denaturation treatment; Subjecting to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, including a hybridization treatment and an extension treatment, whereby the 5′ primer-specific portion of said first secondary oligonucleotide primer, said bisal forming a first polymerase chain reaction product comprising a phyto-treated target nucleotide sequence-specific portion or complementary sequence-specific portion and the complement of said 5′ primer-specific portion of said second secondary oligonucleotide primer; and,
providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets, each tertiary oligonucleotide primer set (a) having the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said first polymerase chain reaction product; and (b) a second tertiary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to said 3′ primer-specific portion of said first polymerase chain reaction product sequence. providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets;
digesting said first polymerase chain reaction product, said one or more tertiary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes capable of deoxynucleotide mix, dUTP, and DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a secondary polymerase chain reaction product;
to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by one or more methylated residues from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample; detecting and identifying said secondary polymerase chain reaction product in the polymerase chain reaction mixture of 2. 試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記１つ以上のメチル化残基を含む前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列と隣接する前記バイサルファイト処理親核酸分子の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記バイサルファイト処理試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物を含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記反応混合物中の前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。 A method for identifying in a sample one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more methylated residues, comprising: the method comprising:
providing a sample comprising one or more parent nucleic acid molecules potentially comprising said target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence of said other parent nucleic acid molecule by one or more methylated residues;
subjecting the nucleic acid molecules in the sample to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set (a) flanking said bisulfite treated target nucleotide sequence comprising said one or more methylated residues; a first primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the sequence of the bisulfite treated parental nucleic acid molecule; and (b) nucleotides complementary to a portion of an extension product formed from said first primary oligonucleotide primer. providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising a second primary oligonucleotide primer comprising the sequence;
the bisulfite-treated sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more polymerase extension reaction mixtures and blending
subjecting the one or more polymerase extension reaction mixtures to conditions suitable for one or more polymerase extension reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby complementing the bisulfite-treated target nucleotide sequence; forming a primary extension product comprising a body;
said one or more polymerase extension reaction mixtures comprising said primary extension products, one or more second of said one or more primary oligonucleotide primer sets, to form one or more first polymerase chain reaction mixtures blending a primary oligonucleotide primer of, one or more enzymes capable of digesting the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule in the reaction mixture, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments and one or more polymerase chain reaction cycles comprising elongation, thereby producing a first polymerase chain reaction product comprising said bisulfite-treated target nucleotide sequence or its complement. forming;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising: (a) a first polymerase chain reaction product formed from said first primary oligonucleotide primer; and (b) a portion of a first polymerase chain reaction product formed from said first secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion complementary to a portion of providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3' portion comprising a complementary nucleotide sequence;
digesting said first polymerase chain reaction product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and extension, to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by one or more methylated residues from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample; detecting and identifying the second polymerase chain reaction product in the polymerase chain reaction mixture of 2. 試料中で、前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる前記標的ヌクレオチド配列を潜在的に含む１つ以上の親核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中の前記核酸分子を、非メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換するのに好適な条件下でバイサルファイト処理に供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び前記１つ以上のメチル化残基を含む前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列と隣接する前記バイサルファイト処理親核酸分子の配列と相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を形成するために、前記バイサルファイト処理試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ伸長反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列の相補体を含む一次伸長産物を形成する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次伸長産物を含む前記１つ以上のポリメラーゼ伸長反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットの１つ以上の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマー、前記反応混合物中の前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、前記バイサルファイト処理標的ヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物またはそれらの相補体の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物またはそれらの相補体の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記試料中の他の親核酸分子のヌクレオチド配列とは１つ以上のメチル化残基によって異なる標的ヌクレオチド配列を含む１つ以上の親核酸分子の存在を特定するために、前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別する段階と
を含む、前記方法。 A method for identifying in a sample one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample by one or more methylated residues, comprising: the method comprising:
providing a sample comprising one or more parent nucleic acid molecules potentially comprising said target nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence of said other parent nucleic acid molecule by one or more methylated residues;
subjecting the nucleic acid molecules in the sample to bisulfite treatment under conditions suitable to convert unmethylated cytosine residues to uracil residues;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a 5′ primer specific portion and said one or more methylated residues; a first primary oligonucleotide primer having a 3' portion comprising a nucleotide sequence complementary to a sequence of said bisulfite treated parental nucleic acid molecule flanked by a target nucleotide sequence; and (b) a 5' primer specific portion and said first providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising a second primary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of the extension products formed from the primary oligonucleotide primers of stages and
the bisulfite-treated sample, one or more first primary oligonucleotide primers of the one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more polymerase extension reaction mixtures and blending
subjecting the one or more polymerase extension reaction mixtures to conditions suitable for one or more polymerase extension reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby complementing the bisulfite-treated target nucleotide sequence; forming a primary extension product comprising a body;
said one or more polymerase extension reaction mixtures comprising said primary extension products, one or more second of said one or more primary oligonucleotide primer sets, to form one or more first polymerase chain reaction mixtures blending a primary oligonucleotide primer of, one or more enzymes capable of digesting the deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule in the reaction mixture, a deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase;
conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures of deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the polymerase chain reaction mixture, as well as denaturation, hybridization, and extension subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles comprising treatment, thereby forming a first polymerase chain reaction product comprising said bisulfite-treated target nucleotide sequence or its complement; and,
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising: (a) the 5′ primer specific for the first polymerase chain reaction product or their complement; (b) a nucleotide sequence complementary to said 3′ primer specific portion of said first polymerase chain reaction product or their complement; providing the one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer comprising
digesting said primary polymerase chain reaction product sequence, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes capable of deoxynucleotide mix, dUTP, and DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
to identify the presence of one or more parent nucleic acid molecules comprising a target nucleotide sequence that differs by one or more methylated residues from the nucleotide sequences of other parent nucleic acid molecules in said sample; detecting and identifying the second polymerase chain reaction product in the polymerase chain reaction mixture of 2. 試料中で、前記試料中の他の親リボ核酸分子のリボ核酸配列とは、選択的スプライシング、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、またはゲノムレベルでの他の再編成に起因して異なる標的リボ核酸配列を含む１つ以上の親リボ核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親リボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる標的リボ核酸分子を含む１つ以上の親リボ核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記標的リボヌクレオチド配列と隣接する前記親リボ核酸分子のＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される前記ｃＤＮＡ伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記接触させた試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、逆転写酵素、及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記標的リボ核酸に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、１つ以上の異なる逆転写／ポリメラーゼ生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）５’標的配列特異的部分及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、前記標的リボ核酸分子配列に対応する逆転写酵素／ポリメラーゼ生成物の相補部分上でハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記逆転写酵素／ポリメラーゼ生成物をリガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させる段階と、
前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のプローブが、それらの相補体にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他の親リボ核酸分子のリボ核酸配列とは、選択的スプライシング、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、またはゲノムレベルでの他の再編成に起因して異なる標的リボ核酸配列を含む１つ以上の親リボ核酸分子の存在を特定する段階と
を含む、前記方法。 In a sample, ribonucleic acid sequences of other parental ribonucleic acid molecules in said sample include alternative splicing, alternative transcripts, alternative initiation sites, alternative coding sequences, alternative non-coding sequences, exon insertions, exon deletions, introns A method for identifying one or more parent ribonucleic acid molecules that contain a target ribonucleic acid sequence that differs due to an insertion, translocation, mutation, or other rearrangement at the genomic level, said method comprising:
providing a sample comprising one or more parent ribonucleic acid molecules comprising a target ribonucleic acid molecule that potentially differs in sequence from other parent ribonucleic acid molecules;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to an RNA sequence of said parent ribonucleic acid molecule that flanks said target ribonucleotide sequence; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of said cDNA extension product formed from said first primary oligonucleotide primer , providing said one or more primary oligonucleotide primer sets;
said contacted sample, said one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix comprising dUTP, a reverse transcriptase, and a DNA polymerase or reverse to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures; blending a DNA polymerase with transcriptase activity;
the one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures under suitable conditions to produce deoxyribonucleic acid (cDNA) molecules complementary to the target ribonucleic acid, and denaturation, hybridization, and extension treatments. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming one or more different reverse transcription/polymerase products;
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set comprising (a) a first oligonucleotide probe having a 5′ primer-specific portion and a 3′ target sequence-specific portion; and (b) ) a second oligonucleotide probe having a 5′ target sequence-specific portion and a 3′ primer-specific portion, wherein said first and second oligonucleotide probes of a probe set are in a base-specific manner, said target providing said one or more oligonucleotide probe sets configured to hybridize on a complementary portion of a reverse transcriptase/polymerase product corresponding to a ribonucleic acid molecule sequence;
contacting the reverse transcriptase/polymerase product with a ligase and the one or more oligonucleotide probe sets to form one or more ligation reaction mixtures;
subjecting said one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, whereby said first and second probes of said one or more oligonucleotide probe sets are converted to their complements ligated together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer-specific portion, said target-specific portion and the 3′ primer-specific portion, subjecting the one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
The ligation product sequence, the one or more secondary oligonucleotide primer sets, can be digested with a deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecule to form one or more first polymerase chain reaction mixtures. blending with one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a first polymerase chain reaction product;
detecting and distinguishing said first polymerase chain reaction product, whereby ribonucleic acid sequences of other parental ribonucleic acid molecules in said sample include: alternative splicing, alternative transcripts, alternative initiation sites, alternative coding sequences; , of one or more parent ribonucleic acid molecules comprising target ribonucleic acid sequences that differ due to alternative non-coding sequences, exon insertions, exon deletions, intron insertions, translocations, mutations, or other rearrangements at the genomic level identifying the presence. 試料中で、前記試料中の他の親リボ核酸分子のリボ核酸配列とは、選択的スプライシング、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、またはゲノムレベルでの他の再編成に起因して異なる標的リボ核酸配列を含む１つ以上の親リボ核酸分子を特定するための方法であって、前記方法が、
他の親リボ核酸分子とは配列が潜在的に異なる標的リボ核酸分子を含む１つ以上の親リボ核酸分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各一次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記標的ヌクレオチド配列と隣接する前記親リボ核酸分子のＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される前記ｃＤＮＡ伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記接触させた試料、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、逆転写酵素、及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記標的ＲＮＡに相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、１つ以上の異なる逆転写／一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される逆転写／一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される逆転写／一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記逆転写／一次ポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他の親リボ核酸分子のリボ核酸配列とは、選択的スプライシング、代替転写産物、代替開始部位、代替コード配列、代替非コード配列、エキソン挿入、エキソン欠失、イントロン挿入、転座、変異、またはゲノムレベルでの他の再編成に起因して異なる標的リボ核酸配列を含む１つ以上の親リボ核酸分子の存在を特定する段階と
を含む、前記方法。 In a sample, ribonucleic acid sequences of other parental ribonucleic acid molecules in said sample include alternative splicing, alternative transcripts, alternative initiation sites, alternative coding sequences, alternative non-coding sequences, exon insertions, exon deletions, introns A method for identifying one or more parent ribonucleic acid molecules that contain a target ribonucleic acid sequence that differs due to an insertion, translocation, mutation, or other rearrangement at the genomic level, said method comprising:
providing a sample comprising one or more parent ribonucleic acid molecules comprising a target ribonucleic acid molecule that potentially differs in sequence from other parent ribonucleic acid molecules;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primary oligonucleotide primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to an RNA sequence of said parent ribonucleic acid molecule that flanks said target nucleotide sequence; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of said cDNA extension product formed from said first primary oligonucleotide primer, providing said one or more primary oligonucleotide primer sets;
said contacted sample, said one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, a reverse transcriptase, and a DNA polymerase or reverse transcriptase activity to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures and blending a DNA polymerase having
the one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures under suitable conditions to produce deoxyribonucleic acid (cDNA) molecules complementary to the target RNA, and denaturation, hybridization, and extension treatments. subjecting to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming one or more different reverse transcription/primary polymerase chain reaction products;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set (a) reverse transcription/primary polymerase chain reaction generation formed from said first primary oligonucleotide primers; and (b) one of the reverse transcription/primary polymerase chain reaction products formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to said portion;
said reverse transcription/primary polymerase chain reaction product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, and said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more first polymerase chain reaction mixtures; blending one or more enzymes capable of digestion, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and extension, to conditions suitable for performing two or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a first polymerase chain reaction product;
Detecting and distinguishing said first polymerase chain reaction product, whereby ribonucleic acid sequences of other parental ribonucleic acid molecules in said sample include alternative splicing, alternative transcripts, alternative initiation sites, alternative coding sequences. , of one or more parent ribonucleic acid molecules comprising target ribonucleic acid sequences that differ due to alternative non-coding sequences, exon insertions, exon deletions, intron insertions, translocations, mutations, or other rearrangements at the genomic level. identifying the presence. 試料中で、前記試料中の他のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
１つ以上の第１のライゲーション反応混合物を形成するために、前記接触させた試料を、リガーゼならびに５’リン酸、５’ステムループ部分、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロッキング基、及び前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む１つ以上の第１のオリゴヌクレオチド予備プローブとブレンドする段階と、
前記試料中に存在する場合には前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチド予備プローブに付加される、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成するために、前記１つ以上の第１のライゲーション反応混合物中で、前記１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を、それらの３’末端で、前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチド予備プローブの前記５’リン酸にライゲーションする段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、（ａ）前記第１のオリゴヌクレオチド予備プローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び３’部分を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、他のセットの他の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、キメラ核酸分子を含む前記１つ以上の第１のライゲーション反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記試料中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる前記１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、ならびに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、前記キメラ核酸分子に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の相補体、及びその相補体を含む１つ以上の異なる一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに（ｂ）５’標的配列特異的部分、一次伸長産物に相補的な部分、及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応する一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物の相補部分上でハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のライゲーション反応混合物を形成するために、前記一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物をリガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させる段階と、
前記１つ以上の第２のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、それらの相補体にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上の第２のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列及び前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記１つ以上の反応物中の前記二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定する段階と
含む、前記方法。 A method for identifying one or more target miRNA molecules in a sample that differ in sequence by one or more bases from other microribonucleic acid (miRNA) molecules in the sample, the method comprising:
providing a sample comprising one or more target miRNA molecules that potentially differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
To form one or more first ligation reaction mixtures, the contacted sample is combined with a ligase and a 5′ phosphate, a 5′ stem loop portion, an internal primer specific portion within the loop region, a blocking group, and blending with one or more first oligonucleotide preprobes comprising a 3′ nucleotide sequence complementary to the 3′ portion of the target miRNA molecule sequence;
to generate a chimeric nucleic acid molecule comprising the target miRNA molecule sequence, appended to the one or more first oligonucleotide preprobes when present in the sample; ligating the one or more target miRNA molecules at their 3′ ends to the 5′ phosphates of the one or more first oligonucleotide preprobes in a ligation reaction mixture;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to said internal primer specific portion of said first oligonucleotide preliminary probe; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion and a 3′ portion, said second primary oligonucleotide primer being linked to another set of other second providing said one or more primary oligonucleotide primer sets, which may be the same or different than the primary oligonucleotide primers of
said one or more first ligation reaction mixtures comprising chimeric nucleic acid molecules; said one or more primary oligonucleotide primer sets; blending the one or more enzymes capable of digesting uracil (dU)-containing nucleic acid molecules, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a reverse transcriptase and a DNA polymerase or a DNA polymerase having reverse transcriptase activity;
conditions suitable for digesting said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures to deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said reverse transcription/polymerase chain reaction mixture, complementary to said chimeric nucleic acid molecules; and conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles comprising denaturation, hybridization, and extension treatments, thereby forming the 5' forming one or more different primary reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising a primer-specific portion, a nucleotide sequence corresponding to said target miRNA molecule sequence, and the complement of said internal primer-specific portion, and the complement thereof stages and
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set comprising (a) a first oligonucleotide probe having a 5′ primer-specific portion and a 3′ target sequence-specific portion; ) a second oligonucleotide probe having a 5′ target sequence-specific portion, a portion complementary to the primary extension product, and a 3′ primer-specific portion, wherein said first and second oligonucleotide probes of the probe set are , the one or more oligos configured to hybridize in a base-specific manner on a complementary portion of a primary reverse transcription/polymerase chain reaction product corresponding to the target miRNA molecule sequence or its complement providing a nucleotide probe set;
contacting said primary reverse transcription/polymerase chain reaction product with a ligase and said one or more oligonucleotide probe sets to form one or more second ligation reaction mixtures;
subjecting said one or more second ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, whereby said first and second oligonucleotide probes of said one or more oligonucleotide probe sets are when hybridized to their complements, ligate together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer-specific portion, subjecting the one or more second ligation reaction mixtures comprising the target-specific portion and the 3′ primer-specific portion to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
The ligation product sequences and the one or more secondary oligonucleotide primer sets can be digested with deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecules to form one or more second polymerase chain reaction mixtures. blending with one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a secondary polymerase chain reaction product;
detecting and identifying said secondary polymerase chain reaction products in said one or more reactions, thereby one or more targets differing in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in said sample; identifying the miRNA molecule. 試料中で、前記試料中の他のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記接触させた試料を、リガーゼならびに５’リン酸、５’ステムループ部分、ループ領域内の内部プライマー特異的部分、ブロッキング基、及び前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列の３’部分に相補的な３’ヌクレオチド配列を含む１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブとブレンドする段階と、
前記試料中に存在する場合には前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブに付加される、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列を含むキメラ核酸分子を生成するために、前記１つ以上のライゲーション反応混合物中で、前記１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を、それらの３’末端で、前記１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記５’リン酸にライゲーションする段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、（ａ）前記第１のオリゴヌクレオチドプローブの前記内部プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び３’部分を含む第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーが、他のセットの他の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、キメラ核酸分子を含む前記１つ以上のライゲーション反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、ならびに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記キメラ核酸分子に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、及び前記内部プライマー特異的部分の相補体、及びそれらの相補体を含む１つ以上の異なる一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される伸長産物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記一次逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーの５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応するヌクレオチド配列、及び他の５’プライマー特異的部分の相補体、第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物またはそれらの相補体の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の三次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物またはそれらの相補体の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応プロセス生成物、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定する段階と
含む、前記方法。 A method for identifying one or more target miRNA molecules in a sample that differ in sequence by one or more bases from other microribonucleic acid (miRNA) molecules in the sample, the method comprising:
providing a sample comprising one or more target miRNA molecules that potentially differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
To form one or more ligation reaction mixtures, the contacted sample is combined with a ligase and a 5' phosphate, a 5' stem loop portion, an internal primer specific portion within the loop region, a blocking group, and the target miRNA. blending with one or more first oligonucleotide probes comprising a 3′ nucleotide sequence complementary to the 3′ portion of the molecular sequence;
in said one or more ligation reaction mixtures to generate a chimeric nucleic acid molecule comprising said target miRNA molecule sequence, appended to said one or more first oligonucleotide probes when present in said sample; and ligating the one or more target miRNA molecules at their 3' ends to the 5' phosphates of the one or more first oligonucleotide probes;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primer set comprising (a) a nucleotide sequence complementary to said internal primer specific portion of said first oligonucleotide probe; and (b) a second primary oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion and a 3′ portion, said second primary oligonucleotide primer being linked to another set of other second providing said one or more primary oligonucleotide primer sets, which may be the same as or different from the primary oligonucleotide primers;
said one or more ligation reaction mixtures comprising a chimeric nucleic acid molecule, said one or more primary oligonucleotide primer sets, a deoxynucleotide mix, and a reverse transcriptase to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures and blending a DNA polymerase or a DNA polymerase with reverse transcriptase activity;
applying said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable for producing deoxyribonucleic acid (cDNA) molecules complementary to said chimeric nucleic acid molecules, and denaturation, hybridization and extension treatments. subjecting to conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles whereby the 5′ primer-specific portion, the nucleotide sequence corresponding to the target miRNA molecule sequence, and the complement of the internal primer-specific portion, and forming one or more different primary reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising the complement of
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set having an extension formed from (a) a 5′ primer specific portion and said first primary oligonucleotide primer; a first secondary oligonucleotide primer having a 3' portion complementary to a portion of the product; and (b) a 5' primer-specific portion and one of the extension products formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to said portion;
Blending said primary reverse transcription/polymerase chain reaction product, said one or more secondary oligonucleotide primer sets, deoxynucleotide mix, and DNA polymerase to form one or more first polymerase chain reaction mixtures stages and
subjecting the one or more first polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable for two or more polymerase chain reaction cycles comprising a denaturation treatment, a hybridization treatment, and an extension treatment, thereby a second oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion of an oligonucleotide primer, a nucleotide sequence corresponding to said target miRNA molecule sequence or its complement, and the complement of the other 5′ primer-specific portion, a second secondary oligonucleotide primer; forming a polymerase chain reaction product of 1;
providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets, each tertiary oligonucleotide primer set comprising: (a) the 5' primer-specific portion of the first polymerase chain reaction product or their complement; and (b) a second tertiary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to said 3′ primer-specific portion of said first polymerase chain reaction product or their complement. providing said one or more tertiary oligonucleotide primer sets comprising tertiary oligonucleotide primers of
digesting said first polymerase chain reaction process product, said one or more tertiary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the second polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
detecting and identifying said second polymerase chain reaction product, thereby identifying one or more target miRNA molecules that differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in said sample. , said method. 試料中で、前記試料中の他のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物を形成するために、前記接触させた試料を、ＡＴＰ及びポリ（Ａ）ポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物を、前記試料中に潜在的に存在する前記１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の前記３’末端にホモポリマーＡを付加するのに好適な条件に供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、（ａ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーであって、５’プライマー特異的部分、内部ポリｄＴ部分、及び前記標的ｍｉＲＮＡの前記３’末端に相補的な１～１０塩基を含む３’部分を含み、他のセットの他の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーであって、５’プライマー特異的部分及び３’部分を含み、他のセットの他の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記試料中のデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる前記１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、ならびに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、次いで、３’ポリＡテールを有する前記標的ｍｉＲＮＡ配列に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、ポリｄＡ領域、及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分の相補体、及びその相補体を含む１つ以上の異なる逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階であって、各プローブセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び３’標的配列特異的部分を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、及び（ｂ）５’標的配列特異的部分、前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物に相補的な部分、及び３’プライマー特異的部分を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、塩基特異的な様式で、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応する前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物の相補部分にハイブリダイズするように構成されている、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを提供する段階と、
１つ以上のライゲーション反応混合物を形成するために、前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物をリガーゼ及び前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させる段階と、
前記１つ以上のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階であって、それによって、前記１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドプローブが、それらの相補体にハイブリダイズされたときに、一緒にライゲーションして、前記ライゲーション反応混合物中にライゲーション産物配列を形成し、ここで、各ライゲーション産物配列が、前記５’プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、及び前記３’プライマー特異的部分を含む、前記１つ以上の第２のライゲーション反応混合物を、１回以上のライゲーション反応サイクルに供する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記ライゲーション産物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記ライゲーション産物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記ライゲーション産物配列及び前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを、デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルを実施するのに好適な条件に供し、それによって、二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記二次ポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定する段階と
含む、前記方法。 A method for identifying one or more target miRNA molecules in a sample that differ in sequence by one or more bases from other microribonucleic acid (miRNA) molecules in the sample, the method comprising:
providing a sample comprising one or more target miRNA molecules that potentially differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
blending the contacted sample with ATP and poly(A) polymerase to form a poly(A) polymerase reaction mixture;
subjecting the poly(A) polymerase reaction mixture to conditions suitable for adding homopolymer A to the 3' ends of the one or more target miRNA molecules potentially present in the sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primer set comprising (a) a first primary oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion, an internal poly dT portion, and said said first primary oligonucleotide primer comprising a 3′ portion comprising 1-10 bases complementary to said 3′ end of the target miRNA, which may be the same or different from other first primary oligonucleotide primers of the other sets; 1 primary oligonucleotide primer, and (b) a second primary oligonucleotide primer, comprising a 5′ primer-specific portion and a 3′ portion, the same as other second primary oligonucleotide primers in other sets providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising said second primary oligonucleotide primers, which may be different from or
said poly(A) polymerase reaction mixture, said one or more primary oligonucleotide primer sets, deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules in said sample to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures; blending the one or more enzymes capable of digestion, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a reverse transcriptase and a DNA polymerase or a DNA polymerase having reverse transcriptase activity;
subjecting said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable for digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said reverse transcription/polymerase chain reaction mixture; and conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles comprising denaturation, hybridization, and extension treatments. thereby providing the 5′ primer-specific portion of the second primary oligonucleotide primer, a nucleotide sequence corresponding to the target miRNA molecule sequence, a poly dA region, and the 5 of the first primary oligonucleotide primer. 'forming the complement of the primer specific portion and one or more different reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising the complement;
providing one or more oligonucleotide probe sets, each probe set comprising (a) a first oligonucleotide probe having a 5′ primer-specific portion and a 3′ target sequence-specific portion; and (b) ) a second oligonucleotide probe having a 5′ target sequence-specific portion, a portion complementary to said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction products, and a 3′ primer-specific portion; First and second oligonucleotide probes hybridize in a base-specific manner to complementary portions of said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction products corresponding to said target miRNA molecule sequence or its complement. providing the one or more oligonucleotide probe sets configured to;
contacting said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction products with a ligase and said one or more oligonucleotide probe sets to form one or more ligation reaction mixtures;
subjecting the one or more ligation reaction mixtures to one or more ligation reaction cycles, whereby the first and second oligonucleotide probes of the one or more oligonucleotide probe sets are ligated together to form ligation product sequences in said ligation reaction mixture, wherein each ligation product sequence comprises said 5′ primer-specific portion, said target-specific subjecting the one or more second ligation reaction mixtures comprising the target portion and the 3′ primer specific portion to one or more ligation reaction cycles;
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set comprising (a) the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said ligation product sequence; and (b) a second secondary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to the 3′ primer-specific portion of the ligation product sequence. providing a nucleotide primer set;
The ligation product sequences and the one or more secondary oligonucleotide primer sets can be digested with deoxyuracil (dU) containing nucleic acid molecules to form one or more first polymerase chain reaction mixtures. blending with one or more enzymes, a deoxynucleotide mix containing dUTP, and a DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more first polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixtures, as well as denaturation treatments, hybridization treatments , and elongation, to conditions suitable for performing one or more polymerase chain reaction cycles, thereby forming a secondary polymerase chain reaction product;
detecting and identifying said secondary polymerase chain reaction products, thereby identifying one or more target miRNA molecules that differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in said sample; the aforementioned method. 試料中で、前記試料中の他のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定するための方法であって、前記方法が、
前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が潜在的に異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を含む試料を提供する段階と、
前記試料中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素を提供する段階と、
前記試料を、前記試料中に潜在的に存在するｄＵ含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素と接触させる段階と、
ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物を形成するために、前記接触させた試料をＡＴＰ及びポリ（Ａ）ポリメラーゼとブレンドする段階と、
前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物を、ホモポリマーＡを前記試料中に潜在的に存在する前記１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子の前記３’末端に付加するのに好適な条件に供する段階と、
１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各プライマーセットが、（ａ）第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーであって、５’プライマー特異的部分、内部ポリｄＴ部分、及び前記標的ｍｉＲＮＡの前記３’末端に相補的な１～１０塩基を含む３’部分を含み、他のセットの他の第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーであって、５’プライマー特異的部分及び３’部分を含み、他のセットの他の第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じであっても異なっていてもよい、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、３’ポリＡテールを有する標的ｍｉＲＮＡ配列を潜在的に含む前記ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応混合物、前記１つ以上の一次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、ならびに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、３’ポリＡテールを有する前記標的ｍｉＲＮＡ配列に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子を生成するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、前記第２の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列に対応するヌクレオチド配列、ポリｄＡ領域、及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’プライマー特異的部分の相補体、及びその相補体を含む１つ以上の異なる逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各二次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の一次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的な３’部分を有する第１の二次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）５’プライマー特異的部分及び前記第１の二次オリゴヌクレオチドプライマーから形成される逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む３’部分を有する第２の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、デオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む２回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、５’プライマー特異的部分、前記標的ｍｉＲＮＡ分子配列またはその相補体に対応するヌクレオチド配列、及び他の５’プライマー特異的部分の相補体を含む第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階であって、各三次オリゴヌクレオチドプライマーセットが、（ａ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物配列の前記５’プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む第１の三次オリゴヌクレオチドプライマー、及び（ｂ）前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物配列の前記３’プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の三次オリゴヌクレオチドプライマーを含む、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセットを提供する段階と、
１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応生成物、前記１つ以上の三次オリゴヌクレオチドプライマーセット、前記デオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化することができる１つ以上の酵素、ｄＵＴＰを含むデオキシヌクレオチドミックス、及びＤＮＡポリメラーゼをブレンドする段階と、
前記１つ以上の第２のポリメラーゼ連鎖反応混合物を、前記第１のポリメラーゼ連鎖反応混合物中に存在するデオキシウラシル（ｄＵ）含有核酸分子を消化するのに好適な条件、ならびに変性処理、ハイブリダイゼーション処理、及び伸長処理を含む１回以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに好適な条件に供し、それによって、第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を形成する段階と、
前記１つ以上の反応物中の前記第２のポリメラーゼ連鎖反応生成物を検出及び識別し、それによって、前記試料中の他のｍｉＲＮＡ分子とは１つ以上の塩基によって配列が異なる１つ以上の標的ｍｉＲＮＡ分子を特定する段階と
含む、前記方法。 A method for identifying one or more target miRNA molecules in a sample that differ in sequence by one or more bases from other microribonucleic acid (miRNA) molecules in the sample, the method comprising:
providing a sample comprising one or more target miRNA molecules that potentially differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in the sample;
providing one or more enzymes capable of digesting deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in said sample;
contacting the sample with one or more enzymes capable of digesting dU-containing nucleic acid molecules potentially present in the sample;
blending the contacted sample with ATP and poly(A) polymerase to form a poly(A) polymerase reaction mixture;
subjecting the poly(A) polymerase reaction mixture to conditions suitable for adding homopolymer A to the 3' ends of the one or more target miRNA molecules potentially present in the sample;
providing one or more primary oligonucleotide primer sets, each primer set comprising (a) a first primary oligonucleotide primer comprising a 5′ primer-specific portion, an internal poly dT portion, and said said first primary oligonucleotide primer comprising a 3′ portion comprising 1-10 bases complementary to said 3′ end of the target miRNA, which may be the same or different from other first primary oligonucleotide primers of the other sets; 1 primary oligonucleotide primer, and (b) a second primary oligonucleotide primer, comprising a 5′ primer-specific portion and a 3′ portion, the same as other second primary oligonucleotide primers in other sets providing said one or more primary oligonucleotide primer sets comprising said second primary oligonucleotide primers, which may be different from or
said poly(A) polymerase reaction mixture potentially containing a target miRNA sequence with a 3′ poly A tail, said one or more primary oligonucleotide primers, to form one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures blending a set, a deoxynucleotide mix, and a reverse transcriptase and a DNA polymerase or a DNA polymerase with reverse transcriptase activity;
subjecting said one or more reverse transcription/polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable to produce deoxyribonucleic acid (cDNA) molecules complementary to said target miRNA sequences with 3' poly A tails, and denaturation, hybridization, subject to conditions suitable for one or more polymerase chain reaction cycles, including treatment and extension, thereby said 5' primer-specific portion of said second primary oligonucleotide primer, corresponding to said target miRNA molecule sequence. forming one or more different reverse transcription/polymerase chain reaction products comprising a nucleotide sequence, a poly dA region, and the complement of said 5' primer-specific portion of said first primary oligonucleotide primer and its complement stages and
providing one or more secondary oligonucleotide primer sets, each secondary oligonucleotide primer set formed from (a) a 5′ primer-specific portion and the first primary oligonucleotide primer; a first secondary oligonucleotide primer having a 3' portion complementary to a portion of the transcription/polymerase chain reaction product; and (b) a 5' primer-specific portion and formed from said first secondary oligonucleotide primer. providing said one or more secondary oligonucleotide primer sets comprising a second secondary oligonucleotide primer having a 3′ portion comprising a nucleotide sequence complementary to a portion of the reverse transcription/polymerase chain reaction product to be and
blending the reverse transcription/polymerase chain reaction product, the one or more secondary oligonucleotide primer sets, the deoxynucleotide mix, and a DNA polymerase to form one or more first polymerase chain reaction mixtures; and,
subjecting the one or more first polymerase chain reaction mixtures to conditions suitable for two or more polymerase chain reaction cycles comprising denaturation, hybridization, and extension treatments, whereby the 5' primer-specific portion is , forming a first polymerase chain reaction product comprising a nucleotide sequence corresponding to said target miRNA molecule sequence or its complement, and the complement of another 5′ primer-specific portion;
providing one or more tertiary oligonucleotide primer sets, each tertiary oligonucleotide primer set (a) having the same nucleotide sequence as said 5′ primer specific portion of said first polymerase chain reaction product sequence; and (b) a second tertiary oligonucleotide primer comprising a nucleotide sequence complementary to said 3′ primer-specific portion of said first polymerase chain reaction product sequence; providing said one or more tertiary oligonucleotide primer sets;
digesting said first polymerase chain reaction product, said one or more tertiary oligonucleotide primer sets, said deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecule to form one or more second polymerase chain reaction mixtures blending one or more enzymes capable of deoxynucleotide mix, dUTP, and DNA polymerase;
Conditions suitable for digesting the one or more second polymerase chain reaction mixtures with deoxyuracil (dU)-containing nucleic acid molecules present in the first polymerase chain reaction mixture, as well as denaturation treatments, hybridization treatments and one or more polymerase chain reaction cycles comprising elongation, thereby forming a second polymerase chain reaction product;
detecting and identifying said second polymerase chain reaction product in said one or more reactions, thereby producing one or more miRNA molecules that differ in sequence by one or more bases from other miRNA molecules in said sample; identifying the target miRNA molecule.
JP2021565022A 2019-05-03 2020-05-01 Markers for identifying and quantifying mutations, expression, splice variants, translocations, copy counts, or methylation changes in nucleic acid sequences Pending JP2022530920A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962843032P 2019-05-03 2019-05-03
US62/843,032 2019-05-03
PCT/US2020/031044 WO2020227100A1 (en) 2019-05-03 2020-05-01 Markers for identifying and quantifying of nucleic acid sequence mutation, expression, splice variant, translocation, copy number, or methylation changes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022530920A JP2022530920A (en) 2022-07-04
JPWO2020227100A5 true JPWO2020227100A5 (en) 2023-03-13

Family

ID=73050598

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021565022A Pending JP2022530920A (en) 2019-05-03 2020-05-01 Markers for identifying and quantifying mutations, expression, splice variants, translocations, copy counts, or methylation changes in nucleic acid sequences

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220243263A1 (en)
EP (1) EP3963095A4 (en)
JP (1) JP2022530920A (en)
CN (1) CN115244188A (en)
AU (1) AU2020268885A1 (en)
BR (1) BR112021022084A2 (en)
CA (1) CA3135726A1 (en)
IL (1) IL287804A (en)
SG (1) SG11202112246UA (en)
WO (1) WO2020227100A1 (en)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022140793A1 (en) * 2020-12-24 2022-06-30 Life Technologies Corporation Compositions and methods for highly sensitive detection of target sequences in multiplex reactions
CA3211005A1 (en) * 2021-03-05 2022-09-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting cervical cancer
WO2022246000A1 (en) * 2021-05-19 2022-11-24 City Of Hope Compositions and methods for determining dna methylation level in cancer
WO2023017001A1 (en) * 2021-08-09 2023-02-16 Epigenomics Ag Improved methods for detecting colorectal cancer
WO2024064369A1 (en) * 2022-09-23 2024-03-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods for amplifying nucleic acids

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60031253D1 (en) * 1999-03-19 2006-11-23 Cornell Res Foundation Inc METHODS BASED ON THE COUPLED REACTIONS OF THE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) DIGESTATION WITH RESTRICTIVE ENZYMS AND LIGAS DETECTION
WO2013123220A1 (en) * 2012-02-14 2013-08-22 Cornell University Method for relative quantification of nucleic acid sequence, expression, or copy changes, using combined nuclease, ligation, and polymerase reactions
WO2014043763A1 (en) * 2012-09-20 2014-03-27 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
WO2015023285A1 (en) * 2013-08-15 2015-02-19 Xia Xueliang James Biomarkers for use in colorectal cancer
ES2784342T3 (en) * 2014-10-08 2020-09-24 Univ Cornell Method for the identification and quantification of changes in nucleic acid expression, splice variants, translocation, copy number or methylation
US10030272B2 (en) * 2015-02-27 2018-07-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting gastrointestinal neoplasms
WO2016154337A2 (en) * 2015-03-23 2016-09-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method for identification and enumeration of nucleic acid sequences, expression, splice variant, translocation, copy, or dna methylation changes using combined nuclease, ligase, polymerase, terminal transferase, and sequencing reactions
GB201511152D0 (en) * 2015-06-24 2015-08-05 Ucl Business Plc Method of diagnosing bladder cancer
WO2018087129A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Region Nordjylland, Aalborg University Hospital Colorectal cancer methylation markers
WO2019068082A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Dna methylation biomarkers for cancer diagnosing

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6673562B2 (en) Epigenetic marker for colorectal cancer and diagnostic method using the marker
Bibikova et al. Genome-wide DNA methylation profiling using Infinium® assay
US11840739B2 (en) Gene composition for detecting cell proliferative abnormality or grading disease degree and use thereof
US20100273151A1 (en) Genome-wide analysis of palindrome formation and dna methylation
US20070231797A1 (en) Methods and compositions for diagnosing lung cancer with specific DNA methylation patterns
US20220243263A1 (en) Markers for identifying and quantifying of nucleic acid sequence mutation, expression, splice variant, translocation, copy number, or methylation changes
WO2016019900A1 (en) Multielement gene composition and use therefor
KR20210099044A (en) Characterization of Methylated DNA, RNA, and Proteins in Pulmonary Neoplasia Detection
WO2015132615A1 (en) Enriching a sample of circulating cell-free nucleic acids
GB2611639A (en) Method for identification and relative quantification of nucleic acid sequence, mutation, copy number, or methylation changes
KR20180108820A (en) Genetic profiling of cancer
WO2009094312A2 (en) Detection of gstp1 hypermethylation in prostate cancer
WO2020227127A2 (en) Method and markers for identifying and quantifying of nucleic acid sequence, mutation, copy number, or methylation changes using combinations of nuclease, ligation, dna repair, and polymerase reactions with carryover prevention
CN116219020B (en) Methylation reference gene and application thereof
JPWO2020227100A5 (en)
JPWO2020112869A5 (en)
EP2140028A1 (en) Method of nucleic acid analysis to analyze the methylation pattern of cpg islands in different samples
AU2015258259A1 (en) Epigenetic markers of colorectal cancers and diagnostic methods using the same
US20080213781A1 (en) Methods of detecting methylation patterns within a CpG island
CN118048451A (en) Marker for screening liver cancer, probe composition and application thereof
TW202417642A (en) Methylation markers for identifying cancer and the applications
KR20230105973A (en) COMPOSITION FOR DIAGNOSING PROSTATE ADENOCARCINOMA USING CpG METHYLATION STATUS OF SPECIFIC GENE AND USES THEREOF