JPWO2020223535A5 - - Google Patents
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Description
TGFBR2遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；ならびに、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該組換え受容体または断片、例えば、その抗原結合断片、ドメイン、および/または鎖をコードする導入遺伝子が、相同性指向修復（HDR）を介した標的部位でのまたはその近くでの組み込みのためにターゲティングされる、ポリヌクレオチド；ならびに、本明細書で提供される態様のいずれかの方法を実施するための説明書、を含むキットが、本明細書において提供される。
[本発明1001]
改変されたトランスフォーミング増殖因子β受容体2型（TGFBR2）遺伝子座を含む、遺伝子操作されたT細胞であって、該改変されたTGFBR2遺伝子座が、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子配列を含む、前記遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1002]
前記導入遺伝子配列が、任意で相同性指向修復（HDR）を介して、T細胞の内在性TGFBR2遺伝子座に組み込まれている、本発明1001の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1003]
前記改変されたTGFBR2遺伝子座が、
機能的なTGFBRIIポリペプチドをコードしない；
TGFBRIIポリペプチドをコードしないか、またはTGFBRIIポリペプチドの発現が排除されている；
完全長TGFBRIIポリペプチドをコードしない；および/あるいは
ドミナントネガティブTGFBRIIポリペプチドをコードし、任意で、該ドミナントネガティブTGFBRIIポリペプチドが、SEQ ID NO:59の残基22～191もしくはSEQ ID NO:60の残基22～216に対応するアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:59の残基22～191もしくはSEQ ID NO:60の残基22～216に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれよりも高い配列同一性を示す配列、またはその断片を含む、
本発明1001または1002の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1004]
前記導入遺伝子配列が、内在性TGFBR2のオープンリーディングフレームの1つもしくは複数のエクソンまたはその部分配列とインフレームである、本発明1001～1003のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1005]
前記導入遺伝子配列が、内在性TGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン1の下流かつエクソン6の上流にある、本発明1001～1004のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1006]
前記導入遺伝子配列が、内在性TGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン4の下流かつエクソン6の上流にある、本発明1001～1005のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1007]
前記組換え受容体が、組換えT細胞受容体（TCR）であるかまたはそれを含み、前記導入遺伝子配列が、TCRアルファ（TCRα）鎖、TCRベータ（TCRβ）鎖、または両方をコードする、本発明1001～1006のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1008]
前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）であり、該CARが、結合ドメインを含む細胞外領域と、膜貫通ドメインと、細胞内領域とを含む、本発明1001～1006のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1009]
前記結合ドメインが、抗体もしくはその抗原結合断片であるか、またはそれを含む、本発明1008の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1010]
前記結合ドメインが、ある疾患、障害、もしくは状態の細胞もしくは組織に関連している、それに特異的である、またはその上に発現している標的抗原に結合することができ、任意で、該標的抗原が腫瘍抗原である、本発明1008または1009の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1011]
前記標的抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される、本発明1010の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1012]
前記細胞外領域が、スペーサーを含み、任意で、該スペーサーが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に機能的に連結されている、本発明1008～1011のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1013]
前記スペーサーが、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびに/またはC
H
2領域およびC
H
3領域を含む、本発明1012の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1014]
前記細胞内領域が、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明1008～1013のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1015]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、もしくはそのシグナル伝達部分であるか、またはそれを含む、本発明1014の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1016]
前記細胞内領域が、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、本発明1008～1015のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1017]
前記1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28、4-1BB、もしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含む、本発明1016の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1018]
前記導入遺伝子配列が、順番に、結合ドメイン、任意で単鎖Fv断片（scFv）；ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を任意で含み、C
H
2領域および/またはC
H
3領域を任意でさらに含む、スペーサー；ならびに、任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達領域、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含み；かつ/あるいは
前記改変されたTGFBR2遺伝子座が、順番に、結合ドメイン、任意でscFv；ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を任意で含み、C
H
2領域および/またはC
H
3領域を任意でさらに含む、スペーサー；ならびに、任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達領域、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む、
本発明1001～1017のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1019]
前記導入遺伝子配列が、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む、本発明1001～1018のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1020]
前記少なくとも1つのさらなるタンパク質が、代用マーカーであり、任意で、該代用マーカーが、トランケートされた受容体であり、任意で、該トランケートされた受容体が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、かつ/またはそのリガンドが結合した場合に細胞内シグナル伝達を媒介することができない、本発明1019の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1021]
前記導入遺伝子配列が、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを含む、本発明1001～1020のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1022]
前記導入遺伝子配列が、組換え受容体またはその一部分をコードするヌクレオチドの配列を含み、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、組換え受容体もしくはその一部分をコードするヌクレオチドの配列の上流に位置づけられており；かつ/または、組換え受容体もしくはその一部分をコードするヌクレオチドの配列と、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/あるいは
前記組換え受容体が、TCRであり、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/あるいは
前記組換え受容体が、多鎖CARのCARであり、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている、
本発明1021の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1023]
前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、リボソームスキップ配列であるかまたはそれを含み、任意で、該リボソームスキップ配列が、T2A、P2A、E2A、またはF2Aエレメントである、本発明1021または1022の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1024]
前記改変されたTGFBR2遺伝子座が、組換え受容体またはその一部分をコードする導入遺伝子配列の発現を調節するために機能的に連結された内在性TGFBR2遺伝子座のプロモーターおよび/または制御もしくは調節エレメントを含むか；あるいは、前記改変されたTGFBR2遺伝子座が、組換え受容体またはその一部分の発現を調節するために機能的に連結された1つまたは複数の異種の制御または調節エレメントを含む、本発明1001～1023のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1025]
前記T細胞が、対象に由来する初代T細胞であり、任意で、該対象がヒトである、本発明1001～1024のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1026]
前記T細胞が、CD8+ T細胞もしくはそのサブタイプ、またはCD4+ T細胞もしくはそのサブタイプである、本発明1001～1025のいずれかの遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1027]
（a）組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列；および
（b）該核酸配列に連結された1つまたは複数の相同性アームであって、トランスフォーミング増殖因子β受容体2型（TGFBR2）遺伝子座のオープンリーディングフレームの1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、1つまたは複数の相同性アーム
を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1028]
（a）の核酸配列が、T細胞、任意でヒトT細胞の内在性TGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームにとって外来性または異種である配列である、本発明1027のポリヌクレオチド。
[本発明1029]
前記1つまたは複数の相同性アームが、T細胞、任意でヒトT細胞のTGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームの少なくとも1つのイントロンまたは少なくとも1つのエクソンを含む、本発明1027または1028のポリヌクレオチド。
[本発明1030]
（a）の核酸配列が、1つまたは複数の相同性アームに含まれるTGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームの1つまたは複数のエクソンとインフレームである、本発明1027～1029のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1031]
前記オープンリーディングフレームの1つまたは複数の領域が、TGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン1の下流にある配列であるか、またはそれを含む、本発明1027～1030のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1032]
前記オープンリーディングフレームの1つまたは複数の領域が、TGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン4の少なくとも一部分もしくはエクソン4の下流を含む配列であるか、またはそれを含む、本発明1027～1031のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1033]
前記1つまたは複数の相同性アームが、5'相同性アームおよび3'相同性アームを含み、前記ポリヌクレオチドが、構造[5'相同性アーム]-[(a)の核酸配列]-[3'相同性アーム]を含む、本発明1027～1032のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1034]
前記5'相同性アームおよび前記3'相同性アームが、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さまたは約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値であるか、あるいは、300ヌクレオチド超または約300ヌクレオチド超の長さ、任意で、400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さまたは約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、本発明1033のポリヌクレオチド。
[本発明1035]
前記5'相同性アームが、SEQ ID NO:69～71に示される配列、またはSEQ ID NO:69～71に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれよりも高い配列同一性を示す配列、またはその部分配列を含み、かつ/あるいは前記3'相同性アームが、SEQ ID NO:72に示される配列、またはSEQ ID NO:72に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれよりも高い配列同一性を示す配列、またはその部分配列を含む、本発明1033または1034のポリヌクレオチド。
[本発明1036]
コードされる組換え受容体が、組換えT細胞受容体（TCR）であるかまたはそれを含み、（a）の核酸配列が、TCRアルファ（TCRα）鎖、TCRベータ（TCRβ）鎖、または両方をコードする、本発明1027～1035のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1037]
コードされる組換え受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）であり、該CARが、結合ドメインを含む細胞外領域と、膜貫通ドメインと、細胞内領域とを含む、本発明1027～1035のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1038]
前記結合ドメインが、抗体もしくはその抗原結合断片であるか、またはそれを含む、本発明1037のポリヌクレオチド。
[本発明1039]
前記結合ドメインが、ある疾患、障害、もしくは状態の細胞もしくは組織に関連している、それに特異的である、またはその上に発現している標的抗原に結合することができ、任意で、該標的抗原が腫瘍抗原である、本発明1037または1038のポリヌクレオチド。
[本発明1040]
前記標的抗原が、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9；CAIXまたはG250としても知られている）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られている）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児抗原、黒色腫優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られている）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られている）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られている）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子の中から選択される、本発明1039のポリヌクレオチド。
[本発明1041]
前記細胞外領域が、スペーサーを含み、任意で、該スペーサーが、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に機能的に連結されている、本発明1037～1040のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1042]
前記スペーサーが、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびに/またはC
H
2領域およびC
H
3領域を含む、本発明1041のポリヌクレオチド。
[本発明1043]
前記細胞内領域が、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明1037～1042のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1044]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメイン、もしくはそのシグナル伝達部分であるか、またはそれを含む、本発明1043のポリヌクレオチド。
[本発明1045]
前記細胞内領域が、1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、本発明1037～1044のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1046]
前記1つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28、4-1BB、もしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそのシグナル伝達部分を含む、本発明1045のポリヌクレオチド。
[本発明1047]
（a）の核酸配列が、順番に、結合ドメイン、任意で単鎖Fv断片（scFv）；ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を任意で含み、C
H
2領域および/またはC
H
3領域を任意でさらに含む、スペーサー；ならびに、任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達領域、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む、本発明1027～1046のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1048]
（a）の核酸配列が、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含む、本発明1027～1047のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1049]
前記少なくとも1つのさらなるタンパク質が、代用マーカーであり、任意で、該代用マーカーが、トランケートされた受容体であり、任意で、該トランケートされた受容体が、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、かつ/またはそのリガンドが結合した場合に細胞内シグナル伝達を媒介することができない、本発明1048のポリヌクレオチド。
[本発明1050]
（a）の核酸配列が、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを含む、本発明1027～1049のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1051]
（a）の核酸配列が、組換え受容体またはその一部分をコードするヌクレオチドの配列を含み、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、組換え受容体もしくはその一部分をコードするヌクレオチドの配列の上流に位置づけられており；かつ/または、組換え受容体もしくはその一部分をコードするヌクレオチドの配列と、少なくとも1つのさらなるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/あるいは
前記組換え受容体がTCRであり、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/あるいは
前記組換え受容体が、多鎖CARのCARであり、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている、
本発明1050のポリヌクレオチド。
[本発明1052]
前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、リボソームスキップ配列であるかまたはそれを含み、任意で、該リボソームスキップ配列が、T2A、P2A、E2A、またはF2Aエレメントである、本発明1050または1051のポリヌクレオチド。
[本発明1053]
（a）の核酸配列が、組換え受容体またはその一部分の発現を調節するために機能的に連結された1つまたは複数の異種の制御または調節エレメントを含む、本発明1027～1052のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1054]
ウイルスベクター中に含まれる、本発明1027～1053のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1055]
前記ウイルスベクターがAAVベクターであり、任意で、該AAVベクターが、AAV2またはAAV6ベクターである、本発明1054のポリヌクレオチド。
[本発明1056]
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、任意でレンチウイルスベクターである、本発明1054のポリヌクレオチド。
[本発明1057]
直鎖ポリヌクレオチド、任意で二本鎖ポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドである、本発明1027～1053のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1058]
2500もしくは約2500から、5000もしくは約5000ヌクレオチド、3500もしくは約3500から、4500もしくは約4500ヌクレオチド、または3750もしくは約3750ヌクレオチドから、4250もしくは約4250ヌクレオチドの長さである、本発明1027～1057のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1059]
本発明1027～1058のいずれかのポリヌクレオチドを、TGFBR2遺伝子座に遺伝子破壊を含むT細胞中に導入する工程を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法。
[本発明1060]
（a）T細胞の内在性TGFBR2遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入する工程、および
（b）本発明1027～1058のいずれかのポリヌクレオチドを、TGFBR2遺伝子座に遺伝子破壊を含むT細胞中に導入する工程
を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法。
[本発明1061]
組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列が、相同性指向修復（HDR）を介して内在性TGFBR2遺伝子座内に組み込まれる、本発明1059または1060の方法。
[本発明1062]
組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを、T細胞中に導入する工程を含む、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法であって、該T細胞が、T細胞のTGFBR2遺伝子座内に遺伝子破壊を有し、該組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列が、相同性指向修復（HDR）を介して内在性TGFBR2遺伝子座内に組み込まれる、前記方法。
[本発明1063]
前記遺伝子破壊が、T細胞の内在性TGFBR2遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質を、T細胞中に導入することによって実施される、本発明1059、1061、および1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記方法が、T細胞において、改変されたTGFBR2遺伝子座を作製し、該改変されたTGFBR2遺伝子座が、組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含む、本発明1059～1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記ポリヌクレオチドが、前記核酸配列に連結された1つまたは複数の相同性アームをさらに含み、該1つまたは複数の相同性アームが、トランスフォーミング増殖因子β受容体2型（TGFBR2）遺伝子座のオープンリーディングフレームの1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、本発明1062～1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記方法によって生成された細胞において、改変されたTGFBR2遺伝子座が、
機能的なTGFBRIIポリペプチドを、前記方法によって生成された細胞においてコードしない；
TGFBRIIポリペプチドをコードしないか、もしくはTGFBRIIポリペプチドの発現が排除されている；および/または
完全長TGFBRIIポリペプチドをコードしないか、もしくはドミナントネガティブTGFBRIIポリペプチドをコードする、
本発明1059～1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記1つまたは複数の相同性アームが、5'相同性アームおよび3'相同性アームを含み、前記ポリヌクレオチドが、構造[5'相同性アーム]-[組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列]-[3'相同性アーム]を含む、本発明1065または1066の方法。
[本発明1068]
コードされる組換え受容体が、組換えT細胞受容体（TCR）であるか、またはそれを含む、本発明1059～1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
コードされる組換え受容体が、キメラ抗原受容体（CAR）である、本発明1059～1067のいずれかの方法。
[本発明1070]
遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質が、
標的部位に特異的に結合するかもしくはハイブリダイズするDNA結合タンパク質もしくはDNA結合核酸、DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼとを含む融合タンパク質、またはRNA誘導型ヌクレアーゼ
を含み、任意で、該1つまたは複数の作用物質が、
標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、または、およびCRISPR-Cas9の組み合わせ
を含む、本発明1060および1063～1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記1つまたは複数の作用物質が、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、本発明1060および1063～1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
前記1つまたは複数の作用物質が、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボ核タンパク質（RNP）複合体として導入され、任意で、該RNPが、電気穿孔、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞の圧縮または圧搾を介して、任意で電気穿孔を介して導入される、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記RNPの濃度が、1μMまたは約1μMから、5μMまたは約5μMであり、任意で、該RNPの濃度が、2μMまたは約2μMである、本発明1072の方法。
[本発明1074]
前記gRNAが、
[本発明1075]
前記T細胞が、対象に由来する初代T細胞であり、任意で、該対象がヒトである、本発明1059～1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
前記T細胞が、CD8+ T細胞もしくはそのサブタイプ、またはCD4+ T細胞もしくはそのサブタイプである、本発明1059～1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
前記ポリヌクレオチドが、ウイルスベクター中に含まれる、本発明1059～1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
前記ウイルスベクターがAAVベクターであり、任意で、該AAVベクターが、AAV2またはAAV6ベクターである、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記ポリヌクレオチドが、直鎖ポリヌクレオチド、任意で二本鎖ポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドである、本発明1059～1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
前記ポリヌクレオチドが、前記1つまたは複数の作用物質の導入の後に導入される、本発明1060および1063～1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
前記ポリヌクレオチドが、前記作用物質の導入の直後に、またはその後約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に導入される、本発明1080の方法。
[本発明1082]
前記1つまたは複数の作用物質の導入の前に、前記方法が、1つまたは複数の免疫細胞を刺激するかまたは活性化するための条件下で、細胞を、1つまたは複数の刺激物質とインビトロでインキュベートする工程を含み、任意で、該1つまたは複数の刺激物質が、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含み、任意で、ビーズ対細胞の比が、1:1であるかまたは約1:1である、本発明1060および1064～1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記方法が、前記1つもしくは複数の作用物質の導入および/または前記ポリヌクレオチドの導入の前に、その最中に、またはその後に、細胞を、1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする工程をさらに含み、任意で、該1つまたは複数の組換えサイトカインが、IL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択され、任意で、該1つまたは複数の組換えサイトカインが、10 U/mLもしくは約10 U/mLから、200 U/mLもしくは約200 U/mL、任意で50 IU/mLもしくは約50 IU/mLから、100 U/mLもしくは約100 U/mLのIL-2の濃度；0.5 ng/mL～50 ng/mL、任意で5 ng/mLもしくは約5 ng/mLから、10 ng/mLもしくは約10 ng/mLのIL-7の濃度；および/または0.1 ng/mL～20 ng/mL、任意で0.5 ng/mLもしくは約0.5 ng/mLから、5 ng/mLもしくは約5 ng/mLのIL-15の濃度から選択される濃度で添加される、本発明1060および1064～1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
インキュベーションが、前記1つまたは複数の作用物質の導入および前記ポリヌクレオチドの導入の後に、最大で24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21日間、またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、もしくは21日間、任意で最大で7日間または約7日間実施される、本発明1082または1083の方法。
[本発明1085]
前記方法によって生成された複数の操作された細胞中の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％の、または該細胞中の35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％超の細胞が、TGFBR2遺伝子座内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含み；かつ/あるいは、前記方法によって生成された複数の操作された細胞中の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％の、または該細胞中の35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％超の細胞が、組換え受容体を発現する、本発明1059～1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
本発明1059～1085のいずれかの方法を用いて生成された、遺伝子操作されたT細胞または複数の遺伝子操作されたT細胞。
[本発明1087]
本発明1001～1026および1086のいずれかの遺伝子操作されたT細胞または本発明1001～1026および1086のいずれかの複数の遺伝子操作されたT細胞を含む、組成物。
[本発明1088]
CD4+ T細胞および/またはCD8+ T細胞を含む、本発明1087の組成物。
[本発明1089]
CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が、1:3～3:1または約1:3～3:1、任意で1:1である、本発明1088の組成物。
[本発明1090]
組換え受容体を発現する細胞が、組成物中の全細胞のうちの、または組成物中の全CD4+ T細胞もしくはCD8+ T細胞のうちの、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれよりも多くを占める、本発明1087～1089のいずれかの組成物。
[本発明1091]
本発明1001～1026および1086～1090のいずれかの遺伝子操作されたT細胞、複数の遺伝子操作されたT細胞、または組成物を、ある疾患または障害を有する対象に投与する工程を含む、処置の方法。
[本発明1092]
ある疾患または障害の処置のための、本発明1001～1026および1086～1090のいずれかの遺伝子操作されたT細胞、複数の遺伝子操作されたT細胞、または組成物の、使用。
[本発明1093]
ある疾患または障害を処置するための薬剤の製造における、本発明1001～1026および1086～1090のいずれかの遺伝子操作されたT細胞、複数の遺伝子操作されたT細胞、または組成物の、使用。
[本発明1094]
ある疾患または障害の処置における使用のための、本発明1001～1026および1086～1090のいずれかの遺伝子操作されたT細胞、複数の遺伝子操作されたT細胞、または組成物。
[本発明1095]
前記疾患または障害が、がんまたは腫瘍である、本発明1091～1094のいずれかの方法、使用、または使用のための遺伝子操作されたT細胞、複数の遺伝子操作されたT細胞、もしくは組成物。
[本発明1096]
前記がんまたは腫瘍が、血液悪性腫瘍、任意でリンパ腫、白血病、または形質細胞悪性腫瘍である、本発明1095の方法、使用、または使用のための遺伝子操作されたT細胞、複数の遺伝子操作されたT細胞、もしくは組成物。
[本発明1097]
前記がんまたは腫瘍が、固形腫瘍であり、任意で、該固形腫瘍が、非小細胞肺がん（NSCLC）または頭頚部扁平上皮癌（HNSCC）である、本発明1095の方法、使用、または使用のための遺伝子操作されたT細胞、複数の遺伝子操作されたT細胞、もしくは組成物。
[本発明1098]
TGFBR2遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；および
本発明1027～1058のいずれかのポリヌクレオチド
を含む、キット。
[本発明1099]
TGFBR2遺伝子座内の標的部位で遺伝子破壊を誘導することができる1つまたは複数の作用物質；および
組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列が、相同性指向修復（HDR）を介した標的部位でのまたはその近くでの組み込みのためにターゲティングされる、ポリヌクレオチド；および
本発明1059～1085のいずれかの方法を実施するための説明書
を含む、キット。
one or more agents capable of inducing gene disruption at a target site within the TGFBR2 locus; and a nucleic acid sequence encoding a recombination receptor or a portion thereof, said recombination receptor comprising Transgenes encoding bodies or fragments, e.g., antigen-binding fragments, domains, and/or chains thereof, are targeted for integration at or near the target site via homology-directed repair (HDR) , polynucleotides; and instructions for practicing the methods of any of the aspects provided herein.
[Invention 1001]
A genetically engineered T cell comprising an altered transforming growth factor beta receptor type 2 (TGFBR2) locus, wherein the altered TGFBR2 locus encodes a recombinant receptor or a portion thereof. Said genetically engineered T cell comprising a gene sequence.
[Invention 1002]
1001. The genetically engineered T cell of invention 1001, wherein said transgene sequence has integrated into the T cell's endogenous TGFBR2 locus, optionally via homology-directed repair (HDR).
[Invention 1003]
wherein the modified TGFBR2 locus is
does not encode a functional TGFBRII polypeptide;
does not encode a TGFBRII polypeptide or eliminates expression of a TGFBRII polypeptide;
does not encode a full-length TGFBRII polypeptide; and/or
an amino acid sequence encoding a dominant negative TGFBRII polypeptide, optionally wherein the dominant negative TGFBRII polypeptide corresponds to residues 22-191 of SEQ ID NO:59 or residues 22-216 of SEQ ID NO:60; or at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% to an amino acid sequence corresponding to residues 22-191 of SEQ ID NO:59 or residues 22-216 of SEQ ID NO:60; comprising sequences exhibiting 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater sequence identity, or fragments thereof;
A genetically engineered T cell of the invention 1001 or 1002.
[Invention 1004]
1003. The engineered T cell of any of inventions 1001-1003, wherein said transgene sequence is in-frame with one or more exons of an endogenous TGFBR2 open reading frame or a partial sequence thereof.
[Invention 1005]
1004. The engineered T cell of any of inventions 1001-1004, wherein said transgene sequence is downstream of exon 1 and upstream of exon 6 of the open reading frame of the endogenous TGFBR2 locus.
[Invention 1006]
1005. The engineered T cell of any of inventions 1001-1005, wherein said transgene sequence is downstream of exon 4 and upstream of exon 6 of the open reading frame of the endogenous TGFBR2 locus.
[Invention 1007]
said recombinant receptor is or comprises a recombinant T-cell receptor (TCR) and said transgene sequence encodes a TCR alpha (TCRα) chain, a TCR beta (TCRβ) chain, or both; The genetically engineered T cell of any of inventions 1001-1006.
[Invention 1008]
1006. Any of inventions 1001-1006, wherein said recombinant receptor is a chimeric antigen receptor (CAR), said CAR comprising an extracellular region comprising a binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular region. genetically engineered T cells.
[Invention 1009]
The genetically engineered T cell of the invention 1008, wherein said binding domain is or comprises an antibody or antigen binding fragment thereof.
[Invention 1010]
Said binding domain is capable of binding a target antigen associated with, specific for, or expressed on a cell or tissue of a disease, disorder, or condition; The genetically engineered T cell of invention 1008 or 1009, wherein the antigen is a tumor antigen.
[Invention 1011]
said target antigen is αvβ6 integrin (avb6 integrin), B cell maturation antigen (BCMA), B7-H3, B7-H6, carbonic anhydrase 9 (CA9; also known as CAIX or G250), cancer testis antigen , cancer/testis antigen 1B (CTAG; also known as NY-ESO-1 and LAGE-2), carcinoembryonic antigen (CEA), cyclins, cyclin A2, CC motif chemokine ligand 1 (CCL-1) , CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, chondroitin sulfate proteoglycan 4 (CSPG4), epidermal growth factor protein (EGFR), III type epidermal growth factor receptor mutation (EGFR vIII), epidermal glycoprotein 2 (EPG-2), epidermal glycoprotein 40 (EPG-40), ephrin B2, ephrin receptor A2 (EPHa2), estrogen receptor, Fc receptor like 5 (FCRL5; also known as Fc receptor homolog 5 or FCRH5), fetal acetylcholine receptor (fetal AchR), folate binding protein (FBP), folate receptor alpha, ganglioside GD2, O-acetylated GD2 ( OGD2), ganglioside GD3, glycoprotein 100 (gp100), glypican-3 (GPC3), G protein-coupled receptor class C group 5 member D (GPRC5D), Her2/neu (receptor tyrosine kinase erb-B2), Her3 ( erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB dimer, human high molecular weight-melanoma-associated antigen (HMW-MAA), hepatitis B surface antigen, human leukocyte antigen A1 (HLA-A1), human leukocyte antigen A2 (HLA-A2), IL-22 receptor alpha (IL-22Rα), IL-13 receptor alpha 2 (IL-13Rα2), kinase insert domain receptor (kdr), kappa light chain, L1 cell adhesion molecule ( L1-CAM), CE7 epitope of L1-CAM, leucine-rich repeat-containing 8 family member A (LRRC8A), Lewis Y, melanoma-associated antigen (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesothelin (MSLN), c-Met, mouse cytomegalovirus (CMV), mucin 1 (MUC1), MUC16, natural killer group 2 member D (NKG2D) ligand, Melan A (MART-1), neural cell adhesion molecule (NCAM) , oncofetal antigen, preferentially expressed melanoma antigen (PRAME), progesterone receptor, prostate-specific antigen, prostate stem cell antigen (PSCA), prostate-specific membrane antigen (PSMA), receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 ( ROR1), survivin, trophoblast glycoprotein (TPBG; also known as 5T4), tumor-associated glycoprotein 72 (TAG72), tyrosinase-related protein 1 (TRP1; also known as TYRP1 or gp75), tyrosinase-related protein 2 (TRP2; also known as dopachrome tautomerase, dopachrome delta-isomerase, or DCT), vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2), Wilms tumor 1 ( WT-1), pathogen-specific or pathogen-expressed antigens, or antigens associated with universal tags, and/or biotinylated molecules, and/or molecules expressed by HIV, HCV, HBV, or other pathogens A genetically engineered T cell of the invention 1010 that is selected.
[Invention 1012]
1011. The genetically engineered T cell of any of inventions 1008-1011, wherein said extracellular region comprises a spacer, optionally wherein said spacer is operably linked between the binding domain and the transmembrane domain. .
[Invention 1013]
The engineered T cell of the invention 1012, wherein said spacer comprises an immunoglobulin hinge region, and/or C H 2 and C H 3 regions.
[Invention 1014]
The engineered T cell of any of inventions 1008-1013, wherein said intracellular region comprises an intracellular signaling domain.
[Invention 1015]
The engineered T of the invention 1014, wherein said intracellular signaling domain is or comprises the intracellular signaling domain of the CD3 chain, optionally the CD3-zeta (CD3ζ) chain, or a signaling portion thereof. cell.
[Invention 1016]
The engineered T cell of any of inventions 1008-1015, wherein said intracellular region comprises one or more co-stimulatory signaling domains.
[Invention 1017]
1016. The genetically engineered T cell of invention 1016, wherein said one or more co-stimulatory signaling domains comprise an intracellular signaling domain of CD28, 4-1BB, or ICOS, or a signaling portion thereof.
[Invention 1018]
said transgene sequences, in order, optionally comprising a binding domain, optionally a single chain Fv fragment (scFv); optionally a sequence derived from a human immunoglobulin hinge, optionally IgG1, IgG2, or IgG4, or a modified version thereof; and a transmembrane domain, optionally from human CD28; a co-stimulatory signaling domain, optionally from human 4-1BB; and a cell, optionally further comprising a CH2 region and/or a CH3 region ; comprising a sequence of nucleotides encoding an internal signaling region, optionally the CD3 zeta chain or a portion thereof; and/or
wherein said modified TGFBR2 locus, in turn, comprises a binding domain, optionally a scFv; a sequence from a human immunoglobulin hinge, optionally from an IgG1, IgG2, or IgG4, or a modified version thereof, and C H 2 and/or a transmembrane domain, optionally from human CD28; a co-stimulatory signaling domain, optionally from human 4-1BB; and intracellular signaling. comprising a sequence of nucleotides encoding the region, optionally the CD3 zeta chain or a portion thereof;
A genetically engineered T cell of any of the inventions 1001-1017.
[Invention 1019]
The engineered T cell of any of the inventions 1001-1018, wherein said transgene sequence comprises a sequence of nucleotides encoding at least one additional protein.
[Invention 1020]
said at least one further protein is a surrogate marker, optionally said surrogate marker is a truncated receptor, optionally said truncated receptor lacks an intracellular signaling domain, and/ or a genetically engineered T cell of the invention 1019 that is incapable of mediating intracellular signaling when bound by its ligand.
[Invention 1021]
The engineered T cell of any of the inventions 1001-1020, wherein said transgene sequence comprises one or more multicistronic elements.
[Invention 1022]
wherein said transgene sequence comprises a sequence of nucleotides encoding a recombinant receptor or a portion thereof, and wherein said one or more multicistronic elements are upstream of the sequence of nucleotides encoding a recombinant receptor or a portion thereof; and/or between a sequence of nucleotides encoding the recombinant receptor or a portion thereof and a sequence of nucleotides encoding at least one additional protein; and/or
said recombinant receptor is a TCR and said one or more multicistronic elements are located between a sequence of nucleotides encoding TCRα and a sequence of nucleotides encoding TCRβ; and/ or
The recombinant receptor is a CAR of a multi-chain CAR, and the one or more multicistronic elements comprise a sequence of nucleotides encoding one chain of the multi-chain CAR and another chain of the multi-chain CAR. positioned between the sequence of nucleotides encoding
A genetically engineered T cell of the invention 1021.
[Invention 1023]
of the invention 1021 or 1022, wherein said one or more multicistronic elements are or comprise a ribosome skip sequence, optionally said ribosome skip sequence is a T2A, P2A, E2A, or F2A element genetically engineered T cells.
[Invention 1024]
Said modified TGFBR2 locus comprises an endogenous TGFBR2 locus promoter and/or control or regulatory element operably linked to regulate expression of a transgene sequence encoding a recombinant receptor or a portion thereof. alternatively, said modified TGFBR2 locus comprises one or more heterologous control or regulatory elements operably linked to regulate expression of the recombinant receptor or portion thereof. A genetically engineered T cell of any of 1001-1023.
[Invention 1025]
1024. The genetically engineered T cell of any of the inventions 1001-1024, wherein said T cell is a primary T cell derived from a subject, optionally said subject is human.
[Invention 1026]
The genetically engineered T cell of any of the inventions 1001-1025, wherein said T cell is a CD8+ T cell or subtype thereof, or a CD4+ T cell or subtype thereof.
[Invention 1027]
(a) a nucleic acid sequence encoding a recombinant receptor or portion thereof; and
(b) one or more homology arms linked to said nucleic acid sequence, which are homologous to one or more regions of the open reading frame of the transforming growth factor beta receptor type 2 (TGFBR2) locus; one or more homology arms containing the sequence
A polynucleotide.
[Invention 1028]
1027. The polynucleotide of the invention 1027, wherein the nucleic acid sequence of (a) is a sequence that is foreign or heterologous to the open reading frame of the endogenous TGFBR2 locus of T cells, optionally human T cells.
[Invention 1029]
The polynucleotide of the invention 1027 or 1028, wherein said one or more homology arms comprise at least one intron or at least one exon of the open reading frame of the TGFBR2 locus of T cells, optionally human T cells.
[Invention 1030]
The polynucleotide of any of Inventions 1027-1029, wherein the nucleic acid sequence of (a) is in frame with one or more exons of the open reading frame of the TGFBR2 locus contained in one or more homology arms. .
[Invention 1031]
1030. The polynucleotide of any of inventions 1027-1030, wherein one or more regions of said open reading frame is or comprises a sequence that is downstream of exon 1 of the open reading frame of the TGFBR2 locus.
[Invention 1032]
Any of the inventions 1027-1031, wherein one or more regions of said open reading frame is or comprises a sequence comprising at least part of exon 4 or downstream of exon 4 of the open reading frame of the TGFBR2 locus. some polynucleotides.
[Invention 1033]
The one or more homology arms comprise a 5' homology arm and a 3' homology arm, and the polynucleotide has the structure [5' homology arm]-[nucleic acid sequence of (a)]-[3 'homology arms].
[Invention 1034]
said 5' homology arm and said 3' homology arm are independently 200, 300, 400, 500, 600, 700, or 800 nucleotides in length or about 200, 300, 400, 500, 600, 700 or 800 nucleotides in length, or any value between any of the foregoing, or greater than or about 300 nucleotides in length, optionally 400, 500, or 600 nucleotides in length or a polynucleotide of the invention 1033 that is about 400, 500, or 600 nucleotides in length, or any value in between any of the foregoing.
[Invention 1035]
wherein said 5' homology arm is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% to the sequences set forth in SEQ ID NOs:69-71 or SEQ ID NOs:69-71; comprising sequences exhibiting 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater sequence identity, or subsequences thereof, and/or said the 3' homology arm is at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% to the sequence shown in SEQ ID NO:72 or to SEQ ID NO:72 , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or greater sequence identity, or a polynucleotide of the invention 1033 or 1034, comprising a sequence, or a subsequence thereof.
[Invention 1036]
The encoded recombinant receptor is or comprises a recombinant T-cell receptor (TCR) and the nucleic acid sequence of (a) comprises a TCR alpha (TCRα) chain, a TCR beta (TCRβ) chain, or both The polynucleotide of any of the invention 1027-1035, which encodes a
[Invention 1037]
of Invention 1027-1035, wherein the encoded recombinant receptor is a chimeric antigen receptor (CAR), the CAR comprising an extracellular region comprising a binding domain, a transmembrane domain, and an intracellular region. any polynucleotide.
[Invention 1038]
1037. The polynucleotide of the invention 1037, wherein said binding domain is or comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof.
[Invention 1039]
Said binding domain is capable of binding a target antigen associated with, specific for, or expressed on a cell or tissue of a disease, disorder, or condition; The polynucleotide of the invention 1037 or 1038, wherein the antigen is a tumor antigen.
[Invention 1040]
said target antigen is αvβ6 integrin (avb6 integrin), B cell maturation antigen (BCMA), B7-H3, B7-H6, carbonic anhydrase 9 (CA9; also known as CAIX or G250), cancer testis antigen , cancer/testis antigen 1B (CTAG; also known as NY-ESO-1 and LAGE-2), carcinoembryonic antigen (CEA), cyclins, cyclin A2, CC motif chemokine ligand 1 (CCL-1) , CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, chondroitin sulfate proteoglycan 4 (CSPG4), epidermal growth factor protein (EGFR), III type epidermal growth factor receptor mutation (EGFR vIII), epidermal glycoprotein 2 (EPG-2), epidermal glycoprotein 40 (EPG-40), ephrin B2, ephrin receptor A2 (EPHa2), estrogen receptor, Fc receptor like 5 (FCRL5; also known as Fc receptor homolog 5 or FCRH5), fetal acetylcholine receptor (fetal AchR), folate binding protein (FBP), folate receptor alpha, ganglioside GD2, O-acetylated GD2 ( OGD2), ganglioside GD3, glycoprotein 100 (gp100), glypican-3 (GPC3), G protein-coupled receptor class C group 5 member D (GPRC5D), Her2/neu (receptor tyrosine kinase erb-B2), Her3 ( erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB dimer, human high molecular weight-melanoma-associated antigen (HMW-MAA), hepatitis B surface antigen, human leukocyte antigen A1 (HLA-A1), human leukocyte antigen A2 (HLA-A2), IL-22 receptor alpha (IL-22Rα), IL-13 receptor alpha 2 (IL-13Rα2), kinase insert domain receptor (kdr), kappa light chain, L1 cell adhesion molecule ( L1-CAM), CE7 epitope of L1-CAM, leucine-rich repeat-containing 8 family member A (LRRC8A), Lewis Y, melanoma-associated antigen (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesothelin (MSLN), c-Met, mouse cytomegalovirus (CMV), mucin 1 (MUC1), MUC16, natural killer group 2 member D (NKG2D) ligand, Melan A (MART-1), neural cell adhesion molecule (NCAM) , oncofetal antigen, preferentially expressed melanoma antigen (PRAME), progesterone receptor, prostate-specific antigen, prostate stem cell antigen (PSCA), prostate-specific membrane antigen (PSMA), receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 ( ROR1), survivin, trophoblast glycoprotein (TPBG; also known as 5T4), tumor-associated glycoprotein 72 (TAG72), tyrosinase-related protein 1 (TRP1; also known as TYRP1 or gp75), tyrosinase-related protein 2 (TRP2; also known as dopachrome tautomerase, dopachrome delta-isomerase, or DCT), vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2), Wilms tumor 1 ( WT-1), pathogen-specific or pathogen-expressed antigens, or antigens associated with universal tags, and/or biotinylated molecules, and/or molecules expressed by HIV, HCV, HBV, or other pathogens A polynucleotide of the invention 1039 that is selected.
[Invention 1041]
The polynucleotide of any of inventions 1037-1040, wherein said extracellular region comprises a spacer, optionally operably linked between the binding domain and the transmembrane domain.
[Invention 1042]
The polynucleotide of invention 1041 , wherein said spacer comprises an immunoglobulin hinge region, and/or C H 2 and C H 3 regions.
[Invention 1043]
The polynucleotide of any of inventions 1037-1042, wherein said intracellular region comprises an intracellular signaling domain.
[Invention 1044]
1043. The polynucleotide of invention 1043, wherein said intracellular signaling domain is or comprises the intracellular signaling domain of the CD3 chain, optionally the CD3-zeta (CD3ζ) chain, or a signaling portion thereof.
[Invention 1045]
The polynucleotide of any of inventions 1037-1044, wherein said intracellular region comprises one or more co-stimulatory signaling domains.
[Invention 1046]
1045. The polynucleotide of invention 1045, wherein said one or more co-stimulatory signaling domains comprise the intracellular signaling domain of CD28, 4-1BB, or ICOS, or a signaling portion thereof.
[Invention 1047]
The nucleic acid sequence of (a) is, in order, a binding domain, optionally a single-chain Fv fragment (scFv); and a transmembrane domain , optionally from human CD28; a co-stimulatory signaling domain, optionally from human 4-1BB ; and , an intracellular signaling region, optionally the CD3 zeta chain or a portion thereof, comprising a sequence of nucleotides.
[Invention 1048]
The polynucleotide of any of Inventions 1027-1047, wherein the nucleic acid sequence of (a) comprises a sequence of nucleotides encoding at least one additional protein.
[Invention 1049]
said at least one further protein is a surrogate marker, optionally said surrogate marker is a truncated receptor, optionally said truncated receptor lacks an intracellular signaling domain, and/ or a polynucleotide of the invention 1048, which is incapable of mediating intracellular signaling when bound by its ligand.
[Invention 1050]
The polynucleotide of any of Inventions 1027-1049, wherein the nucleic acid sequence of (a) comprises one or more multicistronic elements.
[Invention 1051]
the nucleic acid sequence of (a) comprises a sequence of nucleotides encoding a recombinant receptor or a portion thereof, and wherein said one or more multicistronic elements comprise a sequence of nucleotides encoding a recombinant receptor or a portion thereof; positioned upstream; and/or positioned between a sequence of nucleotides encoding the recombinant receptor or a portion thereof and a sequence of nucleotides encoding at least one additional protein; and/or
said recombinant receptor is a TCR and said one or more multicistronic elements are located between a sequence of nucleotides encoding TCRα and a sequence of nucleotides encoding TCRβ; and/or
The recombinant receptor is a CAR of a multi-chain CAR, and the one or more multicistronic elements comprise a sequence of nucleotides encoding one chain of the multi-chain CAR and another chain of the multi-chain CAR. positioned between the sequence of nucleotides encoding
Polynucleotides of the invention 1050.
[Invention 1052]
of the invention 1050 or 1051, wherein said one or more multicistronic elements are or comprise a ribosome skip sequence, optionally said ribosome skip sequence is a T2A, P2A, E2A, or F2A element Polynucleotide.
[Invention 1053]
Any of Inventions 1027-1052, wherein the nucleic acid sequence of (a) comprises one or more heterologous control or regulatory elements operably linked to regulate expression of the recombinant receptor or portion thereof of polynucleotides.
[Invention 1054]
The polynucleotide of any of the invention 1027-1053 contained in a viral vector.
[Invention 1055]
1054. The polynucleotide of the invention 1054, wherein said viral vector is an AAV vector, optionally said AAV vector is an AAV2 or AAV6 vector.
[Invention 1056]
1054. The polynucleotide of the invention 1054, wherein said viral vector is a retroviral vector, optionally a lentiviral vector.
[Invention 1057]
The polynucleotide of any of inventions 1027-1053, which is a linear polynucleotide, optionally a double-stranded polynucleotide or a single-stranded polynucleotide.
[Invention 1058]
2500 or about 2500, 5000 or about 5000 nucleotides, 3500 or about 3500 to 4500 or about 4500 nucleotides, or 3750 or about 3750 nucleotides to 4250 or about 4250 nucleotides in length. some polynucleotides.
[Invention 1059]
A method of making a genetically engineered T cell comprising introducing a polynucleotide of any of the inventions 1027-1058 into a T cell comprising a gene disruption at the TGFBR2 locus.
[Invention 1060]
(a) introducing into the T cell one or more agents capable of inducing gene disruption at a target site within the T cell's endogenous TGFBR2 locus; and
(b) introducing any of the polynucleotides of the present invention 1027-1058 into T cells containing a gene disruption at the TGFBR2 locus
A method of making a genetically engineered T cell, comprising:
[Invention 1061]
The method of invention 1059 or 1060, wherein the nucleic acid sequence encoding the recombinant receptor or portion thereof is integrated into the endogenous TGFBR2 locus via homology-directed repair (HDR).
[Invention 1062]
A method of producing a genetically engineered T cell comprising introducing into a T cell a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a recombinant receptor or a portion thereof, wherein the T cell is a T cell. The above method, having a gene disruption within the TGFBR2 locus, wherein the nucleic acid sequence encoding the recombinant receptor or portion thereof is integrated into the endogenous TGFBR2 locus via homology-directed repair (HDR).
[Invention 1063]
The present invention 1059, wherein said gene disruption is performed by introducing into the T cell one or more agents capable of inducing gene disruption at a target site within the endogenous TGFBR2 locus of the T cell. , 1061, and 1062 methods.
[Invention 1064]
1063. Any of invention 1059-1063, wherein said method creates a modified TGFBR2 locus in a T cell, said modified TGFBR2 locus comprising a nucleic acid sequence encoding a recombinant receptor or a portion thereof the method of.
[Invention 1065]
The polynucleotide further comprises one or more arms of homology linked to the nucleic acid sequence, wherein the one or more arms of homology are linked to the transforming growth factor beta receptor type 2 (TGFBR2) locus. The method of any of inventions 1062-1064 comprising sequences homologous to one or more regions of the open reading frame.
[Invention 1066]
In a cell produced by the method, the modified TGFBR2 locus comprises
does not encode a functional TGFBRII polypeptide in the cells produced by said method;
does not encode a TGFBRII polypeptide, or expression of a TGFBRII polypeptide is eliminated; and/or
does not encode a full-length TGFBRII polypeptide or encodes a dominant-negative TGFBRII polypeptide;
The method of any of Inventions 1059-1065.
[Invention 1067]
The one or more homology arms comprise a 5' homology arm and a 3' homology arm, and the polynucleotide encodes the structure [5' homology arm]-[recombinant receptor or portion thereof nucleic acid sequence]-[3' homology arm].
[Invention 1068]
The method of any of inventions 1059-1067, wherein the encoded recombinant receptor is or comprises a recombinant T cell receptor (TCR).
[Invention 1069]
The method of any of Inventions 1059-1067, wherein the encoded recombinant receptor is a chimeric antigen receptor (CAR).
[Invention 1070]
one or more agents capable of inducing gene disruption are
A DNA-binding protein or nucleic acid that specifically binds or hybridizes to a target site, a fusion protein comprising a DNA-targeting protein and a nuclease, or an RNA-guided nuclease
optionally, the one or more agents are
A zinc finger nuclease (ZFN), a TAL effector nuclease (TALEN), or a combination of CRISPR-Cas9 that specifically binds to, recognizes, or hybridizes to a target site
The method of any of the inventions 1060 and 1063-1069, comprising:
[Invention 1071]
The method of any of the inventions 1060 and 1063-1070, wherein said one or more agents comprises a guide RNA (gRNA) having a targeting domain complementary to at least one target site.
[Invention 1072]
The one or more agents are introduced as a ribonucleoprotein (RNP) complex comprising gRNA and Cas9 protein, optionally wherein the RNP is induced by electroporation, particle guns, calcium phosphate transfection, compaction of cells or The method of the invention 1071 introduced via compression, optionally via electroporation.
[Invention 1073]
1073. The method of invention 1072, wherein the concentration of said RNP is from or about 1 μM to 5 μM or about 5 μM, optionally wherein said concentration of RNP is or about 2 μM.
[Invention 1074]
the gRNA is
[Invention 1075]
1074. The method of any of inventions 1059-1074, wherein said T cells are primary T cells derived from a subject, optionally said subject is human.
[Invention 1076]
The method of any of inventions 1059-1075, wherein said T cells are CD8+ T cells or subtypes thereof, or CD4+ T cells or subtypes thereof.
[Invention 1077]
The method of any of inventions 1059-1076, wherein said polynucleotide is contained in a viral vector.
[Invention 1078]
1077. The method of invention 1077, wherein said viral vector is an AAV vector, optionally said AAV vector is an AAV2 or AAV6 vector.
[Invention 1079]
The method of any of inventions 1059-1078, wherein said polynucleotide is a linear polynucleotide, optionally a double-stranded polynucleotide or a single-stranded polynucleotide.
[Invention 1080]
The method of any of the inventions 1060 and 1063-1079, wherein said polynucleotide is introduced after introduction of said one or more agents.
[Invention 1081]
immediately after introduction of the agent, or about 30 seconds, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes, 5 minutes, 6 minutes, 6 minutes, 8 minutes, 9 minutes, 10 minutes thereafter; The method of the invention 1080, which is introduced within 15 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 60 minutes, 90 minutes, 2 hours, 3 hours, or 4 hours.
[Invention 1082]
Prior to the introduction of said one or more agents, said method includes treating cells with one or more stimulating agents under conditions to stimulate or activate one or more immune cells. incubating in vitro, optionally wherein the one or more stimulating agents comprise anti-CD3 and/or anti-CD28 antibodies, optionally anti-CD3/anti-CD28 beads, optionally bead to cell ratio is 1:1 or about 1:1.
[Invention 1083]
said method incubating cells with one or more recombinant cytokines prior to, during, or after introduction of said one or more agents and/or introduction of said polynucleotides. optionally, the one or more recombinant cytokines are selected from the group consisting of IL-2, IL-7, and IL-15; optionally, the one or more recombinant cytokines are , 10 U/mL or about 10 U/mL, 200 U/mL or about 200 U/mL, optionally 50 IU/mL or about 50 IU/mL, 100 U/mL or about 100 U/mL IL a concentration of -2; a concentration of IL-7 from 0.5 ng/mL to 50 ng/mL, optionally from 5 ng/mL or about 5 ng/mL, to 10 ng/mL or about 10 ng/mL; and/or 0.1 ng/mL to 20 ng/mL, optionally from 0.5 ng/mL or about 0.5 ng/mL, to 5 ng/mL or about 5 ng/mL of IL-15. The method of any of inventions 1060 and 1064-1082.
[Invention 1084]
incubation up to 24 hours, 36 hours, 48 hours, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 after introduction of said one or more agents and introduction of said polynucleotide; , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21 days, or approximately 24 hours, 36 hours, 48 hours, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, The method of invention 1082 or 1083 which is practiced for 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21 days, optionally up to or about 7 days.
[Invention 1085]
at least 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90% of the plurality of engineered cells produced by the method or more than 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90% of the cells have at least one and/or at least 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% in a plurality of engineered cells produced by said method. %, 75%, 80%, or 90%, or 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or 90% in the cells The method of any of inventions 1059-1084, wherein greater than % of the cells express the recombinant receptor.
[Invention 1086]
A genetically engineered T cell or a plurality of genetically engineered T cells produced using the method of any of the inventions 1059-1085.
[Invention 1087]
A composition comprising the genetically engineered T cells of any of the inventions 1001-1026 and 1086 or a plurality of the genetically engineered T cells of any of the inventions 1001-1026 and 1086.
[Invention 1088]
A composition of the invention 1087 comprising CD4+ T cells and/or CD8+ T cells.
[Invention 1089]
1088 of the invention, comprising CD4+ T cells and CD8+ T cells, wherein the ratio of CD4+ T cells to CD8+ T cells is 1:3 to 3:1 or about 1:3 to 3:1, optionally 1:1. Composition.
[Invention 1090]
at least 30%, 40%, 50%, 60% of all cells in the composition or of all CD4+ or CD8+ T cells in the composition express the recombinant receptor; 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more of inventions 1087-1089 any composition.
[Invention 1091]
administering a genetically engineered T cell, a plurality of genetically engineered T cells, or a composition of any of the inventions 1001-1026 and 1086-1090 to a subject having a disease or disorder. Method.
[Invention 1092]
Use of the genetically engineered T cells, plurality of genetically engineered T cells, or compositions of any of the inventions 1001-1026 and 1086-1090 for the treatment of a disease or disorder.
[Invention 1093]
Use of the genetically engineered T cell, plurality of genetically engineered T cells, or composition of any of the inventions 1001-1026 and 1086-1090 in the manufacture of a medicament for treating a disease or disorder.
[Invention 1094]
The genetically engineered T cell, plurality of genetically engineered T cells, or composition of any of the inventions 1001-1026 and 1086-1090 for use in treating a disease or disorder.
[Invention 1095]
A genetically engineered T cell, a plurality of genetically engineered T cells, or a composition for the method, use, or use of any of the inventions 1091-1094, wherein said disease or disorder is cancer or a tumor .
[Invention 1096]
The method, use, or genetically engineered T cell for use of the invention 1095, wherein said cancer or tumor is a hematologic malignancy, optionally a lymphoma, leukemia, or a plasma cell malignancy, a plurality of genetically engineered T cells, or compositions.
[Invention 1097]
The method, use, or use of Invention 1095, wherein said cancer or tumor is a solid tumor, optionally wherein said solid tumor is non-small cell lung cancer (NSCLC) or head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). A genetically engineered T cell, a plurality of genetically engineered T cells, or a composition for.
[Invention 1098]
one or more agents capable of inducing gene disruption at a target site within the TGFBR2 locus; and
Polynucleotide of any of the invention 1027-1058
kit, including
[Invention 1099]
one or more agents capable of inducing gene disruption at a target site within the TGFBR2 locus; and
A polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a recombinant receptor or a portion thereof, wherein the nucleic acid sequence encoding the recombinant receptor or portion thereof is at a target site via homology-directed repair (HDR) or a polynucleotide targeted for incorporation in its vicinity; and
Instructions for carrying out the method of any of the inventions 1059-1085
kit, including
Claims (57)
機能的なTGFBRIIポリペプチドをコードしない；
TGFBRIIポリペプチドをコードしないか、またはTGFBRIIポリペプチドの発現が排除されている；
完全長TGFBRIIポリペプチドをコードしない；および/あるいは
ドミナントネガティブTGFBRIIポリペプチドをコードし、任意で、該ドミナントネガティブTGFBRIIポリペプチドが、SEQ ID NO:59の残基22～191もしくはSEQ ID NO:60の残基22～216に対応するアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:59の残基22～191もしくはSEQ ID NO:60の残基22～216に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれよりも高い配列同一性を示す配列、またはその断片を含む、
請求項1または2に記載の遺伝子操作されたT細胞。 wherein the modified TGFBR2 locus is
does not encode a functional TGFBRII polypeptide;
does not encode a TGFBRII polypeptide or eliminates expression of a TGFBRII polypeptide;
does not encode a full-length TGFBRII polypeptide; and/or encodes a dominant-negative TGFBRII polypeptide, optionally wherein said dominant-negative TGFBRII polypeptide comprises residues 22-191 of SEQ ID NO:59 or at least 85%, 86% relative to the amino acid sequence corresponding to residues 22-216 or residues 22-191 of SEQ ID NO:59 or residues 22-216 of SEQ ID NO:60; Sequences showing 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or higher sequence identity , or containing fragments thereof,
3. A genetically engineered T cell according to claim 1 or 2.
（ｉ）内在性TGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン1の下流かつ/またはエクソン4の下流かつエクソン6の上流にある、かつ/または
（ｉｉ）TGFBR2遺伝子座またはそのオープンリーディングフレームにおける第4エクソンの5'末端から500塩基対（bp）以内下流にある、かつ/または
（ｉｉｉ）TGFBR2遺伝子座の第4エクソン内またはTGFBR2遺伝子座のアイソフォーム1をコードする転写物のオープンリーディングフレーム内にある、かつ/または
（ｉｖ）エクソン4の5'ヌクレオチドと、エクソン4の3'ヌクレオチドの上流との間にある、
請求項1～4のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたT細胞。 The transgene sequence is
(i) downstream of exon 1 and/or downstream of exon 4 and upstream of exon 6 of the open reading frame of the endogenous TGFBR2 locus, and/or
(ii) within 500 base pairs (bp) downstream of the 5' end of exon 4 at the TGFBR2 locus or open reading frame thereof, and/or
(iii) within exon 4 of the TGFBR2 locus or within the open reading frame of a transcript encoding isoform 1 of the TGFBR2 locus, and/or
(iv) between the 5′ nucleotide of exon 4 and the upstream 3′ nucleotide of exon 4,
A genetically engineered T cell according to any one of claims 1-4.
前記改変されたTGFBR2遺伝子座が、順番に、結合ドメイン、任意でscFv；ヒト免疫グロブリンヒンジ由来の、任意でIgG1、IgG2、もしくはIgG4、またはその改変バージョン由来の配列を任意で含み、CH2領域および/またはCH3領域を任意でさらに含む、スペーサー；ならびに、任意でヒトCD28由来の、膜貫通ドメイン；任意でヒト4-1BB由来の、共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに、細胞内シグナル伝達領域、任意でCD3ζ鎖またはその一部分、をコードするヌクレオチドの配列を含む、
請求項7～12のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたT細胞。 said transgene sequences, in order, optionally comprising a binding domain, optionally a single chain Fv fragment (scFv); optionally a sequence derived from a human immunoglobulin hinge, optionally IgG1, IgG2, or IgG4, or a modified version thereof; and a transmembrane domain, optionally from human CD28; a co-stimulatory signaling domain, optionally from human 4-1BB; and a cell, optionally further comprising a CH2 region and/or a CH3 region; a sequence of nucleotides encoding an internal signaling region, optionally the CD3 zeta chain or a portion thereof; and/or said modified TGFBR2 locus, in turn, comprises a binding domain, optionally a scFv; a spacer, optionally comprising a sequence derived from IgG1, IgG2, or IgG4, or modified versions thereof, and optionally further comprising a CH2 region and/or a CH3 region; and, optionally, from human CD28, a transmembrane domain; a co-stimulatory signaling domain, optionally from human 4-1BB; and an intracellular signaling region, optionally a CD3 zeta chain or portion thereof,
A genetically engineered T cell according to any one of claims 7-12 .
前記組換え受容体が、TCRであり、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/あるいは
前記組換え受容体が、多鎖CARのCARであり、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている、
請求項16に記載の遺伝子操作されたT細胞。 wherein said transgene sequence comprises a sequence of nucleotides encoding a recombinant receptor or a portion thereof, and wherein said one or more multicistronic elements are upstream of the sequence of nucleotides encoding a recombinant receptor or a portion thereof; and/or located between a sequence of nucleotides encoding a recombination receptor or a portion thereof and a sequence of nucleotides encoding at least one additional protein; and/or said recombination the receptor is a TCR and said one or more multicistronic elements are located between a sequence of nucleotides encoding TCRα and a sequence of nucleotides encoding TCRβ; and/or said set The replacement receptor is a CAR of a multi-chain CAR, wherein said one or more multicistronic elements encode a sequence of nucleotides encoding one strand of the multi-chain CAR and another strand of the multi-chain CAR. positioned between a sequence of nucleotides,
17. The genetically engineered T cell of claim 16 .
（b）該核酸配列に連結された1つまたは複数の相同性アームであって、トランスフォーミング増殖因子β受容体2型（TGFBR2）遺伝子座のオープンリーディングフレームの1つまたは複数の領域に相同な配列を含む、1つまたは複数の相同性アーム
を含む、ポリヌクレオチド。 (a) a nucleic acid sequence encoding a recombinant receptor or a portion thereof; and (b) one or more homology arms linked to said nucleic acid sequence comprising transforming growth factor beta receptor type 2 (TGFBR2 ) A polynucleotide comprising one or more homology arms comprising sequences homologous to one or more regions of the open reading frame of a locus.
（ｉ）TGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン1の下流にある配列であるか、またはそれを含む、かつ/または
（ｉｉ）TGFBR2遺伝子座のオープンリーディングフレームのエクソン4の少なくとも一部分もしくはエクソン4の下流を含む配列であるか、またはそれを含む、かつ/または
（ｉｉｉ）TGFBR2遺伝子座またはそのオープンリーディングフレームにおける第4エクソンの5'末端から500塩基対（bp）以内下流にある、かつ/または
（ｉｖ）TGFBR2遺伝子座の第4エクソン内またはTGFBR2遺伝子座のアイソフォーム1をコードする転写物のオープンリーディングフレーム内にある、かつ/または
（ｖ）エクソン4の5'ヌクレオチドと、エクソン4の3'ヌクレオチドの上流との間にある、
請求項21～24のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 one or more regions of the open reading frame are
(i) is or comprises a sequence downstream of exon 1 of the open reading frame of the TGFBR2 locus, and/or
(ii) is or comprises a sequence comprising at least a portion of exon 4 or downstream of exon 4 of the open reading frame of the TGFBR2 locus, and/or
(iii) within 500 base pairs (bp) downstream from the 5' end of exon 4 in the TGFBR2 locus or open reading frame thereof, and/or
(iv) within exon 4 of the TGFBR2 locus or within the open reading frame of a transcript encoding isoform 1 of the TGFBR2 locus, and/or
(v) between the 5′ nucleotide of exon 4 and the upstream 3′ nucleotide of exon 4,
A polynucleotide according to any one of claims 21-24 .
前記組換え受容体がTCRであり、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、TCRαをコードするヌクレオチドの配列と、TCRβをコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている；および/あるいは
前記組換え受容体が、多鎖CARのCARであり、前記1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、多鎖CARの1つの鎖をコードするヌクレオチドの配列と、多鎖CARの別の鎖をコードするヌクレオチドの配列との間に位置づけられている、
請求項21に記載のポリヌクレオチド。 the nucleic acid sequence of (a) comprises a sequence of nucleotides encoding a recombinant receptor or a portion thereof, and wherein said one or more multicistronic elements comprise a sequence of nucleotides encoding a recombinant receptor or a portion thereof; positioned upstream; and/or positioned between a sequence of nucleotides encoding the recombinant receptor or a portion thereof and a sequence of nucleotides encoding at least one additional protein; and/or said the recombinant receptor is a TCR and said one or more multicistronic elements are located between a sequence of nucleotides encoding TCRα and a sequence of nucleotides encoding TCRβ; and/or said The recombinant receptor is a CAR of a multi-chain CAR, wherein said one or more multicistronic elements are a sequence of nucleotides encoding one chain of the multi-chain CAR and encoding another chain of the multi-chain CAR is positioned between a sequence of nucleotides that
22. The polynucleotide of claim 21 .
（b）請求項21～29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを導入する工程を含み、工程（a）および（b）が同時にまたは逐次的に、任意の順序で行われる、遺伝子操作されたT細胞を作製する方法。 (a) introducing into the T cell one or more agents capable of inducing gene disruption at a target site within the T cell's endogenous TGFBR2 locus; and (b) claims 21-29 . wherein steps (a) and (b) are performed simultaneously or sequentially and in any order. Method.
該改変されたTGFBR2遺伝子座が、ドミナントネガティブTGFBRIIポリペプチドをコードし、かつ
該組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列が、
（ｉ）TGFBR2遺伝子座またはそのオープンリーディングフレームにおける第4エクソンの5'末端から500塩基対（bp）以内下流にある、かつ/または
（ｉｉ）TGFBR2遺伝子座の第4エクソン内またはTGFBR2遺伝子座のアイソフォーム1をコードする転写物のオープンリーディングフレーム内にある、かつ/または
（ｉｉｉ）エクソン4の5'ヌクレオチドと、エクソン4の3'ヌクレオチドの上流との間にある、
請求項30～33のいずれか一項に記載の方法。 the method creates a modified TGFBR2 locus in a T cell, the modified TGFBR2 locus comprising a nucleic acid sequence encoding a recombinant receptor or a portion thereof;
the modified TGFBR2 locus encodes a dominant-negative TGFBRII polypeptide, and
a nucleic acid sequence encoding the recombinant receptor or a portion thereof comprising:
(i) within 500 base pairs (bp) downstream of the 5' end of exon 4 at the TGFBR2 locus or open reading frame thereof, and/or
(ii) within exon 4 of the TGFBR2 locus or within the open reading frame of a transcript encoding isoform 1 of the TGFBR2 locus, and/or
(iii) between the 5′ nucleotide of exon 4 and the upstream 3′ nucleotide of exon 4;
34. The method of any one of claims 30-33 .
機能的なTGFBRIIポリペプチドを、前記方法によって生成された細胞においてコードしない；
TGFBRIIポリペプチドをコードしないか、もしくはTGFBRIIポリペプチドの発現が排除されている；および/または
完全長TGFBRIIポリペプチドをコードしないか、もしくはドミナントネガティブTGFBRIIポリペプチドをコードする、
請求項30～34のいずれか一項に記載の方法。 In a cell produced by the method, the modified TGFBR2 locus comprises
does not encode a functional TGFBRII polypeptide in the cells produced by said method;
does not encode a TGFBRII polypeptide, or expression of a TGFBRII polypeptide is eliminated; and/or does not encode a full-length TGFBRII polypeptide, or encodes a dominant-negative TGFBRII polypeptide,
A method according to any one of claims 30-34 .
標的部位に特異的に結合するかもしくはハイブリダイズするDNA結合タンパク質もしくはDNA結合核酸、DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼとを含む融合タンパク質、またはRNA誘導型ヌクレアーゼ
を含み、任意で、該1つまたは複数の作用物質が、
標的部位に特異的に結合するか、それを認識するか、またはそれにハイブリダイズする、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、または、およびCRISPR-Cas9の組み合わせ
を含み、
任意で、前記1つまたは複数の作用物質が、少なくとも1つの標的部位に相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、
請求項31および34～38のいずれか一項に記載の方法。 one or more agents capable of inducing gene disruption are
a DNA binding protein or nucleic acid that specifically binds or hybridizes to a target site, a fusion protein comprising a DNA targeting protein and a nuclease, or an RNA-guided nuclease, and optionally said one or more actions the substance
a zinc finger nuclease (ZFN), a TAL effector nuclease (TALEN), or a combination of CRISPR-Cas9 that specifically binds to, recognizes, or hybridizes to a target site;
optionally, said one or more agents comprises a guide RNA (gRNA) having a targeting domain complementary to at least one target site;
39. The method of any one of claims 31 and 34-38 .
（ｉｉ）前記導入遺伝子配列が、TGFBR2遺伝子座の第4エクソン内またはTGFBR2遺伝子座のアイソフォーム1をコードする転写物のオープンリーディングフレーム内にある、かつ/または(ii) said transgene sequence is within exon 4 of the TGFBR2 locus or within the open reading frame of a transcript encoding isoform 1 of the TGFBR2 locus, and/or
（ｉｉｉ）前記導入遺伝子配列が、エクソン4の5'ヌクレオチドと、エクソン4の3'ヌクレオチドの上流との間にある、(iii) the transgene sequence is between the 5' nucleotide of exon 4 and the upstream 3' nucleotide of exon 4;
請求項49～50のいずれか一項に記載の組成物。A composition according to any one of claims 49-50.
請求項21～29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド
を含む、キット。 30. A kit comprising one or more agents capable of inducing gene disruption at a target site within the TGFBR2 locus; and the polynucleotide of any one of claims 21-29 .
組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、該組換え受容体またはその一部分をコードする核酸配列が、相同性指向修復（HDR）を介した標的部位でのまたはその近くでの組み込みのためにターゲティングされる、ポリヌクレオチド；および
請求項30～47のいずれか一項に記載の方法を実施するための説明書
を含む、キット。 one or more agents capable of inducing gene disruption at a target site within the TGFBR2 locus; and a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a recombinant receptor or a portion thereof, said recombinant receptor or a portion thereof, is targeted for integration at or near the target site via homology-directed repair (HDR); and any one of claims 30-47 . A kit comprising instructions for performing the method described in paragraph.
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