JPWO2020210151A5 - - Google Patents
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Description
いくつかの態様において、少なくとも1つの関心対象のマイクロキャピラリーを同定するために用いられるシグナルの増加は、ベースラインおよび/または対照と比較した場合に統計的に有意な増加を示す。
[本発明1001]
以下の段階を含む、変異体タンパク質の集団をスクリーニングする方法:
複数のマイクロキャピラリーを含むマイクロキャピラリーアレイを提供する段階であって、各マイクロキャピラリーが、変異体タンパク質、固定化標的分子、およびレポーターエレメントを含み、該変異体タンパク質が、特定の親和性で固定化標的分子と会合する、段階; ならびに
カルシウム色素アッセイ、T細胞活性化アッセイ、B細胞アッセイ、およびGFPアッセイからなる群より選択されるレポーターアッセイにおける、少なくとも1つの変異体タンパク質と少なくとも1つの固定化標的分子との会合を示す少なくとも1つのレポーターエレメントからのシグナルを測定して、少なくとも1つの関心対象のマイクロキャピラリーを同定する段階。
[本発明1002]
変異体タンパク質が、発現系によって発現される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
発現系が無細胞発現系である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
発現系が細胞発現系である、本発明1002の方法。
[本発明1005]
細胞発現系が、動物系、鳥類系、真菌系、細菌系、昆虫系、または植物系である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
細胞発現系が鳥類系である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
鳥類発現系がニワトリ系である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
変異体タンパク質が可溶性タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
標的分子が、標的タンパク質もしくはポリペプチド、標的核酸、標的炭水化物、または各々の組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
標的分子が表面に固定化される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
表面が細胞の表面である、本発明1009の方法。
[本発明1012]
標的分子が天然タンパク質である、本発明1009の方法。
[本発明1013]
表面がビーズの表面である、本発明1009の方法。
[本発明1014]
表面がマイクロキャピラリー壁の表面である、本発明1009の方法。
[本発明1015]
表面が、重力沈降によってマイクロキャピラリーに定着するように構成された表面である、本発明1009の方法。
[本発明1016]
レポーターエレメントが、標識された抗体または他の結合分子である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
標識された抗体または他の結合分子が、蛍光標識された抗体または他の結合分子である、本発明1015の方法。
[本発明1018]
標識された抗体が、一次抗体または二次抗体である、本発明1015の方法。
[本発明1019]
標識された抗体または他の結合分子が、酵素結合された抗体または他の結合分子である、本発明1015の方法。
[本発明1020]
レポーターエレメントが細胞内で活性化され、標的分子が細胞の表面に固定化される、本発明1001の方法。
[本発明1021]
レポーターエレメントが、緑色蛍光タンパク質または変異体を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
シグナルが、蛍光シグナル、吸光度シグナル、明視野シグナル、または暗視野シグナルである、本発明1001の方法。
[本発明1023]
マイクロキャピラリーアレイ中の各マイクロキャピラリーが、変異体タンパク質の集団からの0～5個の変異体タンパク質を含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
マイクロキャピラリーアレイが、少なくとも100,000個、少なくとも300,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも3,000,000個、または少なくとも10,000,000個のマイクロキャピラリーを含む、本発明1001の方法。
[本発明1025]
各マイクロキャピラリーが、細胞発現系の生存性を改善するための物質をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
物質が、メチルセルロース、デキストランプルロニック（登録商標）F-68、ポリエチレングリコール、またはポリビニルアルコールである、本発明1025の方法。
[本発明1027]
物質が増殖培地である、本発明1025の方法。
[本発明1028]
シグナルが光学検出器によって測定される、本発明1001の方法。
[本発明1029]
シグナルが顕微鏡によって測定される、本発明1001の方法。
[本発明1030]
関心対象のマイクロキャピラリーの内容物を単離する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
関心対象のマイクロキャピラリーの内容物が、関心対象のマイクロキャピラリーをレーザーでパルスすることによって単離される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
レーザーが、ダイオード励起Qスイッチレーザーである、本発明1031の方法。
[本発明1033]
レーザーが、マイクロキャピラリー壁とマイクロキャピラリーに含まれるサンプルとの間の水-ガラス界面に向けられる、本発明1031の方法。
[本発明1034]
関心対象のマイクロキャピラリーの内容物が、2段式サンプル回収エレメントを用いて単離される、本発明1030の方法。
[本発明1035]
マイクロキャピラリーが、電磁放射の透過を阻害することができる微粒子、磁性微粒子、磁気ビーズ、または電磁放射吸収材を含まない、本発明1001の方法。
[本発明1036]
以下を含む、変異体タンパク質の集団をスクリーニングするためのシステム:
複数のマイクロキャピラリーを含むアレイであって、各マイクロキャピラリーが、変異体タンパク質、固定化標的分子、およびレポーターエレメントを含み、該変異体タンパク質が、特定の親和性で固定化標的分子と会合する、アレイ。
[本発明1037]
変異体タンパク質が、発現系によって発現される、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1038]
発現系が無細胞発現系である、本発明1037のスクリーニングシステム。
[本発明1039]
発現系が細胞発現系である、本発明1038のスクリーニングシステム。
[本発明1040]
細胞発現系が、動物系、鳥類系、真菌系、細菌系、昆虫系、または植物系である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
細胞発現系が鳥類系である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
鳥類発現系がニワトリ系である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
変異体タンパク質が可溶性タンパク質である、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1044]
標的分子が、標的タンパク質もしくはポリペプチド、標的核酸、標的炭水化物、または各々の組み合わせである、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1045]
標的分子が表面に固定化される、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1046]
表面が細胞の表面である、本発明1045のスクリーニングシステム。
[本発明1047]
標的分子が天然タンパク質である、本発明1046のスクリーニングシステム。
[本発明1048]
表面がビーズの表面である、本発明1045のスクリーニングシステム。
[本発明1049]
表面がマイクロキャピラリー壁の表面である、本発明1045のスクリーニングシステム。
[本発明1050]
表面が、重力沈降によってマイクロキャピラリーに定着するように構成された表面である、本発明1045のスクリーニングシステム。
[本発明1051]
レポーターエレメントが、標識された抗体または他の結合分子である、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1052]
標識された抗体または他の結合分子が、蛍光標識された抗体または他の結合分子である、本発明1051のスクリーニングシステム。
[本発明1053]
標識された抗体が、一次抗体または二次抗体である、本発明1051のスクリーニングシステム。
[本発明1054]
標識された抗体または他の結合分子が、酵素結合された抗体または他の結合分子である、本発明1051のスクリーニングシステム。
[本発明1055]
レポーターエレメントが細胞内で活性化され、標的分子が細胞の表面に固定化される、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1056]
レポーターエレメントが、緑色蛍光タンパク質または変異体を含む、本発明1055のスクリーニングシステム。
[本発明1057]
シグナルが、蛍光シグナル、吸光度シグナル、明視野シグナル、または暗視野シグナルである、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1058]
マイクロキャピラリーアレイ中の各マイクロキャピラリーが、変異体タンパク質の集団からの0～5個の変異体タンパク質を含む、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1059]
マイクロキャピラリーアレイが、少なくとも100,000個、少なくとも300,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも3,000,000個、または少なくとも10,000,000個のマイクロキャピラリーを含む、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1060]
各マイクロキャピラリーが、細胞発現系の生存性を改善するための物質をさらに含む、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1061]
物質が、メチルセルロース、デキストランプルロニック（登録商標）F-68、ポリエチレングリコール、またはポリビニルアルコールである、本発明1060のスクリーニングシステム。
[本発明1062]
物質が増殖培地である、本発明1060のスクリーニングシステム。
[本発明1063]
光源および検出器をさらに含む、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1064]
顕微鏡をさらに含む、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1065]
抽出装置をさらに含む、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1066]
抽出装置が、ダイオード励起Qスイッチレーザーを含む、本発明1065のスクリーニングシステム。
[本発明1067]
2段式サンプル回収エレメントをさらに含む、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1068]
マイクロキャピラリーが、電磁放射の透過を阻害することができる微粒子、磁性微粒子、磁気ビーズ、または電磁放射吸収材を含まない、本発明1036のスクリーニングシステム。
[本発明1069]
以下の段階を含む変異体タンパク質の集団をスクリーニングする方法:
複数のマイクロキャピラリーを含むマイクロキャピラリーアレイを提供する段階であって、各マイクロキャピラリーが、変異体タンパク質を発現する細胞発現系、細胞の表面に固定化された標的分子、およびレポーターエレメントを含み、該変異体タンパク質が、特定の親和性でマイクロキャピラリー中の固定化された標的分子と会合し、該細胞発現系が鳥類系である、段階; ならびに
レポーターアッセイにおける、少なくとも1つの変異体タンパク質と少なくとも1つの固定化標的分子との会合を示す少なくとも1つのレポーターエレメントからのシグナルを測定して、少なくとも1つの関心対象のマイクロキャピラリーを同定する段階。
[本発明1070]
鳥類系がニワトリ系である、本発明1069の方法。
[本発明1071]
標的分子が、標的タンパク質もしくはポリペプチド、標的核酸、標的炭水化物、標的抗体、または各々の組み合わせである、本発明1069の方法。
[本発明1072]
標的分子が標的抗体である、本発明1069の方法。
[本発明1073]
レポーターアッセイが、カルシウム色素アッセイ、T細胞活性化アッセイ、B細胞アッセイ、およびGFPアッセイからなる群より選択される、本発明1069の方法。
[本発明1074]
レポーターエレメントが、変異体タンパク質上のエピトープに局在する標識された抗体または他の結合分子である、本発明1069の方法。
[本発明1075]
標識された抗体または他の結合分子が、蛍光標識された抗体または他の結合分子である、本発明1074の方法。
[本発明1076]
シグナルが、蛍光シグナル、吸光度シグナル、明視野シグナル、または暗視野シグナルである、本発明1075の方法。
[本発明1077]
B細胞アッセイが、脾臓から供給されたB細胞を含む、本発明1073～1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
T細胞活性化アッセイが、抗体の細胞シグナル伝達誘導能力を評価するために用いられる、本発明1073～1076のいずれかの方法。
[本発明1079]
T細胞活性化アッセイが、抗体の内部シグナル伝達または細胞表面マーカー誘導能力を測定するために用いられる、本発明1073～1076のいずれかの方法。
[本発明1080]
T細胞活性化アッセイが、抗体の細胞増殖誘導能力を評価するために用いられる、本発明1073～1076のいずれかの方法。
[本発明1081]
T細胞活性化アッセイが、抗体のサイトカイン分泌誘導能力を評価するために用いられる、本発明1073～1076のいずれかの方法。
[本発明1082]
T細胞活性化アッセイが、抗体の活性化能力を決定するためにCD25発現を測定する、本発明1073～1076のいずれかの方法。
[本発明1083]
CD25発現が、蛍光標識された抗CD25抗体を用いて測定される、本発明1082の方法。
[本発明1084]
T細胞活性化アッセイが、抗体の活性化能力を決定するためにカルシウムシグナル伝達を測定する、本発明1073～1076のいずれかの方法。
[本発明1085]
T細胞活性化アッセイが、カルシウムシグナル伝達を測定するためにカルシウム感受性フルオロフォアを用いる、本発明1084の方法。
[本発明1086]
カルシウム感受性フルオロフォアが、Fluo-4 AM、Fura-2 AM、およびIndo-1 AMからなる群より選択される、本発明1085の方法。
[本発明1087]
T細胞活性化アッセイが、T細胞および抗体分泌細胞(ASC)の混合物を含む、本発明1073～1076および1078～1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
T細胞およびASCの混合物が、2:1から12:1の比率まで変化する、本発明1087の方法。
[本発明1089]
T細胞およびASCの混合物が、5:1の比率である、本発明1088の方法。
[本発明1090]
ASCがB細胞である、本発明1087～1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
T細胞およびASCの混合物が、T細胞活性化ビーズおよび抗体捕捉ビーズをさらに含む、本発明1087～1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
T細胞が末梢血から精製される、本発明1087～1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
少なくとも1つの関心対象のマイクロキャピラリーを同定するために用いられるシグナルが、ベースラインおよび/または対照サンプルと比較した場合のシグナルより少なくとも10%～10,000%またはそれ以上の増加である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1094]
少なくとも1つの関心対象のマイクロキャピラリーを同定するために用いられるシグナルが、ベースラインおよび/または対照サンプルと比較した場合のシグナルより少なくとも10%またはそれ以上の増加である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1095]
少なくとも1つの関心対象のマイクロキャピラリーを同定するために用いられるシグナルの増加が、ベースラインおよび/または対照と比較した場合に統計的に有意な増加を示す、前記本発明のいずれかの方法。
In some embodiments, the increase in signal used to identify at least one microcapillary of interest exhibits a statistically significant increase when compared to baseline and/or controls.
[Invention 1001]
A method of screening a population of mutant proteins comprising the steps of:
providing a microcapillary array comprising a plurality of microcapillaries, each microcapillary comprising a mutant protein, an immobilized target molecule and a reporter element, wherein the mutant protein is immobilized with a specific affinity; associating with a target molecule, a step; and
at least one exhibiting association of at least one mutant protein with at least one immobilized target molecule in a reporter assay selected from the group consisting of a calcium dye assay, a T cell activation assay, a B cell assay, and a GFP assay; Measuring the signal from the reporter element to identify at least one microcapillary of interest.
[Invention 1002]
1001. The method of invention 1001, wherein the mutant protein is expressed by an expression system.
[Invention 1003]
The method of invention 1002, wherein the expression system is a cell-free expression system.
[Invention 1004]
The method of invention 1002, wherein the expression system is a cell expression system.
[Invention 1005]
The method of invention 1004, wherein the cell expression system is an animal, avian, fungal, bacterial, insect, or plant system.
[Invention 1006]
The method of the invention 1005, wherein the cell expression system is an avian system.
[Invention 1007]
The method of the invention 1006, wherein the avian expression system is the chicken system.
[Invention 1008]
1001. The method of invention 1001, wherein the mutant protein is a soluble protein.
[Invention 1009]
1001. The method of invention 1001, wherein the target molecule is a target protein or polypeptide, a target nucleic acid, a target carbohydrate, or a combination of each.
[Invention 1010]
1001. The method of the invention 1001, wherein the target molecule is immobilized on a surface.
[Invention 1011]
1009. The method of the invention 1009, wherein the surface is the surface of a cell.
[Invention 1012]
1009. The method of the invention 1009, wherein the target molecule is a native protein.
[Invention 1013]
1009. The method of the invention 1009, wherein the surface is the surface of a bead.
[Invention 1014]
The method of the invention 1009, wherein the surface is the surface of a microcapillary wall.
[Invention 1015]
The method of invention 1009, wherein the surface is a surface configured to settle to the microcapillary by gravitational settling.
[Invention 1016]
1001. The method of invention 1001, wherein the reporter element is a labeled antibody or other binding molecule.
[Invention 1017]
The method of invention 1015, wherein the labeled antibody or other binding molecule is a fluorescently labeled antibody or other binding molecule.
[Invention 1018]
The method of invention 1015, wherein the labeled antibody is a primary antibody or a secondary antibody.
[Invention 1019]
The method of invention 1015, wherein the labeled antibody or other binding molecule is an enzyme-linked antibody or other binding molecule.
[Invention 1020]
1001. The method of invention 1001, wherein the reporter element is activated intracellularly and the target molecule is immobilized on the surface of the cell.
[Invention 1021]
The method of invention 1020, wherein the reporter element comprises green fluorescent protein or a mutant.
[Invention 1022]
The method of invention 1001, wherein the signal is a fluorescence signal, an absorbance signal, a bright field signal, or a dark field signal.
[Invention 1023]
1001. The method of invention 1001, wherein each microcapillary in the microcapillary array comprises 0-5 mutant proteins from the population of mutant proteins.
[Invention 1024]
1002. The method of invention 1001, wherein the microcapillary array comprises at least 100,000, at least 300,000, at least 1,000,000, at least 3,000,000, or at least 10,000,000 microcapillaries.
[Invention 1025]
1001. The method of invention 1001, wherein each microcapillary further comprises a substance for improving the viability of the cell expression system.
[Invention 1026]
1025. The method of Invention 1025, wherein the substance is methylcellulose, Dextruronic® F-68, polyethylene glycol, or polyvinyl alcohol.
[Invention 1027]
1025. A method of the invention 1025, wherein the substance is a growth medium.
[Invention 1028]
The method of invention 1001, wherein the signal is measured by an optical detector.
[Invention 1029]
1001. The method of the invention 1001, wherein the signal is measured by microscopy.
[Invention 1030]
The method of invention 1001, further comprising isolating the contents of the microcapillary of interest.
[Invention 1031]
The method of invention 1030, wherein the contents of the microcapillary of interest are isolated by pulsing the microcapillary of interest with a laser.
[Invention 1032]
The method of invention 1031, wherein the laser is a diode-pumped Q-switched laser.
[Invention 1033]
The method of invention 1031, wherein the laser is directed at the water-glass interface between the microcapillary wall and the sample contained in the microcapillary.
[Invention 1034]
The method of invention 1030, wherein the contents of a microcapillary of interest are isolated using a two-stage sample collection element.
[Invention 1035]
1001. The method of invention 1001, wherein the microcapillary does not contain microparticles, magnetic microparticles, magnetic beads, or electromagnetic radiation absorbers capable of inhibiting transmission of electromagnetic radiation.
[Invention 1036]
Systems for screening populations of mutant proteins, including:
An array comprising a plurality of microcapillaries, each microcapillary comprising a mutant protein, an immobilized target molecule, and a reporter element, wherein the mutant protein associates with the immobilized target molecule with a specific affinity. array.
[Invention 1037]
The screening system of invention 1036, wherein the mutant protein is expressed by an expression system.
[Invention 1038]
The screening system of the present invention 1037, wherein the expression system is a cell-free expression system.
[Invention 1039]
The screening system of the present invention 1038, wherein the expression system is a cell expression system.
[Invention 1040]
The method of invention 1039, wherein the cell expression system is an animal, avian, fungal, bacterial, insect, or plant system.
[Invention 1041]
The method of invention 1040, wherein the cell expression system is an avian system.
[Invention 1042]
The method of invention 1041, wherein the avian expression system is the chicken system.
[Invention 1043]
The screening system of invention 1036, wherein the mutant protein is a soluble protein.
[Invention 1044]
The screening system of invention 1036, wherein the target molecule is a target protein or polypeptide, a target nucleic acid, a target carbohydrate, or a combination of each.
[Invention 1045]
The screening system of invention 1036, wherein the target molecule is immobilized on a surface.
[Invention 1046]
The screening system of the invention 1045, wherein the surface is the surface of a cell.
[Invention 1047]
The screening system of invention 1046, wherein the target molecule is a native protein.
[Invention 1048]
A screening system of the invention 1045, wherein the surface is the surface of a bead.
[Invention 1049]
The screening system of invention 1045, wherein the surface is the surface of a microcapillary wall.
[Invention 1050]
The screening system of invention 1045, wherein the surface is a surface configured to settle to the microcapillary by gravitational settling.
[Invention 1051]
The screening system of invention 1036, wherein the reporter element is a labeled antibody or other binding molecule.
[Invention 1052]
The screening system of invention 1051, wherein the labeled antibody or other binding molecule is a fluorescently labeled antibody or other binding molecule.
[Invention 1053]
The screening system of invention 1051, wherein the labeled antibody is a primary antibody or a secondary antibody.
[Invention 1054]
The screening system of invention 1051, wherein the labeled antibody or other binding molecule is an enzyme-linked antibody or other binding molecule.
[Invention 1055]
The screening system of invention 1036, wherein the reporter element is activated intracellularly and the target molecule is immobilized on the surface of the cell.
[Invention 1056]
The screening system of invention 1055, wherein the reporter element comprises green fluorescent protein or a mutant.
[Invention 1057]
The screening system of invention 1036, wherein the signal is a fluorescence signal, an absorbance signal, a brightfield signal, or a darkfield signal.
[Invention 1058]
The screening system of invention 1036, wherein each microcapillary in the microcapillary array contains 0-5 mutant proteins from the population of mutant proteins.
[Invention 1059]
1036. The screening system of invention 1036, wherein the microcapillary array comprises at least 100,000, at least 300,000, at least 1,000,000, at least 3,000,000, or at least 10,000,000 microcapillaries.
[Invention 1060]
The screening system of invention 1036, wherein each microcapillary further comprises a substance for improving the viability of the cell expression system.
[Invention 1061]
The screening system of invention 1060, wherein the substance is methylcellulose, dextran pluronic® F-68, polyethylene glycol, or polyvinyl alcohol.
[Invention 1062]
A screening system of the invention 1060, wherein the substance is a growth medium.
[Invention 1063]
The screening system of invention 1036, further comprising a light source and a detector.
[Invention 1064]
A screening system of the invention 1036, further comprising a microscope.
[Invention 1065]
The screening system of invention 1036, further comprising an extraction device.
[Invention 1066]
The screening system of invention 1065, wherein the extraction device comprises a diode-pumped Q-switched laser.
[Invention 1067]
The screening system of invention 1036, further comprising a two-stage sample collection element.
[Invention 1068]
The screening system of invention 1036, wherein the microcapillary does not contain microparticles, magnetic microparticles, magnetic beads, or electromagnetic radiation absorbers capable of inhibiting the transmission of electromagnetic radiation.
[Invention 1069]
A method of screening a population of mutant proteins comprising the following steps:
providing a microcapillary array comprising a plurality of microcapillaries, each microcapillary comprising a cell expression system expressing a mutant protein, a target molecule immobilized on the surface of the cell, and a reporter element, said a mutant protein associates with a specific affinity to an immobilized target molecule in a microcapillary and said cell expression system is an avian system; and
Identifying at least one microcapillary of interest by measuring a signal from at least one reporter element indicative of association of at least one mutant protein with at least one immobilized target molecule in a reporter assay.
[Invention 1070]
The method of the invention 1069, wherein the avian system is a chicken system.
[Invention 1071]
The method of the invention 1069, wherein the target molecule is a target protein or polypeptide, target nucleic acid, target carbohydrate, target antibody, or a combination of each.
[Invention 1072]
The method of the invention 1069, wherein the target molecule is a target antibody.
[Invention 1073]
1069. The method of the invention 1069, wherein the reporter assay is selected from the group consisting of a calcium dye assay, a T cell activation assay, a B cell assay, and a GFP assay.
[Invention 1074]
The method of invention 1069, wherein the reporter element is a labeled antibody or other binding molecule that localizes to an epitope on the mutant protein.
[Invention 1075]
The method of invention 1074, wherein the labeled antibody or other binding molecule is a fluorescently labeled antibody or other binding molecule.
[Invention 1076]
The method of invention 1075, wherein the signal is a fluorescence signal, an absorbance signal, a brightfield signal, or a darkfield signal.
[Invention 1077]
The method of any of inventions 1073-1076, wherein the B cell assay comprises spleen-sourced B cells.
[Invention 1078]
The method of any of invention 1073-1076, wherein a T cell activation assay is used to assess the ability of the antibody to induce cell signaling.
[Invention 1079]
The method of any of invention 1073-1076, wherein a T cell activation assay is used to measure the ability of the antibody to induce internal signaling or cell surface markers.
[Invention 1080]
The method of any of inventions 1073-1076, wherein a T cell activation assay is used to assess the ability of the antibody to induce cell proliferation.
[Invention 1081]
The method of any of invention 1073-1076, wherein a T cell activation assay is used to assess the ability of the antibody to induce cytokine secretion.
[Invention 1082]
The method of any of inventions 1073-1076, wherein the T cell activation assay measures CD25 expression to determine the ability of the antibody to activate.
[Invention 1083]
1082. The method of invention 1082, wherein CD25 expression is measured using a fluorescently labeled anti-CD25 antibody.
[Invention 1084]
The method of any of inventions 1073-1076, wherein the T cell activation assay measures calcium signaling to determine the ability of the antibody to activate.
[Invention 1085]
1084. The method of invention 1084, wherein the T cell activation assay uses a calcium sensitive fluorophore to measure calcium signaling.
[Invention 1086]
1085. The method of invention 1085, wherein the calcium-sensitive fluorophore is selected from the group consisting of Fluo-4 AM, Fura-2 AM, and Indo-1 AM.
[Invention 1087]
The method of any of the invention 1073-1076 and 1078-1086, wherein the T cell activation assay comprises a mixture of T cells and antibody secreting cells (ASC).
[Invention 1088]
The method of invention 1087, wherein the mixture of T cells and ASCs varies from a ratio of 2:1 to 12:1.
[Invention 1089]
The method of invention 1088, wherein the mixture of T cells and ASCs is in a 5:1 ratio.
[Invention 1090]
The method of any of inventions 1087-1089, wherein the ASC are B cells.
[Invention 1091]
The method of any of inventions 1087-1090, wherein the mixture of T cells and ASCs further comprises T cell activation beads and antibody capture beads.
[Invention 1092]
The method of any of inventions 1087-1091, wherein the T cells are purified from peripheral blood.
[Invention 1093]
wherein the signal used to identify at least one microcapillary of interest is an increase of at least 10% to 10,000% or more over the signal when compared to a baseline and/or control sample. either way.
[Invention 1094]
Any of the preceding inventions wherein the signal used to identify at least one microcapillary of interest is at least a 10% or more increase over the signal when compared to a baseline and/or control sample. Method.
[Invention 1095]
Any of the preceding methods of the invention, wherein the increase in signal used to identify at least one microcapillary of interest exhibits a statistically significant increase when compared to baseline and/or control.
Claims (39)
複数のマイクロキャピラリーを含むマイクロキャピラリーアレイを提供する段階であって、各マイクロキャピラリーが、変異体タンパク質、固定化標的分子、およびレポーターエレメントを含み、該変異体タンパク質が、特定の親和性で固定化標的分子と会合する、段階; ならびに
カルシウム色素アッセイ、T細胞活性化アッセイ、B細胞アッセイ、およびGFPアッセイからなる群より選択されるレポーターアッセイにおける、少なくとも1つの変異体タンパク質と少なくとも1つの固定化標的分子との会合を示す少なくとも1つのレポーターエレメントからのシグナルを測定して、少なくとも1つの関心対象のマイクロキャピラリーを同定する段階。 A method of screening a population of mutant proteins comprising the steps of:
providing a microcapillary array comprising a plurality of microcapillaries, each microcapillary comprising a mutant protein, an immobilized target molecule and a reporter element, wherein the mutant protein is immobilized with a specific affinity; at least one mutant protein and at least one immobilized target in a reporter assay selected from the group consisting of a calcium dye assay, a T cell activation assay, a B cell assay, and a GFP assay. Measuring signal from at least one reporter element indicative of association with a molecule to identify at least one microcapillary of interest.
複数のマイクロキャピラリーを含むアレイであって、各マイクロキャピラリーが、変異体タンパク質、固定化標的分子、およびレポーターエレメントを含み、該変異体タンパク質が、特定の親和性で固定化標的分子と会合する、アレイ。 Systems for screening populations of mutant proteins, including:
An array comprising a plurality of microcapillaries, each microcapillary comprising a mutant protein, an immobilized target molecule, and a reporter element, wherein the mutant protein associates with the immobilized target molecule with a specific affinity. array.
複数のマイクロキャピラリーを含むマイクロキャピラリーアレイを提供する段階であって、各マイクロキャピラリーが、変異体タンパク質を発現する細胞発現系、細胞の表面に固定化された標的分子、およびレポーターエレメントを含み、該変異体タンパク質が、特定の親和性でマイクロキャピラリー中の固定化された標的分子と会合し、該細胞発現系が鳥類系である、段階; ならびに
レポーターアッセイにおける、少なくとも1つの変異体タンパク質と少なくとも1つの固定化標的分子との会合を示す少なくとも1つのレポーターエレメントからのシグナルを測定して、少なくとも1つの関心対象のマイクロキャピラリーを同定する段階。 A method of screening a population of mutant proteins comprising the following steps:
providing a microcapillary array comprising a plurality of microcapillaries, each microcapillary comprising a cell expression system expressing a mutant protein, a target molecule immobilized on the surface of the cell, and a reporter element, said the mutant protein associates with an immobilized target molecule in a microcapillary with a specific affinity and the cell expression system is an avian system; identifying at least one microcapillary of interest by measuring signal from at least one reporter element indicative of association with one immobilized target molecule.
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