JPWO2020208185A5 - - Google Patents
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Description
本開示の実施形態を、以下の項にさらに記載する：
［項１］
細胞集団中の標的細胞中の標的ポリヌクレオチド中に部位特異的変異を導入する方法であって、
（ａ）前記細胞集団内に、
（ｉ）塩基編集酵素と、
（ｉｉ）
（１）細胞毒性剤（ＣＡ）受容体をコードする遺伝子とハイブリダイズし、
（２）前記塩基編集酵素と第１の複合体を形成する、第１のガイドポリヌクレオチドであって、
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中で変異を提供し、前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中の前記変異は、前記細胞集団中でＣＡ耐性細胞を形成する、第１のガイドポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）
（１）前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、
（２）前記塩基編集酵素と第２の複合体を形成する、第２のガイドポリヌクレオチドであって、
前記第２の複合体の前記塩基編集酵素は、前記標的ポリヌクレオチド中で変異を提供する、第２のガイドポリヌクレオチドと、
を導入することと、
（ｂ）前記細胞集団を前記ＣＡと接触させることと、
（ｃ）前記細胞集団から前記ＣＡ耐性細胞を選択することにより、前記標的ポリヌクレオチド中の前記変異を含む前記標的細胞を富化することと、
を含む、方法。
［項２］
細胞集団中の塩基編集酵素の効力を決定する方法であって、
（ａ）前記細胞集団内に、
（ｉ）塩基編集酵素と、
（ｉｉ）
（１）細胞毒性剤（ＣＡ）受容体をコードする遺伝子とハイブリダイズし、
（２）前記塩基編集酵素と第１の複合体を形成する、第１のガイドポリヌクレオチドであって、
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中に変異を導入し、前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中の前記変異は、前記細胞集団中でＣＡ耐性細胞を形成する、第１のガイドポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）
（１）前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、
（２）前記塩基編集酵素と第２の複合体を形成する、第２のガイドポリヌクレオチドであって、
前記第２の複合体の前記塩基編集酵素は、前記標的ポリヌクレオチド中で変異を導入する、第２のガイドポリヌクレオチドと、
を導入することと、
（ｂ）前記細胞集団を前記ＣＡと接触させて、ＣＡ耐性細胞を単離することと、
（ｃ）前記ＣＡ耐性細胞と前記合計細胞集団との比を決定することによって、前記塩基編集酵素の前記効力を決定することと、
を含む、方法。
［項３］
前記塩基編集酵素は、ＤＮＡ標的化ドメイン及びＤＮＡ編集ドメインを含む、上記項１又は２に記載の方法。
［項４］
前記ＤＮＡ標的化ドメインはＣａｓ９を含む、上記項３に記載の方法。
［項５］
前記Ｃａｓ９は、触媒ドメイン中に変異を含む、上記項４に記載の方法。
［項６］
前記塩基編集酵素は、触媒的に不活性なＣａｓ９及びＤＮＡ編集ドメインを含む、上記項１～５のいずれか一項に記載の方法。
［項７］
前記塩基編集酵素は、一本鎖ＤＮＡ切断を生成することが可能なＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、及びＤＮＡ編集ドメインを含む、上記項１～５のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
前記ｎＣａｓ９は、野生型Ｃａｓ９に対する変異をアミノ酸残基Ｄ１０又はＨ８４０に含む（番号付けは配列番号３に対するものである）、上記項７に記載の方法。
［項９］
前記Ｃａｓ９は配列番号３又は４と少なくとも９０％同一である、上記項４～８のいずれか一項に記載の方法。
［項１０］
前記ＤＮＡ編集ドメインはデアミナーゼを含む、上記項３～９のいずれか一項に記載の方法。
［項１１］
前記デアミナーゼはシチジンデアミナーゼ又はアデノシンデアミナーゼである、上記項１０に記載の方法。
［項１２］
前記デアミナーゼはシチジンデアミナーゼである、上記項１１に記載の方法。
［項１３］
前記デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである、上記項１１に記載の方法。
［項１４］
前記デアミナーゼは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼ、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、ＡＤＡＴデアミナーゼ、又はＡＤＡＲデアミナーゼである、上記項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
［項１５］
前記デアミナーゼは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである、上記項１４に記載の方法。
［項１６］
前記デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ１である、上記項１５に記載の方法。
［項１７］
前記塩基編集酵素は、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤ドメインを更に含む、上記項３～１６のいずれか一項に記載の方法。
［項１８］
前記ＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）である、上記項１７に記載の方法。
［項１９］
前記塩基編集酵素は、ｎＣａｓ９及びシチジンデアミナーゼを含む、上記項１～４又は６～１８のいずれか一項に記載の方法。
［項２０］
前記塩基編集酵素は、ｎＣａｓ９及びアデノシンデアミナーゼを含む、上記項１～４又は６～１８のいずれか一項に記載の方法。
［項２１］
前記塩基編集酵素は、配列番号６と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む、上記項１～１２又は１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
［項２２］
前記塩基編集酵素はＢＥ３である、上記項１～１２又は１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
［項２３］
前記第１及び／又は第２のガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドである、上記項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
［項２４］
前記第１及び／又は第２のガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む、上記項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
［項２５］
前記細胞集団はヒト細胞である、上記項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
［項２６］
前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中の前記変異は、シチジン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への点変異である、上記項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
［項２７］
前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中の前記変異は、アデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への点変異である、上記項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
［項２８］
前記ＣＡはジフテリア毒素である、上記項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
［項２９］
前記細胞毒性剤（ＣＡ）受容体は、ジフテリア毒素の受容体である、上記項２８に記載の方法。
［項３０］
前記ＣＡ受容体は、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）である、上記項２９に記載の方法。
［項３１］
前記ＨＢ－ＥＧＦは、配列番号８のポリペプチド配列を含む、上記項３０に記載の方法。
［項３２］
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１０７～１４８のうち１つ以上における変異を提供する、上記項３１に記載の方法。
［項３３］
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１３８～１４４のうち１つ以上における変異を提供する、上記項３２に記載の方法。
［項３４］
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１４１における変異を提供する、上記項３３に記載の方法。
［項３５］
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸配列におけるＧＬＵ１４１からＬＹＳ１４１への変異を提供する、上記項３４に記載の方法。
［項３６］
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、ジフテリア毒素に結合するＨＢ－ＥＧＦの１領域中に変異を提供する、上記項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
［項３７］
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、前記標的細胞をジフテリア毒素耐性にする変異をＨＢ－ＥＧＦ中に提供する、上記項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
［項３８］
前記標的ポリヌクレオチド中の前記変異は、前記標的ポリヌクレオチド中でのシチジン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への点変異である、上記項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
［項３９］
前記標的ポリヌクレオチド中の前記変異は、前記標的ポリヌクレオチド中でのアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への点変異である、上記項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
［項４０］
前記塩基編集酵素は、前記塩基編集酵素をコードするポリヌクレオチドとして前記細胞集団中に導入される、上記項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
［項４１］
前記塩基編集酵素をコードする前記ポリヌクレオチド、前記（ｉｉ）の第１のガイドポリヌクレオチド、及び前記（ｉｉｉ）の第２のガイドポリヌクレオチドは、単一のベクター上にある、上記項４０に記載の方法。
［項４２］
前記塩基編集酵素をコードする前記ポリヌクレオチド、前記（ｉｉ）の第１のガイドポリヌクレオチド、及び前記（ｉｉｉ）の第２のガイドポリヌクレオチドは、１つ以上のベクター上にある、上記項４０に記載の方法。
［項４３］
前記ベクターはウイルスベクターである、上記項４１又は４２に記載の方法。
［項４４］
前記ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスである、上記項４３に記載の方法。
［項４５］
細胞のゲノム中の毒素感受性遺伝子（ＴＳＧ）遺伝子座中に、対象の配列（ＳＯＩ）の２対立遺伝子組込みを提供する方法であって、
（ａ）細胞集団内に、
（ｉ）二本鎖切断を生成することが可能なヌクレアーゼと、
（ｉｉ）前記ヌクレアーゼと複合体を形成し、且つ前記ＴＳＧ遺伝子座とハイブリダイズすることが可能なガイドポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）
（１）５’相同性アーム、３’相同性アーム、及び前記ＴＳＧの天然コード配列における変異であって、前記変異は前記毒素に対する耐性を付与する、変異と、
（２）前記ＳＯＩと、
を含むドナーポリヌクレオチドと、
を導入することであって、
（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を導入した結果、前記ＴＳＧ遺伝子座中に前記ドナーポリヌクレオチドが組み込まれる、導入することと、
（ｂ）前記細胞集団を前記毒素と接触させることと、
（ｃ）前記毒素に対して耐性のある１つ以上の細胞を選択することと、
を含み、
前記毒素に対して耐性のある前記１つ以上の細胞は、前記ＳＯＩの前記２対立遺伝子組込みを含む、方法。
［項４６］
前記ドナーポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって組み込まれる、上記項４５に記載の方法。
［項４７］
前記ドナーポリヌクレオチドは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって組み込まれる、上記項４５に記載の方法。
［項４８］
前記ＴＳＧ遺伝子座はイントロン及びエクソンを含む、上記項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
［項４９］
前記ドナーポリヌクレオチドは、スプライシングアクセプター配列を更に含む、上記項４８に記載の方法。
［項５０］
二本鎖切断を生成することが可能な前記ヌクレアーゼは、前記イントロン中に切断を生成する、上記項４８又は４９に記載の方法。
［項５１］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異は、前記ＴＳＧ遺伝子座の前記エクソンにおけるものである、上記項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
［項５２］
細胞のゲノム中の標的遺伝子座中に対象の配列（ＳＯＩ）を組み込む方法であって、
（ａ）細胞集団内に、
（ｉ）二本鎖切断を生成することが可能なヌクレアーゼと、
（ｉｉ）前記ヌクレアーゼと複合体を形成し、且つ前記細胞の前記ゲノム中の毒素感受性遺伝子（ＴＳＧ）遺伝子座とハイブリダイズすることが可能なガイドポリヌクレオチドであって、前記ＴＳＧが必須遺伝子である、ガイドポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）
（１）前記ＴＳＧの天然コード配列における変異を含む機能性ＴＳＧ遺伝子であって、前記変異は前記毒素に対する耐性を付与する、機能性ＴＳＧ遺伝子と、
（２）前記ＳＯＩと、
（３）前記標的遺伝子座におけるゲノム組込みのための配列と、
を含むドナーポリヌクレオチドと、
を導入することであって、
（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を導入した結果、
前記ヌクレアーゼによる前記細胞の前記ゲノム中における前記ＴＳＧの不活性化、及び
前記標的遺伝子座中における前記ドナーポリヌクレオチドの組込みがもたらされる、導入することと、
（ｂ）前記細胞集団を前記毒素と接触させることと、
（ｃ）前記毒素に対して耐性のある１つ以上の細胞を選択することであって、
前記毒素に対して耐性のある前記１つ以上の細胞は、前記標的遺伝子座中に組み込まれた前記ＳＯＩを含む、選択することと、
を含む、方法。
［項５３］
ゲノム組込みのための前記配列は、トランスポゾン又はレトロウイルスベクターから得られる、上記項５２に記載の方法。
［項５４］
前記ドナーポリヌクレオチドの前記機能性ＴＳＧは、前記ヌクレアーゼによる不活性化に対する耐性がある、上記項４５～５３のいずれか一項に記載の方法。
［項５５］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異により、前記天然コード配列からプロトスペーサー隣接モチーフが除去される、上記項４５～５４のいずれか一項に記載の方法。
［項５６］
前記ガイドポリヌクレオチドは、前記ドナーポリヌクレオチドの前記機能性ＴＳＧとハイブリダイズすることができない、上記項４５～５５のいずれか一項に記載の方法。
［項５７］
二本鎖切断を生成することが可能な前記ヌクレアーゼはＣａｓ９である、上記項４５～５６のいずれか一項に記載の方法。
［項５８］
前記Ｃａｓ９は、粘着末端を生成することが可能である、上記項５７に記載の方法。
［項５９］
前記Ｃａｓ９は、配列番号３又は４のポリペプチド配列を含む、上記項５７又は５８に記載の方法。
［項６０］
前記ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドである、上記項４５～５９のいずれか一項に記載の方法。
［項６１］
前記ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む、上記項４５～６０のいずれか一項に記載の方法。
［項６２］
前記ドナーポリヌクレオチドはベクターである、上記項４５～６１のいずれか一項に記載の方法。
［項６３］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異は、置換変異、挿入、又は欠失である、上記項４５～６２のいずれか一項に記載の方法。
［項６４］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異は、前記ＴＳＧによってコードされるタンパク質の毒素結合領域における変異である、上記項４５～６３のいずれか一項に記載の方法。
［項６５］
前記ＴＳＧ遺伝子座は、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）をコードする遺伝子を含む、上記項４５～６４のいずれか一項に記載の方法。
［項６６］
前記ＴＳＧは、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）をコードする、上記項４５～６５のいずれか一項に記載の方法。
［項６７］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異は、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１０７～１４８のうち１つ以上における変異である、上記項４５～６６のいずれか一項に記載の方法。
［項６８］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異は、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１３８～１４４のうち１つ以上における変異である、上記項６７に記載の方法。
［項６９］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異は、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１４１における変異である、上記項６８に記載の方法。
［項７０］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異は、ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）におけるＧＬＵ１４１からＬＹＳ１４１への変異である、上記項６９に記載の方法。
［項７１］
前記毒素はジフテリア毒素である、上記項６５～７０のいずれか一項に記載の方法。
［項７２］
前記ＴＳＧの前記天然コード配列における前記変異は、前記細胞をジフテリア毒素耐性にする、上記項６５～７１のいずれか一項に記載の方法。
［項７３］
前記毒素は抗体－薬剤コンジュゲートであり、前記ＴＳＧは、前記抗体－薬剤コンジュゲートの受容体をコードする、上記項４５～７２のいずれか一項に記載の方法。
［項７４］
ヒト細胞中でジフテリア毒素に対する耐性を提供する方法であって、前記細胞に、
（ｉ）塩基編集酵素と、
（ｉｉ）前記ヒト細胞中でヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）受容体を標的化するガイドポリヌクレオチドと、
を導入することを含み、
前記塩基編集酵素は、前記ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成し、前記塩基編集酵素は前記ＨＢ－ＥＧＦに対して標的化され、前記ＨＢ－ＥＧＦ中に部位特異的変異を提供することにより前記ヒト細胞中でジフテリア毒素耐性を提供する、方法。
［項７５］
前記塩基編集酵素は、ＤＮＡ標的化ドメイン及びＤＮＡ編集ドメインを含む、上記項７４に記載の方法。
［項７６］
前記ＤＮＡ標的化ドメインはＣａｓ９を含む、上記項７５に記載の方法。
［項７７］
前記Ｃａｓ９は、触媒ドメイン中に変異を含む、上記項７６に記載の方法。
［項７８］
前記塩基編集酵素は、触媒的に不活性なＣａｓ９及びＤＮＡ編集ドメインを含む、上記項７４～７７のいずれか一項に記載の方法。
［項７９］
前記塩基編集酵素は、一本鎖ＤＮＡ切断を生成することが可能なＣａｓ９（ｎＣａｓ９）、及びＤＮＡ編集ドメインを含む、上記項７４～７７のいずれか一項に記載の方法。
［項８０］
前記ｎＣａｓ９は、野生型Ｃａｓ９に対する変異をアミノ酸残基Ｄ１０又はＨ８４０に含む（番号付けは配列番号３に対するものである）、上記項７９に記載の方法。
［項８１］
前記Ｃａｓ９は配列番号３又は４と少なくとも９０％同一である、上記項７６～８０のいずれか一項に記載の方法。
［項８２］
前記ＤＮＡ編集ドメインはデアミナーゼを含む、上記項７５～８１のいずれか一項に記載の方法。
［項８３］
前記デアミナーゼはシチジンデアミナーゼ及びアデノシンデアミナーゼから選択される、上記項８２に記載の方法。
［項８４］
前記デアミナーゼはシチジンデアミナーゼである、上記項８３に記載の方法。
［項８５］
前記デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼである、上記項８３に記載の方法。
［項８６］
前記デアミナーゼは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼ、活性化誘発性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、ＡＤＡＴデアミナーゼ、及びＴａｄＡデアミナーゼから選択される、上記項８２～８５のいずれか一項に記載の方法。
［項８７］
前記デアミナーゼは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである、上記項８６に記載の方法。
［項８８］
前記シチジンデアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ１である、上記項８７に記載の方法。
［項８９］
前記塩基編集酵素は、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤ドメインを更に含む、上記項７４～８８のいずれか一項に記載の方法。
［項９０］
前記ＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）である、上記項８９に記載の方法。
［項９１］
前記塩基編集酵素は、ｎＣａｓ９及びシチジンデアミナーゼを含む、上記項７４～８４又は８６～９０のいずれか一項に記載の方法。
［項９２］
前記塩基編集酵素は、ｎＣａｓ９及びアデノシンデアミナーゼを含む、上記項７４～８３又は８５～９０のいずれか一項に記載の方法。
［項９３］
前記塩基編集酵素は、配列番号６と少なくとも９０％同一のポリペプチド配列を含む、上記項７４～８３又は８６～９１のいずれか一項に記載の方法。
［項９４］
前記塩基編集酵素はＢＥ３である、上記項７４～８３又は８６～９３のいずれか一項に記載の方法。
［項９５］
前記ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドである、上記項７４～９４のいずれか一項に記載の方法。
［項９６］
前記ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む、上記項７４～９５のいずれか一項に記載の方法。
［項９７］
前記部位特異的変異は、前記ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１０７～１４８のうち１つ以上におけるものである、上記項７４～９６のいずれか一項に記載の方法。
［項９８］
前記部位特異的変異は、前記ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１３８～１４４のうち１つ以上におけるものである、上記項９７に記載の方法。
［項９９］
前記部位特異的変異は、前記ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のアミノ酸１４１におけるものである、上記項９８に記載の方法。
［項１００］
前記部位特異的変異は、前記ＨＢ－ＥＧＦ（配列番号８）のＧＬＵ１４１からＬＹＳ１４１への変異である、上記項９９に記載の方法。
［項１０１］
前記部位特異的変異は、ジフテリア毒素に結合する前記ＨＢ－ＥＧＦの領域におけるものである、上記項７４～１００のいずれか一項に記載の方法。
［項１０２］
細胞のゲノム中の標的遺伝子座中に対象の配列（ＳＯＩ）を組み込んで富化する方法であって、
（ａ）細胞集団内に、
（ｉ）二本鎖切断を生成することが可能なヌクレアーゼと、
（ｉｉ）前記ヌクレアーゼと複合体を形成し、且つ前記細胞の前記ゲノム中の必須遺伝子（ＥｘＧ）遺伝子座とハイブリダイズすることが可能なガイドポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）
（１）前記ＥｘＧの天然コード配列における変異を含む機能性ＥｘＧ遺伝子であって、前記変異は前記ガイドポリヌクレオチドによる不活性化に対する耐性を付与する、機能性ＥｘＧ遺伝子と、
（２）前記ＳＯＩと、
（３）前記標的遺伝子座におけるゲノム組込みのための配列と、
を含むドナーポリヌクレオチドと、
を導入することであって、
（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）を導入した結果、
前記ヌクレアーゼによる前記細胞の前記ゲノム中における前記ＥｘＧの不活性化、及び
前記標的遺伝子座中における前記ドナーポリヌクレオチドの組込みがもたらされる、
導入することと、
（ｂ）前記細胞を栽培することと、
（ｃ）１つ以上の生存細胞を選択することであって、
前記１つ以上の生存細胞は、前記標的遺伝子座において組み込まれた前記ＳＯＩを含む、選択することと、
を含む、方法。
［項１０３］
安定なエピソームベクターを細胞中に導入する方法であって、
（ａ）細胞集団内に、
（ｉ）二本鎖切断を生成することが可能なヌクレアーゼと、
（ｉｉ）前記ヌクレアーゼと複合体を形成し、且つ前記細胞の前記ゲノム中の必須遺伝子（ＥｘＧ）遺伝子座とハイブリダイズすることが可能なガイドポリヌクレオチドであって、
（ｉ）及び（ｉｉ）を導入した結果、前記ヌクレアーゼによる前記細胞の前記ゲノム中における前記ＥｘＧの不活性化がもたらされる、ガイドポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）
（１）前記ＥｘＧの天然コード配列における変異を含む機能性ＥｘＧであって、前記変異は前記ヌクレアーゼによる前記不活性化に対する耐性を付与する、機能性ＥｘＧと、
（２）自律的ＤＮＡ複製配列と、
を含むエピソームベクターと、
を導入することと、
（ｂ）前記細胞を栽培することと、
（ｃ）１つ以上の生存細胞を選択することと、を含み、
前記１つ以上の生存細胞は前記エピソームベクターを含む、方法。
［項１０４］
前記ＥｘＧの前記天然コード配列における変異により、前記天然コード配列からプロトスペーサー隣接モチーフが除去される、上記項１０２又は１０３に記載の方法。
［項１０５］
前記ガイドポリヌクレオチドは、前記ドナーポリヌクレオチド又は前記エピソームベクターの前記機能性ＥｘＧとハイブリダイズすることができない、上記項１０２～１０４のいずれか一項に記載の方法。
［項１０６］
二本鎖切断を生成することが可能な前記ヌクレアーゼはＣａｓ９である、上記項１０２～１０５のいずれか一項に記載の方法。
［項１０７］
前記Ｃａｓ９は、粘着末端を生成することが可能である、上記項１０６に記載の方法。
［項１０８］
前記Ｃａｓ９は、配列番号３又は４のポリペプチド配列を含む、上記項１０４又は１０７に記載の方法。
［項１０９］
前記ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドである、上記項１０２～１０８のいずれか一項に記載の方法。
［項１１０］
前記ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を更に含む、上記項１０２～１０９のいずれか一項に記載の方法。
［項１１１］
前記ドナーポリヌクレオチドはベクターである、上記項１０２～１１０のいずれか一項に記載の方法。
［項１１２］
前記ＥｘＧの前記天然コード配列における前記変異は、置換変異、挿入、又は欠失である、上記項１０２～１１１のいずれか一項に記載の方法。
［項１１３］
ゲノム組込みのための前記配列は、トランスポゾン又はレトロウイルスベクターから得られる、上記項１０２又は１０４～１１２のいずれか一項に記載の方法。
［項１１４］
前記エピソームベクターは、人工染色体又はプラスミドである、上記項１０３～１１２のいずれか一項に記載の方法。
［項１１５］
２つ以上のガイドポリヌクレオチドが前記細胞集団内に導入され、各ガイドポリヌクレオチドは、前記ヌクレアーゼと複合体を形成し、各ガイドポリヌクレオチドは、前記ＥｘＧの異なる領域とハイブリダイズする、上記項１０２～１１４のいずれか一項に記載の方法。
［項１１６］
前記標的遺伝子座に組み込まれた前記ＳＯＩを含む生存細胞を富化するために、前記（ａ）（ｉ）のヌクレアーゼ及び前記（ａ）（ｉｉ）のガイドポリヌクレオチドを前記生存細胞内に導入することを更に含む、上記項１０２、１０４～１１３、又は１１５のいずれか一項に記載の方法。
［項１１７］
前記エピソームベクターを含む生存細胞を富化するために、前記（ａ）（ｉ）のヌクレアーゼ及び前記（ａ）（ｉｉ）のガイドポリヌクレオチドを前記生存細胞内に導入することを更に含む、上記項１０３～１１２、１１４、又は１１５のいずれか一項に記載の方法。
［項１１８］
複数の富化ラウンドのために、前記（ａ）（ｉ）のヌクレアーゼ及び前記（ａ）（ｉｉ）のガイドポリヌクレオチドが前記生存細胞に導入される、上記項１１６又は１１７に記載の方法。
本明細書に引用される全ての参考文献、例えば、特許、特許出願、論文、教科書など、及びこれらに引用される参考文献は、それらがまだ引用されていない限りにおいて、その全体が参照により本明細書中に援用される。
Embodiments of the present disclosure are further described in the following sections:
[Section 1]
A method of introducing site-directed mutations into target polynucleotides in target cells in a cell population, comprising:
(a) within said cell population,
(i) a base-editing enzyme;
(ii)
(1) hybridizes with a gene encoding a cytotoxic agent (CA) receptor;
(2) a first guide polynucleotide that forms a first complex with the base-editing enzyme,
The base-editing enzyme of the first complex provides a mutation in the gene encoding the CA receptor, and the mutation in the gene encoding the CA receptor is associated with CA in the cell population. a first guide polynucleotide that forms a resistant cell;
(iii)
(1) hybridize with the target polynucleotide;
(2) a second guide polynucleotide that forms a second complex with the base-editing enzyme,
a second guide polynucleotide, wherein the base-editing enzyme of the second complex provides mutations in the target polynucleotide;
and
(b) contacting said cell population with said CA;
(c) enriching said target cells containing said mutation in said target polynucleotide by selecting said CA-resistant cells from said cell population;
A method, including
[Section 2]
A method for determining the potency of a base-editing enzyme in a cell population, comprising:
(a) within said cell population,
(i) a base-editing enzyme;
(ii)
(1) hybridizes with a gene encoding a cytotoxic agent (CA) receptor;
(2) a first guide polynucleotide that forms a first complex with the base-editing enzyme,
The base-editing enzyme of the first complex introduces a mutation in the gene encoding the CA receptor, and the mutation in the gene encoding the CA receptor causes CA in the cell population. a first guide polynucleotide that forms a resistant cell;
(iii)
(1) hybridize with the target polynucleotide;
(2) a second guide polynucleotide that forms a second complex with the base-editing enzyme,
A second guide polynucleotide in which the base-editing enzyme of the second complex introduces mutations in the target polynucleotide;
and
(b) contacting said cell population with said CA to isolate CA-resistant cells;
(c) determining the potency of the base-editing enzyme by determining the ratio of the CA-resistant cells to the total cell population;
A method, including
[Section 3]
3. The method according to item 1 or 2, wherein the base editing enzyme comprises a DNA targeting domain and a DNA editing domain.
[Section 4]
4. The method of clause 3, wherein the DNA targeting domain comprises Cas9.
[Section 5]
5. The method of claim 4, wherein the Cas9 comprises mutations in the catalytic domain.
[Section 6]
6. The method according to any one of items 1 to 5, wherein the base editing enzyme comprises catalytically inactive Cas9 and a DNA editing domain.
[Section 7]
6. The method according to any one of items 1 to 5, wherein the base editing enzyme comprises Cas9 (nCas9) capable of generating single-stranded DNA breaks and a DNA editing domain.
[Item 8]
8. The method of clause 7, wherein said nCas9 comprises a mutation relative to wild-type Cas9 at amino acid residue D10 or H840 (numbering is relative to SEQ ID NO:3).
[Item 9]
9. The method of any one of clauses 4-8, wherein said Cas9 is at least 90% identical to SEQ ID NO:3 or 4.
[Item 10]
10. The method of any one of clauses 3-9, wherein said DNA editing domain comprises a deaminase.
[Item 11]
11. The method according to item 10, wherein the deaminase is cytidine deaminase or adenosine deaminase.
[Item 12]
12. The method according to item 11, wherein the deaminase is cytidine deaminase.
[Item 13]
12. The method according to item 11, wherein the deaminase is adenosine deaminase.
[Item 14]
14. Any one of the above items 10 to 13, wherein the deaminase is apolipoprotein B mRNA editing complex (APOBEC) deaminase, activation-induced cytidine deaminase (AID), ACF1/ASE deaminase, ADAT deaminase, or ADAR deaminase. described method.
[Item 15]
15. The method of item 14, wherein the deaminase is an apolipoprotein B mRNA editing complex (APOBEC) family deaminase.
[Item 16]
16. The method according to item 15, wherein the deaminase is APOBEC1.
[Item 17]
17. The method according to any one of items 3 to 16 above, wherein the base-editing enzyme further comprises a DNA glycosylase inhibitor domain.
[Item 18]
18. The method of item 17, wherein the DNA glycosylase is uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI).
[Item 19]
The method according to any one of items 1 to 4 or 6 to 18 above, wherein the base editing enzyme includes nCas9 and cytidine deaminase.
[Section 20]
The method according to any one of items 1 to 4 or 6 to 18 above, wherein the base editing enzyme includes nCas9 and adenosine deaminase.
[Section 21]
20. The method according to any one of items 1 to 12 or 13 to 19 above, wherein the base editing enzyme comprises a polypeptide sequence that is at least 90% identical to SEQ ID NO:6.
[Section 22]
20. The method according to any one of items 1 to 12 or 13 to 19, wherein the base editing enzyme is BE3.
[Section 23]
23. The method of any one of the preceding items 1-22, wherein the first and/or second guide polynucleotides are RNA polynucleotides.
[Section 24]
24. The method of any one of the preceding clauses 1-23, wherein said first and/or second guide polynucleotide further comprises a tracrRNA sequence.
[Section 25]
25. The method of any one of the preceding items 1-24, wherein the cell population is human cells.
[Section 26]
26. The method of any one of the preceding clauses 1-25, wherein the mutation in the gene encoding the CA receptor is a point mutation from cytidine (C) to thymine (T).
[Section 27]
26. The method of any one of the preceding clauses 1-25, wherein the mutation in the gene encoding the CA receptor is a point mutation from adenine (A) to guanine (G).
[Section 28]
28. The method of any one of the preceding clauses 1-27, wherein the CA is diphtheria toxin.
[Section 29]
29. The method of paragraph 28, wherein the cytotoxic agent (CA) receptor is a receptor for diphtheria toxin.
[Item 30]
30. The method of paragraph 29, wherein the CA receptor is heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF).
[Item 31]
31. The method of claim 30, wherein said HB-EGF comprises the polypeptide sequence of SEQ ID NO:8.
[Item 32]
32. The method of Clause 31, wherein said base-editing enzyme of said first complex provides mutations in one or more of amino acids 107-148 of HB-EGF (SEQ ID NO:8).
[Item 33]
33. The method of Clause 32, wherein said base-editing enzyme of said first complex provides mutations in one or more of amino acids 138-144 of HB-EGF (SEQ ID NO:8).
[Item 34]
34. The method of Clause 33, wherein said base editing enzyme of said first complex provides a mutation at amino acid 141 of HB-EGF (SEQ ID NO: 8).
[Item 35]
35. The method of paragraph 34, wherein the base-editing enzyme of the first complex provides a mutation from GLU141 to LYS141 in the amino acid sequence of HB-EGF (SEQ ID NO:8).
[Item 36]
36. The method of any one of the preceding paragraphs, wherein the base-editing enzyme of the first complex provides mutations in a region of HB-EGF that binds diphtheria toxin.
[Item 37]
37. The method of any one of the preceding paragraphs, wherein the base-editing enzyme of the first complex provides a mutation in HB-EGF that renders the target cell resistant to diphtheria toxin.
[Item 38]
38. The method of any one of the preceding paragraphs, wherein said mutation in said target polynucleotide is a point mutation from cytidine (C) to thymine (T) in said target polynucleotide.
[Item 39]
38. The method of any one of the preceding paragraphs, wherein said mutation in said target polynucleotide is a point mutation from adenine (A) to guanine (G) in said target polynucleotide.
[Item 40]
40. The method according to any one of items 1 to 39, wherein the base-editing enzyme is introduced into the cell population as a polynucleotide encoding the base-editing enzyme.
[Item 41]
41. The above item 40, wherein the polynucleotide encoding the base editing enzyme, the first guide polynucleotide of (ii), and the second guide polynucleotide of (iii) are on a single vector. the method of.
[Item 42]
41. The above item 40, wherein the polynucleotide encoding the base editing enzyme, the first guide polynucleotide of (ii), and the second guide polynucleotide of (iii) are on one or more vectors. described method.
[Item 43]
43. The method according to item 41 or 42, wherein the vector is a viral vector.
[Item 44]
44. The method of paragraph 43, wherein the viral vector is adenovirus, lentivirus, or adeno-associated virus.
[Item 45]
A method of providing biallelic integration of a sequence of interest (SOI) into a toxin susceptibility gene (TSG) locus in the genome of a cell, comprising:
(a) within the cell population,
(i) a nuclease capable of generating double-strand breaks;
(ii) a guide polynucleotide capable of forming a complex with said nuclease and hybridizing with said TSG locus;
(iii)
(1) mutations in the 5' homology arm, the 3' homology arm, and the native coding sequence of said TSG, said mutation conferring resistance to said toxin;
(2) the SOI;
a donor polynucleotide comprising
by introducing
introducing (i), (ii), and (iii) results in the integration of the donor polynucleotide into the TSG locus;
(b) contacting the cell population with the toxin;
(c) selecting one or more cells resistant to said toxin;
including
The method, wherein said one or more cells resistant to said toxin comprise said biallelic integration of said SOI.
[Section 46]
46. The method of paragraph 45, wherein the donor polynucleotide is integrated by homologous recombination repair (HDR).
[Section 47]
46. The method of paragraph 45, wherein the donor polynucleotide is incorporated by non-homologous end joining (NHEJ).
[Item 48]
48. The method of any one of paragraphs 45-47, wherein the TSG locus comprises introns and exons.
[Item 49]
49. The method of Claim 48, wherein said donor polynucleotide further comprises a splicing acceptor sequence.
[Item 50]
50. The method of paragraphs 48 or 49, wherein said nuclease capable of producing a double-strand break produces a break in said intron.
[Section 51]
51. The method of any one of clauses 48-50, wherein said mutation in said native coding sequence of said TSG is in said exon of said TSG locus.
[Section 52]
A method of integrating a sequence of interest (SOI) into a target locus in the genome of a cell, comprising:
(a) within the cell population,
(i) a nuclease capable of generating double-strand breaks;
(ii) a guide polynucleotide capable of forming a complex with said nuclease and hybridizing to a toxin susceptibility gene (TSG) locus in said genome of said cell, said TSG being an essential gene; , a guide polynucleotide, and
(iii)
(1) a functional TSG gene comprising a mutation in the native coding sequence of said TSG, said mutation conferring resistance to said toxin;
(2) the SOI;
(3) a sequence for genomic integration at said target locus;
a donor polynucleotide comprising
by introducing
As a result of introducing (i), (ii), and (iii),
introducing, resulting in inactivation of the TSG in the genome of the cell by the nuclease and integration of the donor polynucleotide in the target locus;
(b) contacting the cell population with the toxin;
(c) selecting one or more cells resistant to said toxin,
selecting, wherein said one or more cells resistant to said toxin comprise said SOI integrated into said target locus;
A method, including
[Section 53]
53. The method of Claim 52, wherein said sequence for genomic integration is obtained from a transposon or retroviral vector.
[Section 54]
54. The method of any one of paragraphs 45-53, wherein said functional TSG of said donor polynucleotide is resistant to inactivation by said nuclease.
[Section 55]
55. The method of any one of paragraphs 45-54, wherein said mutation in said native coding sequence of said TSG removes a protospacer flanking motif from said native coding sequence.
[Section 56]
56. The method of any one of clauses 45-55, wherein said guide polynucleotide is incapable of hybridizing with said functional TSG of said donor polynucleotide.
[Section 57]
57. The method of any one of paragraphs 45-56, wherein said nuclease capable of generating double-strand breaks is Cas9.
[Section 58]
58. The method of Clause 57, wherein said Cas9 is capable of generating sticky ends.
[Section 59]
59. The method of paragraphs 57 or 58, wherein said Cas9 comprises the polypeptide sequence of SEQ ID NO:3 or 4.
[Section 60]
60. The method of any one of paragraphs 45-59, wherein the guide polynucleotide is an RNA polynucleotide.
[Section 61]
61. The method of any one of paragraphs 45-60, wherein the guide polynucleotide further comprises a tracrRNA sequence.
[Section 62]
62. The method of any one of paragraphs 45-61, wherein said donor polynucleotide is a vector.
[Section 63]
63. The method of any one of paragraphs 45-62, wherein said mutation in said native coding sequence of said TSG is a substitution mutation, insertion, or deletion.
[Section 64]
64. The method of any one of paragraphs 45-63, wherein the mutation in the native coding sequence of the TSG is a mutation in the toxin binding region of the protein encoded by the TSG.
[Section 65]
65. The method of any one of clauses 45-64, wherein the TSG locus comprises a gene encoding heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF).
[Section 66]
66. The method of any one of paragraphs 45-65, wherein said TSG encodes HB-EGF (SEQ ID NO: 8).
[Section 67]
67. The method of any one of paragraphs 45-66, wherein said mutation in said native coding sequence of said TSG is a mutation in one or more of amino acids 107-148 of HB-EGF (SEQ ID NO: 8).
[Section 68]
68. The method of Clause 67, wherein said mutation in said native coding sequence of said TSG is a mutation in one or more of amino acids 138-144 of HB-EGF (SEQ ID NO: 8).
[Section 69]
69. The method of paragraph 68, wherein said mutation in said native coding sequence of said TSG is a mutation at amino acid 141 of HB-EGF (SEQ ID NO: 8).
[Section 70]
70. The method of paragraph 69, wherein said mutation in said native coding sequence of said TSG is a GLU141 to LYS141 mutation in HB-EGF (SEQ ID NO:8).
[Section 71]
71. The method of any one of paragraphs 65-70, wherein said toxin is diphtheria toxin.
[Section 72]
72. The method of any one of paragraphs 65-71, wherein said mutation in said native coding sequence of said TSG renders said cell resistant to diphtheria toxin.
[Section 73]
73. The method of any one of clauses 45-72, wherein said toxin is an antibody-drug conjugate and said TSG encodes a receptor for said antibody-drug conjugate.
[Section 74]
A method of providing resistance to diphtheria toxin in a human cell, comprising:
(i) a base-editing enzyme;
(ii) a guide polynucleotide targeting a heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptor in said human cell;
including introducing
The base-editing enzyme is complexed with the guide polynucleotide, the base-editing enzyme is targeted to the HB-EGF, and the human gene by providing site-directed mutations in the HB-EGF. A method of providing diphtheria toxin resistance in a cell.
[Section 75]
75. The method of Claim 74, wherein said base editing enzyme comprises a DNA targeting domain and a DNA editing domain.
[Section 76]
76. The method of Clause 75, wherein said DNA targeting domain comprises Cas9.
[Section 77]
77. The method of clause 76, wherein said Cas9 comprises a mutation in the catalytic domain.
[Section 78]
78. The method of any one of clauses 74-77, wherein the base editing enzyme comprises a catalytically inactive Cas9 and a DNA editing domain.
[Section 79]
78. The method of any one of the above clauses 74-77, wherein the base editing enzyme comprises Cas9 (nCas9) capable of producing single-stranded DNA breaks and a DNA editing domain.
[Section 80]
80. The method of Clause 79, wherein said nCas9 comprises a mutation relative to wild-type Cas9 at amino acid residue D10 or H840 (numbering is relative to SEQ ID NO:3).
[Section 81]
81. The method of any one of clauses 76-80, wherein said Cas9 is at least 90% identical to SEQ ID NO:3 or 4.
[Section 82]
82. The method of any one of paragraphs 75-81, wherein said DNA editing domain comprises a deaminase.
[Section 83]
83. The method of Claim 82, wherein said deaminase is selected from cytidine deaminase and adenosine deaminase.
[Section 84]
84. The method of Claim 83, wherein said deaminase is cytidine deaminase.
[Section 85]
84. The method of Claim 83, wherein said deaminase is adenosine deaminase.
[Section 86]
86. Any one of paragraphs 82 to 85 above, wherein the deaminase is selected from apolipoprotein B mRNA editing complex (APOBEC) deaminase, activation-induced cytidine deaminase (AID), ACF1/ASE deaminase, ADAT deaminase, and TadA deaminase. The method described in section.
[Section 87]
87. The method of Clause 86, wherein said deaminase is an apolipoprotein B mRNA editing complex (APOBEC) family deaminase.
[Section 88]
88. The method of Clause 87, wherein said cytidine deaminase is APOBEC1.
[Section 89]
89. The method of any one of the above items 74-88, wherein the base editing enzyme further comprises a DNA glycosylase inhibitor domain.
[Item 90]
90. The method of Clause 89, wherein said DNA glycosylase is uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI).
[Item 91]
The method according to any one of items 74 to 84 or 86 to 90 above, wherein the base editing enzyme comprises nCas9 and cytidine deaminase.
[Item 92]
The method according to any one of items 74 to 83 or 85 to 90 above, wherein the base editing enzyme comprises nCas9 and adenosine deaminase.
[Item 93]
92. The method of any one of paragraphs 74-83 or 86-91 above, wherein said base editing enzyme comprises a polypeptide sequence that is at least 90% identical to SEQ ID NO:6.
[Item 94]
94. The method according to any one of the above items 74-83 or 86-93, wherein the base editing enzyme is BE3.
[Item 95]
95. The method of any one of paragraphs 74-94, wherein the guide polynucleotide is an RNA polynucleotide.
[Item 96]
96. The method of any one of paragraphs 74-95, wherein the guide polynucleotide further comprises a tracrRNA sequence.
[Item 97]
97. The method of any one of paragraphs 74-96, wherein said site-directed mutation is at one or more of amino acids 107-148 of said HB-EGF (SEQ ID NO: 8).
[Item 98]
98. The method of Clause 97, wherein said site-directed mutation is at one or more of amino acids 138-144 of said HB-EGF (SEQ ID NO:8).
[Item 99]
99. The method of Clause 98, wherein said site-directed mutation is at amino acid 141 of said HB-EGF (SEQ ID NO:8).
[Item 100]
100. The method of Clause 99, wherein said site-directed mutation is a mutation of said HB-EGF (SEQ ID NO: 8) from GLU141 to LYS141.
[Item 101]
101. The method of any one of paragraphs 74-100, wherein said site-directed mutation is in the region of said HB-EGF that binds diphtheria toxin.
[Item 102]
1. A method of integrating and enriching a sequence of interest (SOI) into a target locus in the genome of a cell, comprising:
(a) within the cell population,
(i) a nuclease capable of generating double-strand breaks;
(ii) a guide polynucleotide capable of forming a complex with said nuclease and hybridizing with an essential gene (ExG) locus in said genome of said cell;
(iii)
(1) a functional ExG gene comprising a mutation in the native coding sequence of said ExG, said mutation conferring resistance to inactivation by said guide polynucleotide;
(2) the SOI;
(3) a sequence for genomic integration at said target locus;
a donor polynucleotide comprising
by introducing
As a result of introducing (i), (ii), and (iii),
resulting in inactivation of the ExG in the genome of the cell by the nuclease and integration of the donor polynucleotide in the target locus;
to introduce and
(b) cultivating the cells;
(c) selecting one or more viable cells,
selecting, wherein the one or more viable cells comprise the SOI integrated at the target locus;
A method, including
[Item 103]
A method of introducing a stable episomal vector into a cell, comprising:
(a) within the cell population,
(i) a nuclease capable of generating double-strand breaks;
(ii) a guide polynucleotide capable of forming a complex with said nuclease and hybridizing with an essential gene (ExG) locus in said genome of said cell,
a guide polynucleotide whose introduction of (i) and (ii) results in inactivation of said ExG in said genome of said cell by said nuclease;
(iii)
(1) a functional ExG comprising a mutation in the native coding sequence of said ExG, said mutation conferring resistance to said inactivation by said nuclease;
(2) an autonomous DNA replication sequence;
an episomal vector comprising
and
(b) cultivating the cells;
(c) selecting one or more viable cells;
The method, wherein said one or more viable cells contain said episomal vector.
[Item 104]
104. The method of paragraphs 102 or 103, wherein the mutation in the native coding sequence of said ExG removes a protospacer flanking motif from the native coding sequence.
[Item 105]
105. The method of any one of paragraphs 102-104, wherein said guide polynucleotide cannot hybridize with said functional ExG of said donor polynucleotide or said episomal vector.
[Item 106]
106. The method of any one of paragraphs 102-105, wherein said nuclease capable of generating double-strand breaks is Cas9.
[Item 107]
107. The method of Clause 106, wherein said Cas9 is capable of generating sticky ends.
[Item 108]
108. The method of paragraph 104 or 107, wherein the Cas9 comprises the polypeptide sequence of SEQ ID NO:3 or 4.
[Item 109]
109. The method of any one of paragraphs 102-108, wherein the guide polynucleotide is an RNA polynucleotide.
[Item 110]
110. The method of any one of paragraphs 102-109, wherein the guide polynucleotide further comprises a tracrRNA sequence.
[Item 111]
111. The method of any one of paragraphs 102-110, wherein said donor polynucleotide is a vector.
[Item 112]
112. The method of any one of paragraphs 102-111, wherein said mutation in said native coding sequence of said ExG is a substitution mutation, insertion or deletion.
[Item 113]
113. The method of any one of paragraphs 102 or 104-112 above, wherein said sequence for genomic integration is obtained from a transposon or retroviral vector.
[Item 114]
113. The method according to any one of items 103 to 112, wherein the episomal vector is an artificial chromosome or a plasmid.
[Item 115]
102, above, wherein two or more guide polynucleotides are introduced into said cell population, each guide polynucleotide forming a complex with said nuclease, each guide polynucleotide hybridizing to a different region of said ExG. 114. The method of any one of claims 1-114.
[Item 116]
introducing the nuclease of (a)(i) and the guide polynucleotide of (a)(ii) into the viable cells to enrich for viable cells containing the SOI integrated at the target locus 116. The method of any one of the above clauses 102, 104-113, or 115, further comprising:
[Item 117]
The above paragraph, further comprising introducing said nuclease of (a)(i) and said guide polynucleotide of (a)(ii) into said viable cells to enrich for viable cells containing said episomal vector. 115. The method of any one of 103-112, 114, or 115.
[Item 118]
118. The method of paragraphs 116 or 117, wherein the nuclease of (a)(i) and the guide polynucleotide of (a)(ii) are introduced into the viable cells for multiple rounds of enrichment.
All references cited herein, such as patents, patent applications, papers, textbooks, etc., and references cited therein, to the extent they are not already cited, are hereby incorporated by reference in their entirety. Incorporated throughout the specification.
Claims (24)
（ａ）前記細胞集団内に、
（ｉ）塩基編集酵素と、
（ｉｉ）
（１）細胞毒性剤（ＣＡ）受容体をコードする遺伝子とハイブリダイズし、
（２）前記塩基編集酵素と第１の複合体を形成する、第１のガイドポリヌクレオチドであって、
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中で変異を提供し、前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中の前記変異は、前記細胞集団中でＣＡ耐性細胞を形成する、第１のガイドポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）
（１）前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、
（２）前記塩基編集酵素と第２の複合体を形成する、第２のガイドポリヌクレオチドであって、
前記第２の複合体の前記塩基編集酵素は、前記標的ポリヌクレオチド中で変異を提供する、第２のガイドポリヌクレオチドと、
を導入することと、
（ｂ）前記細胞集団を前記ＣＡと接触させることと、
（ｃ）前記細胞集団から前記ＣＡ耐性細胞を選択することにより、前記標的ポリヌクレオチド中の前記変異を含む前記標的細胞を富化することと、
を含む、方法。 An in vitro method for introducing site-directed mutations into target polynucleotides in target cells in a cell population, comprising:
(a) within said cell population,
(i) a base-editing enzyme;
(ii)
(1) hybridizes with a gene encoding a cytotoxic agent (CA) receptor;
(2) a first guide polynucleotide that forms a first complex with the base-editing enzyme,
The base-editing enzyme of the first complex provides a mutation in the gene encoding the CA receptor, and the mutation in the gene encoding the CA receptor is associated with CA in the cell population. a first guide polynucleotide that forms a resistant cell;
(iii)
(1) hybridize with the target polynucleotide;
(2) a second guide polynucleotide that forms a second complex with the base-editing enzyme,
a second guide polynucleotide, wherein the base-editing enzyme of the second complex provides mutations in the target polynucleotide;
and
(b) contacting said cell population with said CA;
(c) enriching said target cells containing said mutation in said target polynucleotide by selecting said CA-resistant cells from said cell population;
A method, including
（ａ）前記細胞集団内に、
（ｉ）塩基編集酵素と、
（ｉｉ）
（１）細胞毒性剤（ＣＡ）受容体をコードする遺伝子とハイブリダイズし、
（２）前記塩基編集酵素と第１の複合体を形成する、第１のガイドポリヌクレオチドであって、
前記第１の複合体の前記塩基編集酵素は、前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中に変異を導入し、前記ＣＡ受容体をコードする前記遺伝子中の前記変異は、前記細胞集団中でＣＡ耐性細胞を形成する、第１のガイドポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）
（１）前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、
（２）前記塩基編集酵素と第２の複合体を形成する、第２のガイドポリヌクレオチドであって、
前記第２の複合体の前記塩基編集酵素は、前記標的ポリヌクレオチド中で変異を導入する、第２のガイドポリヌクレオチドと、
を導入することと、
（ｂ）前記細胞集団を前記ＣＡと接触させて、ＣＡ耐性細胞を単離することと、
（ｃ）前記ＣＡ耐性細胞と前記合計細胞集団との比を決定することによって、前記塩基編集酵素の前記効力を決定することと、
を含む、方法。 An in vitro method for determining the potency of a base-editing enzyme in a cell population comprising:
(a) within said cell population,
(i) a base-editing enzyme;
(ii)
(1) hybridizes with a gene encoding a cytotoxic agent (CA) receptor;
(2) a first guide polynucleotide that forms a first complex with the base-editing enzyme,
The base-editing enzyme of the first complex introduces a mutation in the gene encoding the CA receptor, and the mutation in the gene encoding the CA receptor causes CA in the cell population. a first guide polynucleotide that forms a resistant cell;
(iii)
(1) hybridize with the target polynucleotide;
(2) a second guide polynucleotide that forms a second complex with the base-editing enzyme,
A second guide polynucleotide in which the base-editing enzyme of the second complex introduces mutations in the target polynucleotide;
and
(b) contacting said cell population with said CA to isolate CA-resistant cells;
(c) determining the potency of the base-editing enzyme by determining the ratio of the CA-resistant cells to the total cell population;
A method, including
（ｉ）塩基編集酵素と、
（ｉｉ）前記ヒト細胞中でヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）受容体を標的化するガイドポリヌクレオチドと、
を導入することを含み、
前記塩基編集酵素は、前記ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成し、前記塩基編集酵素は前記ＨＢ－ＥＧＦに対して標的化され、前記ＨＢ－ＥＧＦ中に部位特異的変異を提供することにより前記ヒト細胞中でジフテリア毒素耐性を提供する、方法。 An in vitro method of providing resistance to diphtheria toxin in human cells, comprising:
(i) a base-editing enzyme;
(ii) a guide polynucleotide targeting a heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptor in said human cell;
including introducing
The base-editing enzyme is complexed with the guide polynucleotide, the base-editing enzyme is targeted to the HB-EGF, and the human gene by providing site-directed mutations in the HB-EGF. A method of providing diphtheria toxin resistance in a cell.
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