JPWO2020180645A5 - - Google Patents

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Claims (27)

式Ｉの標識プローブであって、
Figure 2020180645000001
式中、Ｂがヌクレオチド塩基であり、Ｒが電気化学発光標識であり、Ｌ１が連結基であり、Ｌ２が連結基であり、ｊが０～１１の整数であり、ｋが０～１の整数であり、ｍが０～１１の整数であり、ｎが０～５の整数である、標識プローブ。 A labeled probe of formula I,
Figure 2020180645000001
wherein B is a nucleotide base, R is an electrochemiluminescent label, L 1 is a linking group, L 2 is a linking group, j is an integer of 0-11, and k is 0-1. m is an integer from 0-11, and n is an integer from 0-5. （ｉ） 式ＩのＲがルテニウム錯体ＲＰ１Ｐ２Ｐ３を含み、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３のそれぞれが独立して、ビピリジン、置換ビピリジン、フェナントロリン、または置換フェナントロリンであるか、
（ｉｉ） 式ＩのＲが、
Figure 2020180645000002
であるか、
（ｉｉｉ） 式ＩのＢが、ウラシルの５位でＬ１に付着したウラシルであるか、
（ｉｖ） 式ＩのＬ１が、
Figure 2020180645000003
 、
またはそれらの組み合わせを含み、式中、ｐが１～１２の整数であるか、
（ｖ） 式ＩのＬ２が、
Figure 2020180645000004
 、
またはそれらの組み合わせを含み、式中、ｑが０～１１の整数であるか、
（ｖｉ） ｋが０、ｊがｍ、およびｎが５であるか、
（ｖｉｉ） 式Ｉの前記オリゴヌクレオチドが、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号３１）または５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号３２）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、または
（ｖｉｉｉ） （ｉ）～（ｖｉｉ）の任意の組み合わせである、
請求項１に記載の標識プローブ。 (i) R of formula I comprises a ruthenium complex RP 1 P 2 P 3 and each of P 1 , P 2 and P 3 is independently bipyridine, substituted bipyridine, phenanthroline, or substituted phenanthroline;
(ii) R of formula I is
Figure 2020180645000002
or
(iii) B of Formula I is uracil attached to L1 at position 5 of uracil;
(iv) L 1 of Formula I is
Figure 2020180645000003
 ,
or combinations thereof, wherein p is an integer from 1 to 12;
(v) L2 of Formula I is
Figure 2020180645000004
 ,
or combinations thereof, wherein q is an integer from 0 to 11;
(vi) k is 0, j is m, and n is 5;
(vii) said oligonucleotide of formula I has a sequence having at least 90% sequence identity to 5′-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3′ (SEQ ID NO:31) or 5′-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3′ (SEQ ID NO:32); or (viii) any combination of (i)-(vii)
A labeled probe according to claim 1 . 式ＩＩの標識プローブであって、
Figure 2020180645000005
式中、ｊは０～１１の整数であり、ｋは０～１の整数であり、ｍは０～１１の整数であり、ｎは０～５の整数であり、Ｒは、電気化学発光標識：
Figure 2020180645000006
である、標識プローブ。 A labeled probe of formula II,
Figure 2020180645000005
wherein j is an integer from 0 to 11, k is an integer from 0 to 1, m is an integer from 0 to 11, n is an integer from 0 to 5, R is an electrochemiluminescent label :
Figure 2020180645000006
is a labeled probe. （ｉ） ｋが０、ｊがｍ、およびｎが５であるか、
（ｉｉ） 式ＩＩの前記オリゴヌクレオチドが、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴ－３’（配列番号３１）または５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号３２）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、または
（ｉｉｉ） （ｉ）～（ｉｉ）の組み合わせである、
請求項３に記載の標識プローブ。 (i) k is 0, j is m, and n is 5;
(ii) said oligonucleotide of Formula II has at least 90% sequence identity to 5′-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3′ (SEQ ID NO:31) or 5′-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3′ (SEQ ID NO:32); or (iii) a combination of (i)-(ii)
A labeled probe according to claim 3 . 電気化学発光を測定する方法であって、
（ａ）電極に電位を、前記電極に近接している複合体が電気化学発光を放出する条件下で、印加することであって、前記複合体は、標的オリゴヌクレオチドおよび請求項１～４のいずれか一項に記載の標識プローブを含み、式Ｉまたは式ＩＩの前記オリゴヌクレオチドは前記標的オリゴヌクレオチドに相補的である、電極に電位を印加することと、
（ｂ）前記放出された電気化学発光を測定することと、を含む、方法。 A method of measuring electrochemiluminescence, comprising:
(a) applying a potential to an electrode under conditions in which a complex in proximity to said electrode emits electrochemiluminescence, said complex comprising a target oligonucleotide and the applying a potential to an electrode comprising a labeled probe according to any one of claims, wherein said oligonucleotide of Formula I or Formula II is complementary to said target oligonucleotide;
(b) measuring the emitted electrochemiluminescence. 前記標的オリゴヌクレオチドが、前記電極上、または任意で、前記電極上に固定される固相担体上に固定され、
任意で、前記複合体が、前記標的オリゴヌクレオチドに結合することができる結合試薬をさらに含み、前記結合試薬が前記電極上又は前記固相担体上に固定され、
さらに任意で、前記固相担体が粒子であり、前記粒子が、重力、遠心分離、濾過、または磁場の印加を使用して、前記電極上に収集される、
請求項５に記載の方法。 said target oligonucleotide is immobilized on said electrode or optionally on a solid support immobilized on said electrode;
optionally, said complex further comprises a binding reagent capable of binding to said target oligonucleotide, said binding reagent immobilized on said electrode or on said solid support;
Further optionally, said solid support is a particle, and said particles are collected on said electrode using gravity, centrifugation, filtration, or application of a magnetic field.
6. The method of claim 5. 電気化学発光を測定するためのキットであって、請求項１～４のいずれか一項に記載の標識プローブと、
（ａ）電極、任意で、炭素系電極である電極、
（ｂ）ＥＣＬ読み取り緩衝液、任意で、ＥＣＬ読み取り緩衝液はトリプロピルアミンおよび／またはブチルジエタノールアミンを含む、
（ｃ）核酸ポリメラーゼ、
（ｄ）核酸リガーゼ、
（ｅ）アッセイ希釈剤、
（ｆ）追加の核酸試薬、
（ｇ）アッセイ消耗品、任意で、前記アッセイ消耗品はマルチウェルプレートアッセイ消耗品であり、前記プレートの各ウェルがカーボンインク電極を含む、または
（ｈ）それらの組み合わせと、を含む、キット。 A kit for measuring electrochemiluminescence, the labeled probe according to any one of claims 1 to 4;
(a) an electrode, optionally an electrode that is a carbon-based electrode;
(b) an ECL read buffer, optionally the ECL read buffer comprises tripropylamine and/or butyldiethanolamine;
(c) a nucleic acid polymerase;
(d) a nucleic acid ligase;
(e) an assay diluent;
(f) additional nucleic acid reagents;
(g) an assay consumable, optionally said assay consumable is a multi-well plate assay consumable, each well of said plate comprising a carbon ink electrode, or (h) a combination thereof. オリゴヌクレオチドを含む、非天然核酸プローブであって、前記オリゴヌクレオチドは、１４～２４ヌクレオチドの長さであり、５’－ＧＡＣＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣ－３’（配列番号３３）の１４または１５個の連続したヌクレオチドを含む、非天然核酸プローブ。 A non-natural nucleic acid probe comprising an oligonucleotide, said oligonucleotide being 14-24 nucleotides in length and containing 14 or 15 contiguous nucleotides of 5′-GACAGAACTAGACAC-3′ (SEQ ID NO: 33). A non-natural nucleic acid probe, comprising: （ｉ） 前記非天然核酸プローブが、反応性官能基を含む非天然の５’修飾をさらに含み、任意で、前記反応性官能基が、チオール、アミン、カルボン酸、活性エステル、ヒドラジン、アルデヒド、ケトン、アルキン、歪んだアルケン、アジド、またはテトラジンであるか、
（ｉｉ） 前記非天然核酸プローブが、式ＩＩＩＡの化合物を含むか、
Figure 2020180645000007
（ｉｉｉ） 前記非天然核酸プローブが、ハプテンまたはビオチンを含む非天然の５’修飾をさらに含み、任意で、前記ハプテンが、フルオレセイン、ジニトロフェニル、またはジゴキシゲニンを含むか、
（ｉｖ） 前記非天然核酸プローブが、式ＩＶの化合物を含むか、
Figure 2020180645000008
（ｖ） 前記非天然核酸プローブの前記オリゴヌクレオチドが、１４～１９ヌクレオチドの長さ、１４ヌクレオチドの長さ、または１５ヌクレオチドの長さでであるか、
（ｖｉ）前記非天然核酸プローブの前記オリゴヌクレオチドが、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号３４）および５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号３５）を含むか、または
（ｖｉｉ） （ｉ）～（ｖｉ）の任意の組み合わせである、
請求項８に記載の非天然核酸プローブ。 (i) said non-natural nucleic acid probe further comprises a non-natural 5′ modification comprising a reactive functional group, optionally wherein said reactive functional group is a thiol, amine, carboxylic acid, active ester, hydrazine, aldehyde, is a ketone, alkyne, strained alkene, azide, or tetrazine;
(ii) said non-natural nucleic acid probe comprises a compound of Formula IIIA;
Figure 2020180645000007
(iii) said non-natural nucleic acid probe further comprises a non-natural 5′ modification comprising a hapten or biotin, optionally said hapten comprises fluorescein, dinitrophenyl, or digoxigenin;
(iv) said non-natural nucleic acid probe comprises a compound of Formula IV;
Figure 2020180645000008
(v) said oligonucleotide of said non-natural nucleic acid probe is 14-19 nucleotides in length, 14 nucleotides in length, or 15 nucleotides in length;
(vi) said oligonucleotide of said non-natural nucleic acid probe comprises 5′-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3′ (SEQ ID NO:34) and 5′-AAGAGAGTAGTACAGCA-3′ (SEQ ID NO:35), or (vii) (i) is any combination of (vi)
The non-natural nucleic acid probe according to claim 8. 請求項８または９に記載の非天然核酸プローブにコンジュゲートされた検出試薬を含み、任意で、前記検出試薬が抗原結合物質である、コンジュゲート化合物。 10. A conjugate compound comprising a detection reagent conjugated to the non-natural nucleic acid probe of claim 8 or 9, optionally wherein said detection reagent is an antigen binding substance. ５３～７６個のヌクレオチドを含み、その５’末端に配列５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣ－３’を、その３’末端に配列５’－ＧＴＧＴＣＴＡ－３’を含む、非天然オリゴヌクレオチド。 A non-natural oligonucleotide comprising 53-76 nucleotides and comprising at its 5' end the sequence 5'-GTTCTGTC-3' and at its 3' end the sequence 5'-GTGTCTA-3'. （ｉ） 前記非天然オリゴヌクレオチド配列が、５’－ＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧ－３’（配列番号３４）および５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号３５）をさらに含むか、
（ｉｉ） 前記非天然オリゴヌクレオチドが、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号３６）からなるか、
（ｉｉｉ） 前記非天然オリゴヌクレオチドが、５３～６１ヌクレオチドの長さであるか、
（ｉｖ） 前記非天然オリゴヌクレオチドが、５’末端ホスフェート基をさらに含むか、または
（ｖ） （ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである、
請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。 (i) said non-natural oligonucleotide sequence further comprises 5′-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3′ (SEQ ID NO:34) and 5′-AAGAGAGTAGTACAGCA-3′ (SEQ ID NO:35);
(ii) the unnatural oligonucleotide consists of 5′-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3′ (SEQ ID NO: 36);
(iii) said unnatural oligonucleotide is 53-61 nucleotides in length;
(iv) the unnatural oligonucleotide further comprises a 5′ terminal phosphate group, or (v) any combination of (i)-(iv).
12. The oligonucleotide of claim 11. 核酸プローブを非核酸検出試薬にコンジュゲートしてコンジュゲートを形成するためのキットであって、
（ａ）ヘテロ二官能性架橋剤であって、
（ｉ）前記検出試薬と反応して、前記架橋剤を前記検出試薬に付着させることができる第１の反応基、および
（ｉｉ）前記検出試薬に対して実質的に非反応性でありながら、前記核酸プローブと反応して、前記架橋剤を前記核酸プローブに付着させることができる第２の反応基を含む、ヘテロ二官能性架橋剤と、
（ｂ）未反応の核酸プローブから前記コンジュゲートを分離することができる第１のサイズ分離デバイス、
任意で、前記第１のサイズ分離デバイスが、透析デバイス、限外濾過デバイスまたはサイズ排除カラムであり、前記分離デバイスが、分子量が約５，０００ダルトン以下のオリゴヌクレオチドを、分子量が５０，０００ダルトンを超えるコンジュゲートから分離するのに適した分画分子量を有し、好ましくは前記分離デバイスが、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスを含むカラムであり、より好ましくは前記サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ１００ビーズを含む、と、
（ｃ）核酸結合フルオロフォアであって、前記フルオロフォアが核酸に結合すると前記フルオロフォアの蛍光強度が増加する、核酸結合フルオロフォア、
任意で、前記フルオロフォアが、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ ＯＬＩＧＲＥＥＮ色素、ＱＵＡＮＴＩ－ＩＴ ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ色素、ＱＵＡＮＴＩＦＬＵＯＲ ｓｓＤＮＡ色素、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素、またはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ色素であり、好ましくは前記フルオロフォアがＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素である、と、
（ｄ）任意で、１つ以上の
（１）前記核酸プローブ、任意で、前記核酸プローブが５’－ＧＡＣＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣ－３’（配列番号３３）の１４または１５個の連続したオリゴヌクレオチドを含む、と、
（２）較正オリゴヌクレオチドと、
（３）コンジュゲーションの前に検出試薬を脱塩するための第２のサイズ分離デバイスと、
を含む、キット。 A kit for conjugating a nucleic acid probe to a non-nucleic acid detection reagent to form a conjugate, comprising:
(a) a heterobifunctional crosslinker comprising
(i) a first reactive group capable of reacting with said detection reagent to attach said cross-linking agent to said detection reagent; and (ii) being substantially non-reactive with respect to said detection reagent, a heterobifunctional cross-linker comprising a second reactive group capable of reacting with the nucleic acid probe to attach the cross-linker to the nucleic acid probe;
(b) a first size separation device capable of separating said conjugate from unreacted nucleic acid probe;
Optionally, said first size separation device is a dialysis device, an ultrafiltration device or a size exclusion column, said separation device separating oligonucleotides having a molecular weight of about 5,000 Daltons or less and having a molecular weight of 50,000 Daltons. preferably said separation device is a column comprising a size exclusion chromatography matrix, more preferably said size exclusion chromatography matrix comprises SEPHADEX G100 beads containing, and
(c) a nucleic acid-binding fluorophore, wherein the fluorescence intensity of said fluorophore increases when said fluorophore binds to a nucleic acid;
optionally, said fluorophore is QUANT-IT OLIGREEN dye, QUANTI-IT RIBOGREEN dye, QUANTIFLUOR ssDNA dye, SYBR Green I dye, or SYBR Green II dye, preferably said fluorophore is SYBR Green I dye; and,
(d) optionally one or more of (1) said nucleic acid probe, optionally said nucleic acid probe comprises 14 or 15 contiguous oligonucleotides of 5'-GACAGAACTAGACAC-3' (SEQ ID NO: 33); ,
(2) a calibration oligonucleotide;
(3) a second size separation device for desalting detection reagents prior to conjugation;
kit, including （ｉ） 前記第１の反応基が、アミン反応性部分、任意で、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルを含むか、
（ｉｉ） 前記核酸プローブがチオール修飾オリゴヌクレオチドであり、前記第２の反応基がチオ―ル反応基、任意で、マレイミドまたはヨードアセトアミド部分であるか、
（ｉｉｉ） 前記検出試薬がタンパク質、任意で、抗原結合物質であるか、
（ｉｖ） 前記キット構成要素が単一のパッケージに入っているか、または
（ｖ） （ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである、
請求項１３に記載のキット。 (i) said first reactive group comprises an amine-reactive moiety, optionally an N-hydroxysuccinimide ester or an N-hydroxysulfosuccinimide ester;
(ii) said nucleic acid probe is a thiol-modified oligonucleotide and said second reactive group is a thiol-reactive group, optionally a maleimide or iodoacetamide moiety;
(iii) said detection reagent is a protein, optionally an antigen binding substance;
(iv) the kit components are in a single package, or (v) any combination of (i)-(iv);
14. A kit according to claim 13. 核酸プローブを非核酸検出試薬にコンジュゲートしてコンジュゲートを形成するための方法であって、
（ａ）検出試薬および核酸プローブを反応させてコンジュゲートを形成することと、
（ｂ）サイズ分離デバイスを使用して、前記コンジュゲートを未反応の核酸プローブから分離し、精製されたコンジュゲートを形成することと、
（ｃ）前記精製されたコンジュゲートの試料、および核酸結合フルオロフォアが核酸に結合すると増加する蛍光強度を有するように選択された核酸結合フルオロフォアを含む試験組成物を形成することと、
（ｄ）前記試験組成物の前記蛍光を測定して、前記精製されたコンジュゲート中の核酸プローブ量を決定することと、を含む、方法。 A method for conjugating a nucleic acid probe to a non-nucleic acid detection reagent to form a conjugate, comprising:
(a) reacting a detection reagent and a nucleic acid probe to form a conjugate;
(b) separating the conjugate from unreacted nucleic acid probes using a size separation device to form a purified conjugate;
(c) forming a test composition comprising a sample of the purified conjugate and a nucleic acid-binding fluorophore selected to have an increased fluorescence intensity when the nucleic acid-binding fluorophore binds to a nucleic acid;
(d) measuring the fluorescence of the test composition to determine the amount of nucleic acid probe in the purified conjugate. 核酸プローブを非核酸検出試薬にコンジュゲートしてコンジュゲートを形成する方法であって、
前記検出試薬がヘテロ二官能性架橋剤の第１の反応基と反応し、前記核酸が前記架橋剤の第２の反応基と反応する条件下で、前記検出試薬および前記核酸プローブを前記ヘテロ二官能性架橋剤と接触させて前記コンジュゲートを形成することを含み、前記ヘテロ二官能性架橋剤は、
（ｉ）前記検出試薬と反応して、前記架橋剤を前記検出試薬に付着させることができる第１の反応基と
（ｉｉ）前記検出試薬に対して実質的に非反応性でありながら、前記核酸プローブと反応して、前記架橋剤を前記核酸プローブに付着させることができる第２の反応基と、を含み、
前記架橋剤と前記核酸プローブとの前記反応の前に、前記検出試薬と前記架橋剤との反応産物を精製することを含まない、方法。 A method of conjugating a nucleic acid probe to a non-nucleic acid detection reagent to form a conjugate, comprising:
The detection reagent and the nucleic acid probe are combined with the heterobifunctional cross-linker under conditions in which the detection reagent reacts with the first reactive group of the heterobifunctional cross-linker and the nucleic acid reacts with the second reactive group of the cross-linker. contacting with a functional cross-linker to form the conjugate, wherein the heterobifunctional cross-linker comprises:
(i) a first reactive group capable of reacting with said detection reagent to attach said cross-linking agent to said detection reagent; and (ii) substantially non-reactive to said detection reagent while said a second reactive group capable of reacting with a nucleic acid probe to attach the cross-linking agent to the nucleic acid probe;
A method that does not include purifying a reaction product of the detection reagent and the cross-linking agent prior to the reaction of the cross-linking agent with the nucleic acid probe. 核酸プローブを非核酸検出試薬にコンジュゲートしてコンジュゲートを形成するための方法であって、
（ａ）前記検出試薬がヘテロ二官能性架橋剤の第１の反応基と反応する条件下で、前記検出試薬を前記ヘテロ二官能性架橋剤と接触させて第１の組成物を形成することであって、前記ヘテロ二官能性架橋剤が、
（ｉ）前記検出試薬と反応して、前記架橋剤を前記検出試薬に付着させることができる第１の反応基、および
（ｉｉ）前記検出試薬に対して実質的に非反応性でありながら、前記核酸プローブと反応して、前記架橋剤を前記核酸プローブに付着させることができる第２の反応基を含む、第１の組成物を形成することと、
（ｂ）前記架橋剤の前記第２の反応基が前記核酸プローブと反応する条件下で、前記第１の組成物を前記核酸プローブと接触させて前記コンジュゲートを形成することと、を含み、
前記架橋剤と前記核酸プローブとの前記反応の前に、前記検出試薬と前記架橋剤との前記反応産物を精製することを含まない、方法。 A method for conjugating a nucleic acid probe to a non-nucleic acid detection reagent to form a conjugate, comprising:
(a) contacting the detection reagent with the heterobifunctional cross-linker under conditions where the detection reagent reacts with the first reactive group of the heterobifunctional cross-linker to form a first composition; wherein the heterobifunctional cross-linking agent is
(i) a first reactive group capable of reacting with said detection reagent to attach said cross-linking agent to said detection reagent; and (ii) being substantially non-reactive with respect to said detection reagent, forming a first composition comprising a second reactive group capable of reacting with the nucleic acid probe to attach the cross-linking agent to the nucleic acid probe;
(b) contacting the first composition with the nucleic acid probe under conditions where the second reactive group of the crosslinker reacts with the nucleic acid probe to form the conjugate;
A method that does not include purifying the reaction product of the detection reagent and the cross-linking agent prior to the reaction of the cross-linking agent with the nucleic acid probe. アッセイを実施するためのキットであって、
（ａ）アンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬と、
（ｂ）請求項１～４のいずれか一項に記載の標識プローブと、
（ｃ）５’末端ヌクレオチド配列を含むコネクターオリゴヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド配列（前記５’および３’末端ヌクレオチド配列は核酸プローブにハイブリダイズすることができる）、前記アンカーオリゴヌクレオチドの相補体にハイブリダイズすることができる第１の内部ヌクレオチド配列、および前記標識プローブの検出オリゴヌクレオチドの相補体にハイブリダイズすることができる第２の内部ヌクレオチド配列と、
（ｄ）核酸リガーゼと、
（ｅ）核酸ポリメラーゼと、
（ｅ）任意で、前記コネクターオリゴヌクレオチドの前記５’末端配列に相補的な第１の配列と、前記コネクターオリゴヌクレオチドの前記３’末端配列に相補的な隣接する第２の配列と、を含む核酸プローブ、好ましくは核酸プローブが、５’－ＧＡＣＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣＡＣ－３’（配列番号３３）の前記１４または１５個の連続したヌクレオチドを含む、と、
を含む、キット。 A kit for performing an assay comprising
(a) an anchor reagent comprising an anchor oligonucleotide;
(b) a labeled probe according to any one of claims 1 to 4;
(c) a connector oligonucleotide comprising a 5' terminal nucleotide sequence, a 3' terminal nucleotide sequence (said 5' and 3' terminal nucleotide sequences are capable of hybridizing to a nucleic acid probe), hybridizing to the complement of said anchor oligonucleotide; a first internal nucleotide sequence capable of hybridizing and a second internal nucleotide sequence capable of hybridizing to the complement of the detection oligonucleotide of said labeled probe;
(d) a nucleic acid ligase;
(e) a nucleic acid polymerase;
(e) optionally comprising a first sequence complementary to said 5' terminal sequence of said connector oligonucleotide and a contiguous second sequence complementary to said 3' terminal sequence of said connector oligonucleotide; the nucleic acid probe, preferably the nucleic acid probe, comprises said 14 or 15 contiguous nucleotides of 5'-GACAGAACTAGACAC-3' (SEQ ID NO: 33);
kit, including （ｉ） 前記アンカーオリゴヌクレオチドが、１７または２５オリゴヌクレオチドの長さであり、任意で、１７または２５ヌクレオチドの長さであるか、
（ｉｉ） 前記アンカーオリゴヌクレオチドが、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号３５）を含むか、
（ｉｉｉ） 前記コネクターオリゴヌクレオチドが、５’末端ホスフェート基をさらに含むか、
（ｉｖ） 前記コネクターオリゴヌクレオチドが、５３～６１ヌクレオチドの長さであり、任意で、前記３’および５’末端配列の長さの合計が、１４～１９ヌクレオチドの長さ、好ましくは１４または１５ヌクレオチドの長さであるか、
（ｖ） 前記５’末端配列が、ＧＴＴＣＴＧＴＣであり、前記３’末端配列が、ＧＴＧＴＣＴＡであるか、
（ｖｉ） 前記コネクターオリゴヌクレオチド配列が、５’－ＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＡ－３’（配列番号３６）からなるか、または
（ｖｉｉ） （ｉ）～（ｖｉ）の任意の組み合わせである、
請求項１８に記載のキット。 (i) said anchor oligonucleotide is 17 or 25 oligonucleotides in length, optionally 17 or 25 nucleotides in length;
(ii) said anchor oligonucleotide comprises 5′-AAGAGAGTAGTACAGCA-3′ (SEQ ID NO: 35);
(iii) said connector oligonucleotide further comprises a 5′ terminal phosphate group;
(iv) said connector oligonucleotide is 53-61 nucleotides in length and optionally the sum of the lengths of said 3′ and 5′ end sequences is 14-19 nucleotides in length, preferably 14 or 15 is the length of nucleotides, or
(v) said 5′ terminal sequence is GTTCTGTC and said 3′ terminal sequence is GTGTCTA;
(vi) said connector oligonucleotide sequence consists of 5′-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3′ (SEQ ID NO: 36), or (vii) any combination of (i)-(vi);
19. Kit according to claim 18. 分析物を測定する方法であって、
（ａ）前記分析物を、（ｉ）表面上の結合ドメインの捕捉試薬であって、前記結合ドメインが、アンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬をさらに含む、捕捉試薬と、（ｉｉ）検出試薬および核酸プローブを含むコンジュゲートとに結合することにより、前記捕捉試薬、前記分析物、および前記コンジュゲートを含む複合体を前記結合ドメインに形成することと、
（ｂ）前記コンジュゲートの前記核酸プローブを伸長して、前記アンカーオリゴヌクレオチドに相補的なアンカーオリゴヌクレオチド相補体および標識プローブの検出オリゴヌクレオチドに相補的な検出配列相補体を含む伸長配列を形成することと、
（ｃ）前記検出オリゴヌクレオチドを含む前記標識プローブを前記伸長配列に結合することと、
（ｄ）前記結合ドメインに結合した前記標識プローブの量を測定することと、を含み、
前記標識プローブは、請求項１～４のいずれか一項に記載の標識プローブである、方法。 A method of measuring an analyte, comprising:
(a) the analyte, (i) a capture reagent for a binding domain on a surface, the binding domain further comprising an anchor reagent comprising an anchor oligonucleotide; and (ii) a detection reagent and a nucleic acid. forming a complex comprising the capture reagent, the analyte, and the conjugate to the binding domain by binding to a conjugate comprising a probe;
(b) extending said nucleic acid probe of said conjugate to form an extended sequence comprising an anchor oligonucleotide complement complementary to said anchor oligonucleotide and a detection sequence complement complementary to a detection oligonucleotide of a labeled probe; and
(c) binding the labeled probe comprising the detection oligonucleotide to the extended sequence;
(d) measuring the amount of said labeled probe bound to said binding domain;
A method, wherein the labeled probe is the labeled probe according to any one of claims 1-4. 分析物を測定する方法であって、
（ａ）前記分析物を、（ｉ）表面上の結合ドメインの捕捉試薬であって、前記結合ドメインが、アンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬をさらに含む、捕捉試薬と、（ｉｉ）検出試薬、ならびに第１のプローブ配列および隣接する第２のプローブ配列を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸プローブを含むコンジュゲートとに結合することにより、前記捕捉試薬、前記分析物、および前記コンジュゲートを含む複合体を前記結合ドメインに形成することと、
（ｂ）前記複合体の前記核酸プローブを、コネクターオリゴヌクレオチドであって、前記第１のプローブ配列に相補的な５’末端配列、前記第２のプローブ配列に相補的な３’末端配列、前記アンカーオリゴヌクレオチドの相補体にハイブリダイズすることができる第１の内部配列、および標識プローブの検出オリゴヌクレオチドの相補体にハイブリダイズすることができる第２の内部配列を含む、コネクターオリゴヌクレオチドに結合することと、
（ｃ）前記コネクターオリゴヌクレオチドを連結して環状テンプレートオリゴヌクレオチドを形成することと、
（ｄ）ローリングサークル増幅により前記核酸プローブを伸長して伸長配列を形成することと、
（ｅ）前記検出オリゴヌクレオチドを含む標識プローブを前記伸長配列に結合することと、
（ｆ）前記結合ドメインに結合した前記標識プローブの量を測定することと、を含み、
前記標識プローブは、請求項１～４のいずれか一項に記載の標識プローブである、方法。 A method of measuring an analyte, comprising:
(a) the analyte, (i) a capture reagent of a binding domain on a surface, the binding domain further comprising an anchor reagent comprising an anchor oligonucleotide; and (ii) a detection reagent; said complex comprising said capture reagent, said analyte, and said conjugate by binding to said conjugate comprising a nucleic acid probe comprising an oligonucleotide having a first probe sequence and an adjacent second probe sequence; forming into a binding domain;
(b) connecting said nucleic acid probe of said complex to a connector oligonucleotide having a 5′ terminal sequence complementary to said first probe sequence, a 3′ terminal sequence complementary to said second probe sequence, said Binds to a connector oligonucleotide comprising a first internal sequence capable of hybridizing to the complement of the anchor oligonucleotide and a second internal sequence capable of hybridizing to the complement of the detection oligonucleotide of the labeled probe and
(c) ligating the connector oligonucleotides to form circular template oligonucleotides;
(d) extending the nucleic acid probe by rolling circle amplification to form an extended sequence;
(e) binding a labeled probe comprising the detection oligonucleotide to the extended sequence;
(f) measuring the amount of said labeled probe bound to said binding domain;
A method, wherein the labeled probe is the labeled probe according to any one of claims 1-4. 分析物を測定する方法であって、
（ａ）表面上の結合ドメイン内の第１の捕捉試薬に前記分析物を結合することであって、前記結合ドメインが、アンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬をさらに含む、第１の捕捉試薬に分析物を結合することと、
（ｂ）検出試薬および核酸プローブを含むコンジュゲートを、前記結合ドメイン内の第２の捕捉試薬に結合し、前記第２の捕捉試薬および前記コンジュゲートを含む複合体を形成することであって、前記検出試薬が、前記第１および第２の捕捉試薬に結合するための前記分析物の競合相手である、複合体を形成することと、
（ｃ）前記複合体中の前記コンジュゲートの前記核酸プローブを伸長して、前記アンカーオリゴヌクレオチドに相補的なアンカーオリゴヌクレオチド相補体および標識プローブの検出オリゴヌクレオチドに相補的な検出配列相補体を含む伸長配列を形成することと、
（ｄ）前記検出オリゴヌクレオチドを含む前記標識プローブを前記伸長配列に結合することと、
（ｅ）前記結合ドメインに結合した前記標識プローブの量を測定することと、を含み、
前記標識プローブは、請求項１～４のいずれか一項に記載の標識プローブである、方法。 A method of measuring an analyte, comprising:
(a) binding said analyte to a first capture reagent within a binding domain on a surface, said binding domain further comprising an anchor reagent comprising an anchor oligonucleotide; joining things together;
(b) binding a conjugate comprising a detection reagent and a nucleic acid probe to a second capture reagent within said binding domain to form a complex comprising said second capture reagent and said conjugate, forming a complex in which the detection reagent is a competitor of the analyte for binding to the first and second capture reagents;
(c) extending said nucleic acid probe of said conjugate in said complex to include an anchor oligonucleotide complement complementary to said anchor oligonucleotide and a detection sequence complement complementary to a detection oligonucleotide of a labeled probe; forming an extended sequence;
(d) binding the labeled probe comprising the detection oligonucleotide to the extended sequence;
(e) measuring the amount of said labeled probe bound to said binding domain;
A method, wherein the labeled probe is the labeled probe according to any one of claims 1-4. 分析物を測定する方法であって、
（ａ）前記分析物を、第１の検出試薬および核酸プローブを含む第１のコンジュゲートに結合することと、
（ｂ）表面上の結合ドメインの捕捉試薬を、第２の検出試薬および核酸プローブを含む第２のコンジュゲートに結合して、前記捕捉試薬および前記第２のコンジュゲートを含む複合体を形成することであって、（ｉ）前記結合ドメインが、アンカーオリゴヌクレオチドを含むアンカー試薬をさらに含み、（ｉｉ）前記捕捉試薬が、前記第１および第２の検出試薬に結合するための前記分析物の競合相手である、複合体を形成することと、
（ｃ）前記複合体中の前記第２のコンジュゲートの前記核酸プローブを伸長して、前記アンカーオリゴヌクレオチドに相補的なアンカーオリゴヌクレオチド相補体および標識プローブの検出オリゴヌクレオチドに相補的な検出配列相補体を含む伸長配列を形成することと、
（ｄ）前記検出オリゴヌクレオチドを含む前記標識プローブを前記伸長配列に結合することと、
（ｅ）前記結合ドメインに結合した前記標識プローブの量を測定することと、を含み、
前記標識プローブは、請求項１～４のいずれか一項に記載の標識プローブである、方法。 A method of measuring an analyte, comprising:
(a) binding the analyte to a first conjugate comprising a first detection reagent and a nucleic acid probe;
(b) binding the capture reagent of the binding domain on the surface to a second conjugate comprising a second detection reagent and a nucleic acid probe to form a complex comprising said capture reagent and said second conjugate; (i) the binding domain further comprises an anchor reagent comprising an anchor oligonucleotide; and (ii) the capture reagent binds to the first and second detection reagents of the analyte. Forming a complex that is a competitor;
(c) extending said nucleic acid probe of said second conjugate in said complex to provide an anchor oligonucleotide complement complementary to said anchor oligonucleotide and a detection sequence complement complementary to a detection oligonucleotide of a labeled probe; forming an elongated sequence comprising the body;
(d) binding the labeled probe comprising the detection oligonucleotide to the extended sequence;
(e) measuring the amount of said labeled probe bound to said binding domain;
A method, wherein the labeled probe is the labeled probe according to any one of claims 1-4. 前記コンジュゲートが式ＶＩの化合物を含み、
Figure 2020180645000009
式中、ｒが０～２４の整数であり、ｘが１～２０の整数であり、およびタンパク質－ＮＨ－が、前記タンパク質に由来するアミノ基のコンジュゲート型である、
請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。 said conjugate comprises a compound of formula VI,
Figure 2020180645000009
wherein r is an integer from 0 to 24, x is an integer from 1 to 20, and protein-NH- is the conjugated form of an amino group derived from said protein.
A method according to any one of claims 20-22. 前記第１のコンジュゲートおよび／または前記第２のコンジュゲートが、式ＶＩの化合物を含み、
Figure 2020180645000010
式中、ｒが０～２４の整数であり、ｘが１～２０の整数であり、およびタンパク質－ＮＨ－が、前記タンパク質に由来するアミノ基のコンジュゲート型である、
請求項２３に記載の方法。 said first conjugate and/or said second conjugate comprises a compound of Formula VI;
Figure 2020180645000010
wherein r is an integer from 0 to 24, x is an integer from 1 to 20, and protein-NH- is the conjugated form of an amino group derived from said protein.
24. The method of claim 23. １つ以上の追加の分析物について、前記方法を繰り返すことをさらに含む方法であって、各分析物が、同じ表面または異なる表面上の異なる結合ドメイン内の異なる捕捉試薬に結合する、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。 20. The method further comprising repeating said method for one or more additional analytes, wherein each analyte binds to a different capture reagent within different binding domains on the same surface or different surfaces. 26. The method of any one of 1-25. 式Ｘのアンカー試薬であって、
Figure 2020180645000011
式中、前記オリゴヌクレオチドが、５’－ＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡ－３’（配列番号３５）を含む、アンカー試薬。 An anchoring reagent of formula X,
Figure 2020180645000011
wherein said oligonucleotide comprises 5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3' (SEQ ID NO: 35).
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