JP5427408B2 - Method for labeling or processing a biological sample containing a target biomolecule, in particular nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標識された、目的の核酸、合成又は天然のリボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)を含む生体試料を精製するための新規な方法に関する。 The present invention relates to a novel method for purifying biological samples containing labeled nucleic acids of interest, synthetic or natural ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA).
用語「合成RNA又はDNA」は、増幅技術(PCR法、必要に応じて、続けて転写を行う)又は転写増幅技術(TMA又はNASBA)などの、人間が開発した技術により得られるRNA又はRNAを意味するものとする。用語「天然RNA又はDNA」は、例えば、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、転移RNA又はゲノムDNAなどの、細胞の抽出により得られるRNA又はDNAを意味するものとする。 The term “synthetic RNA or DNA” refers to RNA or RNA obtained by a human-developed technique, such as an amplification technique (PCR method, followed by transcription if necessary) or a transcription amplification technique (TMA or NASBA). Shall mean. The term “natural RNA or DNA” is intended to mean RNA or DNA obtained by extraction of cells, for example messenger RNA, ribosomal RNA, transfer RNA or genomic DNA.
先行技術では、そのようなヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸を標識するための多くの方法が存在することが示されている。オリゴヌクレオチド及び核酸は全て、以下でポリヌクレオチドと称する。標識化は、合成中か、又は、少なくとも1つの標識ヌクレオチドの取り込みによるかのいずれかにより、実施することができる。 The prior art has shown that there are many methods for labeling such nucleotides, oligonucleotides or nucleic acids. All oligonucleotides and nucleic acids are referred to below as polynucleotides. Labeling can be performed either during synthesis or by incorporation of at least one labeled nucleotide.
第1の方法は、塩基が天然又は改変されたもののいずれかにかかわらず、標識を塩基に付けることを含む。提案される第2の方法は、糖が天然か又は改変されたものかのいずれかにかかわらず、同様に標識を糖に付けることである。第3の方法は、標識をリン酸塩に結合することを目的とする。 The first method involves attaching a label to the base, regardless of whether the base is natural or modified. The proposed second method is to attach a label to the sugar as well, regardless of whether the sugar is natural or modified. The third method aims at coupling the label to the phosphate.
塩基への標識は、特に、直接的に標識されたヌクレオチドの取り込みにより核酸を標識するアプローチに用いられてきた。 Labeling to bases has been used in particular for approaches to labeling nucleic acids by incorporation of directly labeled nucleotides.
糖への標識は、しばしば、化学合成により調製された核酸プローブの場合に用いられる。 Sugar labels are often used in the case of nucleic acid probes prepared by chemical synthesis.
リン酸への標識もまた、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に官能基化アーム及び標識を導入するために用いられてきた。 Labeling to phosphate has also been used to introduce functionalized arms and labels during chemical synthesis of oligonucleotides.
実際に、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ又はポリヌクレオチドの標識を行うべき当業者は、この付着を塩基又は糖について実施する傾向があり、このことにより、当業者にとっては非常に便利となり、また、当業者は多くの代替物を得る。さらに、これは、多くの文献、例えば、塩基については、特許文献1〜9を、糖については、特許文献10を研究して得られたものである。 Indeed, those skilled in the art to label nucleotides, nucleotide analogs or polynucleotides tend to perform this attachment on bases or sugars, which makes it very convenient for those skilled in the art and Get many alternatives. Furthermore, this is obtained by researching many documents, for example, Patent Documents 1 to 9 for a base and Patent Document 10 for a sugar.
標識のリン酸塩への結合は、塩基又は糖を官能基化することからなる技術よりも複雑な技術であり、特にリン酸塩の反応性が低いために、広くは用いられていない(例えば、非特許文献1を参照されたい)。同様に、非特許文献2は、プローブをオリゴヌクレオチド断片に導入する方法に関するが、ヌクレオチド間のホスホジエステルの効果的なアルキル化は不可能であると考えられる。 Binding of a label to a phosphate is a more complex technique than one that consists of functionalizing a base or sugar and is not widely used, especially because of the low reactivity of phosphate (e.g. (See Non-Patent Document 1). Similarly, Non-Patent Document 2 relates to a method for introducing a probe into an oligonucleotide fragment, but effective alkylation of phosphodiester between nucleotides is considered impossible.
本出願人は、標識収量の点から効率的である新規な試薬に基づく標識技術を既に開発しているが、これは標識位置の点から、具体的には、水素結合による二重らせんの形成に関与する塩基のハイブリダイゼーション特性に影響しないという点から、特異的であり、DNA及びRNAの両方に用いることができ、最終的に、天然ポリヌクレオチド又は酵素増幅により調製されたポリヌクレオチドの区別なく標識することができる。 The applicant has already developed a labeling technique based on a novel reagent that is efficient in terms of labeling yield, which is in terms of labeling position, specifically, the formation of a double helix by hydrogen bonding. It is specific in that it does not affect the hybridization properties of the bases involved in the DNA, can be used for both DNA and RNA, and ultimately without discrimination between natural polynucleotides or polynucleotides prepared by enzyme amplification. Can be labeled.
従って、特許文献11は、上記条件を満たし、かつジアゾメチル官能基を標識のための反応性官能基として用いる多数の標識を記載する。ジアゾメチル官能基(式−C(N2)−)は既にリン酸基のアルキル化に用いられてきたが、かなり多くの問題が生じる。第一に、ジアゾ誘導体は、通常、それ自身が不安定であるため、標識キットにおけるこれらの標識試薬の使用には問題がある。第2に、カップリング生成物は不安定であるが、このことは、標識産物の官能基が任意の試料中の標的生体分子の存在を明らかにする場合には、全く容認できるものではない。最後に、ジアゾメチル官能基を有する誘導体は水不溶性であり、その結果、水又は水性緩衝液中でのみ可溶性かつ安定な生体分子とカップリングするための2相条件で使用される。しかし、これらの条件は反応速度を遅くするので、カップリング効率に不利である。特許文献12に記載された本発明の新規な標識試薬もまた、これらの技術的課題を解決する。1つの実施形態によれば、温度安定性標識試薬は、以下の式を有する。 Thus, Patent Document 11 describes a number of labels that satisfy the above conditions and use diazomethyl functional groups as reactive functional groups for labeling. Diazomethyl functional group (formula -C (N 2) -) but has already been used in the alkylation of the phosphate group, quite a few problems. First, since diazo derivatives are usually unstable themselves, the use of these labeling reagents in labeling kits is problematic. Second, the coupling product is unstable, which is not acceptable at all if the functional group of the labeled product reveals the presence of the target biomolecule in any sample. Finally, derivatives with diazomethyl functionality are water insoluble and are therefore used in two-phase conditions for coupling with soluble and stable biomolecules only in water or aqueous buffers. However, these conditions are disadvantageous for coupling efficiency because they slow the reaction rate. The novel labeling reagent of the present invention described in Patent Document 12 also solves these technical problems. According to one embodiment, the temperature stable labeling reagent has the following formula:
式中、
・R1は、H、あるいはアルキル、アリール又は置換アリール基を表し、
・R2は、検出可能な標識又は少なくとも1つの多量体構造で互いに結合した少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直線系を含むリンカーアームであり、かつ、nは、0又は1に等しい整数であり、
・R3及びR4は、互いに独立して、H、NO2、Cl、Br、F、I、R2−(L)n−Y−X−、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR(Rはアルキル又はアリールである)を表し、
・Aは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも1つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、uは、0から2の間の整数、好ましくは0又は1であり、かつ、
・−Y−X−は、−CONH−、−NHCO−、−CH2O−、−CH2S−を表す。
Where
R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group,
R 2 represents a detectable label or at least two detectable labels linked together in at least one multimeric structure;
L is a linker arm comprising at least two linear systems of covalent bonds and n is an integer equal to 0 or 1;
R 3 and R 4 are independently of each other H, NO 2 , Cl, Br, F, I, R 2 — (L) n —Y—X—, OR, SR, NR 2 , R, NHCOR, CONHR, COOR (R is alkyl or aryl),
A is a linker arm comprising at least one covalent double bond that allows conjugation with the aromatic ring of the diazo function, u is an integer between 0 and 2, preferably 0 or 1; And,
· -Y-X- is, -CONH -, - NHCO -, - CH 2 O -, - represents a CH 2 S-.
本出願人により出願されたさらなる特許文献13では、これらのジアゾ官能化系分子がさらに改善されたが、なお温度安定性であり、かつ、以下の式を有する。 In further patent application 13 filed by the present applicant, these diazo functionalized molecules are further improved, but are still temperature stable and have the following formula:
式中、
・R1は、H、あるいはアルキル、アリール又は置換アリール基を表し、
・R2は、検出可能な標識又は少なくとも1つの多量体構造で互いに結合した少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直線系を含むリンカーアームであり、かつ、nは、0又は1に等しい整数であり、
・R3及びR4は、互いに独立して、H、NO2、Cl、Br、F、I、R2−(L)n−Y−X−、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR、−CO−NH−(CH2)3−(O−CH2−CH2)3−CH2−NH−R2、−CO−NH−(CH2)3−(O−CH2−CH2)4−CH2−NH−R2(式中、Rはアルキル又はアリールである)であり、
・Aは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも1つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、uは、0から2の間の整数、好ましくは0又は1であり、
・−Y−X−は、−CONH−、−NHCO−、−CH2O−、−CH2S−を表し、
・−Z−は、−NH−、−NHCO−、−CONH−又はO−であり、
・mは、1から10の間の整数、好ましくは1から3の間の整数であり、かつ、
・pは、1から10の間の整数、好ましくは1から3の間の整数である。
Where
R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group,
R 2 represents a detectable label or at least two detectable labels linked together in at least one multimeric structure;
L is a linker arm comprising at least two linear systems of covalent bonds and n is an integer equal to 0 or 1;
R 3 and R 4 are independently of each other H, NO 2 , Cl, Br, F, I, R 2 — (L) n —Y—X—, OR, SR, NR 2 , R, NHCOR, CONHR, COOR, —CO—NH— (CH 2 ) 3 — (O—CH 2 —CH 2 ) 3 —CH 2 —NH—R 2 , —CO—NH— (CH 2 ) 3 — (O—CH 2) a -CH 2) 4 -CH 2 -NH- R 2 ( wherein, R is alkyl or aryl),
A is a linker arm comprising at least one covalent double bond that allows conjugation with the aromatic ring of the diazo function, u is an integer between 0 and 2, preferably 0 or 1;
· -Y-X- is, -CONH -, - NHCO -, - CH 2 O -, - CH 2 S- and represent,
-Z- is -NH-, -NHCO-, -CONH- or O-
M is an integer between 1 and 10, preferably between 1 and 3, and
P is an integer between 1 and 10, preferably between 1 and 3.
さらに、この標識化をより効率的にするため、天然又は合成ポリヌクレオチドは断片化されることもまた有利である。これらの核酸のサイズを縮小させることにより、標識がより利用しやすくなる。核酸の断片化については、多くの方法が先行技術に記載されている。第一に、断片化は酵素的であり得る。すなわち、核酸の断片化を、ヌクレアーゼ(DNA分解酵素又はRNA分解酵素)を用いて行うことができる。次いで、3’−OH末端、5’−OH末端、3’−リン酸塩末端又は5’−リン酸塩末端を有する小さい断片を生成する。 Furthermore, it is also advantageous that the natural or synthetic polynucleotide is fragmented to make this labeling more efficient. By reducing the size of these nucleic acids, the label becomes easier to use. Many methods have been described in the prior art for nucleic acid fragmentation. First, fragmentation can be enzymatic. That is, nucleic acid fragmentation can be performed using a nuclease (DNA degrading enzyme or RNA degrading enzyme). Small fragments with 3'-OH ends, 5'-OH ends, 3'-phosphate ends or 5'-phosphate ends are then generated.
第二に、断片化は化学的であり得る。例えば、DNAの場合、当該DNA上で脱プリン化又は脱ピリミジン化が行われ得、これは次いで、「β−除去」と呼ばれる機構により塩基の存在下で断片化され得る。DNAの断片化を、とりわけ、酸化、アルキル化、フリーラジカルの添加の機構により行うことができる。 Second, fragmentation can be chemical. For example, in the case of DNA, depurination or depyrimidineization can be performed on the DNA, which can then be fragmented in the presence of a base by a mechanism called “β-removal”. DNA fragmentation can be performed by, inter alia, oxidation, alkylation, free radical addition mechanisms.
RNA又はDNAを断片化するため、本出願人の特許である特許文献14及び15にそれぞれ記載されるように、化学的触媒として用いられる有機分子、例えばイミダゾールと結合することの多い金属カチオンが用いられる。この断片化は、好ましくは、アルカリ性媒体中で行われ、3’−リン酸塩末端を有する断片を生成する。この場合、標識の結合は、切断の間に遊離した核酸断片のリン酸塩のみで起こる。特異性はなく、断片化を、任意の型の核酸でランダムに行うことが可能である。事実、本発明者らの方法は、例えば、検出プローブを調製することができる。最後に、リン酸塩は、単に核酸と標識との間のリンカーアームにすぎない。 In order to fragment RNA or DNA, an organic molecule used as a chemical catalyst, such as a metal cation that often binds to imidazole, is used as described in the patents 14 and 15 of the applicant's patent, respectively. It is done. This fragmentation is preferably performed in an alkaline medium to produce fragments with 3'-phosphate ends. In this case, label binding occurs only at the phosphate of the nucleic acid fragment released during cleavage. There is no specificity and fragmentation can be done randomly with any type of nucleic acid. In fact, our method can, for example, prepare a detection probe. Finally, phosphate is simply a linker arm between the nucleic acid and the label.
用語「検出可能な標識」は、検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に生成できる、少なくとも1つの標識を意味するものとする。これらの標識の非限定的なリストは以下のとおりである:
・例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフェート、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−6−ホスフェート脱水素酵素など、比色分析、蛍光又は発光により、検出可能なシグナルを生成する酵素、
・蛍光性、発光性又は色素化合物などの発色団、
・電子顕微鏡により、あるいは誘電率、アンペロメトリー、ボルタンメトリー又はインピーダンスなどの自身の電気的性質により検出され得る高電子密度の基、
・検出可能な基(例えば、その分子は、それらの物理的及び/又は化学的特徴の検出可能な修飾を誘発するのに十分なサイズのものであり、この検出は、回折、表面プラズモン共鳴、表面変動又は接触角変動などの光学的方法、あるいは原子間力分光法又はトンネル効果などの物理的方法により行われ得る)。
・32P、35S又は125Iなどの放射性分子。
The term “detectable label” shall mean at least one label capable of directly or indirectly producing a detectable signal. A non-limiting list of these signs is as follows:
An enzyme that produces a detectable signal by colorimetry, fluorescence or luminescence, such as, for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphate, β-galactosidase or glucose-6-phosphate dehydrogenase,
Chromophores such as fluorescent, luminescent or dye compounds,
High electron density groups that can be detected by electron microscopy or by their own electrical properties such as dielectric constant, amperometry, voltammetry or impedance,
A detectable group (eg, the molecule is of a size sufficient to induce a detectable modification of their physical and / or chemical characteristics; this detection can include diffraction, surface plasmon resonance, It can be done by optical methods such as surface variation or contact angle variation, or physical methods such as atomic force spectroscopy or tunneling).
Radioactive molecules such as · 32 P, 35 S, or 125 I.
好ましくは、標識は、これらの標識に関する安全性の問題を回避するために、放射性標識ではない。 Preferably, the labels are not radioactive labels in order to avoid the safety issues associated with these labels.
例えば、標識は、フルオレセイン、ダンシル、IR型発色団(Li−COR社、米国ネブラスカ州リンカーン)などの立体障害が低い蛍光化合物、Cy5及びCy3(非特許文献3)などのシアニン誘導体、ならびに特にCy5誘導体などであり得、トレーサーは、ビオチン又はアビエタン誘導体などの立体障害が低いハプテンである(特許文献16を参照のこと)。用語「低い立体障害」は、2000g/mol未満(例えば、1064g/molの分子量を有するbis−bioPDAM)の分子量を意味するものとする。フルオロフォアの場合は、励起波長が450nmよりも長い、好ましくは600nmよりも長いフルオロフォアを用いて研究することが好ましい。 For example, the label may be a fluorescent compound with low steric hindrance such as fluorescein, dansyl, IR type chromophore (Li-COR, Lincoln, USA), cyanine derivatives such as Cy5 and Cy3 (Non-patent Document 3), and particularly Cy5. The tracer is a hapten with a low steric hindrance such as biotin or an abietan derivative (see Patent Document 16). The term “low steric hindrance” shall mean a molecular weight of less than 2000 g / mol (eg bis-bioPDAM having a molecular weight of 1064 g / mol). In the case of fluorophores, it is preferred to study using fluorophores whose excitation wavelength is longer than 450 nm, preferably longer than 600 nm.
トレーサーが、例えば、ビオチンなどのそれ自身がシグナルを生成しないハプテンである場合、検出は、上記の抗リガンド標識を認識することにより行われる。フルオレセインなどの蛍光化合物に結合したビオチン、ストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体の場合、Cy5又はフィコエリスリンが用いられる。アビエタンの場合、特許文献16に記載のモノクローナル抗体が用いられる。 When the tracer is a hapten that itself does not generate a signal, such as biotin, detection is performed by recognizing the anti-ligand label described above. In the case of biotin, streptavidin or anti-biotin antibody bound to a fluorescent compound such as fluorescein, Cy5 or phycoerythrin is used. In the case of Abietan, the monoclonal antibody described in Patent Document 16 is used.
これは標識前駆物質と呼ばれるものである。用語「標識前駆物質」は、ジアゾメチル官能基以外の少なくとも1つの必要に応じて保護された反応性官能基を有しかつ当該官能基と適合性を有する化合物を意味するものとし、これにより、引き続いて(すなわち、上記方法のいずれかの工程の後に、特にMnO2での酸化工程の後に)標識を付けることが可能になる。特に、標識前駆物質は、上記化学式に記載されたリンカーアームLを構成し得る。標識前駆物質を用いる方法の例はシグナル増幅のケースと関連する場合が多いが、当業者に周知の多様な保護基を用いて他の改変も可能である。 This is called a labeling precursor. The term “labeling precursor” is intended to mean a compound that has at least one optionally protected reactive functional group other than the diazomethyl functional group and is compatible with that functional group. (Ie, after any step of the above method, especially after the oxidation step with MnO 2 ). In particular, the labeling precursor may constitute the linker arm L described in the above chemical formula. Examples of methods using labeled precursors are often associated with the case of signal amplification, but other modifications are possible using a variety of protecting groups well known to those skilled in the art.
例えば、抗リガンドと反応し得るリガンドなどの間接的システムもまた用いられ得る。 For example, indirect systems such as ligands that can react with anti-ligands can also be used.
リガンド/抗リガンド対は当業者に周知であり、例えば以下の対の場合が挙げられる:
・ビオチン/ストレプトアビジン、
・ハプテン/抗体、
・抗原/抗体、
・ペプチド/抗体、
・糖/レクチン、
・ポリヌクレオチド/ポリヌクレオチドに相補的な配列。
この場合、結合剤を有するリガンドである。抗リガンドは、前段落に記載した標識により直接的に検出可能であり得るか、又はリガンド/抗リガンドにより単独で検出可能であり得る。
Ligand / anti-ligand pairs are well known to those skilled in the art and include, for example, the following pairs:
Biotin / streptavidin,
・ Hapten / antibody,
Antigen / antibody,
・ Peptides / antibodies,
・ Sugar / lectin,
A sequence complementary to the polynucleotide / polynucleotide.
In this case, the ligand has a binding agent. The anti-ligand can be directly detectable by the label described in the previous paragraph, or it can be detectable alone by the ligand / anti-ligand.
これらの間接的検出システムは、特定の条件下で、例えば、多量体構造を用いることにより、結果としてシグナル増幅を生成し得る。このシグナル増幅技術は、当業者に周知であり、本出願人の先行特許出願である特許文献17及び18、あるいは非特許文献4が参照され得る。
These indirect detection systems can result in signal amplification under certain conditions, for example by using multimeric structures. This signal amplification technique is well known to those skilled in the art, and can be referred to Patent Documents 17 and 18, which are the prior patent applications of the present applicant, or
用語「多量体構造」は、化学的又は生物学的シントンの繰り返し単位から構成されるポリマーを意味する。本発明で用いられ得るそのような構造の多くの変異体が公知であり、例えば
・線状ポリマー(特許文献19及び20)、
・分岐鎖ポリマー(特許文献21)、
・粒子(特許文献22)、
・デンドリマー(特許文献23〜25)、
・ポリヌクレオチド、及び
・ポリペプチド
がある。
The term “multimeric structure” means a polymer composed of repeating units of chemical or biological synthons. Many variants of such structures that can be used in the present invention are known, for example: • Linear polymers (patent documents 19 and 20),
・ Branched polymer (Patent Document 21),
-Particles (Patent Document 22),
・ Dendrimer (Patent Documents 23 to 25),
There are polynucleotides and polypeptides.
間接的システムの他の例は、リガンドと抗リガンドとの間の特定の共有結合、例えば、メチルケトン及びアルコキシアミンを用いる。このシステムの例は、特許文献26及び27に記載されている。これらの間接的検出システムは、特定の条件下で、結果としてシグナル増幅を生成し得、ポリマーを用いる化学的増幅の例として、先行特許出願である特許文献28〜30を、又はスタッキングによる化学的増幅の例として、特許文献31を参照し得る。 Other examples of indirect systems use specific covalent bonds between the ligand and the anti-ligand, such as methyl ketone and alkoxyamine. Examples of this system are described in US Pat. These indirect detection systems can result in signal amplification under certain conditions, as examples of chemical amplification using polymers, see prior patent applications US Pat. As an example of amplification, reference can be made to US Pat.
シグナル増幅の特別な実施では、少なくとも2つの標識が標識試薬上に存在する。 In a special implementation of signal amplification, at least two labels are present on the labeling reagent.
さらに、本発明の標識試薬は、DMF、DMSO、CH3CN、THF、DMA(ジメチルアセトアミド)、NMP(N−メチルピロリドン)又はDME(ジメトキシエタン)などの極性かつ水混和性溶媒に可溶性である。 Furthermore, the labeling reagent of the present invention is soluble in polar and water-miscible solvents such as DMF, DMSO, CH 3 CN, THF, DMA (dimethylacetamide), NMP (N-methylpyrrolidone) or DME (dimethoxyethane). .
好ましくは、標識試薬は、DMSO又は水に可溶性である。 Preferably, the labeling reagent is soluble in DMSO or water.
用語「水混和性溶媒」は、少なくとも5体積%の比率で、水又は塩を含む水性緩衝液と混和性である溶媒を意味するものとする。 The term “water-miscible solvent” shall mean a solvent that is miscible with an aqueous buffer containing water or salt in a proportion of at least 5% by volume.
用語「生体分子」は、化合物が生物学的興味のある標的分子と反応することを可能にする少なくとも1つの認識部位を有する化合物を意味するものとする。例えば、生体分子としては、核酸、抗原、抗体、ポリペプチド、タンパク質及びハプテンを挙げることができる。 The term “biomolecule” is intended to mean a compound having at least one recognition site that allows the compound to react with a target molecule of biological interest. For example, biomolecules can include nucleic acids, antigens, antibodies, polypeptides, proteins, and haptens.
用語「核酸」は、必要に応じて少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、一連の少なくとも2つのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、例えば、イノシン、メチル−5−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−5−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−2,6−プリン、ブロモ−5−デオキシウリジンなどの修飾塩基、又はハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基を含む少なくとも1つのヌクレオチドを意味する。このポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間結合のレベルで修飾され得る(例えば、ホスホロチオエート、H−ホスホン酸塩又はホスホン酸アルキル)か、又は骨格のレベルで修飾され得る(例えば、α−オリゴヌクレオチド(特許文献32)又はPNA(非特許文献5)又は2’−O−アルキルリボヌクレオチド)。核酸は、天然又は合成の、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボソームRNA、メッセンジャーRNA、転写RNA又は以下の酵素増幅技術で得られる核酸である:
・特許文献33〜35に記載のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)及びその派生方法であるRT−PCR(逆転写PCR)、特に、特許文献36に記載の1段階方式、
・例えば、特許文献37に開示のLCR(リガーゼ連鎖反応)、
・特許文献38に記載のRCR(修復連鎖反応)、
・特許文献39に記載の3SR(自己保持配列複製)、
・特許文献40に記載のNASBA(核酸配列系増幅)、及び
・特許文献41に記載のTMA(転写媒介増幅)。
The term “nucleic acid” includes a series of at least two deoxyribonucleotides or ribonucleotides, optionally including at least one modified nucleotide, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine. , Means a modified base such as diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine, or any other modified base that allows hybridization. The polynucleotide can also be modified at the level of internucleotide linkage (eg, phosphorothioate, H-phosphonate or alkyl phosphonate) or it can be modified at the backbone level (eg, α-oligonucleotide 32) or PNA (Non-Patent Document 5) or 2′-O-alkylribonucleotide). A nucleic acid is a natural or synthetic oligonucleotide, polynucleotide, nucleic acid fragment, ribosomal RNA, messenger RNA, transcribed RNA or nucleic acid obtained by the following enzyme amplification techniques:
-PCR (Polymerase Chain Reaction) described in Patent Documents 33 to 35 and RT-PCR (Reverse Transcription PCR) which is a derivative method thereof, in particular, a one-step system described in Patent Document 36,
-For example, LCR (ligase chain reaction) disclosed in Patent Document 37,
-RCR (Repair Chain Reaction) described in Patent Document 38,
3SR (self-retaining sequence replication) described in Patent Document 39,
NASBA (nucleic acid sequence amplification) described in Patent Document 40, and TMA (transcription-mediated amplification) described in Patent Document 41.
従って、用語「アンプリコン」は、酵素増幅技術により産生される核酸を表すのに用いられる。 Thus, the term “amplicon” is used to refer to nucleic acids produced by enzyme amplification techniques.
これらの修飾のそれぞれは、少なくとも1つのリン酸塩が核酸内に存在する限り、組み合わせて用いられ得る。 Each of these modifications can be used in combination as long as at least one phosphate is present in the nucleic acid.
用語「ハプテン」は、非免疫原性の化合物、すなわち、それら自身は抗体産生による免疫反応を促進し得ないが、公知の条件下で、特にハプテン−タンパク質複合体を用いる免疫化によって、動物を免疫化することにより得られる抗体によって認識され得る、化合物を表す。これらの化合物は、一般に、3000Da未満の分子量、最も一般的には2000Da未満の分子量を有し、かつ、例えば、グリコシル化されたペプチド類、代謝産物、ビタミン、ホルモン、プロスタグランジン、毒素、又は種々の薬物、ヌクレオシド及びヌクレオチドであり得る。 The term “hapten” refers to non-immunogenic compounds, ie, animals that themselves cannot promote an immune response due to antibody production, but under known conditions, particularly by immunization with a hapten-protein complex. Represents a compound that can be recognized by an antibody obtained by immunization. These compounds generally have a molecular weight of less than 3000 Da, most commonly less than 2000 Da, and are, for example, glycosylated peptides, metabolites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins, or It can be a variety of drugs, nucleosides and nucleotides.
用語「精製工程」は、特に、微生物の核酸と、核酸精製に先立つ溶解工程で遊離した細胞成分とを分離することを意図する。これらの溶解工程は周知であり、指向的な例としては、以下の特許出願に記載の溶解方法が用いられ得る:
−特許文献42(超音波処理による溶解に関する)、
−特許文献43(磁気的及び機械的混合による溶解に関する)、
−特許文献44(電気的溶解に関する)、及び
−特許文献45(機械的溶解に関する)。
The term “purification step” is specifically intended to separate microbial nucleic acids from cellular components released in the lysis step prior to nucleic acid purification. These dissolution steps are well known and, as a direct example, the dissolution methods described in the following patent applications can be used:
Patent Document 42 (for dissolution by sonication),
Patent document 43 (for dissolution by magnetic and mechanical mixing),
-Patent Literature 44 (for electrical dissolution) and-Patent Literature 45 (for mechanical dissolution).
当業者は、他の周知の溶解方法、例えば、熱又は浸透圧ショック、あるいは、特に、本出願人に帰属する特許文献46に記載されたグアニジウム塩などのカオトロピック剤での処理を用い得る。 One skilled in the art can use other well-known dissolution methods, such as heat or osmotic shock, or treatment with chaotropic agents such as, in particular, guanidinium salts described in US Pat.
この工程は、一般に、核酸を濃縮することを可能にする。例えば、磁性粒子を用いることが可能であるので(これに関しては、本出願人の特許:特許文献47及び48を参照されたい)、これらの磁性粒子に付着した核酸を洗浄工程により精製することが可能である。この核酸精製工程は、引き続いて当該核酸を増幅することが望まれる場合に、特に有利である。これらの磁性粒子の特に有利な実施形態は、特許文献49及び50に記載される。 This step generally makes it possible to concentrate the nucleic acid. For example, it is possible to use magnetic particles (for this, see the Applicant's patents: patent documents 47 and 48), the nucleic acids attached to these magnetic particles can be purified by a washing step. Is possible. This nucleic acid purification step is particularly advantageous when it is desired to subsequently amplify the nucleic acid. Particularly advantageous embodiments of these magnetic particles are described in US Pat.
本明細書中で用いられる用語「固体支持体」は、例えば、標識反応の間に遊離した、除去することが必要とされるジアゾ、アジンなどの分解又は転位の生成物などの、ジアゾメチル官能基又はそれから誘導される官能基を有する分子を付着し得る全ての物質を含む。必要に応じて化学的に修飾された合成物質又は天然物質を、固体支持体として用いることができる:
・特に、セルロース系物質(例えば、紙、酢酸セルロース及びニトロセルロースなどのセルロース誘導体)、又はデキストランなどの多糖類、
・特に、スチレン型のモノマーに基づく、綿などの天然繊維、及びナイロンなどの合成繊維;シリカ、水晶、ガラス、セラミックなどの無機物;ラテックス;磁性粒子;金属誘導体、ゲルなど。固体支持体は、マイクロタイタープレート、膜、粒子あるいはガラス又はケイ素又は誘導体の実質的に平面のプレートの形態であり得る。これらの支持体はまた、以下に説明するように、ジアゾ官能基又はそれから誘導される官能基と反応し得る、目的のアニオン性基及び/又は酸性基で官能基化され得る。
As used herein, the term “solid support” refers to a diazomethyl functional group such as, for example, a product of degradation or rearrangement of a diazo, azine, etc. that is liberated during the labeling reaction and that needs to be removed. Or includes all substances capable of attaching molecules having functional groups derived therefrom. Synthetic or natural substances that are chemically modified as required can be used as solid supports:
-In particular, cellulosic materials (eg, cellulose, cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose), or polysaccharides such as dextran,
In particular, natural fibers such as cotton and synthetic fibers such as nylon based on styrene type monomers; inorganic materials such as silica, quartz, glass, ceramics; latex; magnetic particles; metal derivatives, gels and the like. The solid support can be in the form of a microtiter plate, a membrane, particles or a substantially planar plate of glass or silicon or a derivative. These supports can also be functionalized with anionic and / or acidic groups of interest that can react with diazo functional groups or functional groups derived therefrom, as described below.
上記のように、先行技術はまた、そのリン酸塩基に結合することによって核酸を標識するための、つまり、それらを、特に蛍光読み取りにより検出可能にするための、ジアゾ官能基を有する化合物を用いる方法を記載する。この場合、蛍光分子との共有結合又は非共有結合を可能にする蛍光基(フルオレセイン、Cy5)又は基(ビオチン、ハプテン又は反応性官能基型の基)を有するジアゾ化合物が用いられる。 As mentioned above, the prior art also uses compounds with diazo functional groups for labeling nucleic acids by binding to their phosphate groups, ie for making them detectable, in particular by fluorescence reading. Describes the method. In this case, a diazo compound having a fluorescent group (fluorescein, Cy5) or group (biotin, hapten, or reactive functional group type group) that enables covalent bonding or non-covalent bonding with a fluorescent molecule is used.
先行技術は、標識プロセスに伴って多数の精製手段を用いる方法を記載する。これらの手段のなかでも、有機相での抽出、濾過及びゲル濾過が挙げられ得る。しかし、参考技術は、特異的ハイブリダイゼーション(DNAチップだけでなく、ELOSAプレート又は迅速試験形態にも関する)において検出させるプロセスにおいて、標識の前又は後に、核酸を精製するため、シリカを粉末型、ゲル又は磁性粒子の形状で用いる。標識前の精製は、標識の収量をかなり改善することを可能にし、標識後の精製は、ハイブリダイゼーション収量を決定的に改善することを可能にするので、試験の感度を良好とするために必要なシグナル/ノイズ比を改善することを可能にする。実際に、標識する間に使用されるが反応はしない過剰な標識は、ハイブリダイゼーションにかなり影響し得る。 The prior art describes methods that use multiple purification means in conjunction with the labeling process. Among these means can be mentioned extraction with organic phase, filtration and gel filtration. However, the reference technique is to use silica in powder form to purify nucleic acids before or after labeling in the process of detection in specific hybridization (not only for DNA chips but also for ELOSA plates or rapid test formats). Used in the form of gel or magnetic particles. Purification before labeling can significantly improve the yield of label, and post-labeling purification can significantly improve hybridization yield, so it is necessary to improve the sensitivity of the test. It makes it possible to improve the signal / noise ratio. In fact, excess label that is used during labeling but does not react can significantly affect hybridization.
シリカ上での精製は、洗浄工程及び固相の溶出工程を必要とする。3つの工程(付着/洗浄/溶出)では液体を移動させる必要があり、このことは汚染及び物質の損失の潜在的な要因であるため、一般に、適度に自動化可能である。さらに、このプロセスは、工程全体にわたって操作者の介入を必要とし、かつ、カオトロピック性(刺激性)塩を使用する必要がある。 Purification on silica requires a washing step and a solid phase elution step. The three steps (deposition / wash / elution) require the liquid to be moved, which is a potential source of contamination and material loss and is generally reasonably automatable. Furthermore, this process requires operator intervention throughout the process and requires the use of chaotropic salts.
要約すると、精製工程を有する全てのこれらの標識方法に必須の課題は、実際に効率的な標識を得るということであり、全ての核酸が標識され得るよう、過剰な標識を用いる必要がある。処理された液状溶液中に標識核酸が存在している場合のみならず、反応しなかった標識が存在する場合についても、当該液状試料を特定の検出工程で引き続いて用いることができないということになる。過剰に存在する標識は、前もって除去することが必要である。必要に応じて磁性材料を含むシリカ粒子に核酸を結合することによって、標識又は非標識の核酸を固定し、かつ望ましくない成分を除去することによってこれを洗浄すれば、上記の除去を行うことができる。既に上述した本出願人の特許である特許文献46は、この型のプロセスを可能にする。しかしこれは、実施者が時間を費やすという点及び材料の点でコストのかかる、更なる工程を生じる。
従って、本発明は、標識が目的の核酸に優先的に結合できるように、かつ、そのような結合が生じなかった場合には、洗浄相を要さずに固相上で標識を捕捉することが必要に応じてできるように、標識又は標識前駆物質の化学的特徴を用いることから構成される。さらに、刺激性のカオトロピック剤が、精製プロセスに必要とされない。同様に、本発明の方法は、液体を固相に通すことを意図したポンプ又は遠心分離型の追加のシステムを必要としない。上記プロセスは、精製相が(磁性又は非磁性の)粒子から構成される場合、磁化又は濾過システムを必要とする場合がある;しかし、この装置は必須ではなく、完全受動的なプロセス(標識媒体の固相への通過)が用いられ得る。最終的に、本方法は、固相であること及び単純であること(接触、インキュベーション、ハイブリダイゼーションへの移行)から、容易に自動化され得る。本方法は、連続的フローを使用していて、チップ上でのハイブリダイゼーションを用いる核酸の精製用の自動装置(「Lab−on−Card」型の装置、又は、一本のチューブ中に完全に統合された装置)への統合を単純化できるシステム、で使用できる。このことは、汚染危険性が下がるであろうこと、及び、消費性物質の使用数が減るであろうことを意味する。 Therefore, the present invention captures the label on the solid phase without requiring a wash phase so that the label can preferentially bind to the nucleic acid of interest and if such binding does not occur. Consists of using chemical features of the label or label precursor so that can be done as needed. Furthermore, irritating chaotropic agents are not required for the purification process. Similarly, the method of the present invention does not require a pump or an additional system of the centrifugal type intended to pass the liquid through the solid phase. The above process may require a magnetizing or filtration system if the purified phase is composed of (magnetic or non-magnetic) particles; however, this device is not essential and is a completely passive process (labeling medium) Can be used. Finally, the method can be easily automated because it is a solid phase and is simple (contact, incubation, transition to hybridization). The method uses a continuous flow and is an automated device for nucleic acid purification using on-chip hybridization (a “Lab-on-Card” type device, or completely in a single tube. Can be used in systems, which can simplify the integration into integrated devices). This means that the risk of contamination will be reduced and the number of consumable substances used will be reduced.
この効果のために、第1の実施形態では、本発明は、生体試料に含まれる目的の生体分子を標識する方法であって、以下:
a)反応容器を提供する工程、
b)目的の生体分子の標識又は標識前駆物質を結合し得る捕捉分子を、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面の全部又は一部に固定化する工程、
c)生体試料、及び以下のものを、当該反応容器に導入する工程、
1)目的の生体分子の少なくとも1つの標識又は標識前駆物質、及び
2)必要に応じて、目的の生体分子を標識するのに、又は予備標識するのに必要とされる任意の成分、
d)反応容器の内容物をインキュベートする工程、
e)目的の生体分子と反応しなかった標識又は標識前駆物質を、捕捉分子への結合によって固定化する工程、及び
f)標識された目的の生体分子(すなわち、当該標識又は標識前駆物質と反応するもの)を次の工程に用いる工程
を含む、方法に関する。
Because of this effect, in a first embodiment, the present invention is a method for labeling a target biomolecule contained in a biological sample, comprising:
a) providing a reaction vessel;
b) immobilizing a capture molecule capable of binding a target biomolecule label or label precursor on all or a part of the inner surface of a container or a solid support introduced into the container;
c) introducing a biological sample and the following into the reaction vessel,
1) at least one label or label precursor of the biomolecule of interest, and 2) any components needed to label or pre-label the biomolecule of interest, as required,
d) incubating the contents of the reaction vessel;
e) a step of immobilizing a label or label precursor that has not reacted with the target biomolecule by binding to the capture molecule; and f) a labeled target biomolecule (ie, reacting with the label or label precursor). To the next step.
第2の実施形態によれば、本発明はまた、目的の生体分子、及び、目的の生体分子の少なくとも1つの標識又は標識前駆物質の混合物を含む生体試料を、必要に応じて、目的の生体分子を標識するのに必要とされる任意の成分と併用したものを、処理する方法にも関し、当該方法は、以下を含む:
a)反応容器を提供する工程、
b)目的の生体分子の標識又は標識前駆物質を結合し得る捕捉分子を、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面の全部又は一部に固定化する工程、
c)生体試料を、当該反応容器に導入する工程、
d)反応容器の内容物をインキュベートする工程、
e)目的の生体分子と反応しなかった標識又は標識前駆物質を、捕捉分子への結合によって固定化する工程、及び
f)標識された目的の生体分子(すなわち、当該標識又は標識前駆物質と反応するもの)を次の工程に用いる工程。
According to the second embodiment, the present invention also provides a biological sample comprising a target biomolecule and a mixture of at least one label or labeled precursor of the target biomolecule, Also related to a method of treating a combination with any component required to label a molecule, the method includes:
a) providing a reaction vessel;
b) immobilizing a capture molecule capable of binding a target biomolecule label or label precursor on all or a part of the inner surface of a container or a solid support introduced into the container;
c) introducing a biological sample into the reaction vessel;
d) incubating the contents of the reaction vessel;
e) a step of immobilizing a label or label precursor that has not reacted with the target biomolecule by binding to the capture molecule; and f) a labeled target biomolecule (ie, reacting with the label or label precursor). To use in the next step.
上記の2つの状況において、かつ、好ましい実施形態によれば、目的の生体分子と反応しない標識又は標識前駆物質の捕捉分子への結合は、共有結合により起こる。 In the above two situations, and according to a preferred embodiment, the binding of the label or label precursor that does not react with the biomolecule of interest to the capture molecule occurs via a covalent bond.
特定の実施形態において、かつ、上記工程a)の前には、生体試料を、以下の工程の少なくとも1つに従って処理する:
・上流の他の反応容器からの移動、
・目的の生体分子を利用可能及び/又は検出可能にするための複合体生体物質の溶解、
・目的の生体分子の捕捉又は単離、及び/又は
・目的の生体分子の検出を可能にするか、又はそれらの検出を増強するための、当該目的の生体分子の処理;この処理は、例えば、熱処理からなり得る。
In certain embodiments and prior to step a) above, the biological sample is treated according to at least one of the following steps:
-Movement from other reaction vessels upstream,
Dissolution of complex biological material to make the target biomolecule available and / or detectable;
The treatment or isolation of the biomolecules of interest and / or the treatment of the biomolecules of interest in order to allow or enhance the detection of the biomolecules of interest; May consist of heat treatment.
別の特定の実施形態において、上記工程f)の後に、以下の少なくとも1つの次の工程を行う:
・下流の他の反応容器への移動、
・予備標識された目的の生体分子の標識、
・標識された又は予備標識された目的の生体分子の精製、及び/又は
・捕捉プローブにハイブリダイズした、標識された目的の生体分子の検出。
In another particular embodiment, step f) above is followed by at least one of the following steps:
・ Transfer to other reaction vessels downstream,
-Pre-labeled target biomolecule labeling,
Purification of labeled or prelabeled biomolecules of interest and / or detection of labeled biomolecules of interest hybridized to capture probes.
目的の生体分子の検出は、例えば、均一相中で、検出分子(例えば、核酸プローブ)を用いるハイブリダイゼーションを伴って又は伴わずに、有利に実施され得る。 Detection of the biomolecule of interest can be advantageously performed, for example, in a homogeneous phase, with or without hybridization with a detection molecule (eg, a nucleic acid probe).
全ての上記の状況において、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面は、アニオン性官能基及び/又は酸官能基を有することが可能であり、かつ、標識又は標識前駆物質は、ジアゾ官能基(−N=N)を含むことが可能である。 In all the above situations, the inner surface of the container or the solid support introduced into the container can have anionic and / or acid functional groups and the label or label precursor is It may contain a diazo functional group (—N═N).
後者の実施形態では、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面が有する官能基は、カルボン酸官能基及び/又はスルホン酸官能基からなる。 In the latter embodiment, the functional group possessed by the container or the internal surface of the solid support introduced into the container comprises a carboxylic acid functional group and / or a sulfonic acid functional group.
全てのこれらの状況において、目的の生体分子は、核酸及び/又は核酸断片からなる。 In all these situations, the biomolecule of interest consists of nucleic acids and / or nucleic acid fragments.
後者の実施形態では、核酸及び/又は核酸断片は、DNA、RNA、DNA−RNAキメラポリマーからなり、これは、必要に応じて、少なくとも1つのヌクレオチドチオホスフェート、LNA、2’−O−Me及び/又はメチルホスホン酸塩誘導体を含み得る。 In the latter embodiment, the nucleic acid and / or nucleic acid fragment consists of DNA, RNA, DNA-RNA chimeric polymer, which optionally comprises at least one nucleotide thiophosphate, LNA, 2′-O-Me and And / or a methylphosphonate derivative.
目的の生体分子が核酸又は核酸断片である実施形態では、上記で定義した工程a)の前に、生体試料を、少なくとも1つの以下の工程に従って処理する:
・上流の他の反応容器からの移動、
・核酸を利用可能にするための、生体試料に含まれる複合体生体物質の溶解、
・複合体生体物質からの核酸の抽出、
・目的の核酸の特異的増幅、
・当該目的の核酸又はアンプリコンの断片化、及び/又は
・いかなる注目すべき増幅現象もなく、目的の核酸を転写又は逆転写すること。
In embodiments where the biomolecule of interest is a nucleic acid or nucleic acid fragment, prior to step a) as defined above, the biological sample is treated according to at least one of the following steps:
-Movement from other reaction vessels upstream,
・ Dissolution of complex biological material contained in biological samples to make nucleic acid available,
・ Nucleic acid extraction from complex biological material,
-Specific amplification of the nucleic acid of interest,
• Fragmentation of the nucleic acid or amplicon of interest and / or transcription or reverse transcription of the nucleic acid of interest without any remarkable amplification phenomenon.
なお同様の状況では、上記で定義した工程f)の後に、以下の少なくとも1つの次の工程を行う:
・下流の他の反応容器への移動;
・予備標識された核酸の標識;
・標識された又は予備標識された核酸の精製、
・捕捉プローブにハイブリダイズした標識された又は予備標識された核酸の検出;
・いかなる著しい増幅現象もなく、目的の核酸を転写又は逆転写すること;及び/又は
・検出プローブを用いるか又は用いることなく、標識された又は予備標識された核酸を均一相検出すること。
In a similar situation, after step f) defined above, at least one of the following steps is performed:
-Move downstream to other reaction vessels;
-Labeling of pre-labeled nucleic acids;
Purification of labeled or pre-labeled nucleic acids,
Detection of labeled or pre-labeled nucleic acid hybridized to the capture probe;
Transcription or reverse transcription of the nucleic acid of interest without any significant amplification phenomenon; and / or homogeneous phase detection of labeled or pre-labeled nucleic acid with or without detection probes.
本発明の他の実施形態によれば、捕捉分子は、標識に対して過剰に存在し、かつ、標識は、標識される目的の生体分子に対して過剰に存在する。 According to another embodiment of the invention, the capture molecule is present in excess relative to the label and the label is present in excess relative to the biomolecule of interest to be labeled.
より詳細には、捕捉分子は、核酸と反応しない遊離の標識に対して過剰に存在し、かつ、標識は、標識される核酸に対して過剰に存在する。 More specifically, the capture molecule is present in excess relative to a free label that does not react with the nucleic acid, and the label is present in excess relative to the nucleic acid to be labeled.
目的の核酸の検出及び/又は定量及び/又は精製を可能にするために、標識された核酸は、反応条件によって、特に温度又は反応媒体の塩分の条件によって、特異的にハイブリダイズできるよう標的に対して十分に相補性のある複合体を形成し得る。 In order to allow detection and / or quantification and / or purification of the nucleic acid of interest, the labeled nucleic acid is targeted to the target so that it can specifically hybridize depending on the reaction conditions, in particular the temperature or the salinity conditions of the reaction medium. Complexes that are sufficiently complementary to each other can be formed.
さらに、反応しなかった標識、すなわち遊離の標識は、それらの反応性官能基を完全な形で保持するため、相補的反応性官能基を有する捕捉分子と引き続いて反応し得るが、この反応は特異的ではない。従って、反応性官能基及び相補的反応性官能基は、共有結合を形成し、それによって遊離の標識の固定化を可能にするので、生体試料は、核酸に関連する標識のみを含む。 In addition, unreacted labels, i.e. free labels, retain their reactive functional groups in their entirety and can subsequently react with capture molecules with complementary reactive functional groups, but this reaction Not specific. Thus, the biological sample contains only the label associated with the nucleic acid, as the reactive functional group and the complementary reactive functional group form a covalent bond, thereby allowing immobilization of the free label.
添付の図面は、本発明の精製方法の多様な工程を示す。それらは、特定の実施形態を示すが、本発明の範囲を限定するとは考えられ得ない。 The accompanying drawings show the various steps of the purification method of the present invention. They represent specific embodiments, but cannot be considered to limit the scope of the invention.
図1は、反応容器の横断面における図を表し、ここで、精製方法が実施される。この容器は、上部蓋及び下部本体を含み、当該本体は、本発明の方法が実施され得るスペースを作るように中空になっている。このスペースは、処理すべき生体試料を入れることのできる供給チャネルを左側に有し、かつ、処理された生体試料を排出できる排出チャネルを右側に備える。容器の内部スペースは、処理又は被覆されて、カルボン酸反応性官能基を有する捕捉分子を呈する。蓋の内部スペースについても、処理されていてよい。 FIG. 1 represents a cross-sectional view of the reaction vessel, where the purification method is carried out. The container includes an upper lid and a lower body that is hollow to create a space in which the method of the present invention can be performed. This space has a supply channel on the left side that can contain a biological sample to be processed and a discharge channel on the right side that can discharge the processed biological sample. The interior space of the container is treated or coated to present a capture molecule having a carboxylic acid reactive functional group. The interior space of the lid may also be processed.
上述したように、供給チャネルは、とりわけ、ジアゾ官能基を有する核酸及び標識を含む液体生体試料を矢印の方向に導入することを可能にする。この図で示される場合には、核酸はまだ標識されていないが、それらを前もって標識と接触させることもまた可能である。 As mentioned above, the supply channel makes it possible in particular to introduce a liquid biological sample comprising a nucleic acid having a diazo functional group and a label in the direction of the arrow. In the case shown in this figure, the nucleic acids are not yet labeled, but it is also possible to contact them in advance with a label.
図2は、図1と同一の図を表し、ここで、生体試料は、標識核酸及び遊離の標識(すなわち、核酸と反応していない標識)を含む反応容器の内部スペースに存在する。標識が核酸に対して過剰に存在するため、全てのこれらの核酸が標識される一方、多数の遊離の標識が存在する。 FIG. 2 represents the same diagram as FIG. 1, where the biological sample is present in the internal space of the reaction vessel containing labeled nucleic acid and free label (ie, label that has not reacted with the nucleic acid). While all these nucleic acids are labeled because the label is present in excess of the nucleic acid, there are a number of free labels.
図3も図1及び2と同一であるが、着目すべきは、一定の期間後、すなわち通常はbis−BioPDAMの場合、少なくとも10分間程度かつ1時間未満にわたって、遊離の標識が、容器の内部スペースに存在するカルボン酸反応性官能基に優先的に結合する。用語「優先的に」は、遊離の標識が捕捉されて阻害濃度未満(2mM未満)となることを意図する。これらの反応性官能基が、核酸と反応しなかった遊離の標識に対して過剰に存在することはかなり明らかである。 FIG. 3 is also identical to FIGS. 1 and 2, but it should be noted that after a certain period of time, i.e., in the case of bis-BioPDAM, the free label is usually kept within the container for at least 10 minutes and less than 1 hour. It binds preferentially to the carboxylic acid reactive functional group present in the space. The term “preferentially” intends that free label is captured to be below the inhibitory concentration (less than 2 mM). It is quite clear that these reactive functional groups are present in excess relative to the free label that did not react with the nucleic acid.
図4も図1〜3と同一である。上記のように、出口チャネルは、とりわけ、標識核酸を含むが遊離の標識は含まない処理された液体生体試料が、図の右側の矢印の方向に放出されることを可能にする。 FIG. 4 is also the same as FIGS. As mentioned above, the outlet channel, among other things, allows a treated liquid biological sample containing labeled nucleic acid but no free label to be released in the direction of the arrow on the right side of the figure.
図5は、N,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジアゾメチル)イソフタルアミド分子の構造式を示すが、文章の理解を容易にするため、これを以下で「bis−BioPDAM」ともいう。 FIG. 5 shows the structural formula of N, N′-bis (13-biotinoylamino-4,7,10-trioxatridecyl) -5- (diazomethyl) isophthalamide molecule, but the text is easy to understand. This is hereinafter also referred to as “bis-BioPDAM”.
最後に、図6は、N,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジメトキシメチル)イソフタルアミド分子の構造式を示すが、文章の理解を容易にするため、これを以下で「アセタール」ともいう。 Finally, FIG. 6 shows the structural formula of the N, N′-bis (13-biotinoylamino-4,7,10-trioxatridecyl) -5- (dimethoxymethyl) isophthalamide molecule. This is also referred to as “acetal” hereinafter.
実施例1:RT−PCR増幅産物のカルボン酸粒子の標識化及び精製、その後のDNAチップ(Affymetrix社,カリフォルニア州サンタクララ)上での分析
本実施例では、遊離の標識の結合は固体支持体上では直接起こらないが、標識の磁性粒子との反応性を試験することにより、本発明の概念の有効性を制御することができる。
Example 1: Labeling and purification of carboxylic acid particles of RT-PCR amplification products, followed by analysis on a DNA chip (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) In this example, free label binding is performed on a solid support. Although not directly occurring above, by testing the reactivity of the label with the magnetic particles, the effectiveness of the inventive concept can be controlled.
A − B型インフルエンザのPCR:
この実験は、「B型インフルエンザ」モデルで実施される。
PCR for influenza A-B:
This experiment is performed in the “type B influenza” model.
この名称は、B型インフルエンザウイルスRNA遺伝子の断片の190塩基の配列からRT−PCRにより生成したアンプリコンを意味する。 This name means an amplicon generated by RT-PCR from a 190 base sequence of a fragment of influenza B virus RNA gene.
試料の調製の条件、ウイルスRNA抽出、当該ウイルスRNAの増幅及びプライマーの配列は、論文“Effectiveness of Reverse Transcription−PCR,Virus Isolation,and Enzyme−linked Immunosorbent Assay for diagnosis of Influenza A Virus Infection in different Age Groups”,Steininger C.ら,J.Clin.microbiol.,(2002):40(6),2051−2056に記載されている。 The conditions of sample preparation, viral RNA extraction, amplification of the viral RNA and primer sequences are described in the article “Effectiveness of Reverse Transcription-PCR, Virus Isolation and Instimated Insufficiency Insufficiency Insufficiency Insufficiency Insufficiency Insufficiency Infusion Indication. "Steininger C.I. J. et al. Clin. microbiol. , (2002): 40 (6), 2051-2056.
RT−PCRは、ウイルスRNA(一回増幅あたり103コピー)の調製物を開始テンプレートとして用い、Titan One Tube RT−PCRシステムキット(Roche Diagnostic Corporation社、スイス国バーゼル、参照番号:11 855 476 001)を用い、0.2mMの各デオキシリボヌクレオチド、0.3μMのプライマー及び0.4μlの酵素を用いて行う。 RT-PCR uses a preparation of viral RNA (10 3 copies per amplification) as a starting template and a Titan One Tube RT-PCR system kit (Roche Diagnostics Corporation, Basel, Switzerland, reference number: 11 855 476 001). ) Using 0.2 mM each deoxyribonucleotide, 0.3 μM primer and 0.4 μl enzyme.
RT−PCRサイクルのパラメータは、以下のとおりである:逆転写反応を実行するために60℃で30分間、40サイクルは以下のプロトコルに従う:94℃で20秒、次いで50℃で30秒、最後に72℃で30秒、次いでサーモサイクラーが停止するまで4℃とする。 The parameters of the RT-PCR cycle are as follows: to perform the reverse transcription reaction at 60 ° C. for 30 minutes, 40 cycles follow the following protocol: 94 ° C. for 20 seconds, then 50 ° C. for 30 seconds, last At 72 ° C. for 30 seconds and then 4 ° C. until the thermocycler stops.
上述するRT−PCRに由来するアンプリコンを、以下で、用語「PCR B型インフルエンザ」と称する。 The amplicon derived from the RT-PCR described above is hereinafter referred to as the term “PCR influenza B”.
B − 均一相標識(参照プロトコル):
均一相の標識を参照、すなわち、本発明に対する「コントロール」技術として用いる。
B-Homogeneous phase labeling (reference protocol):
A homogeneous phase label is used as a reference, ie, as a “control” technique for the present invention.
プロトコルは、DNAの十分な標識を可能にするが、閾値を超えると遊離の標識がハイブリダイゼーションに影響するその閾値未満である標識の最終濃度(2mM)を用いて開発された。 The protocol was developed with a final concentration of label (2 mM) that allows sufficient labeling of the DNA, but above which threshold free label affects hybridization when threshold is exceeded.
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlの化合物N,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジアゾメチル)イソフタルアミド(以下で「bis−BioPDAM」と称する、図5参照)と混合し、ジメチルスルホキシド(以下で「DMSO」と称する)及び5μlの水中で6mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。 A 5 μl volume of PCR influenza B was transferred to 5 μl of compound N, N′-bis (13-biotinoylamino-4,7,10-trioxatridecyl) -5- (diazomethyl) isophthalamide (hereinafter “ Mix with bis-BioPDAM (see FIG. 5), dilute to 6 mM in dimethyl sulfoxide (hereinafter “DMSO”) and 5 μl water, then incubate at 80 ° C. for 10 minutes.
反応媒体を、引き続いて、供給者のプロトコルを用いて、ハイブリダイゼーション工程用のDNAチップ(Affymetrix社,カリフォルニア州サンタクララ)と接触させる。用いられるDNAチップは、RT−PCRの間に増幅された領域の分析のために設計される。ハイブリダイゼーションプロトコルの説明及び結果の分析に用いられた技術の説明は、A.Troeschら:“Micobacterium species identification and rifampin resistance testing with high−density DNA probe arrays”J.Clin.Microbiol.(1999),37,49−55により説明されている。 The reaction medium is subsequently contacted with the DNA chip for the hybridization step (Affymetrix, Santa Clara, Calif.) Using the supplier's protocol. The DNA chip used is designed for analysis of the region amplified during RT-PCR. A description of the hybridization protocol and the technique used to analyze the results can be found in A. Troesch et al., “Micobacterium species identification and riffampin resistance testing with high-density DNA probe arrays”, J. Am. Clin. Microbiol. (1999), 37, 49-55.
標識及びハイブリダイゼーション後のDNAチップの表面で発光する蛍光、ならびにシグナル強度及び相同性%に関するデータの生成は、読み取りシステムにより、ならびにGenechip(登録商標)Instrument System及びGenechip(登録商標)Information System(Affymetrix社,カリフォルニア州サンタクララ)より入手したソフトウェアを用いて行われる。 The generation of data regarding the fluorescence emitted on the surface of the DNA chip after labeling and hybridization, as well as the signal intensity and% homology, was performed by the reading system and by the Genechip® Instrument System and Genechip® Information System (Affymetrix). (Santa Clara, California).
読み取りシステムは、RFU(相対蛍光単位)で表されるシグナル及びバックグラウンドノイズ強度を提供する。相同性%は、参照配列に対して得られる(配列決定により得られる増幅標的配列に対応する)。 The reading system provides a signal expressed in RFU (relative fluorescence units) and background noise intensity. % Homology is obtained relative to the reference sequence (corresponding to the amplified target sequence obtained by sequencing).
シグナル(I)、バックグラウンドノイズ(B)及び相同性%(%相同性)の中間強度に関する結果を、結果の表に示す。 The results for the intermediate intensities of signal (I), background noise (B) and% homology (% homology) are shown in the results table.
95%を超える結果が一般に求められるが、90%を超える相同性%は、概して満足な結果であると考えられる。高い強度と低いバックグラウンドノイズ(高いI/B比)は、セットアップで求められる第二の結果である。 Results above 95% are generally sought, but% homology above 90% is generally considered a satisfactory result. High intensity and low background noise (high I / B ratio) are secondary results required in the setup.
C − 阻害標識濃度(コントロール)での均一相標識:
この実験では、bis−BioPDAM標識の最終濃度をより高くする(5mM)。この濃度は、精製をしない場合のハイブリダイゼーションに影響するが、この同じ反応媒体が効率的に精製されるとき、より大きなシグナルを得ることが可能になる(より高い標識収量による)。
C-homogeneous phase labeling at inhibitory label concentration (control):
In this experiment, the final concentration of bis-BioPDAM label is higher (5 mM). This concentration will affect hybridization without purification, but will allow greater signals (due to higher label yields) when this same reaction medium is efficiently purified.
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。 A 5 μl volume of PCR influenza B is mixed with 5 μl bis-BioPDAM, diluted to 15 mM in DMSO and 5 μl water, and then incubated at 80 ° C. for 10 minutes.
反応媒体を、引き続いて、上記段落Bに記載したプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション及び検出用チップと接触させる。 The reaction medium is subsequently contacted with the hybridization and detection chip according to the protocol described in paragraph B above.
D − シリカ膜精製を用いる均一相標識(コントロール):
この実験では、QIAgen社(ドイツ国ヒルデン)により販売されている、シリカ膜含有核酸精製カラムを用いた。この技術は、参照方法を構成する。この場合、標識プロトコルはbis−BioPDAMの最終濃度をより高くして(5mM)行ったが、この標識濃度は、効率的な精製をしていない場合のチップ上でのハイブリダイゼーションに影響する。
D—homogeneous phase labeling using silica membrane purification (control):
In this experiment, a silica membrane-containing nucleic acid purification column sold by QIAgen (Hilden, Germany) was used. This technique constitutes a reference method. In this case, the labeling protocol was performed with a higher final concentration of bis-BioPDAM (5 mM), but this labeling concentration affects hybridization on the chip without efficient purification.
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。 A 5 μl volume of PCR influenza B is mixed with 5 μl bis-BioPDAM, diluted to 15 mM in DMSO and 5 μl water, and then incubated at 80 ° C. for 10 minutes.
反応媒体を、引き続いて、QIAQuickキット(QIAgen社、ドイツ国ヒルデン、参照番号:28 306)を用い、供給者が推奨するプロトコルを用いて精製し、次いで、上記段落Bに既に記載したプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション用DNAチップと接触させる。 The reaction medium is subsequently purified using the protocol recommended by the supplier using the QIAQuick kit (QIAgen, Hilden, Germany, reference number: 28 306) and then according to the protocol already described in paragraph B above. Contact with a DNA chip for hybridization.
E − カルボン酸粒子上での精製を用いる均一相標識(本発明):
この実験では、bis−BioPDAM(5mM)の最終濃度をより高くして得られた標識産物を、カルボン酸固相を用いて精製する(本発明)。5mMの標識濃度は、効率的な精製工程を実施しない場合のハイブリダイゼーションに影響する。従って、これは、精製の有効性の研究のために選択された濃度である。
E-phase labeling using the purification on E-carboxylic acid particles (invention):
In this experiment, the labeled product obtained with a higher final concentration of bis-BioPDAM (5 mM) is purified using a carboxylic acid solid phase (invention). A labeling concentration of 5 mM affects hybridization when an efficient purification step is not performed. This is therefore the concentration chosen for the study of purification effectiveness.
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。 A 5 μl volume of PCR influenza B is mixed with 5 μl bis-BioPDAM, diluted to 15 mM in DMSO and 5 μl water, and then incubated at 80 ° C. for 10 minutes.
反応媒体を、引き続いて、2.5mgのStandard Carboxyl−Adembeads(参照番号:0213、Ademtech社、フランス国ペサック、以下で「カルボン酸粒子」と称する)を用いて、室温で10分間インキュベートし、粒子を、引き続いて、反応媒体の磁化により分離し、後者を、段落Bで上述したプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション工程用のDNAチップと接触させる。 The reaction medium is subsequently incubated for 10 minutes at room temperature with 2.5 mg of Standard Carboxyl-Adembeads (ref. 0213, Ademtech, Pessac, France, hereinafter referred to as “carboxylic acid particles”). Are subsequently separated by magnetization of the reaction medium, the latter being brought into contact with the DNA chip for the hybridization step according to the protocol described above in paragraph B.
F − 結果及び考察:
相同性%、シグナル(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表1に示す:
F-Results and discussion:
The results for% homology, signal (I) and background noise (B) are shown in Table 1 below:
表1:シリカ膜上での精製あり又は精製なしで、コントロールと比較した、本発明を用いる方法の比較研究 Table 1: Comparative study of methods using the present invention compared to controls with or without purification on silica membranes
結果を、相同性%、シグナル(I)及びバックグラウンドノイズ(B)としても表す。 Results are also expressed as% homology, signal (I) and background noise (B).
結論として、参照方法を用いて得られた結果は、シリカ膜精製を用いて得られた結果と実質的に同一であった。さらに、「カルボン酸精製」を用いて得られた結果は、精製なしで又はシリカ膜精製を実施して得られた結果よりも、強度(I)がより良好であることが観察される。チップ上でのシグナルの上昇は、バックグラウンドノイズ(例えば、チップ上にみられる粉塵、沈殿物)に局所的に影響を与える要因に依存することが少ない、より良好な試験を可能にする。さらに、精製プロトコルを実施する際の容易度は、操作手順を大いに容易にするであろう。 In conclusion, the results obtained using the reference method were substantially the same as those obtained using silica membrane purification. Furthermore, it is observed that the results obtained using “carboxylic acid purification” have better strength (I) than the results obtained without purification or by carrying out silica membrane purification. The increase in signal on the chip allows for better testing that is less dependent on factors that locally affect background noise (eg, dust, sediment found on the chip). Furthermore, the ease of performing the purification protocol will greatly facilitate the operating procedure.
実施例2:標識の非反応性等価物で汚染された標識RT−PCR増幅産物の、カルボン酸粒子上での標識及び精製
この実施例は、固体支持体と標識分子との間に形成される結合が、実際には標識の共有結合での捕捉の結果であり、当該支持体上への標識の吸着の結果ではないことを実証する。
Example 2: Labeling and purification of labeled RT-PCR amplification products contaminated with non-reactive equivalents of label on carboxylic acid particles This example is formed between a solid support and a labeled molecule It is demonstrated that the binding is actually the result of covalent capture of the label and not the result of label adsorption on the support.
A − 目的
この実験では、精製した標識産物は、bis−BioPDAMの合成中間体であるN,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジメトキシメチル)イソフタルアミド(本明細書中の以下で、「アセタール」と称する)で汚染されている(図6)。この反応物は、ジアゾメチル官能基を有しないので、カルボン酸官能基と反応し得ない。
A—Purpose In this experiment, the purified labeled product is N, N′-bis (13-biotinoylamino-4,7,10-trioxatridecyl) -5, a synthetic intermediate of bis-BioPDAM. It is contaminated with (dimethoxymethyl) isophthalamide (hereinafter referred to as “acetal”) (FIG. 6). This reactant does not have diazomethyl functionality and therefore cannot react with carboxylic acid functionality.
一方、これは、bis−BioPDAMの全体構造を有するので、観察される精製現象が、特異的結合を含む現象ではなく非特異的吸着現象である場合、bis−BioPDAMと同様の様式で表面に吸着し得る。 On the other hand, since it has the entire structure of bis-BioPDAM, it is adsorbed on the surface in the same manner as bis-BioPDAM when the observed purification phenomenon is a non-specific adsorption phenomenon rather than a phenomenon involving specific binding. Can do.
アセタールは、bis−BioPDAMと同じようにして核酸のハイブリダイゼーションに影響を与え、それによってその除去の質を判断できる。 Acetals can affect nucleic acid hybridization in the same way as bis-BioPDAM, thereby determining the quality of their removal.
B − 実験
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。反応媒体を、引き続いて、QIAQuickキット(QIAgen社、ドイツ国ヒルデン、参照番号:28 306)を用い、供給者のプロトコルを用いて精製する。
B-Experiments A 5 μl volume of PCR influenza B is mixed with 5 μl bis-BioPDAM, diluted to 15 mM in DMSO and 5 μl water and then incubated at 80 ° C. for 10 minutes. The reaction medium is subsequently purified using the QIAQuick kit (QIAgen, Hilden, Germany, reference number: 28 306) using the supplier's protocol.
コントロールをいくつか実行するために十分な容積の精製産物を得るために、上記の調製を、等分量のRT−PCR増幅試料のいくつかについて同時に行う。当該試料の調製により誘発される変動を除くため、精製産物を混合する。 In order to obtain a volume of purified product sufficient to carry out several controls, the above preparation is performed simultaneously on several aliquots of RT-PCR amplified samples. The purified product is mixed to eliminate variations induced by the sample preparation.
混合物のシリカ膜精製による精製後に得られる溶出物の容積に対応する15μlの画分を、以下の方法で引き続いて処理する:
a)実施例1/B(参照)に記載したAffymetrixチップ上での直接的ハイブリダイゼーション。
b)実施例1/B(参照)に記載されるAffymetzixチップ上での5mMのアセタールハイブリダイゼーションの添加(アセタールによる阻害についてのコントロール)。
c)実施例1/Eに記載されるカルボン酸粒子の室温での10分間の精製、次いで実施例1/B(参照)に記載されるAffymetrixチップ上でのハイブリダイゼーション(粒子の標識産物への作用についてのコントロール)。
d)5mMのアセタールの添加、及び次いで実施例1/Eに記載のカルボン酸粒子上での室温での10分間の精製、及び実施例1/B(参照)に記載したAffymetrixチップ上でのハイブリダイゼーション(粒子のアセタールへの作用についてのコントロール)。
A 15 μl fraction corresponding to the volume of eluate obtained after purification of the mixture by silica membrane purification is subsequently treated in the following manner:
a) Direct hybridization on an Affymetrix chip as described in Example 1 / B (reference).
b) Addition of 5 mM acetal hybridization on Affymetzix chip as described in Example 1 / B (reference) (control for inhibition by acetal).
c) Purification of the carboxylic acid particles described in Example 1 / E for 10 minutes at room temperature, followed by hybridization on the Affymetrix chip described in Example 1 / B (reference) Control over action).
d) Addition of 5 mM acetal and then purification on carboxylic acid particles as described in Example 1 / E for 10 minutes at room temperature and high on the Affymetrix chip as described in Example 1 / B (reference) Hybridization (control over the effect of particles on acetals).
C − 結果及び考察:
相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表2に示す:
C-Results and discussion:
The results for% homology, signal intensity (I) and background noise (B) are shown in Table 2 below:
表2:カルボン酸官能基と反応し得ない阻害化合物(B及びD)の存在下で、本発明を用いる方法(C及びD)を、本発明を用いない2つのコントロール(A及びB)と比較した比較研究 Table 2: Method (C and D) using the present invention in the presence of inhibitory compounds (B and D) that cannot react with carboxylic acid functional groups and two controls (A and B) not using the present invention Comparative study compared
結果を、相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)として表す。 Results are expressed as% homology, signal intensity (I) and background noise (B).
結論として、アセタール誘導体は、カルボン酸粒子(D)を用いる前処理の有無とは無関係に、核酸のハイブリダイゼーションに影響する(B及びD)。この結果は、カルボン酸官能基との反応の非存在下では、アセタールは反応し得ないことを示す。従って、アセタール化合物の吸着による著しい除去はない。従って、共有結合を生成するジアゾメチル−カルボン酸の反応は、反応媒体の精製に関与する主要な機構であると結論づけられ得る。 In conclusion, acetal derivatives affect nucleic acid hybridization (B and D) with or without pretreatment with carboxylic acid particles (D). This result indicates that the acetal cannot react in the absence of reaction with the carboxylic acid functionality. Therefore, there is no significant removal by adsorption of the acetal compound. Therefore, it can be concluded that the diazomethyl-carboxylic acid reaction that forms a covalent bond is the primary mechanism involved in the purification of the reaction medium.
実施例3:標識RT−PCR増幅産物の標識及びカルボン酸膜での精製:
A − 目的:
この実験では、最終濃度5mMのbis−BioPDAMを用いて得られた標識産物を、カルボン酸官能基を有する膜(Biodyne C、参照番号S60314、Pall Gelman Sciences社、米国ニューヨーク:以下、Biodyne Cと称する)を用いて精製する。5mMの標識濃度は、効率的な精製工程を実施しない場合に、ハイブリダイゼーションに影響する。従って、これは、精製の効率を研究するために選択された濃度である。
Example 3: Labeled RT-PCR amplification product labeling and purification on carboxylic acid membrane:
A-Purpose:
In this experiment, the labeled product obtained using bis-BioPDAM at a final concentration of 5 mM was used as a membrane having a carboxylic acid functional group (Biodyne C, reference number S60314, Pall Gelman Sciences, New York, USA: hereinafter referred to as Biodyne C). ). A label concentration of 5 mM affects hybridization when an efficient purification step is not performed. This is therefore the concentration chosen to study the efficiency of purification.
B − 実験
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。この実験を二回行い、次いで、手順プロトコルの変動により起こり得る不利な影響を制限するために、標識産物を混合して、2つの等容積に分ける。反応媒体を、引き続いて、6mM2のBiodyne C(b)を用いて室温で10分間インキュベートするか、又は室温で放置し(参照a)、次いで、上記処理したこの媒体を、実施例1/Bに記載のプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション用のDNAチップと接触させる。
B-Experiments A 5 μl volume of PCR influenza B is mixed with 5 μl bis-BioPDAM, diluted to 15 mM in DMSO and 5 μl water and then incubated at 80 ° C. for 10 minutes. This experiment is performed twice and then the labeled product is mixed and divided into two equal volumes in order to limit the adverse effects that can occur due to variations in procedure protocol. The reaction medium is subsequently incubated with 6 mM 2 Biodyne C (b) for 10 minutes at room temperature or left at room temperature (reference a) and the treated medium is then treated with Example 1 / B In contact with the DNA chip for hybridization.
C − 結果及び考察:
相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表3に示す:
C-Results and discussion:
The results for% homology, signal intensity (I) and background noise (B) are shown in Table 3 below:
表3:本発明を用いる方法(b)を、本発明を用いない参照(a)と比較した比較研究 Table 3: Comparative study comparing method (b) using the present invention with reference (a) not using the present invention
結果を再び、相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)として表す。 Results are again expressed as% homology, signal intensity (I) and background noise (B).
結論として、カルボン酸官能基を有するBiodyne C膜は、磁性粒子を用いる場合と同程度の試料の精製を可能にする。 In conclusion, Biodyne C membranes with carboxylic acid functional groups allow sample purification to the same extent as when magnetic particles are used.
実施例4:カルボン酸ポリマーを用いる、標識RT−PCR増幅産物の標識及び精製
A − 目的
この実験では、最終濃度5mMのbis−BioPDAMを用いて得た標識産物を、カルボン酸官能基を有するポリマー(ポリアクリル酸ナトリウム塩)標準28’000、参照番号81124、Fluka社,スイス国ブーフス;以下、APAと称する)を用いて精製する。上記したように、5mMの標識濃度は、効率的な精製工程を実施しない場合に、ハイブリダイゼーションに影響する。
Example 4: Labeling and purification of labeled RT-PCR amplification product using carboxylic acid polymer A-Purpose In this experiment, the labeled product obtained using bis-BioPDAM at a final concentration of 5 mM was converted to a polymer having a carboxylic acid functional group. (Polyacrylic acid sodium salt) Standard 28'000, reference number 81124, Fluka, Buchs, Switzerland; hereinafter referred to as APA). As noted above, a 5 mM label concentration affects hybridization if an efficient purification step is not performed.
B − Myco 16S PCR:
この実験は、「Myco 16S」モデルで行われるが、これは、ヒト型結核菌の16SリボソームRNAをコードする遺伝子の断片の180塩基配列からPCRにより産生するアンプリコンを意味する。
B-Myco 16S PCR:
This experiment is carried out in the “Myco 16S” model, which means an amplicon produced by PCR from a 180 base sequence of a fragment of the gene encoding 16S ribosomal RNA of Mycobacterium tuberculosis.
培養の条件、抗酸菌の抽出及び増幅プライマーは、A.Troeschら:“Micobacterium species identification and rifampin resistance testing with high−density DNA probe arrays”J.Clin.Microbiol.(1999),37,49−55に記載されている。 Culture conditions, acid-fast bacilli extraction and amplification primers Troesch et al., “Micobacterium species identification and riffampin resistance testing with high-density DNA probe arrays”, J. Am. Clin. Microbiol. (1999), 37, 49-55.
PCRを、ゲノムDNA(PCR一回当たり103コピー)の調製物を開始テンプレートとして用い、FastStart High Fidelity PCR Systemキット(Roche Diagnostic Corporation社、スイス国バーゼル、参照番号:03 553 426 001)を用い、0.2mMの各デオキシリボヌクレオチド、0.3μMのプライマー及び0.4μlの酵素を用いて行う。 PCR using a preparation of genomic DNA (10 3 copies per PCR) as starting template and using FastStart High Fidelity PCR System kit (Roche Diagnostics Corporation, Basel, Switzerland, reference number: 03 553 426 001), Perform with 0.2 mM each deoxyribonucleotide, 0.3 μM primer and 0.4 μl enzyme.
PCRサイクルのパラメータは以下のとおりである:95℃で4分間、次いで以下のプロトコルに従って35増幅サイクル:95℃で30秒間、次いで55℃で30秒間、最後に72℃で30秒間。最後に、室温でアンプリコンが分解するのを防ぐため、混合物を、サーモサイクラーが停止するまで4℃で維持する。 The parameters of the PCR cycle are as follows: 95 ° C. for 4 minutes, then 35 amplification cycles according to the following protocol: 95 ° C. for 30 seconds, then 55 ° C. for 30 seconds, and finally 72 ° C. for 30 seconds. Finally, to prevent the amplicon from degrading at room temperature, the mixture is maintained at 4 ° C. until the thermocycler stops.
上記のPCR由来アンプリコンを含む溶液を、以下で「PCR 16S」と称する。 Hereinafter, the solution containing the PCR-derived amplicon is referred to as “PCR 16S”.
C − 実験:
5μlの容積のPCR 16Sを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び15μlの水中で2.5mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。この実験を二回行い、次いで、手順プロトコルの変動によって生じ得る不利な影響を制限するために、標識産物を混合し、2つの等容積に分ける。
C-Experiment:
A 5 μl volume of PCR 16S is mixed with 5 μl bis-BioPDAM, diluted to 2.5 mM in DMSO and 15 μl water, and then incubated at 80 ° C. for 10 minutes. This experiment is performed twice and then the labeled product is mixed and divided into two equal volumes in order to limit the adverse effects that can be caused by variations in the protocol of the procedure.
反応媒体を、引き続いて、室温で10分間インキュベートするか(a)、又は20%のAPAを含む10μlの溶液のペレットと共に真空下で乾燥させ(b)、次いで、実施例1/Bに記載のプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション工程用のDNAチップと接触させる。 The reaction medium is subsequently incubated for 10 minutes at room temperature (a) or dried under vacuum with a pellet of 10 μl solution containing 20% APA (b) and then as described in Example 1 / B Contact with a DNA chip for the hybridization step according to the protocol.
D − 結果及び考察:
相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表4に示す:
D-Results and discussion:
The results for% homology, signal intensity (I) and background noise (B) are shown in Table 4 below:
表4:本発明を用いる方法(b)を、本発明を用いない参照(a)と比較した比較研究 Table 4: Comparative study comparing method (b) using the present invention with reference (a) not using the present invention
結論として、カルボン酸官能基を有するポリマーは、試料の精製を、磁性粒子を用いてできる試料の精製と同程度に実施できる。 In conclusion, polymers with carboxylic acid functional groups can perform sample purification to the same extent as sample purification using magnetic particles.
実施例5:標識の非反応性等価物で汚染された標識RT−PCR増幅産物の、スルホン酸ポリマーを用いる標識及び精製
A − 目的:
この実験では、最終濃度5mMのbis−BioPDAMを用いて得た標識産物を、スルホン酸官能基を有するポリマー(参照番号29 256−7、Sigma−Aldrich社、米国ミシガン州セントルイス、以下、Nafionと称する)を用いて精製する。
Example 5: Labeling and purification of a labeled RT-PCR amplification product contaminated with a non-reactive equivalent of the label using a sulfonic acid polymer A-Purpose:
In this experiment, a labeled product obtained using bis-BioPDAM at a final concentration of 5 mM is referred to as a polymer having a sulfonic acid functional group (reference number 29 256-7, Sigma-Aldrich, St. Louis, Michigan, USA, hereinafter referred to as Nafion). ).
B − 実験:
5μlの容積のPCR 16Sを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び15μlの水中で2.5mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。この実験を二回行い、次いで、手順プロトコルの変動によって生じ得る不利な影響を制限するために、標識産物を混合し、2つの等容積に分ける。
B-Experiment:
A 5 μl volume of PCR 16S is mixed with 5 μl bis-BioPDAM, diluted to 2.5 mM in DMSO and 15 μl water, and then incubated at 80 ° C. for 10 minutes. This experiment is performed twice and then the labeled product is mixed and divided into two equal volumes in order to limit the adverse effects that can be caused by variations in the protocol of the procedure.
反応媒体を、引き続いて:
・室温で10分間(a)、又は
・真空中で乾燥した、10μlのNafionのペレット(メタノール中5%)(b)
を用いて、インキュベートし、次いで、実施例1/Bに記載のプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション工程用のDNAチップと接触させる。
The reaction medium is subsequently:
10 minutes at room temperature (a) or 10 μl of Nafion pellet (5% in methanol) dried in vacuum (b)
And then contact with the DNA chip for the hybridization step according to the protocol described in Example 1 / B.
C − 結果及び考察:
相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表5に示す:
C-Results and discussion:
The results for% homology, signal intensity (I) and background noise (B) are shown in Table 5 below:
表5:本発明を用いる方法(b)を、本発明を用いない参照(a)と比較した比較研究 Table 5: Comparative study comparing method (b) using the present invention with reference (a) not using the present invention
結果を、相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)として表す。 Results are expressed as% homology, signal intensity (I) and background noise (B).
結論として、スルホン酸官能基を有するポリマーは、試料の精製を、磁性粒子を用いてできる試料の精製と同程度に実施できる。 In conclusion, polymers with sulfonic acid functional groups can perform sample purification to the same extent as sample purification using magnetic particles.
総括:
本発明者らの方法は、標識工程後の過剰な標識を捕捉する目的で、酸(特に、カルボン酸官能基)に対するジアゾメチル官能基の反応性を用いることに基づく。この反応性は、当業者に公知である。例示として、タンパク質をそれらのカルボン酸結合を介して共有結合するのに用いられる4−(ジアゾメチル)フェノキシメチルポリスチレン(参照番号17338、Fluka社,スイス国ブーフス)を挙げることができる。この樹脂は、本出願人により、核酸の捕捉実験の際に用いられた。標識後の精製プロセスにおける固体支持体に関してジアゾメチル官能基の反応性を用いるという思想は、本出願時に知られていない。
Summary:
Our method is based on using the reactivity of diazomethyl functional groups with acids (particularly carboxylic acid functional groups) in order to capture excess label after the labeling step. This reactivity is known to those skilled in the art. By way of illustration, mention may be made of 4- (diazomethyl) phenoxymethylpolystyrene (reference number 17338, Fluka, Buchs, Switzerland) which is used to covalently bind proteins via their carboxylic acid bonds. This resin was used by the applicant during a nucleic acid capture experiment. The idea of using the reactivity of diazomethyl functionality with respect to the solid support in the purification process after labeling is not known at the time of this application.
反応は、標識工程後のジアゾ官能基の反応性の保存に基づく。この反応性の保存は少しも明らかではない。なぜなら、いくらかの官能基は、最初の標識工程の間に反応媒体中で加水分解した可能性があったからである。核酸と反応しなかった標識の大部分が依然として反応性であり、かつ、固相上への固定化が、試料をハイブリダイゼーションできる十分な収量で実施されるという結果は、驚くべきものである。 The reaction is based on preserving the reactivity of the diazo functional group after the labeling step. This conservation of reactivity is not clear at all. This is because some functional groups may have been hydrolyzed in the reaction medium during the initial labeling step. The result is surprising that the majority of the labels that did not react with the nucleic acid are still reactive and the immobilization on the solid phase is carried out with a sufficient yield to allow the sample to hybridize.
ジアゾ官能基のカルボン酸官能基との高い反応性により、室温で、2、3分の限られた時間での反応が可能になる。共有結合に基づくこのアプローチは、同等の技術と比較して画期的である。 The high reactivity of the diazo functional group with the carboxylic acid functional group allows for a limited reaction at room temperature for a few minutes. This approach based on covalent bonding is groundbreaking compared to equivalent technology.
標識分子は、固体支持体又は可溶性ポリマー上で共有結合により捕捉されているので、精製後に洗浄する必要がない。洗浄工程をなくしたことは、既存の精製方法と比較して画期的である。 The labeled molecule is captured covalently on the solid support or soluble polymer, so there is no need to wash after purification. The elimination of the washing step is epochal compared to existing purification methods.
本発明の主題である方法は化学反応に基づいているので、濾過よりも、相排除精製よりも、又は、固体支持体上への吸着よりも、特異的かつ選択的である。吸着による生体試料の損失のリスクが低減される。 Because the method that is the subject of the present invention is based on chemical reactions, it is more specific and selective than filtration, phase exclusion purification, or adsorption onto a solid support. The risk of loss of biological sample due to adsorption is reduced.
最後に、精製支持体は、手動法における管や自動プロトコル用のカード型の部品などの消耗品にも容易に組み込まれ得る。 Finally, the purification support can be easily incorporated into consumables such as tubes in manual methods and card-type parts for automated protocols.
Claims (10)
以下:
(i)目的の核酸を、標識又は標識前駆物質と反応させて標識又は予備標識する工程、
(ii)標識又は標識前駆物質を結合し得る捕捉分子を、反応容器の内部表面、又はこの容器に導入された固体支持体の全部又は一部に固定化し、目的の核酸、及び標識又は標識前駆物質を、当該反応容器に導入する工程、及び
(iii)目的の核酸と反応しなかった標識又は標識前駆物質を、捕捉分子への共有結合によって固定化する工程
を含み、
標識又は標識前駆物質は、以下の式:
・R1は、H、あるいはアルキル、アリール又は置換アリール基を表し、
・R2は、検出可能な標識又は少なくとも1つの多量体構造で互いに結合した少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直線系を含むリンカーアームであり、かつ、nは、0又は1に等しい整数であり、
・R3及びR4は、互いに独立して、H、NO2、Cl、Br、F、I、R2−(L)n−Y−X−、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR(Rはアルキル又はアリールである)を表し、
・Aは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも1つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、uは、0から2の間の整数、好ましくは0又は1であり、かつ、
・−Y−X−は、−CONH−、−NHCO−、−CH2O−、−CH2S−を表す)
で表されることを特徴とする方法。 A method for labeling a target nucleic acid contained in a biological sample,
Less than:
(I) a step of reacting a target nucleic acid with a label or label precursor to label or pre-label;
The capture molecules capable of binding (ii) label or labeling precursor, the inner surface of the reaction vessel, or immobilized to all or part of the introduced solid support to the container, a nucleic acid of interest, and a labeled or labeling precursor Introducing a substance into the reaction vessel; and (iii) immobilizing a label or label precursor that has not reacted with the target nucleic acid by covalent binding to a capture molecule,
The label or label precursor has the following formula:
R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group,
R 2 represents a detectable label or at least two detectable labels linked together in at least one multimeric structure;
L is a linker arm comprising at least two linear systems of covalent bonds and n is an integer equal to 0 or 1;
R 3 and R 4 are independently of each other H, NO 2 , Cl, Br, F, I, R 2 — (L) n —Y—X—, OR, SR, NR 2 , R, NHCOR, CONHR, COOR (R is alkyl or aryl),
A is a linker arm comprising at least one covalent double bond that allows conjugation with the aromatic ring of the diazo function, u is an integer between 0 and 2, preferably 0 or 1; And,
· -Y-X- is, -CONH -, - NHCO -, - CH 2 O -, - represents a CH 2 S-)
A method characterized by being represented by:
以下:
(i)目的の核酸を、標識又は標識前駆物質と反応させて標識又は予備標識する工程、
(ii)標識又は標識前駆物質を結合し得る捕捉分子を、反応容器の内部表面、又はこの容器に導入された固体支持体の全部又は一部に固定化し、目的の核酸、及び標識又は標識前駆物質を、当該反応容器に導入する工程、及び
(iii)目的の核酸と反応しなかった標識又は標識前駆物質を、捕捉分子への共有結合によって固定化する工程
を含み、
標識又は標識前駆物質は、以下の式:
・R1は、H、あるいはアルキル、アリール又は置換アリール基を表し、
・R2は、検出可能な標識又は少なくとも1つの多量体構造で互いに結合した少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直線系を含むリンカーアームであり、かつ、nは、0又は1に等しい整数であり、
・R3及びR4は、互いに独立して、H、NO2、Cl、Br、F、I、R2−(L)n−Y−X−、OR、SR、NR2、R、NHCOR、CONHR、COOR(Rはアルキル又はアリールである)を表し、
・Aは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも1つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、uは、0から2の間の整数、好ましくは0又は1であり、かつ、
・−Y−X−は、−CONH−、−NHCO−、−CH2O−、−CH2S−を表す)
で表されることを特徴とする方法。 A method for processing a biological sample, comprising:
Less than:
(I) a step of reacting a target nucleic acid with a label or label precursor to label or pre-label;
The capture molecules capable of binding (ii) label or labeling precursor, the inner surface of the reaction vessel, or immobilized to all or part of the introduced solid support to the container, a nucleic acid of interest, and a labeled or labeling precursor Introducing a substance into the reaction vessel; and (iii) immobilizing a label or label precursor that has not reacted with the target nucleic acid by covalent binding to a capture molecule,
The label or label precursor has the following formula:
R 1 represents H or an alkyl, aryl or substituted aryl group,
R 2 represents a detectable label or at least two detectable labels linked together in at least one multimeric structure;
L is a linker arm comprising at least two linear systems of covalent bonds and n is an integer equal to 0 or 1;
R 3 and R 4 are independently of each other H, NO 2 , Cl, Br, F, I, R 2 — (L) n —Y—X—, OR, SR, NR 2 , R, NHCOR, CONHR, COOR (R is alkyl or aryl),
A is a linker arm comprising at least one covalent double bond that allows conjugation with the aromatic ring of the diazo function, u is an integer between 0 and 2, preferably 0 or 1; And,
· -Y-X- is, -CONH -, - NHCO -, - CH 2 O -, - represents a CH 2 S-)
A method characterized by being represented by:
・生体試料の、上流の他の反応容器からの反応容器への移動、
・目的の核酸を利用可能及び/又は検出可能にするための微生物の溶解、
・目的の核酸の捕捉又は単離、及び
・目的の核酸の検出を可能にするか、又はそれらの検出を増強するための、当該核酸の処理:
の少なくとも1つの工程を行う
ことを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。 Before step ( i ), the following:
The transfer of biological samples from other upstream reaction vessels to the reaction vessel,
Lysis of microorganisms to make the nucleic acid of interest available and / or detectable;
• Capture or isolation of the nucleic acid of interest, and • Treatment of the nucleic acid to allow detection of the nucleic acid of interest or to enhance their detection:
The method according to claim 1, wherein at least one of the following steps is performed.
・標識された又は予備標識された目的の核酸の下流の他の反応容器への移動、
・目的の核酸を標識して標識核酸を得ること、
・標識された又は予備標識された目的の核酸の精製、及び
・捕捉プローブにハイブリダイズした、標識された目的の核酸の検出:
の少なくとも1つの次の工程を行う
ことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 After step (iii), the following:
The transfer of labeled or pre-labeled nucleic acids of interest downstream to other reaction vessels,
-Labeling the target nucleic acid to obtain a labeled nucleic acid,
Purification of labeled or pre-labeled nucleic acid of interest, and detection of labeled nucleic acid of interest hybridized to the capture probe:
The method according to claim 1, wherein at least one of the following steps is performed.
ことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 Capture molecules are immobilized on the interior surface of the container or solid support introduced into this vessel, according to claim 1, wherein <br/> have a carboxylic acid functional group and / or sulfonic acid functional group The method of any one of these.
ことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 The nucleic acid consists of DNA, RNA, DNA-RNA chimeric polymer, which may optionally contain at least one nucleotide thiophosphate, LNA, 2′-O-Me and / or methylphosphonate derivative. The method according to claim 1, wherein the method is characterized in that
・微生物からの核酸の抽出、
・目的の核酸の特異的増幅、
・当該目的の核酸又はアンプリコンの断片化、及び
・増幅現象なく、目的の核酸から転写又は逆転写すること:
の少なくとも1つの工程に従って処理する
ことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 Prior to step ( i ) according to claim 1 or 2, the biological sample is:
・ Nucleic acid extraction from microorganisms,
-Specific amplification of the nucleic acid of interest,
• Fragmentation of the nucleic acid or amplicon of interest and transcription or reverse transcription from the nucleic acid of interest without amplification phenomena:
The method according to claim 1, wherein the treatment is performed according to at least one of the following steps.
・増幅現象なく、目的の核酸から転写又は逆転写すること;又は
・検出プローブを用いるか又は用いることなく、標識された又は予備標識された核酸を均一相検出すること:
の少なくとも1つの次の工程を行う
ことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 After step (iii) according to claim 1 or 2, the following:
• Transcription or reverse transcription from the nucleic acid of interest without amplification phenomenon; or • Homogeneous phase detection of labeled or pre-labeled nucleic acid with or without detection probes:
The method according to claim 1, wherein at least one subsequent step is performed.
ことを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the capture molecule is present in excess relative to the label, and the label is present in excess relative to the nucleic acid of interest to be labeled. .
ことを特徴とする請求項9に記載の方法。 10. The method of claim 9, wherein the capture molecule is present in excess relative to a free label that does not react with the nucleic acid, and the label is present in excess relative to the nucleic acid of interest to be labeled.
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