JPWO2020158947A1 - Polypeptide - Google Patents
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-
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Abstract
本発明は、下記式（１）で算出される凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドに関する。【数１】［式（１）中、εｐｉ，ｊ（Ｌ）及びεａｉ，ｊ（Ｌ）は、アミノ酸残基のペアに対して算出されたエネルギーである。δｉ≦ｋ＜ｉ＋Ｌは、ｋがｉ〜ｉ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。δｊ≦ｋ＜ｊ＋Ｌは、ｋがｊ〜ｊ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。ｉ及びｊは、始点を１としたアミノ酸配列中の残基番号に対応する。λは、２．０である。］The present invention relates to a polypeptide having an amino acid sequence in which the average value per amino acid residue of the aggregation free energy g (k) calculated by the following formula (1) is -4.0 or less. [Equation 1] [In the formula (1), εpi, j (L) and εai, j (L) are energies calculated for a pair of amino acid residues. δi ≦ k <i + L is 1 when k belongs to i to i + L-1, and 0 otherwise. δj≤k <j + L is 1 when k belongs to j to j + L-1, and 0 otherwise. i and j correspond to the residue numbers in the amino acid sequence starting from 1. λ is 2.0. ]
Description
本発明は、ポリペプチドに関する。本発明はまた、当該ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。 The present invention relates to polypeptides. The invention also relates to a fusion protein containing the polypeptide.
タンパク質は、タンパク質分子間の相互作用（タンパク質間相互作用）を通じて、特異的複合体を形成することがある。タンパク質間相互作用は、例えば、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により検出することができる。また、近年、タンパク質間相互作用を予測する手法も報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１）。 Proteins may form specific complexes through interactions between protein molecules (protein-protein interactions). The protein-protein interaction can be detected, for example, by the Two-hybrid method or the like. In recent years, methods for predicting protein-protein interactions have also been reported (for example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸配列は、種々応用することができる。例えば、所望のタンパク質にタンパク質間相互作用に関与するアミノ酸配列を有するポリペプチドを付加等することにより、当該タンパク質同士の会合を制御することが可能になると考えられる。 Amino acid sequences involved in protein-protein interactions can be applied in various ways. For example, by adding a polypeptide having an amino acid sequence involved in protein-protein interaction to a desired protein, it is considered possible to control the association between the proteins.
タンパク質間相互作用には、タンパク質の高次構造（例えば、二次構造、三次構造）もその一要因として関与していると考えられる。タンパク質の高次構造は、例えば、温度、ｐＨ、変性剤の存在により影響を受けやすく、タンパク質が置かれる環境によっては、安定してタンパク質同士を相互作用させることができないという問題があった。 It is considered that the higher-order structure of protein (for example, secondary structure and tertiary structure) is also involved in the protein-protein interaction as one of the factors. The higher-order structure of a protein is easily affected by, for example, temperature, pH, and the presence of a denaturant, and there is a problem that the proteins cannot stably interact with each other depending on the environment in which the protein is placed.
本発明は、変性条件下でも選択的に相互作用させることができるポリペプチドを提供することを目的とする。 It is an object of the present invention to provide a polypeptide capable of selectively interacting even under denaturing conditions.
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
下記式（１）で算出される凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
［２］
配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［３］
Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含む、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］
上記タグ配列が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む、［３］に記載のポリペプチド。
［５］
配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［６］
配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［７］
［１］〜［６］のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
［８］
［１］〜［６］のいずれかに記載のポリペプチドと、タンパク質とが融合されたアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
［９］
上記タンパク質のアミノ酸配列と、上記ポリペプチドのアミノ酸配列とを含む、［８］に記載の融合タンパク質。
［１０］
上記タンパク質のアミノ酸配列中に、上記ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、［８］に記載の融合タンパク質。
［１１］
上記タンパク質のＮ末端又はＣ末端から融合部位までのアミノ酸残基数が、上記タンパク質の総アミノ酸残基数に対して、１０％以下である、［１０］に記載の融合タンパク質。
［１２］
上記タンパク質が、構造タンパク質である、［８］〜［１１］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１３］
上記タンパク質が、クモ糸タンパク質である、［８］〜［１２］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１４］
［８］〜［１３］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
［１５］
［１］〜［６］のいずれかに記載のポリペプチドと、タンパク質とを融合させることを含む、上記タンパク質に自己会合能を付与する方法。The present invention relates to, for example, the following inventions.
[1]
A polypeptide having an amino acid sequence in which the average value per amino acid residue of the aggregation free energy g (k) calculated by the following formula (1) is -4.0 or less.
[2]
A polypeptide comprising an amino acid sequence having 60% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3-16.
[3]
The polypeptide according to [1] or [2], which comprises a tag sequence at either or both of the N-terminal and the C-terminal.
[4]
The polypeptide according to [3], wherein the tag sequence comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
[5]
A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3-16.
[6]
A polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 18-31.
[7]
A nucleic acid encoding the polypeptide according to any one of [1] to [6].
[8]
A fusion protein comprising an amino acid sequence in which the polypeptide according to any one of [1] to [6] and the protein are fused.
[9]
The fusion protein according to [8], which comprises the amino acid sequence of the protein and the amino acid sequence of the polypeptide.
[10]
The fusion protein according to [8], which comprises the amino acid sequence of the polypeptide in the amino acid sequence of the protein.
[11]
The fusion protein according to [10], wherein the number of amino acid residues from the N-terminal or C-terminal of the protein to the fusion site is 10% or less of the total number of amino acid residues of the protein.
[12]
The fusion protein according to any one of [8] to [11], wherein the protein is a structural protein.
[13]
The fusion protein according to any one of [8] to [12], wherein the protein is a spider silk protein.
[14]
A nucleic acid encoding the fusion protein according to any one of [8] to [13].
[15]
A method for imparting self-association ability to the protein, which comprises fusing the polypeptide according to any one of [1] to [6] with the protein.
本発明によれば、変性条件下でも選択的に相互作用させることができるポリペプチドの提供が可能となる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a polypeptide capable of selectively interacting even under denaturing conditions.
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
本実施形態に係るポリペプチドは、下記式（１）で算出される凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列を有する。
なお、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）は、残基番号ｋのアミノ酸残基に対して算出される値である。凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値とは、あるアミノ酸配列における各アミノ酸残基に対して算出された凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の合計値をアミノ酸残基数で除した値を意味する。 The aggregation free energy g (k) is a value calculated for the amino acid residue of the residue number k. The average value of the aggregation free energy g (k) per amino acid residue is the total value of the aggregation free energy g (k) calculated for each amino acid residue in a certain amino acid sequence divided by the number of amino acid residues. Means the value that was set.
本実施形態に係るポリペプチドは、このような構成を有することから、変性条件下でも選択的に相互作用（自己会合）することができる。 Since the polypeptide according to the present embodiment has such a constitution, it can selectively interact (self-associate) even under denaturing conditions.
εｐ ｉ，ｊ（Ｌ）及びεａ ｉ，ｊ（Ｌ）で表されるエネルギーは、タンパク質データベース（ＰＤＢ）に登録されている高品質の球状タンパク質（上位５００）に対して、ＤＳＳＰアルゴリズムにより帰属される二次構造を元に下記式（２）で算出した値であり、具体的には表１（Ｅｐ ａｂ）及び表２（Ｅａ ａｂ）に示すものである。
表１及び表２中、第１列及び第１行のアルファベットは、アミノ酸残基の一文字表記である。 In Tables 1 and 2, the alphabets in the first column and the first row are one-letter notations for amino acid residues.
本実施形態に係るポリペプチドは、少なくとも一部に凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列（以下、「自己会合配列」ともいう。）を有すればよく、当該自己会合配列に加えて、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０超であるアミノ酸配列を有していてもよい。 The polypeptide according to this embodiment is also referred to as an amino acid sequence having an average value of agglomeration free energy g (k) per amino acid residue of -4.0 or less (hereinafter, also referred to as “self-association sequence”). ), And in addition to the self-associating sequence, it may have an amino acid sequence in which the average value of the aggregation free energy g (k) per amino acid residue is more than -4.0.
自己会合配列の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値は、−４．５以下であることが好ましく、−５．０以下であることがより好ましく、−５．５以下であることが更に好ましく、−６．０以下であることが更により好ましく、−６．５以下であることが更により一層好ましく、−７．０以下であることが特に好ましい。 The average value of the agglutination free energy g (k) of the self-association sequence per amino acid residue is preferably -4.5 or less, more preferably -5.0 or less, and -5.5 or less. It is even more preferably -6.0 or less, even more preferably -6.5 or less, and particularly preferably -7.0 or less.
本実施形態に係るポリペプチドの具体例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４６番目のアミノ酸残基から５８２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号２で示されるアミノ酸配列の５４７番目のアミノ酸残基から５７９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列が挙げられる。 As a specific example of the polypeptide according to the present embodiment, the amino acid sequence consisting of the 546th amino acid residue to the 582nd amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the 547th amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Examples thereof include an amino acid sequence consisting of the 579th amino acid residue from the amino acid residue of the above, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3 to 16.
配列番号３〜８で示されるアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列中の自己会合配列の一部又は全部を含むアミノ酸配列である。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 3 to 8 is an amino acid sequence containing a part or all of the self-associating sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
他の実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本実施形態に係るポリペプチドは、このような構成を有することから、変性剤存在下でも選択的に相互作用（自己会合）することができる。 Polypeptides according to other embodiments include amino acid sequences having 60% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 3-16. Since the polypeptide according to this embodiment has such a constitution, it can selectively interact (self-associate) even in the presence of a denaturing agent.
配列番号３で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＣ末端の非繰り返し領域（ＮＲＣ領域）のアミノ酸配列である。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の部分配列であり、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が特に低い部分に対応するアミノ酸配列である。 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the C-terminal non-repetitive region (NRC region) of the large spider angulate orbweaver (Araneus diadematus). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and is an amino acid sequence corresponding to a portion having a particularly low average value per amino acid residue of the aggregation free energy g (k). be.
配列番号５で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＣ末端の非繰り返し領域のアミノ酸配列である。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、配列番号５で示されるアミノ酸配列の部分配列であり、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が特に低い部分に対応するアミノ酸配列である。 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of the non-repeating region at the C-terminal of the large spider tube bookmarker thread protein (ADF3) of Niwaoni spider. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and is an amino acid sequence corresponding to a portion having a particularly low average value per amino acid residue of the aggregation free energy g (k). be.
配列番号７で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＣ末端の非繰り返し領域から最もＣ末端側に位置するヘリックス５が欠損したアミノ酸配列である。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の部分配列であり、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が特に低い部分に対応するアミノ酸配列である。 The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 is an amino acid sequence lacking the helix 5 located most on the C-terminal side from the non-repeating region of the C-terminal of the large spider thread tube bookmark thread protein (ADF3). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and is an amino acid sequence corresponding to a portion having a particularly low average value per amino acid residue of the aggregation free energy g (k). be.
配列番号１０、１２、１４及び１６で示されるアミノ酸配列は、以下の手順で選出したアミノ酸配列である。まず、既知の大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）のＣ末端のアミノ酸配列（具体的には、配列番号２７〜１９１で示されるアミノ酸配列）からプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を作成した。作成したＨＭＭを入力値としてｈｍｍｅｍｉｔプログラムを実行することにより、アミノ酸配列を生成した（１００００配列）。生成したアミノ酸配列に対して、連続する５アミノ酸残基ごとに凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値を算出した。算出した平均値の最小値が−４．５以下になるアミノ酸配列を選出した。 The amino acid sequences shown by SEQ ID NOs: 10, 12, 14 and 16 are amino acid sequences selected by the following procedure. First, a profile hidden Markov model (HMM) was created from the amino acid sequence at the C-terminal of a known large bottle-shaped gland spidroin (MaSp) (specifically, the amino acid sequence shown by SEQ ID NOs: 27 to 191). An amino acid sequence was generated (10000 sequence) by executing the hmmemit program using the created HMM as an input value. For the generated amino acid sequence, the average value of the aggregation free energy g (k) per amino acid residue was calculated for each of the five consecutive amino acid residues. Amino acid sequences having a minimum calculated average value of -4.5 or less were selected.
配列番号９、１１、１３及び１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、１２、１４及び１６で示されるアミノ酸配列のＮ末端に付加配列を付加したアミノ酸配列である。 The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 9, 11, 13 and 15 are amino acid sequences in which an additional sequence is added to the N-terminal of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10, 12, 14 and 16, respectively.
配列番号３、配列番号５及び配列番号７で示されるアミノ酸配列は、相互に少なくとも６０％以上（６３％）の配列同一性を有する。 The amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 have at least 60% or more (63%) sequence identity with each other.
本実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列と６５％以上の配列同一性を有するものであってもよく、７０％以上の配列同一性を有するものであってもよく、７５％以上の配列同一性を有するものであってもよく、８０％以上の配列同一性を有するものであってもよく、８５％以上の配列同一性を有するものであってもよく、９０％以上の配列同一性を有するものであってもよく、９５％以上の配列同一性を有するものであってもよく、９８％以上の配列同一性を有するものであってもよく、９９％以上の配列同一性を有するものであってもよい。 The polypeptide according to the present embodiment may have 65% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 16, and may have 70% or more sequence identity. It may be, may have 75% or more sequence identity, may have 80% or more sequence identity, and may have 85% or more sequence identity. It may be 90% or more sequence identity, 95% or more sequence identity, or 98% or more sequence identity. , 99% or more of sequence identity may be used.
本実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むものであってよく、配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The polypeptide according to the present embodiment may contain the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 16, and may consist of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 16. good.
本実施形態に係るポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列が付加されたものであってよい。これにより、本実施形態に係るポリペプチドの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。 The polypeptide according to this embodiment may have a tag sequence added to either or both of the N-terminal and the C-terminal. This enables isolation, immobilization, detection, visualization, and the like of the polypeptide according to the present embodiment.
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による本実施形態に係るポリペプチドの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。 Examples of the tag sequence include affinity tags that utilize specific affinity (binding, affinity) with other molecules. As a specific example of the affinity tag, a histidine tag (His tag) can be mentioned. The His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are lined up, and has a property of specifically binding to a metal ion such as nickel. Therefore, the His tag relates to the present embodiment by metal chelation chromatography. It can be used for isolation of polypeptides. As a specific example of the tag sequence, for example, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17 (amino acid sequence including His tag) can be mentioned.
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。 In addition, tag sequences such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione and maltose-binding protein (MBP) that specifically binds to maltose can also be used.
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に本実施形態に係るポリペプチドを精製することができる。 Furthermore, an "epitope tag" utilizing an antigen-antibody reaction can also be used. By adding a peptide (epitope) exhibiting antigenicity as a tag sequence, an antibody against the epitope can be bound. Examples of the epitope tag include HA (peptide sequence of hemagglutinin of influenza virus) tag, myc tag, FLAG tag and the like. By using the epitope tag, the polypeptide according to the present embodiment can be easily purified with high specificity.
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着した本実施形態に係るポリペプチドをプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した本実施形態に係るポリペプチドを回収することもできる。 Further, a tag sequence in which the tag sequence can be separated by a specific protease can also be used. By treating the polypeptide according to the present embodiment adsorbed via the tag sequence with a protease, the polypeptide according to the present embodiment from which the tag sequence has been separated can also be recovered.
タグ配列を含むポリペプチドの具体例として、例えば、配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることができる。配列番号１８〜３１で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）を付加したものである。 As a specific example of the polypeptide containing the tag sequence, for example, a polypeptide containing the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 18 to 31 can be mentioned. The amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 18 to 31 are obtained by adding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 (amino acid sequence including His tag) to the N-terminal of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 16, respectively.
一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むものであってよく、配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。 The polypeptide according to one embodiment may contain the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 18 to 31, and may consist of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 18 to 31. good.
本実施形態に係るポリペプチドの分子量は、特に限定されないが、例えば、１ｋＤａ以上３００ｋＤａ以下であってよい。本実施形態に係るポリペプチドの分子量は、例えば、２ｋＤａ以上、３ｋＤａ以上、４ｋＤａ以上、５ｋＤａ以上、６ｋＤａ以上、７ｋＤａ以上、８ｋＤａ以上、９ｋＤａ以上、又は１０ｋＤａ以上であってよく、例えば、２５０ｋＤａ以下、２００ｋＤａ以下、１５０ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、９０ｋＤａ以下、８０ｋＤａ以下、７０ｋＤａ以下、６０ｋＤａ以下、５０ｋＤａ以下、４０ｋＤａ以下、３０ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、又は１５ｋＤａ以下であってよい。 The molecular weight of the polypeptide according to this embodiment is not particularly limited, but may be, for example, 1 kDa or more and 300 kDa or less. The molecular weight of the polypeptide according to this embodiment may be, for example, 2 kDa or more, 3 kDa or more, 4 kDa or more, 5 kDa or more, 6 kDa or more, 7 kDa or more, 8 kDa or more, 9 kDa or more, or 10 kDa or more, for example, 250 kDa or less, It may be 200 kDa or less, 150 kDa or less, 100 kDa or less, 90 kDa or less, 80 kDa or less, 70 kDa or less, 60 kDa or less, 50 kDa or less, 40 kDa or less, 30 kDa or less, 20 kDa or less, or 15 kDa or less.
本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸残基数は、特に限定されないが、例えば、１５０アミノ酸残基以下、１２０アミノ酸残基以下、１００アミノ酸残基以下、８０アミノ酸残基以下、６０アミノ酸残基以下、４０アミノ酸残基以下、３０アミノ酸残基以下、２５アミノ酸残基以下、又は２０アミノ酸残基以下であってよく、例えば、５アミノ酸残基以上、１０アミノ酸残基以上、又は１５アミノ酸残基以上であってよい。本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸残基数が少ない場合（例えば、２０アミノ酸残基程度）、例えば、微生物等で本実施形態に係るポリペプチドを含む融合タンパク質を生産させる場合に、融合タンパク質のアミノ酸残基総数を大きく増やさないため生産性に与える影響を低くすることができ、また融合タンパク質の凝集性を高める、又は凝集性を付加することができる。 The number of amino acid residues of the polypeptide according to this embodiment is not particularly limited, but is, for example, 150 amino acid residues or less, 120 amino acid residues or less, 100 amino acid residues or less, 80 amino acid residues or less, 60 amino acid residues or less. , 40 amino acid residues or less, 30 amino acid residues or less, 25 amino acid residues or less, or 20 amino acid residues or less, for example, 5 amino acid residues or more, 10 amino acid residues or more, or 15 amino acid residues or more. May be. When the number of amino acid residues of the polypeptide according to the present embodiment is small (for example, about 20 amino acid residues), for example, when a fusion protein containing the polypeptide according to the present embodiment is produced by a microorganism or the like, the fusion protein Since the total number of amino acid residues is not significantly increased, the influence on productivity can be reduced, and the aggregation of the fusion protein can be enhanced or added.
本実施形態に係るポリペプチドは、親水性であってもよく、疎水性であってもよい。本実施形態に係るポリペプチドは、ポリペプチドを構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ、以下「疎水度」とも表す。）が−１．０以上であるものが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標は、下記表３に示すとおりである。 The polypeptide according to this embodiment may be hydrophilic or hydrophobic. For the polypeptide according to the present embodiment, the sum of the hydrophobicity indexes (hydropathy index, HI) of all the amino acid residues constituting the polypeptide is obtained, and then the sum is divided by the total number of amino acid residues. (Average HI, hereinafter also referred to as "hydrophobicity") is preferably −1.0 or higher. For the hydrophobicity index of the amino acid residue, a known index (Hydrotherapy index: Kyte J, & Dolottle R (1982) “A simple method for dispensing the thehydropatic protein, type7, b.M. 105-132) is used. Specifically, the hydrophobicity index of each amino acid is as shown in Table 3 below.
本実施形態に係るポリペプチドの疎水度は、−０．５以上、０以上、１以上、５以上又は１０以上であってよく、また、１０以下、５以下又は１以下であってよい。 The hydrophobicity of the polypeptide according to this embodiment may be −0.5 or more, 0 or more, 1 or more, 5 or more or 10 or more, and may be 10 or less, 5 or less or 1 or less.
本実施形態に係るポリペプチドは、当該ポリペプチド同士でタンパク質間相互作用し、特異的複合体を形成するものであること（すなわち、自己会合能を有するものであること）が好ましく、変性条件下で自己会合能を有するものであることがより好ましい。 The polypeptide according to the present embodiment preferably has a protein-protein interaction between the polypeptides to form a specific complex (that is, has a self-association ability), and is preferably under denaturing conditions. It is more preferable that the protein has a self-association ability.
本実施形態に係るポリペプチドは、人工ポリペプチドであってよい。本明細書において「人工ポリペプチド」は、人為的に製造されたポリペプチドを意味する。人工ポリペプチドは、例えば、遺伝子組換え技術を使用して製造されたポリペプチド、化学合成されたポリペプチドを含む。 The polypeptide according to this embodiment may be an artificial polypeptide. As used herein, "artificial polypeptide" means an artificially produced polypeptide. Artificial polypeptides include, for example, polypeptides produced using genetically modified technology, chemically synthesized polypeptides.
（変性条件）
変性条件は、タンパク質の高次構造（例えば、二次構造、三次構造）を破壊し得る条件である。変性条件としては、例えば、タンパク質溶液のｐＨ（例えば、ｐＨ１〜４の酸性条件、及びｐＨ１０〜１４のアルカリ性条件）、タンパク質がおかれる環境温度（例えば、−２０℃〜５℃の低温条件、及び３５℃以上の高温条件）、変性剤の存在等が挙げられる。(Degeneration condition)
The denaturation condition is a condition that can destroy the higher-order structure (for example, secondary structure, tertiary structure) of the protein. The denaturation conditions include, for example, the pH of the protein solution (for example, acidic conditions of pH 1 to 4 and alkaline conditions of
変性剤としては、例えば、タンパク質分子間及び／又は分子内の水素結合、疎水結合、イオン結合、ジスルフィド結合を破壊する物質が挙げられる。変性剤の具体例としては、例えば、尿素、グアニジン塩（例えば、グアニジンチオシアン酸塩）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２−メルカプトエタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、並びにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びアセトニトリル等の水と混和する極性溶媒が挙げられる。 Examples of the modifier include substances that break hydrogen bonds, hydrophobic bonds, ionic bonds, and disulfide bonds between and / or within protein molecules. Specific examples of the denaturing agent include urea, guanidine salt (eg, guanidine thiocyanate), sodium dodecyl sulfate (SDS), 2-mercaptoethanol, tetrahydrofuran (THF), and dimethyl sulfoxide (DMSO), acetone, alcohol. Classes (eg, methanol, ethanol, isopropanol), dioxane, dimethylformamide (DMF), acetonitrile and other polar solvents that are miscible with water.
（ポリペプチドの製造方法）
本実施形態に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードする核酸を使用して、常法により製造することができる。当該ポリペプチドをコードする核酸は、塩基配列情報に基づいて、化学合成してもよく、ＰＣＲ法等を利用して合成してもよい。(Method for producing polypeptide)
The polypeptide according to this embodiment can be produced by a conventional method using a nucleic acid encoding the polypeptide. The nucleic acid encoding the polypeptide may be chemically synthesized based on the base sequence information, or may be synthesized by using a PCR method or the like.
〔融合タンパク質〕
本実施形態に係る融合タンパク質は、本発明に係るポリペプチドと、タンパク質とが融合されたアミノ酸配列を含む。[Fusion protein]
The fusion protein according to the present embodiment includes an amino acid sequence in which the polypeptide according to the present invention and the protein are fused.
本実施形態に係る融合タンパク質における融合の態様は特に限定されず、例えば、タンパク質のアミノ酸配列と、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列とを含む融合タンパク質（例えば、タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質）であってもよく、タンパク質のアミノ酸配列中に、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質（例えば、タンパク質のアミノ酸配列の途中に本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質）であってもよい。 The mode of fusion in the fusion protein according to the present embodiment is not particularly limited, and for example, the fusion protein containing the amino acid sequence of the protein and the amino acid sequence of the polypeptide according to the present invention (for example, the N-terminal of the amino acid sequence of the protein and the N-terminal of the amino acid sequence of the protein). A fusion protein containing the amino acid sequence of the polypeptide according to the present invention in either or both of the C-terminals) may be a fusion protein containing the amino acid sequence of the polypeptide according to the present invention in the amino acid sequence of the protein. For example, it may be a fusion protein containing the amino acid sequence of the polypeptide according to the present invention in the middle of the amino acid sequence of the protein).
タンパク質のアミノ酸配列中に、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質においては、タンパク質のＮ末端又はＣ末端から融合部位（タンパク質のアミノ酸配列中の本発明に係るポリペプチドの挿入部位）までのアミノ酸残基数が、タンパク質の総アミノ酸残基数に対して、４５％以下であってよく、４０％以下であってよく、３５％以下であってよく、３０％以下であってよく、２５％以下であってよく、２０％以下であってよく、１５％以下であることが好ましく、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下であることがより好ましい。当該比率が低いほど、本発明に係るポリペプチドが、タンパク質のＮ末端又はＣ末端により近い位置に融合されていることになり、選択的な相互作用（自己会合）をより生じやすくなる。 In a fusion protein containing the amino acid sequence of the polypeptide according to the present invention in the amino acid sequence of the protein, the fusion site from the N-terminal or C-terminal of the protein (the insertion site of the polypeptide according to the present invention in the amino acid sequence of the protein). The number of amino acid residues up to may be 45% or less, 40% or less, 35% or less, and 30% or less with respect to the total number of amino acid residues of the protein. , 25% or less, 20% or less, preferably 15% or less, 10% or less, 9% or less, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, It is more preferably 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less. The lower the ratio, the closer the polypeptide of the invention to the N-terminus or C-terminus of the protein is fused, and the more likely it is that selective interaction (self-association) will occur.
（タンパク質）
本実施形態に係る融合タンパク質におけるタンパク質には、特に制限はなく、任意のタンパク質を使用することができる。タンパク質の具体例として、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、クモ糸タンパク質、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、及び完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、フィブロイン（例えば、クモ糸フィブロイン（スパイダーシルク）、カイコシルク等）、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、及びこれらタンパク質の断片、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。(protein)
The protein in the fusion protein according to the present embodiment is not particularly limited, and any protein can be used. Specific examples of the protein include proteins that can be used for industrial purposes, proteins that can be used for medical purposes, structural proteins, and the like. Specific examples of proteins that can be used for industrial or medical purposes include spider silk proteins, enzymes, regulatory proteins, receptors, peptide hormones, cytokines, membrane or transport proteins, antigens used for vaccination, vaccines, antigen-binding proteins, etc. Immunostimulatory proteins, allergens, and full-length antibodies or antibody fragments or derivatives can be mentioned. Specific examples of structural proteins include fibroin (for example, spider silk fibroin (spider silk), silkworm silk, etc.), keratin, collagen, elastin, lecillin, fragments of these proteins, and proteins derived from these. Can be done.
本明細書においてフィブロインは、天然由来のフィブロインと改変フィブロインとを含む。本明細書において「天然由来のフィブロイン」とは、天然由来のフィブロインと同一のアミノ酸配列を有するフィブロインを意味し、「改変フィブロイン」とは、天然由来のフィブロインとは異なるアミノ酸配列を有するフィブロインを意味する。 As used herein, fibroin includes naturally occurring fibroin and modified fibroin. As used herein, "naturally occurring fibroin" means fibroin having the same amino acid sequence as naturally occurring fibroin, and "modified fibroin" means fibroin having an amino acid sequence different from that of naturally occurring fibroin. do.
フィブロインは、クモ糸フィブロインであってよい。「クモ糸フィブロイン」には、天然クモ糸フィブロイン、及び天然クモ糸フィブロインに由来する改変フィブロインが含まれる。天然クモ糸フィブロインとしては、例えば、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質（ＳＳＰ）が挙げられる。 The fibroin may be spider silk fibroin. "Spider silk fibroin" includes natural spider silk fibroin and modified fibroin derived from natural spider silk fibroin. Examples of the natural spider silk fibroin include spider silk protein (SSP) produced by spiders.
フィブロインは、例えば、式３：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式４：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってもよい。本実施形態に係るフィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。Fibroin is, for example, a protein containing a domain sequence represented by the formula 3: [(A) n motif-REP] m or the formula 4: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. You may. The fibroin according to the present embodiment may further have an amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence. The N-terminal sequence and the C-terminal sequence are not limited to this, but are typically regions that do not have the repetition of the amino acid motif characteristic of fibroin, and consist of about 100 residues of amino acids.
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式３：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式４：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。As used herein, the term "domain sequence" refers to a fibroin-specific crystalline region (typically corresponding to (A) n motif of an amino acid sequence) and an amorphous region (typically to REP of an amino acid sequence). An amino acid sequence that produces (corresponding to.)), Which is represented by the formula 3: [(A) n motif-REP] m or the formula 4: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif. Means an array. Here, the (A) n motif indicates an amino acid sequence mainly composed of alanine residues, and the number of amino acid residues is 2 to 27. (A) The number of amino acid residues of the n motif may be an integer of 2 to 20, 4 to 27, 4 to 20, 8 to 20, 10 to 20, 4 to 16, 8 to 16, or 10 to 16. .. Further, (A) the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, It may be 86% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed only of alanine residues). A plurality of (A) n motifs present in a domain sequence may be composed of at least seven alanine residues only. REP shows an amino acid sequence consisting of 2 to 200 amino acid residues. REP may be an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues. m indicates an integer of 2 to 300, and may be an integer of 10 to 300. The plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences. The plurality of REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
天然由来のフィブロインとしては、例えば、式３：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式４：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。天然由来のフィブロインの具体例としては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。As naturally derived fibroin, for example, a domain sequence represented by the formula 3: [(A) n motif-REP] m or the formula 4: [(A) n motif-REP] m- (A) n motif can be used. The proteins contained can be mentioned. Specific examples of naturally occurring fibroin include, for example, fibroin produced by insects or spiders.
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ Ｃｙｎｔｈｉａ ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｓｉｍｉｌｌｉｍａ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。 Examples of fibroins produced by insects include Bombyx mori, Bombyx mandarina, Antheraea yamamai, Anteraea perni, and tussah. ), Silk moth (Samia cinthia), tussah (Caligra japonica), tussah silk moth (Antheraea mylitta), silk moth (Antheraea assama) Hornet silk protein can be mentioned.
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。 More specific examples of insect-produced fibroin include, for example, the silk moth fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence) and AAA27840.1 (amino acid sequence)).
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、クモ目（Ａｒａｎｅａｅ）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。より具体的には、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）、ＡｃＳｐ、ＰｙＳｐ、Ｆｌａｇ等が挙げられる。 Examples of fibroin produced by spiders include spider silk proteins produced by spiders belonging to the order Araneae. More specifically, spiders belonging to the genus Araneus such as spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders. Spiders belonging to the genus Pronus, such as spiders, spiders belonging to the genus Cyrtarachne, such as Torinofundamashi and Otorinofundamashi, spiders belonging to the genus Cyrtarachne, spiders belonging to the genus Gasteractha. Spiders belonging to the spider genus Ordgarius such as spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders Spiders belonging to the genus), spiders belonging to the genus Acusilas such as spiders, spiders belonging to the genus Cytophora such as spiders, spiders, spiders and spiders, and spiders belonging to the genus Poltys such as spiders. Spider silk proteins produced by spiders belonging to the genus Cyclosa, such as spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders, spiders. Spiders belonging to the genus Tetragnatha, such as Ashidaka spider and Urokoa shinaga spider, spiders belonging to the genus White spider (genus Leucage, etc.) such as spiders, spiders, spiders, and spiders. Spiders belonging to the genus Azumi (Menosira genus) such as spiders and spiders, spiders belonging to the genus Dyschiriognatha such as Himea shinaga spiders, spiders belonging to the genus Dyschiriognatha Spider silk proteins produced by spiders belonging to the family Spider, such as spiders belonging to the genus Euprostenops and spiders belonging to the genus Euprosthenops. Will be. Examples of the spider silk protein include traction thread proteins such as MaSp (MaSp1 and MaSp2) and ADF (ADF3 and ADF4), MiSp (MiSp1 and MiSp2), AcSp, PySp, Flag and the like.
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。 Examples of the keratin-derived protein include Type I keratin of Capra hilcus.
コラーゲン由来のタンパク質としては、例えば、式５：［ＲＥＰ２］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式５中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。Examples of collagen-derived proteins include formula 5: a protein containing a domain sequence represented by [REP2] p (where, in formula 5, p represents an integer of 5 to 300. REP2 is Gly-X-. An amino acid sequence composed of Y is shown, and X and Y indicate arbitrary amino acid residues other than Gly. Multiple REP2s may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.) can.
エラスチン由来のタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。 Examples of the elastin-derived protein include proteins having an amino acid sequence such as NCBI GenBank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine).
レシリン由来のタンパク質としては、例えば、式６：［ＲＥＰ３］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式６中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意アミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。Examples of the protein derived from resilin include formula 6: a protein containing a domain sequence represented by [REP3] q (where, in
（融合タンパク質の製造方法）
本実施形態に係る融合タンパク質は、当該融合タンパク質をコードする核酸を使用して、常法により製造することができる。当該融合タンパク質をコードする核酸は、塩基配列情報に基づいて、化学合成してもよく、ＰＣＲ法等を利用して合成してもよい。(Method for producing fusion protein)
The fusion protein according to the present embodiment can be produced by a conventional method using a nucleic acid encoding the fusion protein. The nucleic acid encoding the fusion protein may be chemically synthesized based on the base sequence information, or may be synthesized by using a PCR method or the like.
〔核酸〕
本実施形態に係る核酸は、本発明に係るポリペプチド、又は本発明に係る融合タンパク質をコードする。[Nucleic acid]
The nucleic acid according to the present embodiment encodes a polypeptide according to the present invention or a fusion protein according to the present invention.
一実施形態に係る核酸は、本発明に係るポリペプチド、又は本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよい。 The nucleic acid according to one embodiment may be a nucleic acid that hybridizes with a polypeptide according to the present invention or a complementary strand of a nucleic acid encoding a fusion protein according to the present invention under stringent conditions.
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件とは、少なくとも８５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、４２℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。中ストリンジェントな条件とは、少なくとも９０％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、５０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、少なくとも９５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、６０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。 The "stringent condition" refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. The "stringent condition" may be any of a low stringent condition, a medium stringent condition and a high stringent condition. Low stringent conditions mean that hybridization occurs only when at least 85% or more of the identity is present between the sequences, eg, with 5 × SSCs containing 0.5% SDS, at 42 ° C. Conditions for hybridization can be mentioned. Medium stringent conditions mean that hybridization occurs only when at least 90% or more identity is present between the sequences, eg, using a 5 × SSC containing 0.5% SDS at 50 ° C. Conditions for hybridization can be mentioned. High stringent conditions mean that hybridization occurs only when at least 95% or more identity is present between the sequences, eg, using a 5 × SSC containing 0.5% SDS at 60 ° C. Conditions for hybridization can be mentioned.
一実施形態に係る核酸は、本発明に係るポリペプチド、又は本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸であってもよい。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。 The nucleic acid according to one embodiment may be a nucleic acid having 90% or more sequence identity with the nucleic acid encoding the polypeptide according to the present invention or the fusion protein according to the present invention. The sequence identity is preferably 95% or higher.
本実施形態に係る核酸の具体例として、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４で示される塩基配列を有する核酸を挙げることができる。配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４で示される塩基配列は、それぞれ配列番号３、配列番号５及び配列番号７で示されるアミノ酸配列をコードするものである。 Specific examples of the nucleic acid according to the present embodiment include nucleic acids having the base sequence represented by SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 34. The base sequence represented by SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 or SEQ ID NO: 34 encodes the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7, respectively.
本実施形態に係る核酸は、発現ベクターに組み込まれた形態で提供されてもよい。当該発現ベクターは、本実施形態に係る核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する。調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。 The nucleic acid according to this embodiment may be provided in a form incorporated in an expression vector. The expression vector has a nucleic acid sequence according to the present embodiment and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. The regulatory sequence is a sequence that controls the expression of the recombinant protein in the host (for example, a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a transcription termination sequence, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host. The type of expression vector can be appropriately selected depending on the type of host, such as a plasmid vector, a viral vector, a cosmid vector, a phosmid vector, and an artificial chromosome vector.
〔タンパク質に自己会合能を付与する方法〕
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドと、タンパク質とを融合させることを含む、タンパク質に自己会合能を付与する方法と捉えることもできる。ポリペプチド、タンパク質、及び融合タンパク質の製造方法等の具体的な態様等は、上述したとおりである。[Method of imparting self-association ability to proteins]
The present invention can also be regarded as a method for imparting self-association ability to a protein, which comprises fusing the polypeptide according to the present invention with the protein. Specific aspects such as a method for producing a polypeptide, a protein, and a fusion protein are as described above.
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on Examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
［試験例１：凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の評価］
二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８９１，配列番号１）及び二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８８９，配列番号２）の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）を下記式（１）に従って算出した。
Amino acid sequence (# GEN891, SEQ ID NO: 1) in which the tag sequence shown by SEQ ID NO: 17 is added to the N-terminal of the large spit tube bookmark thread protein (ADF4) of the two wagon spider and the large spit tube bookmark thread protein of the two wagon spider (# GEN891, SEQ ID NO: 1). The aggregation free energy g (k) of the amino acid sequence (# GEN889, SEQ ID NO: 2) to which the tag sequence shown by SEQ ID NO: 17 was added to the N-terminal of ADF3) was calculated according to the following formula (1).
式（１）中、εｐ ｉ，ｊ（Ｌ）及びεａ ｉ，ｊ（Ｌ）は、アミノ酸残基のペアに対して算出されたエネルギーである（表１及び表２参照）。In formula (1), ε p i, j (L) and ε a i, j (L) are the energies calculated for the pair of amino acid residues (see Tables 1 and 2).
また、式（１）中、δｉ≦ｋ＜ｉ＋Ｌは、ｋがｉ〜ｉ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。δｊ≦ｋ＜ｊ＋Ｌは、ｋがｊ〜ｊ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。ｉ及びｊは、始点を１としたアミノ酸配列中の残基番号に対応する。λは、２．０である。Further, in the equation (1), δ i ≦ k <i + L is 1 when k belongs to i to i + L-1, and is 0 otherwise. δ j ≦ k <j + L is 1 when k belongs to j to j + L-1, and 0 otherwise. i and j correspond to the residue numbers in the amino acid sequence starting from 1. λ is 2.0.
図１は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８９１，配列番号１）における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）を残基番号に対してプロットしたグラフである。図２は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８８９，配列番号２）における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）を残基番号に対してプロットしたグラフである。＃ＧＥＮ８９１は、５４６番目のアミノ酸残基から５８２番目のアミノ酸残基において、各アミノ酸残基の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）が−４．０以下となった（図１）。なお、これらのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値も当然−４．０以下である。＃ＧＥＮ８８９は、５４７番目のアミノ酸残基から５７９番目のアミノ酸残基において、各アミノ酸残基の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）が−４．０以下となった（図２）。なお、これらのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値も当然−４．０以下である。凝集自由エネルギーｇ（ｋ）が低い程、凝集傾向は強くなるため、これらのアミノ酸配列は、自己会合能を有するアミノ酸配列であると考えられる。 FIG. 1 shows the aggregation free energy g (k) in the amino acid sequence (# GEN891, SEQ ID NO: 1) in which the tag sequence shown by SEQ ID NO: 17 is added to the N-terminal of the large spit tube bookmark thread protein (ADF4). Is a graph plotted against the residue number. FIG. 2 shows the aggregation free energy g (k) in the amino acid sequence (# GEN889, SEQ ID NO: 2) in which the tag sequence shown by SEQ ID NO: 17 is added to the N-terminal of the large spit tube bookmark thread protein (ADF3). Is a graph plotted against the residue number. In # GEN891, the agglutination free energy g (k) of each amino acid residue was -4.0 or less at the 582nd amino acid residue from the 546th amino acid residue (FIG. 1). The average value of the aggregation free energy g (k) per amino acid residue in the amino acid sequence consisting of these amino acid residues is also naturally less than -4.0. In #GEN889, the agglutination free energy g (k) of each amino acid residue was -4.0 or less at the 547th amino acid residue to the 579th amino acid residue (FIG. 2). The average value of the aggregation free energy g (k) per amino acid residue in the amino acid sequence consisting of these amino acid residues is also naturally less than -4.0. The lower the aggregation free energy g (k), the stronger the aggregation tendency. Therefore, these amino acid sequences are considered to be amino acid sequences having self-association ability.
［試験例２：自己会合能を有するポリペプチドの製造及び評価］
（１）自己会合能を有するポリペプチドの製造
配列番号１８、２０及び２２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを設計した。配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＣ末端の非繰り返し領域（ＮＲＣ領域）のアミノ酸配列に配列番号１７で示すアミノ酸配列（タグ配列）を付加したものである（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ，平均ＨＩ ０．２９７，分子量１２．９ｋＤａ）。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＣ末端の非繰り返し領域のアミノ酸配列に配列番号１７で示すアミノ酸配列（タグ配列）を付加したものである（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ＮＲＣ，平均ＨＩ ０．２２１，分子量１３．５ｋＤａ）。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＣ末端の非繰り返し領域から最もＣ末端側に位置するヘリックス５が欠損したアミノ酸配列に配列番号１７で示すアミノ酸配列（タグ配列）を付加したものである（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ｓｈｏｒｔＮＲＣ，平均ＨＩ ０．７７７，分子量１０．６ｋＤａ）。配列番号１８、２０及び２２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、＃ＧＥＮ８９１及び＃ＧＥＮ８８９の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）が−４．０以下であるアミノ酸残基からなるアミノ酸配列の一部又は全部を含むものである。[Test Example 2: Production and evaluation of a polypeptide having self-association ability]
(1) Production of polypeptide having self-association ability A polypeptide having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 18, 20 and 22 was designed. The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 is the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17 in the amino acid sequence of the C-terminal non-repetitive region (NRC region) of the large spit tube bookmarker thread protein (ADF4) of the two spider (Araneus diadematus). (Tag sequence) is added (His-ADF4-NRC, average HI 0.297, molecular weight 12.9 kDa). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 is obtained by adding the amino acid sequence (tag sequence) shown in SEQ ID NO: 17 to the amino acid sequence of the non-repeating region at the C-terminal of the large spider's large spitting tube bookmark thread protein (ADF3). There is (His-ADF3-NRC, average HI 0.221, molecular weight 13.5 kDa). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 is the amino acid sequence in which the helix 5 located most on the C-terminal side from the non-repeating region of the C-terminal of the large spider's large spit tube bookmarker thread protein (ADF3) is deleted in SEQ ID NO: 17. The amino acid sequence (tag sequence) shown is added (His-ADF3-shortNRC, average HI 0.777, molecular weight 10.6 kDa). The polypeptide having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 18, 20 and 22 is a part of an amino acid sequence consisting of amino acid residues having an aggregation free energy g (k) of # GEN891 and # GEN889 of -4.0 or less. It includes everything.
各ポリペプチドをコードする核酸をそれぞれクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、各核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、それぞれタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）をそれぞれ形質転換して、各ポリペプチドを発現する形質転換大腸菌（組換え細胞）を得た。 The nucleic acids encoding each polypeptide were cloned into a cloning vector (pUC118). Then, each nucleic acid was treated with restriction enzymes NdeI and EcoRI to cut out, and then recombinant into the protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector. Escherichia coli BLR (DE3) was transformed with the obtained expression vector to obtain transformed Escherichia coli (recombinant cells) expressing each polypeptide.
得られた形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。The obtained transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours. The culture broth was added to 100 mL of seed culture medium (Table 4) containing ampicillin so that OD 600 was 0.005. The culture solution temperature was maintained at 30 ° C., and flask culture was carried out until the OD 600 reached 5, (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように当該シード培養液を添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。The seed culture solution was added to the jar fermenter to which 500 mL of the production medium (Table 5) was added so that the OD 600 was 0.05. The temperature of the culture solution was kept at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、酵母エキス１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持し、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のポリペプチドを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を超音波破砕し、遠心分離を行い、目的とするポリペプチドを回収した。回収した目的とするポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするポリペプチドの分子量に対応するバンドの出現により、目的とするポリペプチドが不溶体として発現されていることを確認した。 Immediately after the glucose in the production medium was completely consumed, the feed solution (glucose 455 g / 1 L, yeast extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min. The temperature of the culture solution was kept at 37 ° C., and the culture was controlled at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and the culture was carried out for 20 hours. Then, 1 M of isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce the expression of the target polypeptide. Twenty hours after the addition of IPTG, the culture broth was centrifuged and the cells were collected. The cells prepared from the culture broth before and after the addition of IPTG were ultrasonically crushed and centrifuged to recover the target polypeptide. SDS-PAGE was performed on the recovered target polypeptide, and it was confirmed that the target polypeptide was expressed as an insoluble substance by the appearance of a band corresponding to the molecular weight of the target polypeptide depending on the addition of IPTG. bottom.
（２）自己会合能を有するポリペプチドの可溶化
目的とするポリペプチドをエッペンチューブに分取し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（２％）（富士フィルム和光純薬社製、生化学用）及びグアニジンチオシアン酸塩（富士フィルム和光純薬社製、生化学用）を添加し、目的とする各ポリペプチドを溶解させた。図３は、ＳＤＳ及びグアニジンチオシアン酸塩を含むポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ＮＲＣ（配列番号２０）又はＨｉｓ−ＡＤＦ３−ｓｈｏｒｔＮＲＣ（配列番号２２））液の上清及び沈殿を、変性剤（２−メルカプトエタノール）存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。各ポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ＮＲＣ及びＨｉｓ−ＡＤＦ３−ｓｈｏｒｔＮＲＣ）の分子量に対応するバンドが主に上清から検出されており、ＳＤＳ及びグアニジンチオシアン酸塩の添加により、各ポリペプチドを可溶化できたことが示された。(2) Sodium solubilization of self-associating polypeptide The target polypeptide is dispensed into an Eppentube, sodium dodecyl sulfate (SDS) (2%) (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemistry) and Guanidinium thiocyanate (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemistry) was added to dissolve each target polypeptide. FIG. 3 shows the supernatant and precipitate of a polypeptide containing SDS and guanidin thiocyanate (His-ADF3-NRC (SEQ ID NO: 20) or His-ADF3-shortNRC (SEQ ID NO: 22)) with a denaturing agent (2-). It is a photograph showing the result of analysis by the SDS-PAGE method in the presence of mercaptoethanol). Bands corresponding to the molecular weights of each polypeptide (His-ADF3-NRC and His-ADF3-shortNRC) were mainly detected in the supernatant, and each polypeptide could be solubilized by the addition of SDS and guanidin thiocyanate. It was shown that
（３）自己会合能の確認
各ポリペプチドをＳＤＳを含む緩衝液（１％ＳＤＳ、５ｍＭトリス塩酸塩、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）に溶解し、透析によって溶媒を尿素を含む緩衝液（８Ｍ尿素、２５ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ８．０）に交換し、ヒスチジンタグを利用して以下に示す条件でカラム精製を行った。(3) Confirmation of self-association ability Each polypeptide is dissolved in a buffer solution containing SDS (1% SDS, 5 mM Tris hydrochloride, 2 mM DTT, pH 8.0), and the solvent is a buffer solution containing urea (8 M urea) by dialysis. , 25 mM Tris hydrochloride, pH 8.0), and column purification was performed under the conditions shown below using a histidine tag.
（カラム精製）
平衡化溶液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス塩酸塩、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉｓ Ｇｒａｖｉ Ｔｒａｐカラム（ベッド体積１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社製）に各ポリペプチドを含む溶液を通し、各ポリペプチドをカラムに吸着させた。カラムを４ｍＬの洗浄液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス塩酸塩、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄した。次にカラムに第１の溶出液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス塩酸塩、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を３ｍＬ流し、ポリペプチドを溶出させた。さらに第２の溶出液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス塩酸塩、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を３ｍＬ流し、ポリペプチドを溶出させた。(Column purification)
A solution containing each polypeptide on a His Gravi Trap column (bed volume 1 mL, manufactured by GE Healthcare) equilibrated with an equilibrated solution (8 M urea, 100 mM sodium chloride, 25 mM Tris hydrochloride, 10 mM imidazole, pH 8.0). Each polypeptide was adsorbed on the column. The column was washed with 4 mL of wash solution (8 M urea, 100 mM sodium chloride, 25 mM Tris hydrochloride, 10 mM imidazole, pH 8.0). Next, 3 mL of the first eluate (8 M urea, 100 mM sodium chloride, 25 mM Tris hydrochloride, 300 mM imidazole, pH 8.0) was flowed through the column to elute the polypeptide. Further, 3 mL of a second eluate (8 M urea, 100 mM sodium chloride, 25 mM Tris hydrochloride, 500 mM imidazole, pH 8.0) was poured to elute the polypeptide.
図４は、カラム精製の際の各溶液を変性剤非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。図４中、「ｔｈｒｏｕｇｈ」は溶解液をカラムに負荷した際の通過液、「ｗａｓｈ」はカラムを洗浄した際の通過液、「ｅｌｕｔｅ１」は第１の溶出液で溶出した際の溶出液、「ｅｌｕｔｅ２」は第２の溶出液で溶出した際の溶出液である。図４に示すとおり、各ポリペプチドは二量体に相当する分子量を有するバンドとして検出された。この結果より、各ポリペプチドは、変性剤非存在下では二量体化することが確認でき、自己会合能を有することが確認された。
FIG. 4 is a photograph showing the results of analysis of each solution during column purification by the SDS-PAGE method in the absence of a denaturant. In FIG. 4, "throw" is the passing liquid when the solution is loaded on the column, "wash" is the passing liquid when the column is washed, and "elute1" is the eluate when eluted with the first eluate. “
（４）変性剤存在下での自己会合能の確認
上記（３）と同様の条件でカラム精製した配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）を使用して、当該ポリペプチドが変性剤（ＤＴＴ：ジチオトレイトール）存在下で選択的な自己会合能を有するかを確認した。対照として、当該ポリペプチドに代えて、非特許文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．４９，ｐｐ．２５５−２６５，（２００２年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ．，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．２７１−２７７，（２００５年））に記載の方法に従って調製したＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ）を使用した。(4) Confirmation of self-association ability in the presence of a denaturing agent Using a polypeptide (His-ADF4-NRC) having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 column-purified under the same conditions as in (3) above, It was confirmed whether the polypeptide had a selective self-association ability in the presence of a denaturing agent (DTT: dithiothreitol). As a control, instead of the polypeptide, non-patent literature (Proteins: Struct. Funct. Genet., Vol. 49, pp. 255-265 (2002), Proteins: Struct. Funct. Bioinformat., Vol. 58). , Pp. 271-277, (2005)), and SNase (K116C) prepared according to the method described was used.
Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ溶液（溶媒：５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、１０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ８）にＤＴＴを５ｍＭとなるように添加した。ＤＴＴを添加した溶液を透析チューブ（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎＤｉａｌｙｓｉｓＴｕｂｉｎｇ ＃Ｄ１００、８０００ＭＷＣＯ，ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｉｎｃ．製）に移し、透析液（５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、１０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ８）に入れて、１２時間透析を行った。ＤＴＴ添加前、ＤＴＴ添加直後、透析開始から３時間後、６時間後及び１２時間後にＨｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ溶液から試料を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。ＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ）についても同様に分析を行った。図５は、変性剤添加前、変性剤（ＤＴＴ）添加後、透析開始から３時間後、６時間後及び１２時間後のポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。 DTT was added to His-ADF4-NRC solution (solvent: 5M guanidine thiocyanate, 10 mM Tris hydrochloride, pH 8) so as to be 5 mM. The solution to which DTT was added was transferred to a dialysis tube (BioDesignDiarysisTubing # D100, 8000MWCO, manufactured by BioDesign Inc.), placed in a dialysate (5M guanidine thiocyanate, 10 mM Tris hydrochloride, pH 8), and dialyzed for 12 hours. Samples were taken from the His-ADF4-NRC solution before DTT addition, immediately after DTT addition, 3 hours after the start of dialysis, 6 hours and 12 hours after the start of dialysis, and analyzed by the SDS-PAGE method. The same analysis was performed for SNase (K116C). In FIG. 5, the polypeptide (His-ADF4-NRC) solution before the addition of the denaturant, after the addition of the denaturant (DTT), and 3 hours, 6 hours, and 12 hours after the start of dialysis was analyzed by the SDS-PAGE method. It is a photograph showing the result.
図５に示すとおり、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）は、変性剤添加直後は単量体となっているものの、透析開始から３時間後には、ほとんどが二量体化していた。一方、ＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ）透析開始から１２時間後であっても二量体化していないタンパク質が存在することが確認された。 As shown in FIG. 5, the polypeptide having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 18 (His-ADF4-NRC) is a monomer immediately after the addition of the denaturing agent, but almost 3 hours after the start of dialysis. Was dimerized. On the other hand, it was confirmed that there was a protein that was not dimerized even 12 hours after the start of SNase (K116C) dialysis.
変性剤存在下では立体構造を保つことができず、タンパク質同士の相互作用はランダムな熱ゆらぎによって制御されるため、タンパク質間相互作用の効率は非常に低くなる。しかし、一般的なタンパク質（ＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ））が二量体していない透析開始から３時間後（すなわち、変性剤の影響が残っていると考えられる。）には、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）は、非常に高い効率で二量体化が起きることが確認された。すなわち、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）は、変性剤存在下であっても選択的な自己会合能を有しているといえる。また、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）は、選択的な相互作用を介して短時間でジスルフィド結合の形成が可能である。なお、ＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ）の一部が二量体化しているのは、ブラウン運動により分子が衝突することで二量体化しているものと考えられる。 Since the three-dimensional structure cannot be maintained in the presence of the denaturant and the interaction between proteins is controlled by random thermal fluctuation, the efficiency of protein-protein interaction is very low. However, 3 hours after the start of dialysis in which a common protein (SNase (K116C)) is not dimerized (that is, the effect of the denaturant is considered to remain), it is shown by SEQ ID NO: 18. It was confirmed that the polypeptide having an amino acid sequence (His-ADF4-NRC) undergoes dimerization with extremely high efficiency. That is, it can be said that the polypeptide (His-ADF4-NRC) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 has a selective self-association ability even in the presence of a denaturing agent. In addition, the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18 (His-ADF4-NRC) can form a disulfide bond in a short time through selective interaction. It is considered that the reason why a part of SNase (K116C) is dimerized is that the molecules collide with each other due to Brownian motion.
［試験例３：自己会合能を有するポリペプチドの設計及び評価］
（１）自己会合能を有するポリペプチドの設計
既知の大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）のＣ末端のアミノ酸配列（配列番号２７〜１９１で示されるアミノ酸配列）に基づいて、プロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を作成した。次いで、作成したＨＭＭを入力値としてｈｍｍｅｍｉｔプログラムを実行することにより、Ｅ値が１０−５よりも小さいアミノ酸配列を生成した（１００００配列）。生成したアミノ酸配列に対して、連続する５アミノ酸残基ごとに凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値を算出した。算出した平均値の最小値が−４．５以下になるアミノ酸配列として、配列番号１０、１２、１４及び１６で示されるアミノ酸配列を選出した。[Test Example 3: Design and evaluation of a polypeptide having self-association ability]
(1) Design of a polypeptide having self-association ability Based on the amino acid sequence at the C-terminal of a known large bottle-shaped gland spidroin (MaSp) (amino acid sequence shown by SEQ ID NOs: 27 to 191), a profile hidden Markov model (HMM). It was created. Then, by executing the hmmemit program using the created HMM as an input value, an amino acid sequence having an E value smaller than 10-5 was generated (10000 sequence). For the generated amino acid sequence, the average value of the aggregation free energy g (k) per amino acid residue was calculated for each of the five consecutive amino acid residues. The amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 10, 12, 14 and 16 were selected as the amino acid sequences having the minimum calculated average value of −4.5 or less.
（２）自己会合能を有するポリペプチドの製造
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７）を設計した。配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１７で示すアミノ酸配列（タグ配列）を付加したものである。また、配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列のＮ末端に付加配列を付加したものである。(2) Production of a polypeptide having self-association ability A polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 (His-ADF3-9467) was designed. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is obtained by adding the amino acid sequence (tag sequence) shown in SEQ ID NO: 17 to the N-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15. Further, the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 15 is obtained by adding an additional sequence to the N-terminal of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16.
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードする核酸を使用した他は、試験例２と同様の手順で製造及び可溶化し、試験例２と同様の手順で変性剤存在下での自己会合能の確認を行った。変性剤存在下での自己会合能の確認では、ＤＴＴ添加直後、透析開始から１．５時間後、３時間後、６時間後及び８時間後にポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７）溶液から試料を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。結果を図６に示す。 The polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 was produced and solubilized by the same procedure as in Test Example 2 except that the nucleic acid encoding the polypeptide was used, and was denatured by the same procedure as Test Example 2. The self-association ability was confirmed in the presence of the drug. To confirm the self-association ability in the presence of a denaturing agent, a sample was taken from the polypeptide (His-ADF3-9467) solution immediately after the addition of DTT, 1.5 hours, 3 hours, 6 hours and 8 hours after the start of dialysis. It was collected and analyzed by the SDS-PAGE method. The results are shown in FIG.
図６は、変性剤（ＤＴＴ）添加直後（０時間）、透析開始から１．５時間後、３時間後、６時間後及び８時間後のポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７）溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。図６に示すとおり、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７）は、変性剤添加直後は単量体となっているものの、透析開始から１．５時間後には二量体が形成されており、変性剤存在下であっても選択的な自己会合能を有することが確認された。 FIG. 6 shows a solution of a polypeptide (His-ADF3-9467) immediately after the addition of a denaturant (DTT) (0 hours), 1.5 hours after the start of dialysis, 3 hours, 6 hours and 8 hours after the start of dialysis. It is a photograph which shows the result of analysis by the PAGE method. As shown in FIG. 6, the polypeptide having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30 (His-ADF3-9467) is a monomer immediately after the addition of the denaturant, but 1.5 hours after the start of dialysis. It was confirmed that a dimer was formed and had a selective self-association ability even in the presence of a denaturing agent.
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