JPWO2020132177A5 - - Google Patents

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JPWO2020132177A5
JPWO2020132177A5 JP2021535876A JP2021535876A JPWO2020132177A5 JP WO2020132177 A5 JPWO2020132177 A5 JP WO2020132177A5 JP 2021535876 A JP2021535876 A JP 2021535876A JP 2021535876 A JP2021535876 A JP 2021535876A JP WO2020132177 A5 JPWO2020132177 A5 JP WO2020132177A5
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aav
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Description

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の態様であってもよい。
項目１
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を完全密閉式細胞工学システムに導入することであって、前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、そのゲノムに組み込まれた、
ｉ．第１の抑制解除プロモータの制御下のＥ２ＡおよびＥ４Ｏｒｆ６遺伝子を含むアデノウイルスヘルパー遺伝子、
ｉｉ．第２の抑制解除プロモータの制御下のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むＡＡＶ遺伝子、
ｉｉｉ．第３の抑制解除プロモータの制御下のウイルス関連非コードＲＮＡ、ならびに
ｉｖ．前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータの抑制要素、を含む、導入することと、
（ｂ）対象遺伝子をコードするベクターで前記哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を形質導入して、形質導入ウイルス産生細胞を産生することと、
（ｃ）前記抑制要素の結合パートナーで前記哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を治療することと、
（ｄ）前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータを活性化することと、
（ｅ）前記形質導入ウイルス産生細胞を増殖させ、前記形質導入ウイルス産生細胞内で前記ＡＡＶウイルスベクターを産生することと、
（ｆ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｆ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われる、方法。
項目２
前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳類細胞培養物である、項目１に記載の方法。
項目３
前記哺乳類細胞培養物が、懸濁培養物である、項目２に記載の方法。
項目４
前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
項目５
前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、ヒト細胞である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
項目６
前記ヒト細胞が、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である、項目５に記載の方法。
項目７
前記抑制解除プロモータの各々が、機能的プロモータおよび２つのテトラサイクリンオペレータ配列（ＴｅｔＯ ２ ）を含み、前記抑制要素が、テトラサイクリン抑制タンパク質である、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
項目８
前記治療することが、ドキシサイクリンで治療することを含む、項目７に記載の方法。
項目９
前記対象遺伝子が、治療対象遺伝子である、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
項目１０
産生されたＡＡＶウイルスベクターの量が、少なくとも約１０ １０ 個のウイルスベクターである、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
項目１１
前記閉鎖型自動化プロセスが、
（ａ）温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、ラクトースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および光学密度センサのうちの１つ以上で監視することと、
（ｂ）温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、ラクトースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および光学密度のうちの１つ以上を自動的に調節することと、を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２
前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、または膜破壊を含む、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法。
項目１３
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）ＴｅｔＲおよび／またはＴｅｔＲ－ＫＲＡＢをコードする１つ以上の核酸を安定的に発現する哺乳類細胞を、
ｉ．第１の抑制解除プロモータの制御下でＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４Ｏｒｆ遺伝子、およびウイルス関連非コードＲＮＡを含むアデノウイルスヘルパー遺伝子をコードする第１の核酸、
ｉｉ．第２の抑制解除プロモータの制御下でＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むＡＡＶ遺伝子をコードする第２の核酸、および
ｉｉｉ．任意選択で、第３の抑制解除プロモータの制御下で対象遺伝子をコードする第３の核酸によって形質導入することと、
（ｂ）前記哺乳類細胞を前記ＴｅｔＲの結合パートナーで治療することと、
（ｃ）前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータを活性化することと、
（ｄ）前記形質導入細胞を増殖させ、前記形質導入細胞内で前記ＡＡＶウイルスベクターを産生することと、
（ｅ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｅ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われる、方法。
項目１４
前記哺乳類細胞が、哺乳類細胞培養物である、項目１３に記載の方法。
項目１５
前記哺乳類細胞培養物が、懸濁培養物である、項目１４に記載の方法。
項目１６
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、項目１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
項目１７
前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、項目１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
項目１８
前記ヒト細胞が、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である、項目１７に記載の方法。
項目１９
前記治療することが、ドキシサイクリンで治療することを含む、項目１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
項目２０
前記対象遺伝子が、治療対象遺伝子である、項目１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
項目２１
産生されたＡＡＶウイルスベクターの量が、少なくとも約１０ １０ 個のウイルスベクターである、項目１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
項目２２
前記閉鎖型自動化プロセスが、
（ａ）温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、ラクトースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および光学密度センサのうちの１つ以上で監視することと、
（ｂ）温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、ラクトースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および光学密度のうちの１つ以上を自動的に調節することと、を含む、項目１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
項目２３
前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、または膜破壊を含む、項目１２～２２のいずれか一項に記載の方法。
項目２４
レンチウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）人工哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞を完全密閉式細胞工学システムに導入することであって、前記人工哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞が、そのゲノムに組み込まれた、
ｉ．第１のプロモータの制御下のビリオンタンパク質（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルス調節因子、
ｉｉ．第２のプロモータの制御下のレンチウイルスエンベロープ遺伝子、ならびに
ｉｉｉ．ともに第３のプロモータの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子、を含み、
核酸配列が、トランスポゾン特異的逆方向末端反復（ＩＴＲ）の組換えから生じる配列によって５’末端および３’末端の両方に隣接されている、導入することと、
（ｂ）対象遺伝子をコードするベクターで前記哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞を形質導入して、形質導入ウイルス産生細胞を産生することと、
（ｃ）前記第１、第２、および第３のプロモータを活性化することと、
（ｄ）前記形質導入ウイルス産生細胞を増殖させ、前記形質導入ウイルス産生細胞内で前記レンチウイルスベクターを産生することと、
（ｅ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｅ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われる、方法。
項目２５
前記人工哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞が、哺乳類細胞培養物である、項目２４に記載の方法。
項目２６
前記哺乳類細胞培養物が、懸濁培養物である、項目２５に記載の方法。
項目２７
前記人工哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞が、ヒト細胞である、項目２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
項目２８
前記ヒト細胞が、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である、項目２７に記載の方法。
項目２９
前記ＧＡＧ遺伝子が、ＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、前記ＰＯＬ遺伝子が、ＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、項目２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
項目３０
前記レンチウイルスエンベロープ遺伝子が、水疱口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、項目２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
項目３１
前記第１のプロモータ、第２のプロモータ、および第３のプロモータが、抑制解除プロモータである、項目２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
項目３２
前記人工哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞が、前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータの抑制要素をそのゲノムに組み込むことをさらに含む、項目３１に記載の方法。
項目３３
前記抑制解除プロモータの各々が、機能的プロモータおよびテトラサイクリンオペレータ配列（ＴｅｔＯ）を含み、前記抑制要素が、テトラサイクリン抑制タンパク質である、項目３２に記載の方法。
項目３４
前記テトラサイクリン抑制タンパク質をコードする配列に続く、クルッペル会合ボックス配列をさらに含む、項目３３に記載の方法。
項目３５
前記トランスポゾン特異的ＩＴＲが、レピドプテラントランスポゾン（ＰＩＧＧＹＢＡＣ （登録商標）） ＩＴＲである、項目２４～３４のいずれか一項に記載の方法。
項目３６
前記対象遺伝子が、治療対象遺伝子である、項目２４～３５のいずれか一項に記載の方法。
項目３７
産生されたレンチウイルスベクターの量が、少なくとも約１０ １０ 個のウイルスベクターである、項目２４～３６のいずれか一項に記載の方法。
項目３８
前記閉鎖型自動化プロセスが、
（ａ）温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、ラクトースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および光学密度センサのうちの１つ以上で監視することと、
（ｂ）温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、ラクトースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および光学密度のうちの１つ以上を自動的に調節することと、を含む、項目２４～３７のいずれか一項に記載の方法。
項目３９
前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、または膜破壊を含む、項目２４～３８のいずれか一項に記載の方法。
項目４０
レンチウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）完全密閉式細胞工学システムに哺乳類細胞を導入することと、
（ｂ）哺乳類細胞を、
ｉ．第１のプロモータの制御下のビリオンタンパク質（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルス調節因子ならびに第２のプロモータの制御下のエンベロープ糖タンパク質遺伝子をコードする第１の核酸、
ｉｉ．第３のプロモータの制御下の対象遺伝子をコードする第２の核酸、および
ｉｉｉ．第４のプロモータの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子ならびにレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子の両方をコードする第３の核酸によって形質導入することと、
（ｃ）前記形質導入細胞を増殖させ、前記形質導入細胞内で前記レンチウイルスベクターを産生することと、
（ｄ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｄ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われる、方法。
項目４１
前記哺乳類細胞が、哺乳類細胞培養物である、項目４０に記載の方法。
項目４２
前記哺乳類細胞培養物が、懸濁培養物である、項目４１に記載の方法。
項目４３
前記哺乳類細胞が、ヒト細胞である、項目４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
項目４４
前記ヒト細胞が、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である、項目４３に記載の方法。
項目４５
前記ＧＡＧ遺伝子が、ＨＩＶ ＧＡＧ遺伝子であり、前記ＰＯＬ遺伝子が、ＨＩＶ ＰＯＬ遺伝子である、項目４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
項目４６
前記エンベロープ糖タンパク質遺伝子が、水疱口炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子であり、前記ＶＳＶ－Ｇ遺伝子および前記ＲＥＶ遺伝子が、コドン最適化される、項目４０～４６のいずれか一項に記載の方法。
項目４７
前記対象遺伝子が、治療対象遺伝子である、項目４０～４６のいずれか一項に記載の方法。
項目４８
産生されたレンチウイルスベクターの量が、少なくとも約１０ １０ 個のウイルスベクターである、項目４０～４７のいずれか一項に記載の方法。
項目４９
前記閉鎖型自動化プロセスが、
（ａ）温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、ラクトースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および光学密度センサのうちの１つ以上で監視することと、
（ｂ）温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、ラクトースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および光学密度のうちの１つ以上を自動的に調節することと、を含む、項目４０～４８のいずれか一項に記載の方法。
項目５０
前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、または膜破壊を含む、項目４０～４９のいずれか一項に記載の方法。
項目５１
項目１～２３のいずれか一項に記載の方法によって産生されるＡＡＶウイルスベクター。
項目５２
項目１４～５０のいずれか一項に記載の方法によって産生されるレンチウイルスベクター。
項目５３
ＡＡＶベクターによる治療方法であって、
ａ．哺乳類対象に項目５１に記載のＡＡＶベクターを投与することを含む、方法。
項目５４
前記投与することが、吸入、注射、または静脈内投与を含む、項目５３に記載の方法。
項目５５
レンチウイルスベクターによる治療方法であって、
ａ．哺乳類対象に項目５２に記載のレンチウイルスベクターを投与することを含む、方法。
項目５６
前記投与することが、吸入、注射、または静脈内投与を含む、項目５５に記載の方法。 All publications, patents, and patent applications referred to in this specification are to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. , incorporated herein by reference.
The present invention may have the following aspects.
Item 1
A method for automated production of an adeno-associated virus (AAV) viral vector, comprising:
(a) introducing an artificial mammalian AAV virus-producing cell into a completely closed cell engineering system, wherein said artificial mammalian AAV virus-producing cell is integrated into its genome;
i. an adenoviral helper gene comprising the E2A and E4Orf6 genes under the control of a first derepressed promoter;
ii. an AAV gene comprising the Rep and Cap genes under the control of a second derepressed promoter;
iii. a virus-associated non-coding RNA under control of a third derepressed promoter, and
iv. introducing, comprising repressing elements of said first, second and third derepressed promoters;
(b) transducing said mammalian AAV virus-producing cells with a vector encoding a gene of interest to produce transduced virus-producing cells;
(c) treating said mammalian AAV virus-producing cell with a binding partner of said inhibitory element;
(d) activating said first, second and third derepressed promoters;
(e) propagating said transduced virus-producing cells to produce said AAV viral vectors within said transduced virus-producing cells;
(f) isolating the viral vector;
A method wherein (a)-(f) are performed in a closed automated process.
Item 2
2. The method of item 1, wherein the artificial mammalian AAV virus-producing cell is a mammalian cell culture.
Item 3
3. The method of item 2, wherein the mammalian cell culture is a suspension culture.
Item 4
4. The method of any one of items 1-3, wherein the artificial mammalian AAV virus-producing cells are Chinese Hamster Ovary (CHO) cells.
Item 5
4. The method of any one of items 1-3, wherein the artificial mammalian AAV virus-producing cells are human cells.
Item 6
6. The method of item 5, wherein said human cells are human embryonic kidney (HEK) cells.
Item 7
A method according to any one of items 1 to 6, wherein each of said derepressed promoters comprises a functional promoter and two tetracycline operator sequences (TetO 2 ) and said repressible element is a tetracycline repressor protein.
Item 8
8. The method of item 7, wherein said treating comprises treating with doxycycline.
Item 9
9. The method according to any one of items 1 to 8, wherein the target gene is a therapeutic target gene.
Item 10
10. The method of any one of items 1-9, wherein the amount of AAV viral vectors produced is at least about 10 10 viral vectors.
Item 11
said closed automated process comprising:
(a) monitoring with one or more of temperature sensors, pH sensors, glucose sensors, lactose sensors, oxygen sensors, carbon dioxide sensors, and optical density sensors;
(b) automatically adjusting one or more of temperature, pH level, glucose level, lactose level, oxygen level, carbon dioxide level, and optical density. The method described in section.
Item 12
12. The method of any one of items 1-11, wherein said transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection, or membrane disruption.
Item 13
A method for automated production of an adeno-associated virus (AAV) viral vector, comprising:
(a) a mammalian cell stably expressing one or more nucleic acids encoding TetR and/or TetR-KRAB,
i. a first nucleic acid encoding an adenoviral helper gene comprising an E2A gene, an E4Orf gene, and a virus-associated non-coding RNA under control of a first derepressed promoter;
ii. a second nucleic acid encoding an AAV gene comprising the Rep and Cap genes under the control of a second derepressed promoter; and
iii. optionally transducing with a third nucleic acid encoding the gene of interest under control of a third derepressed promoter;
(b) treating said mammalian cell with a binding partner of said TetR;
(c) activating said first, second and third derepressed promoters;
(d) propagating the transduced cell to produce the AAV viral vector within the transduced cell;
(e) isolating the viral vector;
A method wherein (a)-(e) are performed in a closed automated process.
Item 14
14. The method of item 13, wherein said mammalian cell is a mammalian cell culture.
Item 15
15. The method of item 14, wherein said mammalian cell culture is a suspension culture.
Item 16
16. The method of any one of items 12-15, wherein said mammalian cells are Chinese Hamster Ovary (CHO) cells.
Item 17
16. The method of any one of items 12-15, wherein said mammalian cells are human cells.
Item 18
18. The method of item 17, wherein said human cells are human embryonic kidney (HEK) cells.
Item 19
19. The method of any one of items 12-18, wherein said treating comprises treating with doxycycline.
Item 20
20. The method according to any one of items 12 to 19, wherein the target gene is a therapeutic target gene.
Item 21
21. The method of any one of items 12-20, wherein the amount of AAV viral vectors produced is at least about 10 10 viral vectors.
Item 22
said closed automated process comprising:
(a) monitoring with one or more of temperature sensors, pH sensors, glucose sensors, lactose sensors, oxygen sensors, carbon dioxide sensors, and optical density sensors;
(b) automatically adjusting one or more of temperature, pH level, glucose level, lactose level, oxygen level, carbon dioxide level, and optical density. The method described in section.
Item 23
23. The method of any one of items 12-22, wherein said transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection, or membrane disruption.
Item 24
A method for automated production of a lentiviral vector, comprising:
(a) introducing an artificial mammalian lentiviral vector-producing cell into a fully closed cell engineering system, wherein the artificial mammalian lentiviral vector-producing cell has integrated into its genome;
i. a lentiviral regulator of expression of the virion protein (REV) gene under the control of the first promoter;
ii. a lentiviral envelope gene under the control of a second promoter, and
iii. a lentiviral group-specific antigen (GAG) gene and a lentiviral polymerase (POL) gene, both under the control of a third promoter;
introducing a nucleic acid sequence flanked at both the 5′ and 3′ ends by sequences resulting from recombination of transposon-specific inverted terminal repeats (ITRs);
(b) transducing said mammalian lentiviral vector-producing cell with a vector encoding a gene of interest to produce a transduced virus-producing cell;
(c) activating said first, second and third promoters;
(d) growing said transduced virus-producing cells to produce said lentiviral vector within said transduced virus-producing cells;
(e) isolating the viral vector;
A method wherein (a)-(e) are performed in a closed automated process.
Item 25
25. The method of item 24, wherein said artificial mammalian lentiviral vector-producing cell is a mammalian cell culture.
Item 26
26. The method of item 25, wherein said mammalian cell culture is a suspension culture.
Item 27
27. The method of any one of items 24-26, wherein said artificial mammalian lentiviral vector-producing cells are human cells.
Item 28
28. The method of item 27, wherein said human cells are human embryonic kidney (HEK) cells.
Item 29
29. The method of any one of items 24-28, wherein the GAG gene is the HIV GAG gene and the POL gene is the HIV POL gene.
item 30
30. The method of any one of items 24-29, wherein the lentiviral envelope gene is the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) gene.
Item 31
31. The method of any one of items 24-30, wherein said first promoter, second promoter and third promoter are derepressed promoters.
Item 32
32. The method of item 31, wherein said artificial mammalian lentiviral vector-producing cell further comprises integrating repressible elements of said first, second and third derepressed promoters into its genome.
Item 33
33. The method of item 32, wherein each of said derepressed promoters comprises a functional promoter and a tetracycline operator sequence (TetO) and said repressible element is a tetracycline repressor protein.
Item 34
34. The method of item 33, further comprising a Kruppel-associated box sequence following the sequence encoding said tetracycline inhibitory protein.
Item 35
35. The method of any one of items 24-34, wherein said transposon-specific ITR is a lepidopteran transposon (PIGGYBAC®) ITR.
Item 36
36. The method according to any one of items 24 to 35, wherein the target gene is a therapeutic target gene.
Item 37
37. The method of any one of items 24-36, wherein the amount of lentiviral vector produced is at least about 10 10 viral vectors.
Item 38
said closed automated process comprising:
(a) monitoring with one or more of temperature sensors, pH sensors, glucose sensors, lactose sensors, oxygen sensors, carbon dioxide sensors, and optical density sensors;
(b) automatically adjusting one or more of temperature, pH level, glucose level, lactose level, oxygen level, carbon dioxide level, and optical density. The method described in section.
Item 39
39. The method of any one of items 24-38, wherein said transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection, or membrane disruption.
Item 40
A method for automated production of a lentiviral vector, comprising:
(a) introducing a mammalian cell into a fully closed cell engineering system;
(b) a mammalian cell,
i. a first nucleic acid encoding a lentiviral regulator of expression of a virion protein (REV) gene under control of a first promoter and an envelope glycoprotein gene under control of a second promoter;
ii. a second nucleic acid encoding a gene of interest under control of a third promoter; and
iii. transducing with a third nucleic acid encoding both a lentiviral group-specific antigen (GAG) gene under the control of a fourth promoter as well as a lentiviral polymerase (POL) gene;
(c) growing said transduced cells to produce said lentiviral vector within said transduced cells;
(d) isolating the viral vector;
A method, wherein (a)-(d) are performed in a closed automated process.
Item 41
41. The method of item 40, wherein said mammalian cell is a mammalian cell culture.
Item 42
42. The method of item 41, wherein said mammalian cell culture is a suspension culture.
Item 43
43. The method of any one of items 40-42, wherein said mammalian cells are human cells.
Item 44
44. The method of item 43, wherein said human cells are human embryonic kidney (HEK) cells.
Item 45
45. The method of any one of items 40-44, wherein the GAG gene is the HIV GAG gene and the POL gene is the HIV POL gene.
Item 46
47. Any one of items 40-46, wherein the envelope glycoprotein gene is the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) gene, and wherein the VSV-G gene and the REV gene are codon optimized. the method of.
Item 47
47. The method according to any one of items 40 to 46, wherein the target gene is a therapeutic target gene.
Item 48
48. The method of any one of items 40-47, wherein the amount of lentiviral vector produced is at least about 10 10 viral vectors.
Item 49
said closed automated process comprising:
(a) monitoring with one or more of temperature sensors, pH sensors, glucose sensors, lactose sensors, oxygen sensors, carbon dioxide sensors, and optical density sensors;
(b) automatically adjusting one or more of temperature, pH level, glucose level, lactose level, oxygen level, carbon dioxide level, and optical density. The method described in section.
item 50
50. The method of any one of items 40-49, wherein said transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection, or membrane disruption.
Item 51
An AAV viral vector produced by the method of any one of items 1-23.
Item 52
A lentiviral vector produced by the method of any one of items 14-50.
Item 53
A method of treatment with an AAV vector, comprising:
a. A method comprising administering the AAV vector of item 51 to a mammalian subject.
Item 54
54. The method of item 53, wherein said administering comprises inhalation, injection, or intravenous administration.
Item 55
A method of treatment with a lentiviral vector, comprising:
a. 53. A method comprising administering the lentiviral vector of item 52 to a mammalian subject.
Item 56
56. The method of item 55, wherein said administering comprises inhalation, injection, or intravenous administration.

Claims (26)

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を完全密閉式細胞工学システムに導入することであって、前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、そのゲノムに組み込まれた、
ｉ．第１の抑制解除プロモータの制御下のＥ２ＡおよびＥ４Ｏｒｆ６遺伝子を含むアデノウイルスヘルパー遺伝子、
ｉｉ．第２の抑制解除プロモータの制御下のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むＡＡＶ遺伝子、
ｉｉｉ．第３の抑制解除プロモータの制御下のウイルス関連非コードＲＮＡ、ならびに
ｉｖ．前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータの抑制要素、を含む、ことと、
（ｂ）対象遺伝子をコードするベクターで前記哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を形質導入して、形質導入ウイルス産生細胞を産生することと、
（ｃ）前記抑制要素の結合パートナーで前記哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を治療することと、
（ｄ）前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータを活性化することと、
（ｅ）前記形質導入ウイルス産生細胞を増殖させ、前記形質導入ウイルス産生細胞内で前記ＡＡＶウイルスベクターを産生することと、
（ｆ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｆ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われ、並びに、
前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクションまたは、膜破壊を含む、方法。 A method for automated production of an adeno-associated virus (AAV) viral vector, comprising:
(a) introducing an artificial mammalian AAV virus-producing cell into a completely closed cell engineering system, wherein said artificial mammalian AAV virus-producing cell is integrated into its genome;
i. an adenoviral helper gene comprising the E2A and E4Orf6 genes under the control of a first derepressed promoter;
ii. an AAV gene comprising the Rep and Cap genes under the control of a second derepressed promoter;
iii. a virus-associated non-coding RNA under the control of a third derepressed promoter, and iv. repression elements of said first, second and third derepressed promoters;
(b) transducing said mammalian AAV virus-producing cells with a vector encoding a gene of interest to produce transduced virus-producing cells;
(c) treating said mammalian AAV virus-producing cell with a binding partner of said inhibitory element;
(d) activating said first, second and third derepressed promoters;
(e) propagating said transduced virus-producing cells to produce said AAV viral vectors within said transduced virus-producing cells;
(f) isolating the viral vector;
(a)-(f) are performed in a closed automated process , and
A method, wherein said transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection or membrane disruption . 前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、哺乳類細胞培養物である、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein said artificial mammalian AAV virus-producing cell is a mammalian cell culture. 前記哺乳類細胞培養物が、懸濁培養物である、請求項２に記載の方法。 3. The method of claim 2, wherein said mammalian cell culture is a suspension culture. 前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-3, wherein the artificial mammalian AAV virus-producing cells are Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. 前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、ヒト細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 The method of any one of claims 1-3, wherein the artificial mammalian AAV virus-producing cells are human cells. 前記抑制解除プロモータの各々が、機能的プロモータおよび２つのテトラサイクリンオペレータ配列（ＴｅｔＯ２）を含み、前記抑制要素が、テトラサイクリン抑制タンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 1 to 5 , wherein each of said derepressed promoters comprises a functional promoter and two tetracycline operator sequences (TetO 2 ) and said repressible element is a tetracycline repressor protein. 前記対象遺伝子が、治療対象遺伝子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 6 , wherein the target gene is a therapeutic target gene. 産生されたＡＡＶウイルスベクターの量が、少なくとも約１０１０個のウイルスベクターである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 8. The method of any one of claims 1-7 , wherein the amount of AAV viral vectors produced is at least about 10 10 viral vectors. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を完全密閉式細胞工学システムに導入することであって、前記人工哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞が、そのゲノムに組み込まれた、
ｉ．第１の抑制解除プロモータの制御下のＥ２ＡおよびＥ４Ｏｒｆ６遺伝子を含むアデノウイルスヘルパー遺伝子、
ｉｉ．第２の抑制解除プロモータの制御下のＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むＡＡＶ遺伝子、
ｉｉｉ．第３の抑制解除プロモータの制御下のウイルス関連非コードＲＮＡ、ならびに
ｉｖ．前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータの抑制要素、を含む、ことと、
（ｂ）対象遺伝子をコードするベクターで前記哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を形質導入して、形質導入ウイルス産生細胞を産生することと、
（ｃ）前記抑制要素の結合パートナーで前記哺乳類ＡＡＶウイルス産生細胞を治療することと、
（ｄ）前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータを活性化することと、
（ｅ）前記形質導入ウイルス産生細胞を増殖させ、前記形質導入ウイルス産生細胞内で前記ＡＡＶウイルスベクターを産生することと、
（ｆ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｆ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われ、並びに、
前記閉鎖型自動化プロセスがさらに、
温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、ラクトースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および光学密度センサのうちの１つ以上で監視することと、
温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、ラクトースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および光学密度のうちの１つ以上を自動的に調節することと、を含む、方法。 A method for automated production of an adeno-associated virus (AAV) viral vector, comprising:
(a) introducing an artificial mammalian AAV virus-producing cell into a completely closed cell engineering system, wherein said artificial mammalian AAV virus-producing cell is integrated into its genome;
i. an adenoviral helper gene comprising the E2A and E4Orf6 genes under the control of a first derepressed promoter;
ii. an AAV gene comprising the Rep and Cap genes under the control of a second derepressed promoter;
iii. a virus-associated non-coding RNA under control of a third derepressed promoter, and
iv. repression elements of said first, second and third derepressed promoters;
(b) transducing said mammalian AAV virus-producing cells with a vector encoding a gene of interest to produce transduced virus-producing cells;
(c) treating said mammalian AAV virus-producing cell with a binding partner of said inhibitory element;
(d) activating said first, second and third derepressed promoters;
(e) propagating said transduced virus-producing cells to produce said AAV viral vectors within said transduced virus-producing cells;
(f) isolating the viral vector;
(a)-(f) are performed in a closed automated process, and
said closed automated process further comprising:
monitoring with one or more of a temperature sensor, a pH sensor, a glucose sensor, a lactose sensor, an oxygen sensor, a carbon dioxide sensor, and an optical density sensor;
automatically adjusting one or more of temperature , pH level, glucose level, lactose level, oxygen level, carbon dioxide level , and optical density. 前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、または膜破壊を含む、請求項９に記載の方法。 10. The method of claim 9 , wherein transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection, or membrane disruption. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）ＴｅｔＲおよび／またはＴｅｔＲ－ＫＲＡＢをコードする１つ以上の核酸を安定的に発現する哺乳類細胞を、
ｉ．第１の抑制解除プロモータの制御下でＥ２Ａ遺伝子、Ｅ４Ｏｒｆ遺伝子、およびウイルス関連非コードＲＮＡを含むアデノウイルスヘルパー遺伝子をコードする第１の核酸、
ｉｉ．第２の抑制解除プロモータの制御下でＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むＡＡＶ遺伝子をコードする第２の核酸、および
ｉｉｉ．任意選択で、第３の抑制解除プロモータの制御下で対象遺伝子をコードする第３の核酸によって形質導入することと、
（ｂ）前記哺乳類細胞を前記ＴｅｔＲの結合パートナーで治療することと、
（ｃ）前記第１、第２、および第３の抑制解除プロモータを活性化することと、
（ｄ）前記形質導入細胞を増殖させ、前記形質導入細胞内で前記ＡＡＶウイルスベクターを産生することと、
（ｅ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｅ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われ、並びに、
前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクションまたは、膜破壊を含む、方法。 A method for automated production of an adeno-associated virus (AAV) viral vector, comprising:
(a) a mammalian cell stably expressing one or more nucleic acids encoding TetR and/or TetR-KRAB,
i. a first nucleic acid encoding an adenoviral helper gene comprising an E2A gene, an E4Orf gene, and a virus-associated non-coding RNA under control of a first derepressed promoter;
ii. a second nucleic acid encoding an AAV gene comprising the Rep and Cap genes under the control of a second derepressed promoter; and iii. optionally transducing with a third nucleic acid encoding the gene of interest under control of a third derepressed promoter;
(b) treating said mammalian cell with a binding partner of said TetR;
(c) activating said first, second and third derepressed promoters;
(d) propagating the transduced cell to produce the AAV viral vector within the transduced cell;
(e) isolating the viral vector;
(a)-(e) are performed in a closed automated process , and
A method, wherein said transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection or membrane disruption . 前記哺乳類細胞が、哺乳類細胞培養物である、請求項１１に記載の方法。 12. The method of claim 11 , wherein said mammalian cell is a mammalian cell culture. 前記治療することが、ドキシサイクリンで治療することを含む、請求項１１または１２に記載の方法。 13. The method of claim 11 or 12 , wherein said treating comprises treating with doxycycline. 前記対象遺伝子が、治療対象遺伝子である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 11 to 13 , wherein the target gene is a therapeutic target gene. 産生されたＡＡＶウイルスベクターの量が、少なくとも約１０１０個のウイルスベクターである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。 15. The method of any one of claims 11-14 , wherein the amount of AAV viral vectors produced is at least about 10 10 viral vectors. 前記閉鎖型自動化プロセスがさらに、
温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、ラクトースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および光学密度センサのうちの１つ以上で監視することと、
温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、ラクトースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および光学密度のうちの１つ以上を自動的に調節することと、を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。 said closed automated process further comprising:
monitoring with one or more of a temperature sensor, a pH sensor, a glucose sensor, a lactose sensor, an oxygen sensor, a carbon dioxide sensor, and an optical density sensor;
automatically adjusting one or more of temperature , pH level, glucose level, lactose level, oxygen level, carbon dioxide level, and optical density. The method described in . 前記形質導入することが、ウイルス感染を含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。 A method according to any one of claims 11 to 16 , wherein said transducing comprises viral infection . レンチウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）人工哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞を完全密閉式細胞工学システムに導入することであって、前記人工哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞が、そのゲノムに組み込まれた、
ｉ．第１のプロモータの制御下のビリオンタンパク質（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルス調節因子、
ｉｉ．第２のプロモータの制御下のレンチウイルスエンベロープ遺伝子、ならびに
ｉｉｉ．ともに第３のプロモータの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子、を含み、
核酸配列が、トランスポゾン特異的逆方向末端反復（ＩＴＲ）の組換えから生じる配列によって５’末端および３’末端の両方に隣接されている、導入することと、
（ｂ）対象遺伝子をコードするベクターで前記哺乳類レンチウイルスベクター産生細胞を形質導入して、形質導入ウイルス産生細胞を産生することと、
（ｃ）前記第１、第２、および第３のプロモータを活性化することと、
（ｄ）前記形質導入ウイルス産生細胞を増殖させ、前記形質導入ウイルス産生細胞内で前記レンチウイルスベクターを産生することと、
（ｅ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｅ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われ、並びに、
前記閉鎖型自動化プロセスがさらに、
温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、ラクトースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および光学密度センサのうちの１つ以上で監視することと、
温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、ラクトースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および光学密度のうちの１つ以上を自動的に調節することと、を含む、、方法。 A method for automated production of a lentiviral vector, comprising:
(a) introducing an artificial mammalian lentiviral vector-producing cell into a fully closed cell engineering system, wherein the artificial mammalian lentiviral vector-producing cell has integrated into its genome;
i. a lentiviral regulator of expression of the virion protein (REV) gene under the control of the first promoter;
ii. a lentiviral envelope gene under the control of a second promoter, and iii. a lentiviral group-specific antigen (GAG) gene and a lentiviral polymerase (POL) gene, both under the control of a third promoter;
introducing a nucleic acid sequence flanked at both the 5′ and 3′ ends by sequences resulting from recombination of transposon-specific inverted terminal repeats (ITRs);
(b) transducing said mammalian lentiviral vector-producing cell with a vector encoding a gene of interest to produce a transduced virus-producing cell;
(c) activating said first, second and third promoters;
(d) growing said transduced virus-producing cells to produce said lentiviral vector within said transduced virus-producing cells;
(e) isolating the viral vector;
(a)-(e) are performed in a closed automated process , and
said closed automated process further comprising:
monitoring with one or more of a temperature sensor, a pH sensor, a glucose sensor, a lactose sensor, an oxygen sensor, a carbon dioxide sensor, and an optical density sensor;
automatically adjusting one or more of temperature, pH level, glucose level, lactose level, oxygen level, carbon dioxide level, and optical density . 前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、または、膜破壊を含む、請求項１８に記載の方法。19. The method of claim 18, wherein transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection, or membrane disruption. レンチウイルスベクターの自動産生方法であって、
（ａ）完全密閉式細胞工学システムに哺乳類細胞を導入することと、
（ｂ）哺乳類細胞を、
ｉ．第１のプロモータの制御下のビリオンタンパク質（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルス調節因子ならびに第２のプロモータの制御下のエンベロープ糖タンパク質遺伝子をコードする第１の核酸、
ｉｉ．第３のプロモータの制御下の対象遺伝子をコードする第２の核酸、および
ｉｉｉ．第４のプロモータの制御下のレンチウイルス群特異抗原（ＧＡＧ）遺伝子ならびにレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子の両方をコードする第３の核酸によって形質導入することと、
（ｃ）前記形質導入細胞を増殖させ、前記形質導入細胞内で前記レンチウイルスベクターを産生することと、
（ｄ）前記ウイルスベクターを単離することと、を含み、
（ａ）～（ｄ）が、閉鎖型自動化プロセスで行われ、並びに、
前記閉鎖型自動化プロセスがさらに、
温度センサ、ｐＨセンサ、グルコースセンサ、ラクトースセンサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ、および光学密度センサのうちの１つ以上で監視することと、
温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、ラクトースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、および光学密度のうちの１つ以上を自動的に調節することと、を含む、方法。 A method for automated production of a lentiviral vector, comprising:
(a) introducing a mammalian cell into a fully closed cell engineering system;
(b) a mammalian cell,
i. a first nucleic acid encoding a lentiviral regulator of expression of a virion protein (REV) gene under control of a first promoter and an envelope glycoprotein gene under control of a second promoter;
ii. a second nucleic acid encoding a gene of interest under control of a third promoter, and iii. transducing with a third nucleic acid encoding both a lentiviral group-specific antigen (GAG) gene under the control of a fourth promoter as well as a lentiviral polymerase (POL) gene;
(c) growing said transduced cells to produce said lentiviral vector within said transduced cells;
(d) isolating the viral vector;
(a)-(d) are performed in a closed automated process , and
said closed automated process further comprising:
monitoring with one or more of a temperature sensor, a pH sensor, a glucose sensor, a lactose sensor, an oxygen sensor, a carbon dioxide sensor, and an optical density sensor;
automatically adjusting one or more of temperature, pH level, glucose level, lactose level, oxygen level, carbon dioxide level, and optical density . 前記形質導入することが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、または、膜破壊を含む、請求項２０に記載の方法。21. The method of claim 20, wherein transducing comprises viral infection, electroporation, liposome transfection, or membrane disruption. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法によって産生されるＡＡＶウイルスベクター。
An AAV viral vector produced by the method of any one of claims 1-8 .
 請求項９または１０に記載の方法によって産生されるＡＡＶウイルスベクター。An AAV viral vector produced by the method of claim 9 or 10. 請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法によって産生されるＡＡＶウイルスベクター。An AAV viral vector produced by the method of any one of claims 11-17. 請求項１８または１９に記載の方法によって産生されるレンチウイルスベクター。A lentiviral vector produced by the method of claim 18 or 19. 請求項２０または２１に記載の方法によって産生されるレンチウイルスベクター。A lentiviral vector produced by the method of claim 20 or 21.
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