JPWO2020101740A5

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Publication number: JPWO2020101740A5
Application number: JP2021526563A
Authority: JP
Publication date: 2022-05-31

Description

図面は、例示のみを目的として本開示の様々な態様を示す。当業者は、本明細書に例示される構造及び方法の代替的な態様が、本明細書に記載される本開示の原理から逸脱することなく用いられ得ることを以下の考察から容易に認識するであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記足場タンパク質はＮ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、前記ＮＤは前記ＥＶの内腔表面と会合し、前記ＥＤはイオン相互作用によって前記ＥＶの前記内腔表面と会合し、前記ＥＤは配列中に少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）を含む、前記単離された細胞外小胞（ＥＶ）。
（項目２）
前記ＮＤが、ミリストイル化を介して前記ＥＶの前記内腔表面と会合する、項目１に記載のＥＶ。
（項目３）
前記ＮＤが、Ｎ末端にＧｌｙを有する、項目２に記載のＥＶ。
（項目４）
前記ＥＤが、少なくとも３つのＬｙｓ、少なくとも４つのＬｙｓ、少なくとも５つのＬｙｓ、少なくとも６つのＬｙｓ、または少なくとも７つのＬｙｓを含む、項目１～３のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目５）
前記ＥＤが、ペプチド結合によって前記ＮＤに連結される、項目１～４のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目６）
前記ＥＤが、（Ｌｙｓ）ｎを含み、ｎが１～１０の整数である、項目４または５に記載のＥＶ。
（項目７）
前記ＥＤが、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１～６のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目８）
前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載されるアミノ酸配列を含み、ＧがＧｌｙとして表されるグリシンであり、「：」がペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６のそれぞれが独立してアミノ酸であり、前記Ｘ６が塩基性アミノ酸を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目９）
前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される、項目８に記載のＥＶ。
（項目１０）
足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記足場タンパク質はＮ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、前記ＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に記載のアミノ酸配列を含み、ＧはＧｌｙによって表されるグリシンであり、「：」はペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６のそれぞれは独立してアミノ酸であり、前記Ｘ６は塩基性アミノ酸を含み、前記ＥＤはペプチド結合によってＸ６に連結され、前記ＥＤのＮ末端に少なくとも１つのリジンを含む、前記単離された細胞外小胞（ＥＶ）。
（項目１１）
前記ＥＤが、ウイルスの膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを含まない、項目１～１０のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１２）
前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される、項目８～１１のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１３）
前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択される、項目８～１２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１４）
前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される、項目８～１３のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１５）
前記足場タンパク質の前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）Ｇが、Ｇｌｙを表し、
（ｉｉ）「：」が、ペプチド結合を表し、
（ｉｉｉ）前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｉｖ）前記Ｘ３が、アミノ酸であり、
（ｖ）前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｖｉ）前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｖｉｉ）前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である、項目１～１４のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１６）
前記Ｘ３が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される、項目８～１５のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１７）
前記ＮＤ及び前記ＥＤが、リンカーによって接合される、項目１～９及び１１～１６のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目１８）
前記リンカーが、ペプチド結合または１つ以上のアミノ酸を含む、項目１７に記載のＥＶ。
（項目１９）
足場タンパク質に連結した生物学的に活性な分子を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記足場タンパク質はＮＤ－ＥＤを含み、
ａ．ＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６を含み、
ｉ．ＧはＧｌｙを表し、
ｉｉ．「：」はペプチド結合を表し、
ｉｉｉ．前記Ｘ２はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ｉｖ．前記Ｘ３はアミノ酸であり、
ｖ．前記Ｘ４はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ｖｉ．前記Ｘ５はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ｖｉｉ．前記Ｘ６はＬｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸であり、
ｂ．「－」は１つ以上のアミノ酸を含む任意のリンカーであり、
ｃ．ＥＤは（ｉ）ペプチド結合もしくは１つ以上のアミノ酸によって前記Ｘ６に連結される少なくとも２つの連続するリジン（Ｌｙｓ）、または（ｉｉ）ペプチド結合によって前記Ｘ６に直接連結される少なくとも１つのリジンを含むエフェクタードメインである、前記単離された細胞外小胞（ＥＶ）。
（項目２０）
前記Ｘ２が、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択される、項目８～１９のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２１）
前記Ｘ３が、Ｌｙｓである、項目８～２０のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２２）
前記Ｘ４が、ＬｅｕまたはＧｌｕである、項目８～２１のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２３）
前記Ｘ５が、Ｓｅｒ及びＡｌａからなる群から選択される、項目８～２２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２４）
前記Ｘ６がＬｙｓである、項目８～２３のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２５）
前記Ｘ２が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、前記Ｘ３が、ＬｙｓまたはＧｌｕであり、前記Ｘ４が、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、及びＧｌｕであり、前記Ｘ５が、ＳｅｒまたはＡｌａであり、前記Ｘ６が、Ｌｙｓである、項目８～２４のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２６）
前記ＮＤ及び前記ＥＤが、１つ以上のアミノ酸を含むリンカーによって連結される、項目１９～２５のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２７）
前記ＥＤが、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号１５１）、ＫＫＫＫＫ（配列番号１５２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１９～２６のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２８）
前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号１５７）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号１５８）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号１５９）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号１６０）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１～２７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目２９）
前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６１）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６２）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号１６３）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号１６４）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号１６５）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号１６６）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号１６７）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号１６８）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目２８に記載のＥＶ。
（項目３０）
前記足場タンパク質が、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００アミノ酸長である、項目１～２９のいずれか１項に記載のＥＶ。
（項目３１）
前記足場タンパク質が、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１６９）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７０）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７１）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号１７２）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号１７３）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号１７４）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号１７５）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号１７６）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１７７）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号１７８）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号１７９）を含む、項目１～３０のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目３２）
前記足場タンパク質が、Ｎ末端にＭｅｔを含まない、項目１～３１のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目３３）
前記足場タンパク質が、前記足場タンパク質の前記Ｎ末端にミリストイル化アミノ酸残基を含む、項目１～３２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目３４）
前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、Ｇｌｙである、項目３３に記載のＥＶ。
（項目３５）
前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、合成物質である、項目３３または３４に記載のＥＶ。
（項目３６）
前記足場タンパク質の前記Ｎ末端における前記アミノ酸残基が、グリシン類似体である、項目３３または３５に記載のＥＶ。
（項目３７）
前記足場タンパク質が、配列番号１（ＭＡＲＫＳ）、配列番号２（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、または配列番号３（ＢＡＳＰ１）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～３６のいずれか１項に記載のＥＶ。
（項目３８）
前記生物学的に活性な分子が、前記ＥＶの前記内腔表面または内腔上にある、項目１～３７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目３９）
前記足場タンパク質が、膜貫通ドメインをさらに含む、項目１及び８のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４０）
前記膜貫通ドメインが、前記足場タンパク質のＥＤドメインと前記生物学的に活性な分子との間にある、項目３９に記載のＥＶ。
（項目４１）
前記足場タンパク質が、小胞外ドメインをさらに含む、項目１～４０のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４２）
前記生物学的に活性な分子が、前記小胞外ドメインに連結される、項目４１に記載のＥＶ。
（項目４３）
前記足場タンパク質が、リンカーによって前記生物学的に活性な分子に連結される、項目１～４２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４４）
ＮＤドメインが、リンカーによってＥＤドメインに連結される、項目１～４３のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４５）
前記リンカーが、ペプチド結合または１つ以上のアミノ酸を含む、項目４３または４４に記載のＥＶ。
（項目４６）
前記リンカーが、切断可能なリンカーを含む、項目１７～１９、２６、及び４３～４５のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４７）
前記リンカーが、柔軟なリンカーを含む、項目１７～１９、２６、及び４３～４５のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４８）
前記生物学的に活性な分子が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）、化学化合物、ウイルス、イオノフォア、イオノフォア用担体、チャネルもしくは細孔を形成する部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目１～４７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目４９）
前記タンパク質が、組換えペプチド、天然ペプチド、合成ペプチド、抗体、融合タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目５０）
前記タンパク質が、酵素、サイトカイン、リガンド、受容体、転写因子、またはそれらの組み合わせを含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目５１）
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目５２）
前記ＥＶが、第２の足場タンパク質をさらに含む、項目１～５１のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目５３）
前記第２の足場タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮポリペプチド、ＢＳＧポリペプチド、ＩＧＳＦ２ポリペプチド、ＩＧＳＦ３ポリペプチド、ＩＧＳＦ８ポリペプチド、ＩＴＧＢ１ポリペプチド、ＩＴＧＡ４ポリペプチド、ＳＬＣ３Ａ２ポリペプチド、ＡＴＰトランスポーターポリペプチド、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）ポリペプチド、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチド、ネプリライシン（ＭＭＥ）ポリペプチド、ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）ポリペプチド、またはそれらの断片を含む、項目５２に記載のＥＶ。
（項目５４）
前記生物学的に活性な分子が、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である、項目１～５３のいずれか１項に記載のＥＶ。
（項目５５）
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される、項目５４に記載のＥＶ。
（項目５６）
前記生物学的に活性な分子が、免疫原性タンパク質である、項目１～４７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目５７）
前記生物学的に活性な分子が、毒素、トキソイド、または毒素の非毒性変異体である、項目１～４７のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目５８）
前記毒素が、ジフテリア毒素である、項目５７に記載のＥＶ。
（項目５９）
前記トキソイドが、破傷風トキソイドである、項目５７に記載のＥＶ。
（項目６０）
前記生物学的に活性な分子が、ジフテリア毒素の非毒性変異体である、項目５７に記載のＥＶ。
（項目６１）
前記生物学的に活性な分子が、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である、項目１～６０のいずれか１項に記載のＥＶ。
（項目６２）
前記正の共刺激分子が、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである、項目６１に記載のＥＶ。
（項目６３）
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される、項目６２に記載のＥＶ。
（項目６４）
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーである、項目６３に記載のＥＶ。
（項目６５）
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーが、ＴＮＦα、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ－２からなる群から選択される、項目６４に記載のＥＶ。
（項目６６）
前記正の共刺激分子が、ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子である、項目６１に記載のＥＶ。
（項目６７）
前記ＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子が、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である、項目６６に記載のＥＶ。
（項目６８）
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である、項目６７に記載のＥＶ。
（項目６９）
前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、及びＩＬ－１５からなる群から選択される、項目５０に記載のＥＶ。
（項目７０）
前記タンパク質が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはそれらの誘導体を含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目７１）
前記タンパク質が、腫瘍抗原を含む、項目４８に記載のＥＶ。
（項目７２）
前記腫瘍抗原が、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ－葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん－精巣抗原、ＭＡＲＴ－１ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される、項目７１に記載のＥＶ。
（項目７３）
前記ＥＶがエクソソームである、項目１～７２のいずれか一項に記載のＥＶ。
（項目７４）
項目１～７３のいずれか一項に記載のＥＶ及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
（項目７５）
項目１～７３のいずれか一項に記載のＥＶを産生する細胞。
（項目７６）
１つ以上のベクターを含む細胞であって、前記ベクターが、前記足場タンパク質及び項目１～７３のいずれか一項に記載の生物学的に活性な分子をコードする核酸配列を含む、前記細胞。
（項目７７）
前記核酸配列が、プロモーターに作用可能に結合している、項目７６に記載の細胞。
（項目７８）
項目１～７３のいずれか一項に記載のＥＶ及び使用説明書を含む、キット。
（項目７９）
好適な条件下で項目７５～７７のいずれか一項に記載の細胞を培養し、前記ＥＶを得ることを含む、ＥＶの作製方法。
（項目８０）
項目１～７３のいずれか一項に記載の生物学的に活性な分子を項目１～７３のいずれか一項に記載の足場タンパク質に連結することを含む、生物学的に活性な分子を細胞外小胞に固定する方法。
（項目８１）
疾患の予防または治療を必要とする対象において前記疾患を予防または治療する方法であって、項目１～７３のいずれか一項に記載のＥＶを投与することを含み、前記疾患は前記抗原と関連付けられる、前記方法。
（項目８２）
前記ＥＶが、非経口、経口、静脈内、筋肉内、腫瘍内、鼻腔内、皮下、または腹腔内で投与される、項目８１に記載の方法。 The drawings show various aspects of the present disclosure for purposes of illustration only. Those skilled in the art will readily recognize from the following considerations that alternative embodiments of the structures and methods exemplified herein can be used without departing from the principles of the present disclosure described herein. Will.
In the embodiment of the present invention, for example, the following items are provided.
(Item 1)
An isolated extracellular vesicle (EV) containing a biologically active molecule linked to a scaffold protein, wherein the scaffold protein contains an N-terminal domain (ND) and an effector domain (ED), said ND. Associates with the lumen surface of the EV, the ED associates with the lumen surface of the EV by ionic interaction, and the ED comprises at least two contiguous lys in the sequence, said isolation. Extracellular vesicles (EV).
(Item 2)
The EV of item 1, wherein the ND associates with the lumen surface of the EV via myristoylation.
(Item 3)
The EV according to item 2, wherein the ND has Gly at the N-terminal.
(Item 4)
The EV according to any one of items 1 to 3, wherein the ED comprises at least 3 Lys, at least 4 Lys, at least 5 Lys, at least 6 Lys, or at least 7 Lys.
(Item 5)
The EV according to any one of items 1 to 4, wherein the ED is linked to the ND by a peptide bond.
(Item 6)
The EV according to item 4 or 5, wherein the ED comprises (Lys) n, where n is an integer of 1-10.
(Item 7)
The EV according to any one of items 1 to 6, wherein the ED comprises KK, KKK, KKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), or any combination thereof.
(Item 8)
The ND contains the amino acid sequence described in G: X2: X3: X4: X5: X6, G is a glycine represented as Gly, ":" represents a peptide bond, and the X2 to X6. The EV according to any one of items 1 to 7, wherein each is an independent amino acid and the X6 contains a basic amino acid.
(Item 9)
The EV according to item 8, wherein the X6 is selected from the group consisting of Lys, Arg, and His.
(Item 10)
An isolated extracellular vesicle (EV) containing a biologically active molecule linked to a scaffold protein, wherein the scaffold protein comprises an N-terminal domain (ND) and an effector domain (ED), said ND. Contains the amino acid sequence described in G: X2: X3: X4: X5: X6, where G is glycine represented by Gly, where ":" represents a peptide bond and each of X2 to X6 is independent. The isolated extracellular vesicle (EV), wherein the X6 contains a basic amino acid, the ED is linked to the X6 by peptide binding, and the N-terminus of the ED contains at least one lysine. ..
(Item 11)
The EV according to any one of items 1 to 10, wherein the ED does not contain a transmembrane domain or a cytoplasmic domain of a virus.
(Item 12)
The EV according to any one of items 8 to 11, wherein the X2 is selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, and Ser.
(Item 13)
The EV according to any one of items 8 to 12, wherein the X4 is selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, and Met.
(Item 14)
The EV according to any one of items 8 to 13, wherein the X5 is selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, and Ser.
(Item 15)
The ND of the scaffold protein comprises the amino acid sequence of G: X2: X3: X4: X5: X6.
(I) G represents Gly and represents
(Ii) ":" represents a peptide bond,
(Iii) The X2 is an amino acid selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, and Ser.
(Iv) The X3 is an amino acid,
(V) The X4 is an amino acid selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Gln, and Met.
(Vi) The X5 is an amino acid selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, and Ser.
(Vii) The EV according to any one of items 1 to 14, wherein the X6 is an amino acid selected from the group consisting of Lys, Arg, and His.
(Item 16)
The EV according to any one of items 8 to 15, wherein the X3 is selected from the group consisting of Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, His, and Arg.
(Item 17)
The EV according to any one of items 1 to 9 and 11 to 16, wherein the ND and the ED are bonded by a linker.
(Item 18)
17. The EV of item 17, wherein the linker comprises a peptide bond or one or more amino acids.
(Item 19)
An isolated extracellular vesicle (EV) containing a biologically active molecule linked to a scaffold protein, said scaffold protein comprising ND-ED.
a. ND includes G: X2: X3: X4: X5: X6,
i. G stands for Gly
ii. ":" Represents a peptide bond
iii. X2 is an amino acid selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, and Ser.
iv. The X3 is an amino acid,
v. X4 is an amino acid selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, Ser, Val, Ile, Leu, Phe, Trp, Tyr, Glu, and Met.
vi. X5 is an amino acid selected from the group consisting of Pro, Gly, Ala, and Ser.
vii. X6 is an amino acid selected from the group consisting of Lys, Arg, and His.
b. "-" Is any linker containing one or more amino acids.
c. The ED comprises (i) at least two consecutive lysines linked to the X6 by a peptide bond or one or more amino acids, or (ii) at least one lysine directly linked to the X6 by a peptide bond. The isolated extracellular vesicle (EV), which is the effector domain.
(Item 20)
The EV according to any one of items 8 to 19, wherein X2 is selected from the group consisting of Gly and Ala.
(Item 21)
The EV according to any one of items 8 to 20, wherein X3 is Lys.
(Item 22)
The EV according to any one of items 8 to 21, wherein the X4 is Leu or Glu.
(Item 23)
The EV according to any one of items 8 to 22, wherein X5 is selected from the group consisting of Ser and Ala.
(Item 24)
The EV according to any one of items 8 to 23, wherein X6 is Lys.
(Item 25)
X2 is Gly, Ala, or Ser, X3 is Lys or Glu, X4 is Leu, Phe, Ser, and Glu, X5 is Ser or Ala, and X6. Is Lys, the EV according to any one of items 8 to 24.
(Item 26)
The EV according to any one of items 19 to 25, wherein the ND and the ED are linked by a linker containing one or more amino acids.
(Item 27)
The EV according to any one of items 19 to 26, wherein the ED comprises Lys (K), KK, KKK, KKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), or any combination thereof.
(Item 28)
The scaffold proteins are (i) GGKLSKK (SEQ ID NO: 157), (ii) GAKLSKK (SEQ ID NO: 158), (iii) GGKQSKK (SEQ ID NO: 159), (iv) GGKLAKK (SEQ ID NO: 160), or (v) them. The EV according to any one of items 1 to 27, which comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of any combination of the above.
(Item 29)
The scaffold protein is (i) GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161), (ii) GGKLSKKS (SEQ ID NO: 162), (iii) GAKLSKKK (SEQ ID NO: 163), (iv) GAKLSKKS (SEQ ID NO: 164), (v) GGKQSKK (v). SEQ ID NO: 165), (vi) GGKQSKKS (SEQ ID NO: 166), (vii) GGKLAKKK (SEQ ID NO: 167), (viii) GGKLAKKS (SEQ ID NO: 168), and (ix) selected from the group consisting of any combination thereof. 28. The EV of item 28, comprising the amino acid sequence.
(Item 30)
The scaffold protein is at least about 8, at least about 9, at least about 10, at least about 11, at least about 12, at least about 13, at least about 14, at least about 15, at least about 16, at least about 17, at least about 18, at least. About 19, at least about 20, at least about 21, at least about 22, at least about 23, at least about 24, at least about 25, at least about 30, at least about 35, at least about 40, at least about 45, at least about 50, at least about 55 At least about 60, at least about 65, at least about 70, at least about 75, at least about 80, at least about 85, at least about 90, at least about 95, at least about 100, at least about 105, at least about 110, at least about 120, at least The EV according to any one of items 1-29, which is about 130, at least about 140, at least about 150, at least about 160, at least about 170, at least about 180, at least about 190, or at least about 200 amino acids long.
(Item 31)
The scaffold protein is (i) GGKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 169), (ii) GAKLSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 170), (iii) GGKQSKKKKGYNVN (SEQ ID NO: 171), (iv) GGKLKKGYNVN. SEQ ID NO: 173), (vi) GGKLSKKKKGSGGS (SEQ ID NO: 174), (vii) GGKLSKKKSKSGSG (SEQ ID NO: 175), (viii) GGKLSKKGSGSG (SEQ ID NO: 176), (ix) GGKGSG (SEQ ID NO: 176), (ix) The EV according to any one of items 1 to 30, which comprises SEQ ID NO: 178) or (xi) GAKKSKRFSFKKS (SEQ ID NO: 179).
(Item 32)
The EV according to any one of items 1 to 31, wherein the scaffold protein does not contain Met at the N-terminal.
(Item 33)
The EV according to any one of items 1 to 32, wherein the scaffold protein contains a myristoylated amino acid residue at the N-terminal of the scaffold protein.
(Item 34)
33. The EV of item 33, wherein the amino acid residue at the N-terminus of the scaffold protein is Gly.
(Item 35)
The EV according to item 33 or 34, wherein the amino acid residue at the N-terminal of the scaffold protein is a synthetic substance.
(Item 36)
The EV according to item 33 or 35, wherein the amino acid residue at the N-terminus of the scaffold protein is a glycine analog.
(Item 37)
The scaffold protein is at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90 with SEQ ID NO: 1 (MARKS), SEQ ID NO: 2 (MARKSL1), or SEQ ID NO: 3 (BASP1). %, At least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, or any one of items 1-36 comprising an amino acid sequence having about 100% sequence identity. The EV described in the section.
(Item 38)
The EV according to any one of items 1 to 37, wherein the biologically active molecule is on the lumen surface or on the lumen of the EV.
(Item 39)
The EV according to any one of items 1 and 8, wherein the scaffold protein further comprises a transmembrane domain.
(Item 40)
39. EV, wherein the transmembrane domain is between the ED domain of the scaffold protein and the biologically active molecule.
(Item 41)
The EV according to any one of items 1 to 40, wherein the scaffold protein further comprises an extracellular domain.
(Item 42)
41. The EV of item 41, wherein the biologically active molecule is linked to the extracellular domain.
(Item 43)
The EV according to any one of items 1-42, wherein the scaffold protein is linked to the biologically active molecule by a linker.
(Item 44)
The EV according to any one of items 1-43, wherein the ND domain is linked to the ED domain by a linker.
(Item 45)
The EV according to item 43 or 44, wherein the linker comprises a peptide bond or one or more amino acids.
(Item 46)
The EV according to any one of items 17 to 19, 26, and 43 to 45, wherein the linker includes a cleavable linker.
(Item 47)
The EV according to any one of items 17 to 19, 26, and 43 to 45, wherein the linker includes a flexible linker.
(Item 48)
The biologically active molecule forms a protein, polypeptide, peptide, polynucleotide (DNA and / or RNA), chemical compound, virus, ionophore, carrier for ionophore, channel or pore, or any of them. The EV according to any one of items 1 to 47, which comprises any combination.
(Item 49)
28. EV according to item 48, wherein the protein comprises a recombinant peptide, a natural peptide, a synthetic peptide, an antibody, a fusion protein, or any combination thereof.
(Item 50)
28. EV according to item 48, wherein the protein comprises an enzyme, a cytokine, a ligand, a receptor, a transcription factor, or a combination thereof.
(Item 51)
28. EV according to item 48, wherein the virus comprises an adeno-associated virus, parvovirus, retrovirus, adenovirus, or any combination thereof.
(Item 52)
The EV according to any one of items 1 to 51, wherein the EV further comprises a second scaffold protein.
(Item 53)
The second scaffold protein is PTGFRN polypeptide, BSG polypeptide, IGSF2 polypeptide, IGSF3 polypeptide, IGSF8 polypeptide, ITGB1 polypeptide, ITGA4 polypeptide, SLC3A2 polypeptide, ATP transporter polypeptide, aminopeptidase N ( Item 52. ..
(Item 54)
The EV according to any one of items 1 to 53, wherein the biologically active molecule is an inhibitor of a negative checkpoint regulator or an inhibitor of a binding partner of a negative checkpoint regulator.
(Item 55)
The negative checkpoint regulators are cytotoxic T lymphocyte-related protein 4 (CTLA-4), programmed cell death protein 1 (PD-1), lymphocyte activation gene 3 (LAG-3), and T cell immunity. Globulin Mutin-Containing Protein 3 (TIM-3), B and T Lymphocyte Attenuating Factor (BTLA), T Cell Immunoreceptor with Ig and ITIM Domains (TIGIT), V Domain Ig Inhibitor of T Cell Activation (VISTA) 54, item 54, selected from the group consisting of adenosine A2a receptor (A2aR), killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR), indolamine 2,3-dioxygenase (IDO), CD20, CD39, and CD73. EV.
(Item 56)
The EV according to any one of items 1 to 47, wherein the biologically active molecule is an immunogenic protein.
(Item 57)
The EV according to any one of items 1-47, wherein the biologically active molecule is a toxin, toxoid, or a non-toxic variant of the toxin.
(Item 58)
57. EV, wherein the toxin is a diphtheria toxin.
(Item 59)
58. The EV according to item 57, wherein the toxoid is a tetanus toxoid.
(Item 60)
57. EV according to item 57, wherein the biologically active molecule is a non-toxic variant of diphtheria toxin.
(Item 61)
The EV according to any one of items 1 to 60, wherein the biologically active molecule is an activator of a positive co-stimulator molecule or an activator of a binding partner of a positive co-stimulator molecule.
(Item 62)
The EV according to item 61, wherein the positive co-stimulator molecule is a member of the TNF receptor superfamily.
(Item 63)
The TNF receptor superfamily members include CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas receptor, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, RANK, OCIF, TWEK receptor, Taci. 62. EV according to item 62, selected from the group consisting of BAFF receptor, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, and XEDAR.
(Item 64)
The EV according to item 63, wherein the activator of the positive co-stimulatory molecule is a member of the TNF superfamily.
(Item 65)
The TNF superfamily members include TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB ligand, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF. 64. EV according to item 64, selected from the group consisting of NT-3, NT-4, GITR ligand, and EDA-2.
(Item 66)
The EV according to item 61, wherein the positive co-stimulator is a CD28-superfamily co-stimulator.
(Item 67)
66. EV, wherein the CD28-superfamily co-stimulator molecule is ICOS or CD28.
(Item 68)
67. EV, wherein the activator of the positive co-stimulator molecule is ICOSL, CD80, or CD86.
(Item 69)
The EV according to item 50, wherein the cytokine is selected from the group consisting of IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, and IL-15.
(Item 70)
28. EV according to item 48, wherein the protein comprises a T cell receptor (TCR), a T cell co-receptor, a major histocompatibility complex (MHC), a human leukocyte antigen (HLA), or a derivative thereof.
(Item 71)
28. EV, wherein the protein comprises a tumor antigen.
(Item 72)
The tumor antigens are alpha-fet protein (AFP), cancer fetal antigen (CEA), epithelial tumor antigen (ETA), mutin 1 (MUC1), Tn-MUC1, mutin 16 (MUC16), tyrosinase, melanoma-associated antigen ( MAGE), tumor protein p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, programmed death ligand 1 (PD-L1), programmed death ligand 2 (PD-L2), NY-ESO-1, PSMA, TAG- Selected from the group consisting of 72, HER2, GD2, cMET, EGFR, mesothelin, VEGFR, alpha-folic acid receptor, CE7R, IL-3, cancer-testis antigen, MART-1gp100, and TNF-related apoptosis-inducing ligands. EV according to item 71.
(Item 73)
The EV according to any one of items 1 to 72, wherein the EV is an exosome.
(Item 74)
A pharmaceutical composition comprising the EV according to any one of items 1 to 73 and a pharmaceutically acceptable carrier.
(Item 75)
The cell that produces the EV according to any one of items 1 to 73.
(Item 76)
A cell comprising one or more vectors, wherein the vector comprises a nucleic acid sequence encoding the scaffold protein and the biologically active molecule according to any one of items 1-73.
(Item 77)
76. The cell of item 76, wherein the nucleic acid sequence is operably bound to a promoter.
(Item 78)
A kit comprising the EV and instruction manual according to any one of items 1 to 73.
(Item 79)
A method for producing an EV, which comprises culturing the cells according to any one of items 75 to 77 under suitable conditions to obtain the EV.
(Item 80)
Cell cells of a biologically active molecule comprising linking the biologically active molecule according to any one of items 1 to 73 to the scaffold protein according to any one of items 1 to 73. How to fix to the outer vesicles.
(Item 81)
A method of preventing or treating a disease in a subject in need of prevention or treatment of the disease, comprising administering the EV according to any one of items 1-73, wherein the disease is associated with the antigen. The above method.
(Item 82)
81. The method of item 81, wherein the EV is administered parenterally, orally, intravenously, intramuscularly, intratumorally, intranasally, subcutaneously, or intraperitoneally.

Claims

An isolated extracellular vesicle (EV) containing a biologically active molecule linked to a scaffold protein.
The scaffold protein contains an N-terminal domain (ND) and an effector domain (ED).
The ND associates with the luminal surface of the EV, and the ED associates with the luminal surface of the EV by ion interaction.
The ND contains the amino acid sequence of GGKLSK (SEQ ID NO: 203), but does not contain methionine (Met) at the N-terminus.
The ED contains a lysine (Lys) directly linked to the C-terminal lysine of SEQ ID NO: 203 of the ND at its N-terminal .
The isolated extracellular vesicle (EV).

The EV according to claim 1 , wherein the ED comprises KK, KKK, KKK (SEQ ID NO: 151), KKKKK (SEQ ID NO: 152), or any combination thereof.

The EV according to claim 1 or 2 , wherein the ND and the ED are joined by a linker.

The EV of claim 3 , wherein the linker comprises a peptide bond .

The EV according to any one of claims 1 to 4 , wherein the scaffold protein comprises the amino acid sequence of GGKLSKK (SEQ ID NO: 157).

The EV according to claim 5 , wherein the scaffold protein comprises the amino acid sequence of GGKLSKKK (SEQ ID NO: 161).

The EV according to any one of claims 1 to 6 , wherein the scaffold protein is at least about 8 amino acids long.

The EV according to any one of claims 1 to 7, wherein the amino acid residue at the N-terminal of the scaffold protein is Gly or a glycine analog .

The EV according to any one of claims 1 to 8 , wherein the biologically active molecule is on or in the lumen of the EV.

The scaffold protein
(I) Transmembrane domain ,
(Ii) Extravesicular domain, or
(Iii) Both (i) and (ii)
The EV according to claim 1 , further comprising.

The scaffold protein further comprises a transmembrane domain and an extracellular domain.
(I) The transmembrane domain is between the ED domain of the scaffold protein and the biologically active molecule .
(Ii) The biologically active molecule is linked to the extracellular domain.
The EV according to claim 1 .

The EV according to any one of claims 1 to 11 , wherein the scaffold protein is linked to the biologically active molecule by a linker.

12. The EV of claim 12 , wherein the linker comprises a cleavable linker.

The biologically active molecule
(A) Protein,
(B) Polypeptide ;
(C) Peptide ;
(D) Polynucleotide (DNA and / or RNA) ;
(E) Chemical compound ;
(F) Virus ;
(G) Ionophore ;
(H) Ionophore carrier ;
(I) The part forming the channel or pore ; or
(J) The EV according to any one of claims 1 to 13 , which comprises any combination thereof.

The protein
(I) Recombinant peptides, natural peptides, synthetic peptides, antibodies, fusion proteins, or any combination thereof.
(Ii) Enzymes, cytokines, ligands, receptors, transcription factors, or combinations thereof;
(Iii) T cell receptor (TCR), T cell co-receptor, major histocompatibility complex (MHC), human leukocyte antigen (HLA), or derivatives thereof; or
(Iv) Tumor antigens, as needed, alpha-apoptotic protein (AFP), cancer fetal antigen (CEA), epithelial tumor antigen (ETA), mutin 1 (MUC1), Tn-MUC1, mutin 16 ( MUC16), tyrosinase, melanoma-related antigen (MAGE), tumor protein p53 (p53), CD4, CD8, CD45, CD80, CD86, programmed death ligand 1 (PD-L1), programmed death ligand 2 (PD-L2), NY -ESO-1, PSMA, TAG-72, HER2, GD2, cMET, EGFR, mesothelin, VEGFR, alpha-folic acid receptor, CE7R, IL-3, cancer-testile antigen, MART-1gp100, and TNF-related apoptosis induction Tumor antigen selected from the group consisting of ligands
The EV according to claim 14 , wherein the EV comprises.

The EV according to any one of claims 1 to 15 , wherein the EV further comprises a second scaffold protein.

The second scaffold protein is PTGFRN polypeptide, BSG polypeptide, IGSF2 polypeptide, IGSF3 polypeptide, IGSF8 polypeptide, ITGB1 polypeptide, ITGA4 polypeptide, SLC3A2 polypeptide, ATP transporter polypeptide, aminopeptidase N ( 19. 7 . EV.

The biologically active molecule
(A) an inhibitor of a negative checkpoint regulator or an inhibitor of a binding partner of a negative checkpoint regulator, wherein the negative checkpoint regulator is optionally.
(I) Cytotoxic T lymphocyte-related protein 4 (CTLA-4),
(Ii) Programmed cell death protein 1 (PD-1),
(Iii) Lymphocyte activation gene 3 (LAG-3),
(Iv) T cell immunoglobulin mucin-containing protein 3 (TIM-3),
(V) B and T lymphocyte attenuating factor (BTLA),
(Vi) T cell immune receptor (TIGIT) with Ig and ITIM domains,
(Vii) V-domain Ig inhibitor (VISTA) for T cell activation,
(Viii) Adenosine A2a receptor (A2aR),
(Ix) Killer Cell Immunoglobulin-like Receptor (KIR),
(X) Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO),
(Xi) CD20,
(Xii) CD39, and
(Xiii) CD73
Selected from the group consisting of;
(B) An immunogenic protein;
(C) Toxins, toxoids, or non-toxic variants of toxins, where
(I) The toxin is, if necessary, a diphtheria toxin, or
(Ii) The toxoid is, if necessary, a tetanus toxoid;
(D) An activator of a positive co-stimulator molecule or an activator of a binding partner of a positive co-stimulator molecule, wherein the positive co-stimulator molecule is, if necessary.
(I) TNF receptor superfamily members, CD120a, CD120b, CD18, OX40, CD40, Fas receptor, M68, CD27, CD30, 4-1BB, TRAILR1, TRAILR2, TRAILR3, TRAILR4, as needed. Selected from the group consisting of RANK, OCIF, TWEAK receptor, TACI, BAFF receptor, ATAR, CD271, CD269, AITR, TROY, CD358, TRAMP, and XEDAR, where the positive costimulatory molecule is optionally. The activator is a TNF superfamily member and, if necessary, TNFα, TNF-C, OX40L, CD40L, FasL, LIGHT, TL1A, CD27L, Siva, CD153, 4-1BB ligand, TRAIL, RANKL, TWEAK. , APRIL, BAFF, CAMLG, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, GITR ligands, and TNF receptor superfamily members selected from the group consisting of EDA-2;
(Ii) A CD28-superfamily co-stimulator, optionally selected from ICOS and CD28, wherein the activator of the positive co-stimulator is ICOSL, CD80, or, optionally. CD28-superfamily co-stimulatory molecule, CD86
Selected from a group of
The EV according to any one of claims 1 to 17 .

The EV according to any one of claims 1 to 18 , wherein the EV is an exosome.

A pharmaceutical composition comprising the EV according to any one of claims 1 to 19 and a pharmaceutically acceptable carrier.

The EV-producing cell according to any one of claims 1 to 20 .

A cell comprising one or more vectors, wherein the vector comprises a nucleic acid sequence encoding the scaffold protein and the biologically active molecule of any one of claims 1-20 . ..

22. The cell of claim 22 , wherein the nucleic acid sequence is operably bound to a promoter.

A kit comprising the EV and instruction manual according to any one of claims 1 to 20 .

A method for producing an EV, which comprises culturing the cell according to any one of claims 21 to 23 under suitable conditions to obtain the EV.

A biologically active molecule comprising linking the biologically active molecule according to any one of claims 1 to 20 to the scaffold protein according to any one of claims 1 to 20 . To the extracellular vesicles.

The pharmaceutical composition comprising EV according to any one of claims 1 to 20 , for preventing or treating the disease in a subject in need of prevention or treatment of the disease.