KR20240007815A - Anti-BDCA-2 Antibody and Use Thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 신규한 항체는 공지된 항체와 유사할 정도로 BDCA-2를 인식하고, 인간 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid Dendritic cell, pDC)의 표면으로부터의 BDCA-2의 내재화를 매개하여 I형 인터페론의 발현을 억제하는 효과를 보이며, 상기 효과는 공지된 항체보다 더 뛰어남을 확인하였다. 더불어 상기 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 기반으로 제작한 CAR, 상기 CAR를 발현하는 T세포는 우수한 pDC 제거능을 보였으며, 상기 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 기반으로 제작한 키메라 항체와 인간화 항체는 인간 BDCA-2를 발현하는 세포와 원숭이 BDCA-2를 발현하는 세포 모두 결합할 수 있음을 확인한 바, 전신성 홍반성 낭창과 같은 자가면역질환의 에방 또는 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.The novel antibody that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention recognizes BDCA-2 to a degree similar to known antibodies and binds to BDCA-2 from the surface of human plasmacytoid dendritic cells (pDC). It was confirmed that it was effective in suppressing the expression of type I interferon by mediating the internalization of 2, and that this effect was superior to that of known antibodies. In addition, CAR produced based on an antibody that specifically binds to BDCA-2 and T cells expressing the CAR showed excellent pDC removal ability, and CAR produced based on an antibody that specifically binds to BDCA-2 It was confirmed that chimeric antibodies and humanized antibodies can bind to both cells expressing human BDCA-2 and cells expressing monkey BDCA-2, so they can be useful for preventing or treating autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus. You can.
Description
본 발명은 BDCA-2(Blood dendritic cell antigen 2)에 특이적으로 결합하는 신규한 항체, 이를 기반으로 한 키메라 항원 수용체, 이를 발현하는 형질전환된 T세포, 키메라 항체 및 인간화 항체에 대한 것이다.The present invention relates to a novel antibody that specifically binds to BDCA-2 (Blood dendritic cell antigen 2), a chimeric antigen receptor based thereon, transformed T cells expressing the same, chimeric antibodies, and humanized antibodies.
BDCA-2(Blood Dendritic Cell Antigen 2)는 1회 막관통형의 막단백질이다. BDCA-2는 인간 형질세포양 수상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDCs)에 한정하여 발현되며, pDCs의 세포 내에 시그널을 전달함으로써, pDCs의 기능 조절을 담당하는 것으로 알려져 있다.BDCA-2 (Blood Dendritic Cell Antigen 2) is a single-transmembrane type membrane protein. BDCA-2 is expressed exclusively in human plasmacytoid dendritic cells (pDCs), and is known to be responsible for regulating the function of pDCs by transmitting signals within the cells of pDCs.
BDCA-2는 활성화된 면역 반응에 대하여 억제적으로 기능한다. 상기 메커니즘의 상세한 것은 아직 불명확한 부분이 많지만, 후술하는 바와 같이, BDCA-2에 대한 항체를 이용하여 BDCA-2 분자를 가교함으로써, 활성화 상태에 있는 pDCs를 억제할 수 있는 것이 보고되어 있다.BDCA-2 functions suppressively against activated immune responses. Although the details of the mechanism are still largely unclear, it has been reported that pDCs in an activated state can be inhibited by cross-linking BDCA-2 molecules using an antibody against BDCA-2, as described later.
BDCA-2의 특이적 발현 세포인 pDCs는 자가면역질환, 예컨대 전신 홍반 루푸스, 전신경화증, 다발성근염 및 피부근염, 건선, 쇼그렌 증후군, 류마티스 관절염, 그레이브병 및 하시모토병에서 비정상적인 활성화를 보인다. 더불어 인터페론-α(interferon-α, IFN-α) 뿐만 아니라 염증성 사이토카인 및 케모카인을 다량으로 생성하는 것으로 알려져 있다.pDCs, cells that specifically express BDCA-2, show abnormal activation in autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, polymyositis and dermatomyositis, psoriasis, Sjögren's syndrome, rheumatoid arthritis, Grave's disease, and Hashimoto's disease. In addition, it is known to produce large amounts of inflammatory cytokines and chemokines, as well as interferon-α (IFN-α).
자가면역질환의 일종인 전신 홍반 루푸스에 있어서는, 환자의 중증도와 혈중 IFN-α 농도에 양의 상관이 있는 경우가 있다고 보고되어 있다. 또한, 전신 홍반 루푸스 병태 모델 마우스에 대하여, pDCs가 발생하지 않도록 유전자 개변을 실시하면, 전신 홍반 루푸스의 발증이 억제되는 점에서, 전신 홍반 루푸스 병태에 대한 pDCs의 직접적인 관여가 증명되어 있다.In systemic lupus erythematosus, a type of autoimmune disease, it has been reported that there may be a positive correlation between the severity of the patient and the concentration of IFN-α in the blood. Furthermore, when genetic modification is performed on systemic lupus erythematosus condition model mice so as not to generate pDCs, the onset of systemic lupus erythematosus is suppressed, proving the direct involvement of pDCs in the systemic lupus erythematosus condition.
인간 BDCA-2에 대한 항체로는, 마우스 모노클로날 항체인 AC144가 알려져 있고 AC144가 BDCA-2 분자를 가교함으로써, 활성화 상태에 있는 pDCs를 억제할 수 있는 것이 보고되어 있다. 구체적으로는, Toll 유사 수용체 9(Toll-like receptor 9, TLR 9)에 대한 리간드로 자극된 pDCs로부터 유도되는 IFN-α의 생성을 AC144를 이용하여 억제할 수 있는 것이 보고되어 있다. 또한, 전신 홍반 루푸스 환자의 혈청을 자극제를 이용하여 자극하는 경우, pDCs로부터 IFN-α 생성이 유도되었지만, 이 또한 AC144를 이용하여 억제할 수 있는 것이 보고된 바 있다.AC144, a mouse monoclonal antibody, is known as an antibody against human BDCA-2, and it has been reported that AC144 can inhibit pDCs in an activated state by cross-linking BDCA-2 molecules. Specifically, it has been reported that the production of IFN-α induced from pDCs stimulated with a ligand for Toll-like receptor 9 (TLR 9) can be suppressed using AC144. In addition, it has been reported that when the serum of a patient with systemic lupus erythematosus was stimulated using a stimulant, production of IFN-α was induced from pDCs, but this could also be suppressed using AC144.
그러므로 정신 홍반 루푸스를 포함한 자가면역질환의 치료를 위하여, BDCA-2를 특이적으로 인식하고, pDCs의 IFN-α 생성을 효과적으로 억제할 수 있는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다.Therefore, for the treatment of autoimmune diseases, including mental lupus erythematosus, there is a need to develop new substances that can specifically recognize BDCA-2 and effectively inhibit the production of IFN-α by pDCs.
본 발명자들은 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid Dendritic cell, pDC)의 비정상적인 증가로 인한 질병을 치료할 수 있는 물질을 개발하던 중, BDCA-2에 특이적으로 결합하는 신규한 항체를 발굴하고, 이를 기반으로 BDCA-2 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR), 이를 발현하는 CAR-T세포, 키메라 항체 및 인간화 항체를 제작하였으며 각각의 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.While developing a substance that can treat diseases caused by an abnormal increase in plasmacytoid dendritic cells (pDC), the present inventors discovered a novel antibody that specifically binds to BDCA-2, and based on this, BDCA-2-specific chimeric antigen receptor (CAR), CAR-T cells expressing it, chimeric antibodies, and humanized antibodies were produced, and the activity of each was confirmed to complete the present invention.
따라서 본 발명의 목적은 BDCA-2(Blood dendritic cell antigen 2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.Therefore, the purpose of the present invention is to provide an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 (Blood dendritic cell antigen 2).
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector containing the nucleic acid according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide host cells transfected with the recombinant expression vector according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 BDCA-2 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a BDCA-2 specific chimeric antigen receptor (CAR).
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide host cells transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide transformed T cells expressing the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 BDCA-2에 대한 키메라 항체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a chimeric antibody against BDCA-2.
본 발명의 또 다른 목적은 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a humanized antibody against BDCA-2.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; or providing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Alternatively, a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 is provided.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Alternatively, host cells transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 are provided.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a chimeric antibody against BDCA-2 or a humanized antibody against BDCA-2 according to the present invention.
본 발명의 또 다른 목적은 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, BDCA-2(Blood dendritic cell antigen 2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 (Blood dendritic cell antigen 2), including a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other objects, the present invention provides a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides host cells transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding an antibody that specifically binds to BDCA-2 or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention. .
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention includes the steps of culturing the host cell according to the present invention to produce an antibody; and isolating and purifying the produced antibody. A method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 is provided.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일쇄 가변 단편(scFv)를 포함하는, BDCA-2 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and a single-chain variable fragment (scFv) containing a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It provides a BDCA-2 specific chimeric antigen receptor (CAR).
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a nucleic acid encoding the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 포함하는, 재조합 발현벡터를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 포함하는, 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a host cell transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공한다.In addition, to achieve the above-mentioned other object, the present invention provides transformed T cells expressing the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 BDCA-2에 대한 키메라 항체를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10; And a chimeric antibody against BDCA-2 comprising a heavy chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is provided.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a light chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; and a heavy chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Alternatively, nucleic acids encoding humanized antibodies against BDCA-2 are provided.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Alternatively, a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 is provided.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Alternatively, host cells transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 are provided.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, BDCA-2에 대한 키메라 항체 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체의 제조방법을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; or producing an antibody by culturing a host cell transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2; It provides a method for producing a chimeric antibody against BDCA-2 or a humanized antibody against BDCA-2, comprising the step of isolating and purifying the produced antibody.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체; BDCA-2 특이적 CAR; BDCA-2 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포; BDCA-2에 대한 키메라 항체; 및 BDCA-2에 대한 인간화 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, in order to achieve the above other object, the present invention provides an antibody that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention; BDCA-2 specific CAR; Transduced T cells expressing BDCA-2 specific CAR; Chimeric antibody against BDCA-2; It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases, comprising at least one selected from the group consisting of humanized antibodies against BDCA-2.
본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 신규한 항체는 공지된 항체와 유사할 정도로 BDCA-2를 인식하고, 인간 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid Dendritic cell, pDC)의 표면으로부터의 BDCA-2의 내재화를 매개하여 I형 인터페론의 발현을 억제하는 효과를 보이며, 상기 효과가 공지된 항체보다 뛰어남을 확인하였다. 더불어 상기 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 기반으로 제작한 CAR, 상기 CAR를 발현하는 T세포는 우수한 pDC 제거능을 보였으며, 상기 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 기반으로 제작한 키메라 항체와 인간화 항체는 인간 BDCA-2를 발현하는 세포와 원숭이 BDCA-2를 발현하는 세포 모두 결합할 수 있음을 확인한 바, 전신성 홍반성 낭창(Lupus)과 같은 자가면역질환의 예방 또는 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.The novel antibody that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention recognizes BDCA-2 to a degree similar to known antibodies and binds to BDCA-2 from the surface of human plasmacytoid dendritic cells (pDC). It was confirmed that it was effective in suppressing the expression of type I interferon by mediating the internalization of 2, and that the effect was superior to that of known antibodies. In addition, CAR produced based on an antibody that specifically binds to BDCA-2 and T cells expressing the CAR showed excellent pDC removal ability, and CAR produced based on an antibody that specifically binds to BDCA-2 It has been confirmed that chimeric antibodies and humanized antibodies can bind to both cells expressing human BDCA-2 and cells expressing monkey BDCA-2, for the prevention or treatment of autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (Lupus). It can be useful.
도 1은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 신규한 항체(201A)와 공지된 항체인 AC144의 BDCA-2 인식 효과를 확인 및 비교한 결과이다.
도 2는 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 TLR7 및 TLR9 활성화제를 처리하고, 이의 IFN-α 분비를 확인한 결과이다.
도 3은 PBMC에 TLR7 및 TLR9 활성화제를 처리하고, 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 신규한 항체(201A) 및 공지된 항체인 AC144를 처리한 후, IFN-α의 분비를 확인한 결과이다.
도 4 및 도 5는 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 대해 TLR7 및 TLR9 활성화제를 처리하고, 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 신규한 항체를 처리한 후, 세포 표면의 BDCA-2를 발현하는 세포를 확인한 결과이다.
도 6은 BDCA-2를 타겟하는 CAR-T의 생산을 위한 CAR 구조체의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 7은 BDCA-2를 타겟하는 CAR 렌티바이러스를 세포에 형질도입한 후, CAR 발현을 확인한 세포(A)와 BDCA-2 항원 발현을 확인한 세포(B)를 다양한 비율로 혼합하고 공동배양한 후, CAR 발현 세포의 활성화 여부를 확인(C)한 결과이다.
도 8은 BDCA-2를 타겟하는 CAR-T 세포를 생산하고, 이의 CAR 발현을 확인(A), CAR-T세포와 BDCA-2 항원 발현 세포를 4시간 동안 공동 배양한 후 배양 배지 내의 IFN-γ(Interferon-gamma)의 농도 측정(B), 공동 배양 24시간 후 IFN-γ의 농도를 측정(C)한 결과이다.
도 9는 BDCA-2를 타겟하는 CAR-T 세포의 pDC 제거능을 확인하기 위하여, PBMC로부터 pDC를 농축(A), 본 발명에 따른 CAR를 발현하는 CAR-T세포(B)에 대한 결과로, 상기 PBMC 및 CAR-T세포는 동일 지원자로부터 유래하였다.
도 10은 BDCA-2를 타겟하는 CAR-T 세포의 pDC 제거능을 확인하기 위하여, 농축된 pDC와 본 발명에 따른 CAR-T를 4시간동안 공동배양한 후 pDC가 차지하는 %(A)와 CAR-T가 차지하는 %(B)를 확인한 결과이다. 이때 CD123와 BDCA-2 항체로 염색하여 CAR-T세포에 의하여 pDC 집단에 변화가 발생하는지 확인하였다.
도 11은 BDCA-2를 타겟하는CAR-T 세포가 pDC에 의해 활성화되는지를 확인하기 위하여, 농축된 pDC와 본 발명에 따른 CAR-T를 4시간동안 공동배양한 후 IFN-γ의 분비를 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체와 BDCA-2에 대한 인간화 항체의 크기를 확인한 결과이다.
도 13은 확립한 원숭이(Cynomolgus monkey) BDCA-2 유전자를 발현하는 세포주에 있어서, 발현 벡터에 포함된 GFP 형광을 확인한 결과이다.
도 14는 확립한 원숭이 BDCA-2 유전자를 발현하는 세포주에 있어서, 공지된 항체를 이용해 염색한 후, 원숭이 BDCA-2 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체 및 인간화 항체를 인간 BDCA-2를 발현하는 세포에 다양한 농도로 처리하고 인간 BDCA-2에 결합하는지 확인한 결과이다.
도 16은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체 및 인간화 항체를 원숭이 BDCA-2를 발현하는 세포에 다양한 농도로 처리하고 원숭이 BDCA-2에 결합하는지 확인한 결과이다.Figure 1 shows the results of confirming and comparing the BDCA-2 recognition effect of a novel antibody (201A) that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention and AC144, a known antibody.
Figure 2 shows the results of treating peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with TLR7 and TLR9 activators and confirming their secretion of IFN-α.
Figure 3 shows the secretion of IFN-α after treating PBMC with TLR7 and TLR9 activators, a novel antibody (201A) that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention, and AC144, a known antibody. This is the confirmed result.
Figures 4 and 5 show peripheral blood mononuclear cells (PBMC) treated with TLR7 and TLR9 activators and a novel antibody specifically binding to BDCA-2 according to the present invention; This is the result of confirming cells expressing BDCA-2 on the cell surface.
Figure 6 is a schematic diagram showing the structure of the CAR construct for the production of CAR-T targeting BDCA-2.
Figure 7 shows after transducing CAR lentivirus targeting BDCA-2 into cells, cells confirming CAR expression (A) and cells confirming BDCA-2 antigen expression (B) were mixed and co-cultured at various ratios. , This is the result of confirming the activation of CAR expressing cells (C).
Figure 8 shows the production of CAR-T cells targeting BDCA-2 and confirmation of their CAR expression (A). After co-culturing CAR-T cells and BDCA-2 antigen-expressing cells for 4 hours, the IFN- in the culture medium This is the result of measuring the concentration of γ (Interferon-gamma) (B) and the concentration of IFN-γ after 24 hours of co-culture (C).
Figure 9 shows the results of pDC enrichment from PBMC (A) and CAR-T cells expressing CAR according to the present invention (B) to confirm the pDC removal ability of CAR-T cells targeting BDCA-2. The PBMC and CAR-T cells were derived from the same volunteer.
Figure 10 shows the % (A) occupied by pDC and the CAR- This is the result of checking the %(B) occupied by T. At this time, staining was performed with CD123 and BDCA-2 antibodies to confirm whether changes occurred in the pDC population due to CAR-T cells.
Figure 11 shows the secretion of IFN-γ after co-culturing concentrated pDC and CAR-T according to the present invention for 4 hours to confirm whether CAR-T cells targeting BDCA-2 are activated by pDC. It is a result.
Figure 12 shows the results of confirming the sizes of the chimeric antibody against BDCA-2 and the humanized antibody against BDCA-2 according to the present invention.
Figure 13 shows the results of confirming the GFP fluorescence contained in the expression vector in the established cell line expressing the cynomolgus monkey BDCA-2 gene.
Figure 14 shows the results of confirming the expression of monkey BDCA-2 after staining with a known antibody in an established cell line expressing the monkey BDCA-2 gene.
Figure 15 shows the results of treating cells expressing human BDCA-2 with the chimeric and humanized antibodies against BDCA-2 according to the present invention at various concentrations and confirming whether they bind to human BDCA-2.
Figure 16 shows the results of treating cells expressing monkey BDCA-2 with the chimeric and humanized antibodies against BDCA-2 according to the present invention at various concentrations and confirming whether they bind to monkey BDCA-2.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, BDCA-2(Blood dendritic cell antigen 2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.The present invention provides a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 (Blood dendritic cell antigen 2), including a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 BDCA-2는 영장류의 BDCA-2이고, 상기 영장류는 인간, 원숭이, 침팬지, 고릴라 또는 오랑우탄이고, 보다 바람직하게는 인간 또는 원숭이이다.In a preferred embodiment of the present invention, the BDCA-2 is a primate BDCA-2, and the primate is a human, a monkey, a chimpanzee, a gorilla or an orangutan, and more preferably a human or a monkey.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄로 이루어진 것을 특징으로 한다.In the present invention, the antibody is characterized in that it consists of a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
본 발명에 있어서, 용어 "항체(antibody)"는 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항-BDCA-2 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.In the present invention, the term “antibody” refers to an anti-BDCA-2 antibody that specifically binds to BDCA-2. The scope of the present invention includes not only complete antibody forms that specifically bind to BDCA-2, but also antigen-binding fragments of the antibody molecule.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.A complete antibody has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, with each light chain connected to the heavy chain by a disulfide bond.
본 발명에 있어서, 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.In the present invention, the term "heavy chain" refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH and three constant region domains CH1, CH2, and CH3, including an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen, and This means all fragments of this. In addition, the term "light chain" as used herein refers to a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL containing an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It all means.
본 발명에 있어서, 용어 "항원 결합 단편"은 상술한 온전한 항체의 일부를 일컫는 것으로, 길이면에서 온전한 항체의 아미노산 서열보다 하나 이상의 서열이 짧은 서열이다. 기능적인 면에서는 온전한 항체 또는 모(parent) 항체의 적어도 일부 활성 또는 기능을 포함하는 것으로 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term “antigen-binding fragment” refers to a portion of the above-described intact antibody, and is a sequence that is at least one sequence shorter in length than the amino acid sequence of the intact antibody. In terms of functionality, it contains at least some activities or functions of an intact antibody or parent antibody, such as Fab, F(ab) 2 , Fab', F(ab') 2 , F(ab') 3 , Fd, Fv. and domain antibodies, but are not limited thereto.
항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab‘)2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.Among antibody fragments, Fab has a structure that includes the variable regions of the light and heavy chains, the constant region of the light chain, and the first constant region (CH1) of the heavy chain, and has one antigen binding site. Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain. F(ab') 2 is generated when the cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
상기 Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.The Fv corresponds to the minimum antibody fragment containing only the heavy chain variable region and the light chain variable region. Double-chain Fv (two-chain Fv) is a non-covalent bond that connects the heavy chain variable region and light chain variable region, and single-chain Fv (single-chain Fv, scFv) generally connects the heavy chain variable region and the light chain variable region through a peptide linker. The regions can be covalently linked or linked directly at the C-terminus to form a dimer-like structure, such as double-chain Fv. These antibody fragments can be created using proteolytic enzymes (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the complete antibody with papain, and F(ab') 2 can be obtained by digestion with pepsin) or genetic recombination technology. It can be produced using .
상기 "Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다. 상기 "Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.The “Fv” fragment is an antibody fragment that contains the complete antibody recognition and binding site. This region is a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain. The “Fab” fragment includes the variable and constant domains of the light chain and the variable and first constant domains of the heavy chain (CH1). F(ab') 2 antibody fragments generally comprise a pair of Fab' fragments covalently linked by a cysteine in the hinge region present at the C-terminus of the Fab' fragments.
본 발명의 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체일 수 있다. 용어 “모노클로날 항체” 또는 “단일클론 항체”는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.The antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 of the present invention may be a monoclonal antibody. The term “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of single molecular composition obtained from a population of substantially identical antibodies, and a monoclonal antibody exhibits a single binding specificity and affinity for a specific epitope.
모노클로날 항체는 골수종 세포를 면역화된 포유류 유래의 비장세포와 융합하여 제조하는 것을 기본으로 하는 것으로 당업계에 다양한 공지된 방법으로 제조될 수 있다.Monoclonal antibodies are produced by fusing myeloma cells with spleen cells derived from immunized mammals, and can be produced by various methods known in the art.
본 발명에 따른 항체는 구체적 목적에 따라, 추가적으로, 치료제, 프로드럭(prodrug), 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 개질제, 약물 및 PEG(polyethylene glycol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 기능적 물질과 컨쥬게이션되어 제공될 수 있다. 또한, 컨쥬게이션 되는 물질의 종류에 따라 다양한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.Depending on the specific purpose, the antibody according to the present invention may additionally be a functional substance selected from the group consisting of therapeutic agents, prodrugs, peptides, proteins, enzymes, viruses, lipids, biological modifiers, drugs, and PEG (polyethylene glycol). It may be provided in conjugation with. Additionally, it can be manufactured using various methods depending on the type of material being conjugated.
상기 치료제, 프로드럭, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 개질제 및 약물은 목적의 효과를 달성할 수 있는 한, 당업계에서 통상적으로 이용되는 임의의 것들을 이용할 수 있다.The therapeutic agents, prodrugs, peptides, proteins, enzymes, viruses, lipids, biological modifiers and drugs may be any commonly used in the art as long as they can achieve the desired effect.
본 발명에 있어서, 용어 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항원 결합 단편의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1x10-5 M 미만 또는 1x10-6 M 미만 또는 1x10-7 M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.In the present invention, the term “binding” or “specific binding” refers to the affinity of the antibody or antigen-binding fragment for the antigen. In antigen-antibody binding, “specific binding” can typically be distinguished from non-specific background binding if the dissociation constant (Kd) is less than 1x10 -5 M or less than 1x10 -6 M or less than 1x10 -7 M. Specific binding can be detected by methods known in the art, such as ELISA, SPR (Surface plasmon resonance), immunoprecipitation, coprecipitation, etc., and non-specific binding and specific binding can be distinguished. Include an appropriate control group for differentiation.
상술한 바와 같은 온전한 항체 또는 그 단편을 포함하는 본 발명의 항체는 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.The antibodies of the present invention, including intact antibodies or fragments thereof as described above, may exist as multimers such as dimers, trimers, tetramers, and pentamers that contain at least part of the antigen-binding ability of the monomer. These multimers also include homomultimers and heteromultimers. Antibody multimers have superior antigen-binding ability compared to monomers because they contain multiple antigen-binding sites. Antibody multimers also facilitate the production of multifunctional (bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) antibodies.
상기 "다기능성"이란, 두 가지 이상의 활성 또는 기능 (예를 들면 항원결합능, 효소 활성, 리간드 또는 수용체 결합능)을 갖는 항체를 일컫는 것으로, 예를 들면 본원의 항체는 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드 예를 들면 루시퍼라제, 아세틸트랜스퍼라제, 갈락토시다제 등과 결합될 수 있다. 다기능성 항체는 또한 다가성(multivalent) 또는 다특이성(bispecific, trispecific, 등) 형태의 항체를 포함한다.The term “multifunctionality” refers to an antibody having two or more activities or functions (e.g., antigen-binding ability, enzyme activity, ligand or receptor-binding ability). For example, the antibody herein is a polypeptide with enzyme activity, such as For example, it can be combined with luciferase, acetyltransferase, galactosidase, etc. Multifunctional antibodies also include antibodies in multivalent or multispecific (bispecific, trispecific, etc.) forms.
더불어 본 발명은 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 분리하여 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다.In addition, the present invention provides a nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2. An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 can be recombinantly produced by isolating the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
핵산은 예를 DNA, cDNA, RNA, 또는 재조합 또는 합성된 DNA 또는 RNA를 포함한다. 한 구현예에서, 핵산 분자는 cDNA이다. 핵산은 또한 상응하는 유전체(genomic DNA) 또는 그 단편일 수 있다. 본원에 따른 항체 또는 그 일부 또는 그 단편을 코딩하는 핵산 서열을 아미노산을 코딩하는 핵산서열의 중첩성 (redundancy)으로 인하여 상이할 수 있으며, 이러한 서열도 본원에 포함된다.Nucleic acids include, for example, DNA, cDNA, RNA, or recombinant or synthesized DNA or RNA. In one embodiment, the nucleic acid molecule is cDNA. Nucleic acids may also be the corresponding genomic DNA or fragments thereof. The nucleic acid sequence encoding the antibody or part or fragment thereof according to the present application may be different due to redundancy in the nucleic acid sequence encoding amino acids, and such sequences are also included herein.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, 항체와 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리코뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 또한 본 발명은 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. The DNA encoding the antibody can be easily isolated or synthesized using conventional molecular biology techniques (for example, by using an oligonucleotide probe that can specifically bind to the antibody and the DNA encoding the heavy and light chains). This can be done by isolating the nucleic acid and inserting it into a replicable vector for further cloning (DNA amplification) or further expression. Based on this, the present invention also provides a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding an antibody that specifically binds to BDCA-2 or an antigen-binding fragment thereof.
본 발명에 있어서, 용어 "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.In the present invention, the term "vector" refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell, including viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, adeno-associated virus vectors, etc. Includes. Components of a vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more antibiotic resistance marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Nucleic acids encoding antibodies are operably linked, such as promoter and transcription termination sequences.
상기 "작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.The term “operably linked” refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is connected to the other nucleic acid. It regulates the transcription and/or translation of the sequence.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.When a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of advancing transcription (e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pLλ promoter, pRλ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.), a ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription/translation termination sequence. Additionally, for example, in the case of eukaryotic cells as hosts, promoters derived from the genome of mammalian cells (e.g., metallothionein promoter, β-actin promoter, human heroglobin promoter, and human muscle creatine promoter) or mammalian Promoters derived from viruses (e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV, Promoters of Moloney virus (promoters of Epstein-Barr virus (EBV) and promoters of Rouss sarcoma virus (RSV)) can be used and generally have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.In some cases, the vector may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom. Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.The vector contains an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, for ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin, and tetracycline. There is a resistance gene.
더불어 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 일실시예에서는 293T 세포를 숙주세포로 사용하였다. 물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는 데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. In addition, the present invention provides host cells transfected with the above recombinant expression vector. Host cells used to produce the antibodies of the present invention may be prokaryotic, yeast, or higher eukaryotic cells, but are not limited thereto. Additionally, hosts with high efficiency of introducing DNA and high expression efficiency of introduced DNA are usually used. Known eukaryotic and prokaryotic hosts such as Escherichia coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi and yeast, insect cells such as Spodoptera frugiperda (SF9), animal cells such as CHO and mouse cells, COS 1, COS 7, African green monkey cells such as BSC 1, BSC 40 and BMT 10, and tissue cultured human cells are examples of host cells that can be used. In one embodiment of the present invention, 293T cells were used as host cells. Of course, it should be understood that not all vectors and expression control sequences are equally functional in expressing the DNA sequence of the present invention. Likewise, not all hosts perform equally well for the same expression system.
그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.However, those skilled in the art can make an appropriate selection among various vectors, expression control sequences, and hosts without excessive experimental burden and without departing from the scope of the present invention. For example, when choosing a vector, the host must be considered, because the vector must replicate within it. The copy number of the vector, the ability to control copy number and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, should also be considered. When selecting an expression control sequence, various factors must be considered. For example, the relative strength of the sequences, their controllability and their compatibility with the DNA sequences of the invention should be considered, especially in relation to possible secondary structures. The single cell host must be prepared by the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the present invention, the secretion characteristics, the ability to correctly fold the protein, the culture and fermentation requirements, and the product encoded by the DNA sequence of the present invention from the host. It must be selected taking into account factors such as ease of purification. Within these parameters, one skilled in the art can select various vector/expression control sequence/host combinations capable of expressing the DNA sequence of the present invention in fermentation or large-scale animal culture.
상기 “형질감염”은 “형질전환”을 의미하는 것일 수 있다. 상기 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. The term “transfection” may mean “transformation.” The term “transformation” means introducing DNA into a host so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or through completion of chromosomal integration.
또한 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of culturing the host cells to produce antibodies; and isolating and purifying the produced antibody. A method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 is provided.
상기 숙주세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.The host cells can be cultured in various media. Any commercially available medium can be used as a culture medium without limitation. All other necessary supplements known to those skilled in the art may be included in suitable concentrations. Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are already used with host cells selected for expression and will be clear to those skilled in the art.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment thereof can be recovered by, for example, centrifugation or ultrafiltration to remove impurities, and the resulting product can be purified using, for example, affinity chromatography. Additional other purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, etc.
또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일쇄 가변 단편(scFv)를 포함하는, BDCA-2 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 제공한다.Additionally, the present invention provides a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and a single-chain variable fragment (scFv) containing a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It provides a BDCA-2 specific chimeric antigen receptor (CAR).
상기 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 (GGGGS)m 링커로 연결될 수 있으며, 상기 m은 1 내지 10인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 m은 1 내지 5일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 링커의 m은 3으로, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.The light chain variable region and the heavy chain variable region of the single chain variable fragment (scFv) may be connected by a (GGGGS)m linker, where m is 1 to 10. Preferably, m may be 1 to 5, and more preferably, m of the linker may be 3 and may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
본 발명의 바람직한 구체예로서, 상기 scFv는 경쇄 가변영역, 링커 및 중쇄 가변영역이 순차적으로 연결될 수 있고, 상기 scFv는 중쇄 가변영역, 링커 및 경쇄 가변영역이 순차적으로 연결될 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the scFv may have a light chain variable region, a linker, and a heavy chain variable region sequentially linked, and the scFv may have a heavy chain variable region, a linker, and a light chain variable region sequentially linked.
따라서 상기 scFv는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.Therefore, the scFv may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
상기 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv는 서열번호 8로 표시되는 염기서열에 암호화되고, 상기 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv는 서열번호 9로 표시되는 염기서열에 암호화될 수 있다.The scFv containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is encoded in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the scFv containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is encoded in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. It can be.
더불어 본 발명의 BDCA-2 특이적 CAR는 신호 펩티드, 줄기 도메인, 막 관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.In addition, the BDCA-2 specific CAR of the present invention may further include one or more selected from the group consisting of a signal peptide, stem domain, transmembrane domain, and intracellular signaling domain.
바람직하게는 본 발명의 BDCA-2 특이적 CAR는 신호 펩티드, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일쇄 가변 단편(scFv), 줄기 도메인, 막 관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인이 순차적으로 연결될 수 있다.Preferably, the BDCA-2 specific CAR of the present invention includes a signal peptide, a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and a single chain variable fragment (scFv) including a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a stem domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain may be sequentially linked.
본 발명에 있어서, 상기 신호 펩티드(signal sequence)는 초기 단백질을 소포체로 보내는 역할을 하며, 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, CD8, CD28, GM-CSF, CD4 및 CD137로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명에서는 CD8 유래 신호 펩티드를 사용하였다.In the present invention, the signal peptide (signal sequence) serves to send the nascent protein to the endoplasmic reticulum, and any polypeptide known to have the same or similar function as the above can be used without limitation regardless of whether it is from a natural or synthetic source. It is not limited thereto, but may be one or more selected from the group consisting of CD8, CD28, GM-CSF, CD4, and CD137. In the present invention, a signal peptide derived from CD8 was used.
본 발명에 있어서, 용어 “줄기 도메인"은 막 관통 도메인을 본 발명의 scFv에 연결하는 기능을 하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28 및 CD8 힌지로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 CD8 힌지 도메인을 사용하였다. In the present invention, the term “stem domain” refers to any polypeptide that functions to link the transmembrane domain to the scFv of the present invention. If the polypeptide is known to have the same or similar function as the above, it may be from a natural or synthetic source. It can be used without limitation regardless of origin. It is not limited thereto, but may be one selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28, and CD8 hinge. One embodiment of the present invention In the example, the CD8 hinge domain was used.
본 발명에 있어서, 용어 “막 관통 도메인”은 본 발명에 따른 CAR가 세포의 표면 막 상에서 발현되도록 하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명에 개시된 CAR에 적합한 막 관통 도메인은 (a) 세포, 예를 들어, 면역 세포, 예컨대, 예를 들어, 비제한적으로, 림프구 세포 또는 자연 킬러(NK) 세포의 표면에서 발현되는 능력, 및 (b) 미리 규정된 타겟 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 지시하기 위해서 본 발명에 따른 scFv 및 세포내 신호전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다. 막 관통 도메인 또한 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, CD40, DAP10, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1, TNFSF14, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD154, T 세포 수용체의 알파 쇄, T 세포 수용체의 베타 쇄 및 T 세포 수용체의 제타 쇄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 CD8α 막 관통 도메인을 사용하였다.In the present invention, the term “transmembrane domain” refers to any polypeptide that allows the CAR according to the present invention to be expressed on the surface membrane of a cell. Suitable transmembrane domains for CARs disclosed herein include (a) the ability to be expressed on the surface of cells, such as immune cells, such as, but not limited to, lymphoid cells or natural killer (NK) cells, and (b) has the ability to interact with the scFv and intracellular signaling domains according to the invention to direct the cellular response of immune cells against predefined target cells. The transmembrane domain can also be used without limitation, regardless of whether it is from a natural or synthetic source, as long as it is a polypeptide known to have the same or similar function as the above. However, it is not limited to FcγR, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, CD40, DAP10, MHC class I molecule, TNF receptor protein, Immunoglobulin-like protein , cytokine receptor, integrin, SLAM protein, activated NK cell receptor, BTLA, Toll ligand receptor, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a , LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile ), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 specific ligand, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD8, Ig alpha (CD79a), IL-2Rγ, IL- 7Rα, PD-1, TNFSF14, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD154, alpha chain of T cell receptor, beta chain of T cell receptor and zeta chain of T cell receptor. It may be one or more types selected from the group consisting of. In one embodiment of the present invention, the CD8α transmembrane domain was used.
본 발명에 있어서, 용어 “세포내 신호전달 도메인"은 효과기 신호 기능 신호를 전송하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 이는 본 발명에 따른 scFv가 표적에 결합된 후, 세포내 신호전달을 담당하여 T세포 활성화를 야기한다. 세포내 신호전달 도메인 또한, 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. In the present invention, the term “intracellular signaling domain” refers to the portion of a protein that transmits effector signal function signals and instructs cells to perform specialized functions. This means that after the scFv according to the present invention binds to the target, It is responsible for intracellular signaling and causes T cell activation.Intracellular signaling domain.In addition, any polypeptide known to have the same or similar function as the above can be used without limitation, regardless of whether it is from a natural or synthetic source.
이에 제한되는 것은 아니나, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88, DAP10, DAP12, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1 및 TNFSF14로 이루어진 군에서 선택된 어느 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 4-1BB(CD137) 및 CD3ζ를 사용하였다.Although not limited thereto, the intracellular signaling domains include CD3ζ, FcγR, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88, DAP10, DAP12, MHC class I molecule, TNF receptor protein, Immunoglobulin-like protein, cytokine receptor, integrin, SLAM protein, activated NK cell receptor, BTLA, Toll ligand receptor, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM- 1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 ( NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 specific ligand, CD247 , CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD8, Ig alpha (CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1, and TNFSF14. In one example of the present invention, 4-1BB (CD137) and CD3ζ were used.
또한 본 발명의 BDCA-2 특이적 CAR는 본 발명에 따른 BDCA-2에 결합하는 scFv의 발현 확인 또는 정제를 위한 태그 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 이는 공지된 태그 펩타이드라면 제한없이 사용가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 플래그 펩타이드(Flag peptide)(DYKDDDDK)를 사용하였다.Additionally, the BDCA-2 specific CAR of the present invention may further include a tag peptide for confirming or purifying the expression of scFv binding to BDCA-2 according to the present invention. Any known tag peptide can be used without limitation, and in one embodiment of the present invention, Flag peptide (DYKDDDDK) was used.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 분리하여 BDCA-2 특이적 CAR를 재조합적으로 생산할 수 있다.In addition, the present invention provides a nucleic acid encoding the BDCA-2 specific CAR according to the present invention. The BDCA-2-specific CAR can be recombinantly produced by isolating the nucleic acid encoding the BDCA-2-specific CAR of the present invention.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 암호화하는 핵산을 포함하는, 재조합 발현벡터를 제공한다. 더불어 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.Additionally, the present invention provides a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding the BDCA-2 specific CAR according to the present invention. In addition, the present invention provides host cells transfected with the above recombinant expression vector.
상기 핵산, 재조합 발현벡터 및 숙주세포 등의 중복된 내용은 본 명세서의과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Redundant information regarding nucleic acids, recombinant expression vectors, and host cells is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공한다.In addition, the present invention provides transformed T cells expressing the BDCA-2 specific CAR according to the present invention.
상기 T 세포는 알파 베타 T세포, 감마 델타 T세포 또는 NKT세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 T세포는 동종 T세포, 자가 T세포, 조작된 자가 T세포 (eACT), 또는 종양-침윤 림프구 (TIL)일 수 있다.The T cells may be alpha beta T cells, gamma delta T cells, or NKT cells. Preferably, the T cells may be allogeneic T cells, autologous T cells, engineered autologous T cells (eACT), or tumor-infiltrating lymphocytes (TIL).
또한 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 이용하여 자가면역질환의 치료 및 연구 목적의 키메라 항체 또는 인간화 항체를 용이하게 생산할 수 있음에 기술적 특징이 있다.In addition, the present invention uses a light chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the antibody that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention. Therefore, it has a technical feature in that it can easily produce chimeric antibodies or humanized antibodies for treatment and research purposes of autoimmune diseases.
따라서 본 발명은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 BDCA-2에 대한 키메라 항체를 제공한다.Therefore, the present invention provides a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10; And a chimeric antibody against BDCA-2 comprising a heavy chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is provided.
상기 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 서열번호 12로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 서열번호 13으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.The light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, and the heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 13. can be encrypted by
상기 "키메라 항체"는 가변영역 즉 항원 결합 부위와 항체의 불변영역 (경쇄의 경우 CL1, 중쇄의 경우, CH1, CH2, 및 CH3 영역을 포함)의 적어도 일부가 다른 종(species)로부터 유래한 것을 의미한다. 예를 들면 가변영역은 마우스 유래이고, 불변영역은 인간 유래의 것을 포함할 수 있다. 또는 클래스전환(class switch)된 항체 예를 들면 IgG 유형에서 IgE 유형으로 전환된 항체를 또한 의미한다.The “chimeric antibody” refers to one in which at least part of the variable region, i.e., the antigen-binding site, and the constant region of the antibody (including CL1 for light chains and CH1, CH2, and CH3 regions for heavy chains) are derived from different species. it means. For example, the variable region may be of mouse origin, and the constant region may be of human origin. Alternatively, it also refers to a class switched antibody, for example, an antibody converted from an IgG type to an IgE type.
더불어 본 발명은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 제공한다.In addition, the present invention provides a light chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14; and a heavy chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
상기 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 서열번호 17로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.The light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, and the heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 17. can be encrypted by
상기 “인간화 항체"는 항체의 골격은 인간의 항체이고 CDR 영역의 일부는 원래 항체분자가 유래된 종의 CDR 중 항원에 대한 특이적 결합에 필수적인 부분만을 포함하도록 변형된 것을 의미한다. 예를 들면 원숭이, 또는 마우스 유래 항체의 CDR 중 항원에 대한 특이적 결합에 필수적인 부위를 제외한 나머지 CDR 부위와 경쇄 및 중쇄 골격은 인간의 항체로 대치된다.The “humanized antibody” means that the antibody framework is a human antibody and part of the CDR region is modified to include only the part essential for specific binding to the antigen among the CDRs of the species from which the antibody molecule was originally derived. For example, Among the CDRs of monkey- or mouse-derived antibodies, the remaining CDR regions and light and heavy chain frameworks, excluding those essential for specific binding to antigens, are replaced with human antibodies.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 제공한다.The present invention also provides a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Alternatively, a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 according to the present invention is provided.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Alternatively, a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 according to the present invention is provided.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Alternatively, host cells transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 according to the present invention are provided.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 인간화 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, BDCA-2에 대한 키메라 항체 또는 BDCA-2에 대한 인간화 항체의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; or producing an antibody by culturing a host cell transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 according to the present invention; It provides a method for producing a chimeric antibody against BDCA-2 or a humanized antibody against BDCA-2, comprising the step of isolating and purifying the produced antibody.
상기 핵산, 재조합 발현벡터 및 숙주세포 등의 중복된 내용은 본 명세서의과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Redundant information regarding nucleic acids, recombinant expression vectors, and host cells is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
한편, 본 발명에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열은 이와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.Meanwhile, in the present invention, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, and SEQ ID NO: 15 It is clear to those skilled in the art that any one or more amino acid sequences selected from the group consisting of will be limited to including mutations in amino acid sequences that exhibit equivalent biological activity. These amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc. Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substitutions shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).In introducing mutations, the hydrophobic index of the amino acid may be considered. Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); Cysteine/Cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
단백질 또는 펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.The hydrophobic amino acid index is very important in imparting interactive biological functions to proteins or peptides. It is a known fact that similar biological activity can be maintained only when substituted with an amino acid having a similar hydrophobic index. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, substitution is made between amino acids showing a difference in the hydrophobicity index, preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). Meanwhile, it is also well known that substitution between amino acids with similar hydrophilicity values results in proteins or peptides with equivalent biological activity. The following hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Asphaltate (+3.0±1); glutamate (+3.0±1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); threonine (-0.4); Proline (-0.5±1); Alanine (-0.5); histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.When introducing a mutation with reference to the hydrophilicity value, substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophilicity value, preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Amino acid exchanges in proteins or peptides that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art. The most common exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 14 및 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.Considering the mutations having the above-mentioned biological equivalent activity, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 11 of the present invention , any one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 are interpreted to also include sequences showing substantial identity with the sequences described in the sequence listing. The above substantial identity refers to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, and sequences of the present invention. When at least one amino acid sequence selected from the group consisting of number 15 and any other sequence are aligned to match as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art, at least 80% or more It means a sequence showing homology, more preferably 90% or more homology. As an alignment method for sequence comparison, any method known in the art can be used without limitation.
또한 본 발명은 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물”이란 염기의 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)의 결과로, 상기 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.Additionally, the present invention may include functional equivalents of one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17. The “functional equivalent” refers to SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 8 as a result of deletion, substitution, or insertion of a base. Having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more sequence homology with one or more base sequences selected from the group consisting of 17, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17. It refers to a polynucleotide that exhibits substantially the same physiological activity as a polynucleotide represented by one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16. The “% sequence homology” for a polynucleotide is determined by comparing a comparison region with two optimally aligned sequences, where a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (additions or deletions) for the optimal alignment of the two sequences. may contain additions or deletions (i.e. gaps) compared to those that do not contain .
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 신규한 항체는 공지된 항체와 유사할 정도로 BDCA-2를 인식하는 효과를 보였고, 인간 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid Dendritic cell, pDC)의 표면으로부터의 BDCA-2의 내재화를 매개하여 I형 인터페론의 발현을 억제하는 효과를 보였다. 특히 상기 효과가 공지된 항체보다 뛰어남을 확인하였다. According to one embodiment of the present invention, the novel antibody specifically binding to BDCA-2 according to the present invention showed an effect of recognizing BDCA-2 to a degree similar to that of known antibodies, and was effective against human plasmacytoid dendritic cells ( It showed the effect of suppressing the expression of type I interferon by mediating the internalization of BDCA-2 from the surface of plasmacytoid dendritic cell (pDC). In particular, it was confirmed that the effect was superior to that of known antibodies.
더불어 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 기반으로 제작한 CAR, 상기 CAR를 발현하는 T세포는 우수한 pDC 제거능을 보였다.In addition, according to another embodiment of the present invention, CAR produced based on an antibody that specifically binds to BDCA-2 and T cells expressing the CAR showed excellent pDC removal ability.
또한 본 발명의 또다른 일실시예에 따르면, 상기 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 기반으로 제작한 키메라 항체와 인간화 항체는 인간 BDCA-2를 발현하는 세포와 원숭이 BDCA-2를 발현하는 세포 모두 결합할 수 있음을 확인하였다.In addition, according to another embodiment of the present invention, chimeric antibodies and humanized antibodies produced based on the antibody specifically binding to BDCA-2 are used in cells expressing human BDCA-2 and monkeys expressing BDCA-2. It was confirmed that all cells could bind.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체; 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR; 본 발명에 따른 형질전환된 T세포; 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 키메라 항체; 또는 본 발명에 따른 BDCA-2에 대한 인간화 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Therefore, the present invention provides an antibody that specifically binds to BDCA-2 according to the present invention; BDCA-2 specific CAR according to the present invention; Transformed T cells according to the present invention; Chimeric antibody against BDCA-2 according to the present invention; Or, it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases, comprising at least one selected from the group consisting of humanized antibodies against BDCA-2 according to the present invention.
상기 자가면역질환은 전신성 홍반성 낭창(Lupus), 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 셀리악 병(Celiac disease-sprue), IgA 결핍(IgA deficiency), 크론병(Crohn's disease), 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 궤양성 대장염, 건선, 하시모토병 및 고밀도 침착병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 전신성 홍반성 낭창(Lupus)일 수 있다.The autoimmune diseases include systemic lupus erythematosus (Lupus), type 1 diabetes, rheumatoid arthritis, celiac disease-sprue, IgA deficiency, Crohn's disease, multiple sclerosis, and Sjögren's syndrome. , scleroderma, polymyositis, chronic active hepatitis, mixed connective tissue disease, primary biliary cirrhosis, pernicious anemia, autoimmune thyroiditis, idiopathic Addison's disease, vitiligo, gluten-sensitive enteropathy, Grave's disease, myasthenia gravis, autoimmune neutropenia, Characterized by one or more types selected from the group consisting of idiopathic thrombocytopenic purpura, cirrhosis, pemphigus vulgaris, autoimmune infertility, Goodpasture syndrome, bullous pemphigoid, ulcerative colitis, psoriasis, Hashimoto's disease, and dense deposit disease, More preferably, it may be systemic lupus erythematosus (Lupus).
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. In the present invention, the pharmaceutical composition may be in the form of a capsule, tablet, granule, injection, ointment, powder, or beverage, and the pharmaceutical composition may be intended for human subjects. The pharmaceutical composition is not limited to these, but can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, and aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods. .
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, colorants, flavorings, etc. for oral administration. For injections, buffers, preservatives, and analgesics can be used. Topics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc. can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives, etc. can be used. The dosage form of the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared in various ways by mixing it with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. For example, for oral administration, it can be manufactured in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be manufactured in the form of unit dosage ampoules or multiple dosage forms. there is.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.Meanwhile, examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil may be used. In addition, fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives, etc. may be additionally included.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로도 투여될 수 있다.The route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited to these, but is oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, and topical. , sublingual or rectal. The term “parenteral” includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intra-articular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques. The pharmaceutical composition according to the present invention can also be administered in the form of a suppository for rectal administration.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효 투여량 및 투여기간은 특정 환자, 조성물에 포함된 항체의 종류 및 투여방식 등을 고려하여 목적하는 치료효과에 따라 변할 수 있으며, 환자에게 독성을 유발하지 않아야 한다. 환자별 실제 투여량은 사용되는 조성물의 활성도, 투여경로, 투여시간, 분비속도, 함께 사용하는 다른 약물, 성별, 나이, 몸무게, 전반적 건강상태, 기저질병 등과 같은 다양한 요인을 고려하여 선별해야 한다. 한 구현예에서 본 발명의 항체는 질환의 치료 또는 예방을 위해 약 1 내지 100 mg/kg 체중, 예를 들면 약 10, 20, 30, 40, 또는 50 mg/kg 체중의 양으로 투여될 수 있으나, 경우에 따라 많게는 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다.The effective dosage and administration period of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the desired therapeutic effect, taking into account the specific patient, the type of antibody contained in the composition, and the administration method, etc., and should not cause toxicity to the patient. . The actual dosage for each patient should be selected in consideration of various factors such as the activity of the composition used, administration route, administration time, secretion rate, other drugs used together, gender, age, weight, overall health, underlying disease, etc. In one embodiment, the antibody of the present invention may be administered in an amount of about 1 to 100 mg/kg body weight, for example, about 10, 20, 30, 40, or 50 mg/kg body weight for the treatment or prevention of disease. , in some cases, it may be administered in an amount of up to about 100 mg/kg.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여간격은 투여되는 항체의 반감기를 고려하여 적절한 간격 일단위, 주단위, 달 단위로 투여될 수 있다.The administration interval of the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered at appropriate intervals of daily, weekly, or monthly basis in consideration of the half-life of the administered antibody.
또한 본원 조성물은 투여 경로와 상관없이 약학적으로 허용가능한 적절한 투약 형태, 예를 들면, 수화된 형태, 예를 들면 수용액, 또는 동결건조된 형태로 제형화될 수 있다.Additionally, the composition herein may be formulated in a suitable pharmaceutically acceptable dosage form, such as a hydrated form, such as an aqueous solution, or a lyophilized form, regardless of the route of administration.
조성물을 대상체에게 투여하는 것은 분무, 주사, 연하, 주입, 착상 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 결절내, 척수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해 또는 복막내로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 환자에게 피내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. Administering the composition to a subject can be performed in any convenient manner, including nebulization, injection, swallowing, infusion, implantation, or implantation. The compositions described herein can be administered to a patient by subcutaneous, intradermal, intratumoral, intranodal, intraspinal, intramuscular, intravenous (i.v.) injection or intraperitoneally. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient by intradermal or subcutaneous injection.
본 발명의 특정 실시양태에서, 약학적 조성물에 있어서, 형질 전환된 T세포를 포함하는 경우 본 발명의 형질전환된 T 세포를 치료 수준으로 확장시키기 위해 본원에 기술된 방법 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 활성화 및 확장된 세포가 환자에게 임의의 관련된 치료 형태와 조합되어(예를 들어, 이전에 동시에 또는 후속적으로) 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 화학요법, 방사선, 항암제, 면역치료제 등의 기존 공지된 치료 방법과 조합되어 사용될 수 있다.In certain embodiments of the invention, the pharmaceutical composition, when comprising transformed T cells, uses a method described herein or known in the art to expand transformed T cells of the invention to therapeutic levels. Cells activated and expanded using other methods may be administered to a patient in combination (e.g., previously simultaneously or subsequently) with any relevant treatment form. The pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with known treatment methods such as chemotherapy, radiation, anticancer agents, and immunotherapy agents.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.The contents of the present invention described above are applied equally to each other unless they contradict each other, and implementation by a person skilled in the art with appropriate changes is also included in the scope of the present invention.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. BDCA-2(Blood dendritic cell antigen 2)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 아미노산 서열 분석Example 1. Amino acid sequence analysis of a monoclonal antibody that specifically binds to BDCA-2 (Blood dendritic cell antigen 2)
Biolegend 사에서 인간 BDCA-2에 결합하는 마우스 항체를 구입하고, Rapid Novor 사의 단일클론 시퀀싱 솔루션인 REmAb®을 이용하여 아미노산 시퀀싱을 수행하였다.A mouse antibody binding to human BDCA-2 was purchased from Biolegend, and amino acid sequencing was performed using REmAb®, a monoclonal sequencing solution from Rapid Novor.
이를 통해 중쇄 IgG2A 및 경쇄 κ (kappa)를 포함하는 인간 BDCA-2에 결합하는 마우스 단일클론 항체 201A를 확보하였다.Through this, mouse monoclonal antibody 201A, which binds to human BDCA-2 including heavy chain IgG2A and light chain κ (kappa), was obtained.
실시예 2. BDCA-2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 특성 분석Example 2. Characterization of monoclonal antibodies specifically binding to BDCA-2
상기 실시예 1에서 확보한 인간 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 201A가 인간 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid Dendritic cell, pDC)의 표면으로부터의 BDCA-2의 내재화를 매개하여 I형 인터페론의 발현을 억제할 수 있는지 확인하였다. 먼저 건강한 두명의 지원자로부터 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리한 후 PBMC에 존재하는 pDC를 항-CD123(anti-CD123 (6H6, Biolegend))과 항-BDCA-2(anti-BDCA-2 (AC144, Miltenyi))항체로 이중염색(double staining)하여 확인하였다. Monoclonal antibody 201A, which specifically binds to human BDCA-2 obtained in Example 1, mediates internalization of BDCA-2 from the surface of human plasmacytoid dendritic cells (pDC), producing type I interferon. It was confirmed whether the expression of could be suppressed. First, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from two healthy volunteers, and pDCs present in the PBMC were treated with anti-CD123 (6H6, Biolegend) and anti-BDCA-2 (anti-BDCA-2). It was confirmed by double staining with BDCA-2 (AC144, Miltenyi) antibody.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 건강한 지원자 1(donor-1)의 경우 CD123+ BDCA-2+ 세포가 0.51%, 건강한 지원자 2(donor-2)의 경우 CD123+ BDCA-2+ 세포가 0.15% 로 존재하였다. anti-BDCA-2 (AC144, Miltenyi) 항체 대신 본 발명에 따른 201A 항체를 이용한 경우도 0.65, 0.16%로 상기와 유사한 결과를 확인하였다. 따라서 이를 통해 201A 항체가 공지된 항체인 AC144와 유사하게 BDCA-2를 인식함을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 1, in healthy volunteer 1 (donor-1), CD123+ BDCA-2+ cells were present at 0.51%, and in healthy volunteer 2 (donor-2), CD123+ BDCA-2+ cells were present at 0.15%. did. Similar results to the above were confirmed at 0.65 and 0.16% when the 201A antibody according to the present invention was used instead of the anti-BDCA-2 (AC144, Miltenyi) antibody. Therefore, it was confirmed that the 201A antibody recognizes BDCA-2 similarly to the known antibody AC144.
더불어 상기 두 지원자의 PBMC를 이용하여 pDC가 TLR(Toll-like receptor) 7번(TLR7)과 9번(TLR9)의 활성을 통해 I형 인터페론(Interferon type I)을 분비하는 지를 IFN-α ELISA (Thermo scientific)를 이용하여 확인하였다. R848 (Invivogen)을 2.5-10μM의 농도로 처리하여 TLR7을 활성화시켰고, ODN2216(Invivogen)을 0.5-2μM의 농도로 처리하여 TLR9을 활성화시켰다. 그 결과 도 2와 같이, 두 지원자의 PBMC는 R848 및 ODN2216에 있어서, 처리한 모든 농도 조건에서 높은 수준의 IFN-α를 분비함을 확인하였다.In addition, using PBMCs from the above two volunteers, we tested whether pDCs secrete type I interferon (Interferon type I) through the activation of TLR (Toll-like receptor) numbers 7 (TLR7) and 9 (TLR9) using an IFN-α ELISA (IFN-α ELISA). It was confirmed using Thermo scientific). TLR7 was activated by treatment with R848 (Invivogen) at a concentration of 2.5-10 μM, and TLR9 was activated by treatment with ODN2216 (Invivogen) at a concentration of 0.5-2 μM. As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that the PBMCs of the two volunteers secreted high levels of IFN-α in all treatment concentration conditions in R848 and ODN2216.
그 후 5 μM의 R848 또는 1 μM의 ODN2216을 처리하여 PBMC를 자극시키고 동시에 본 발명에 따른 201A 항체를 처리하여 16시간동안 반응시켰다. 이로부터 본 발명에 따른 201A 항체가 TLR7 혹은 TLR9 활성에 의한 IFN-α의 분비를 저해할 수 있는지를 확인하였다. 이때 BDCA-2의 내재화를 매개하여 TLR7 혹은 TLR9 활성에 의한 IFN-α의 분비를 저해할 수 있다고 잘 알려진 클론인 AC144 항체를 양성 대조군으로 사용하였다. Afterwards, PBMCs were stimulated by treatment with 5 μM of R848 or 1 μM of ODN2216, and at the same time, they were treated with the 201A antibody according to the present invention and reacted for 16 hours. From this, it was confirmed whether the 201A antibody according to the present invention can inhibit the secretion of IFN-α by TLR7 or TLR9 activity. At this time, the AC144 antibody, a well-known clone that can mediate the internalization of BDCA-2 and thereby inhibit the secretion of IFN-α by TLR7 or TLR9 activity, was used as a positive control.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, AC144 항체는 농도 의존적(dose-dependent)으로 R848 또는 ODN2216에 의해 유도된 IFN-α 분비를 저해하였다. AC144 항체를 처리한 실험군과 같이, 본 발명의 201A 항체를 처리한 실험군도 농도의존적으로 R848 또는 ODN2216에 의해 유도된 IFN-α 분비를 저해하는 효과를 보였다. 특히 ODN2216으로 자극된 세포의 경우에 동일한 항체 농도에서 AC144보다 저해능이 뛰어남을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 3, the AC144 antibody inhibited the secretion of IFN-α induced by R848 or ODN2216 in a dose-dependent manner. Like the experimental group treated with the AC144 antibody, the experimental group treated with the 201A antibody of the present invention also showed an effect of inhibiting the secretion of IFN-α induced by R848 or ODN2216 in a concentration-dependent manner. In particular, in the case of cells stimulated with ODN2216, it was confirmed that the inhibitory ability was superior to that of AC144 at the same antibody concentration.
상기에서 확인한 201A 항체에 의한 IFN-a의 분비 저해능이 AC144와 유사하게 pDC의 표면으로부터의 BDCA-2의 내재화를 통해 야기되는지 확인하였다. 이를 위하여 상기 실험에 있어서, 세포 배양이 끝난 시점에서 세포 표면에 존재하는 BDCA-2를 염색하여 확인하였다. 그 결과 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, CD123+ 세포 중 세포 표면에 BDCA-2를 발현하는 세포가 거의 존재하지 않음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 201A 항체가 pDC의 표면에 존재하는 BDCA-2 분자를 내재화할 수 있는 것으로 판단하였다.It was confirmed whether the inhibitory ability of the 201A antibody identified above to inhibit secretion of IFN-a was caused through internalization of BDCA-2 from the surface of pDC, similar to AC144. For this purpose, in the above experiment, BDCA-2 present on the cell surface was confirmed by staining at the end of cell culture. As a result, as shown in Figures 4 and 5, it was confirmed that there were almost no cells expressing BDCA-2 on the cell surface among CD123+ cells. Through this, it was determined that the 201A antibody according to the present invention was able to internalize the BDCA-2 molecule present on the surface of pDC.
실시예 3. BDCA-2 특이적 CAR 구조체 제작Example 3. Production of BDCA-2 specific CAR structure
BDCA-2를 발현하는 세포를 타겟하는 CAR-T를 생산하기 위하여 도 6에 나타낸 CAR 구조체를 고안하였다. BDCA-2에 결합할 수 있는 scFv(single chain variable fragment)을 T세포 표면에 발현시키기 위하여 CD8 신호 서열(signal sequence, signal seg), 힌지(hinge), 막관통 도메인(transmembrane domain, TM)이랑 융합하였고 T세포가 BDCA-2에 결합한 후 시그널을 받아 증식하기 위한 세포내 신호전달 도메인으로 41BB와 CD3Z를 융합시킨 구조를 디자인하였다. 또한 scFv의 발현을 확인할 목적으로 scFv의 N-말단(N-term)에 플래그 펩타이드(Flag peptide (DYKDDDDK))를 태깅하였다. 이들 유전자의 서열은 하기 표 1에 나타내었으며, 각 유전자를 합성하여 공지된 방법으로 렌티벡터(Lenti vector, pELPS3)에 삽입한 후 렌티바이러스를 생산하였다. 이에 있어, BDCA-2에 결합할 수 있는 scFv는 항체의 경쇄 (light chain)와 중쇄(heavy chain)의 가변영역(variable region)을 GGGGS가 세번 반복된 GGGGSGGGGSGGGGS로 구성된 링커로 연결하였으며 경쇄 (light chain)과 중쇄 (heavy chain)의 배치순서에 따라 201HL(서열번호 6), 201LH(서열번호 7)로 명명하였다.The CAR construct shown in Figure 6 was designed to produce CAR-T targeting cells expressing BDCA-2. Fusion with CD8 signal sequence (signal sequence, signal seg), hinge, and transmembrane domain (TM) to express scFv (single chain variable fragment) that can bind to BDCA-2 on the surface of T cells. A structure was designed that fused 41BB and CD3Z as an intracellular signaling domain for T cells to proliferate after binding to BDCA-2. Additionally, for the purpose of confirming the expression of scFv, Flag peptide (DYKDDDDK) was tagged at the N-terminus of scFv. The sequences of these genes are shown in Table 1 below, and each gene was synthesized and inserted into a lenti vector (pELPS3) using a known method to produce lentivirus. In this case, the scFv that can bind to BDCA-2 connects the variable region of the light chain and heavy chain of the antibody with a linker consisting of GGGGSGGGGSGGGGS with GGGGS repeated three times, and the light chain (light chain) ) and heavy chain were named 201HL (SEQ ID NO: 6) and 201LH (SEQ ID NO: 7) according to the arrangement order.
실시예 4. BDCA-2를 타겟하는 CAR 렌티바이러스 생산 및 바이러스를 이용한 CAR의 활성 확인Example 4. Production of CAR lentivirus targeting BDCA-2 and confirmation of CAR activity using virus
상기 실시예 3에서 제작한 렌티벡터를 렌티바이러스 생산에 필요한 악세서리 유전자를 가진 플라스미스 (pRSV_rev, pMD2.5G, pMD_RRE)와 함께 Lenti-X™ 293T 세포(Clonetech)를 형질주입(transfection)하였다. 이를 통해 생산된 렌티바이러스는 농축하여 역가를 측정한 후 사용 전까지 -80℃에 보관하였다. The lentivector produced in Example 3 was transfected into Lenti- The lentivirus produced through this was concentrated, the titer was measured, and then stored at -80°C until use.
상기 렌티바이러스의 CAR 발현 및 그 활성을 확인하기 위하여 NFAT reporter(luc)-Jurkat 세포(BPS Bioscience에서 구입)에 렌티바이러스를 형질도입(transduction)하고 3일 후 세포를 anti-Flag-APC (L5, Biolegend)로 염색한 후 FACS 기기를 이용하여 CAR의 발현을 확인하였다. 이때 렌티바이러스로 형질도입하지 않은 세포(UTD)를 음성 대조군으로 사용하였다(도 7 중 A 참고, 이펙터 세포(effector cell)).To confirm CAR expression and activity of the lentivirus, lentivirus was transduced into NFAT reporter (luc)-Jurkat cells (purchased from BPS Bioscience), and 3 days later, the cells were incubated with anti-Flag-APC (L5, After staining with Biolegend), the expression of CAR was confirmed using a FACS device. At this time, cells not transduced with lentivirus (UTD) were used as a negative control (see A in Figure 7, effector cells).
이를 통해 확인된 CAR가 발현된 NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포는 항원에 의해 세포가 활성화되면 루시퍼라아제(luciferase) 활성도 증가하므로, 루시퍼라아제 기질을 첨가하고 발광(luminescence)를 측정함으로써 정량화하였다. 따라서 도 7 중 A에서 CAR의 발현이 확인된 각각의 NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포 (effector 세포, 1×104 cells)를 BDCA-2 항원이 발현된 293세포(293/ BDCA-2) (도 7 중 B 참고, 타겟 세포(target cell))와 다양한 비율로 4시간 동안 배양한 후 이펙터 세포의 활성화 정도를 확인하였다. As the luciferase activity of NFAT reporter (luc)-Jurkat cells expressing the identified CAR increases when the cells are activated by antigen, luciferase substrate was added and luminescence was quantified. . Therefore, each NFAT reporter (luc)-Jurkat cell (effector cell, 1×10 4 cells) in which CAR expression was confirmed in A in Figure 7 was divided into 293 cells (293/BDCA-2) expressing BDCA-2 antigen ( After culturing with target cells (see B in Figure 7) at various ratios for 4 hours, the degree of activation of the effector cells was confirmed.
그 결과 도 7 중 C에 나타낸 바와 같이, 모든 CAR 발현 세포들이 293/ BDCA-2 세포에 의해 타겟 세포 수에 비례하여 활성화됨을 확인하였다. 반면, CAR를 발현시키지 않은 NFAT reporter(luc)- Jurkat 세포(UTD)를 이펙터 세포로 이용하였을 때에는 타겟 세포 수와 관계없이 활성화가 일어나지 않았다. 또한 동일한 293/BDCA-2 세포 수를 이용하였을 때의 각 이펙터 세포의 활성화 정도는 앞서 확인한 이펙터 세포 표면의 CAR 발현 정도에 비례하였다. As a result, as shown in C of FIG. 7, it was confirmed that all CAR-expressing cells were activated by 293/BDCA-2 cells in proportion to the number of target cells. On the other hand, when NFAT reporter (luc)-Jurkat cells (UTD), which did not express CAR, were used as effector cells, activation did not occur regardless of the number of target cells. Additionally, when using the same number of 293/BDCA-2 cells, the level of activation of each effector cell was proportional to the level of CAR expression on the surface of the effector cell previously confirmed.
따라서 본 발명에 따른 BDCA-2 특이적 CAR가 BDCA-2 항원 특이적으로 반응하여 T세포를 활성화시킬 수 있음을 확인하였다. Therefore, it was confirmed that the BDCA-2 specific CAR according to the present invention can activate T cells by reacting specifically to the BDCA-2 antigen.
이에 있어, 상기 타겟 세포는 다음과 같이 준비하였다. BDCA-2 (CLEC4C) 유전자 발현벡터(Sino Biological)를 리포펙타민(lipofectamine) 2000을 이용하여 HEK 293세포에 형질전환시킨 후 G418 400 μg/mL을 첨가한 배지에서 계대 배양하였다. 이를 통해 BDCA-2를 발현하는 세포를 선별하여 타겟 세포를 확립하였다. 선별된 타겟 세포가 BDCA-2를 발현하는지를 확인하기 위하여 anti-BDCA-2-APC (Miltenyi, AC144)를 이용하여 세포를 염색한 후, FACS로 확인하였다(도 7 중 B 참고).In this case, the target cells were prepared as follows. The BDCA-2 (CLEC4C) gene expression vector (Sino Biological) was transformed into HEK 293 cells using lipofectamine 2000, and then subcultured in medium supplemented with 400 μg/mL of G418. Through this, cells expressing BDCA-2 were selected and target cells were established. To confirm whether the selected target cells expressed BDCA-2, the cells were stained using anti-BDCA-2-APC (Miltenyi, AC144) and then confirmed by FACS (see B in Figure 7).
실시예 5. BDCA-2를 타겟하는 CAR-T 세포 생산Example 5. Production of CAR-T cells targeting BDCA-2
상기 실시예 4에서 CAR 기능을 확인한 렌티바이러스를 이용하여 CAR-T를 생산하였다. 이를 위하여 건강한 자원자로부터 혈액을 제공받아 피콜(Ficoll) 밀도구배 방법을 이용하여 공지된 절차에 따라 PBMC를 분리하였다. 분리한 PBMC를 TransAct(Miltenyi)를 포함한 배지에서 2일동안 배양하여 T 세포를 활성화시키고, 이에 렌티바이러스를 첨가한 후 회전접종(spinoculation) 방법을 이용하여 공지된 절차에 따라 형질도입을 수행하였다. 이후 IL-2(Interleukin-2)가 포함된 배양배지를 2-3일 간격으로 첨가해주며 CAR-T 세포를 증식시켰다. 배양된 세포를 anti-Flag-PE 혹은 anti-Flag-APC (L5, Biolegend)로 염색한 후 FACS 기기를 이용하여 세포 표면의 CAR 발현 여부를 확인하였다. CAR를 발현하는 세포 중 CD8+T세포가 차지하는 비율을 알아보기 위해서 anti-CD8-BV786 (SK-1, Biolegend)로 동시에 염색한 후 FACS로 분석하였다. 이때 렌티바이러스로 형질도입하지 않은 세포 (UTD)를 음성 대조군으로 사용하였다(도 8 중 A 참고, 이펙터 세포). 이를 통해 BDCA-2를 타겟하는 CAR-T 세포를 생산하였음을 확인하였다.CAR-T was produced using the lentivirus whose CAR function was confirmed in Example 4 above. For this purpose, blood was provided from a healthy volunteer and PBMCs were isolated according to a known procedure using the Ficoll density gradient method. Isolated PBMCs were cultured in medium containing TransAct (Miltenyi) for 2 days to activate T cells, and after adding lentivirus, transduction was performed according to a known procedure using a spinoculation method. Afterwards, culture medium containing IL-2 (Interleukin-2) was added every 2-3 days to proliferate CAR-T cells. Cultured cells were stained with anti-Flag-PE or anti-Flag-APC (L5, Biolegend), and then CAR expression on the cell surface was confirmed using a FACS device. To determine the proportion of CD8 + T cells among cells expressing CAR, they were simultaneously stained with anti-CD8-BV786 (SK-1, Biolegend) and analyzed by FACS. At this time, cells not transduced with lentivirus (UTD) were used as a negative control (see A in Figure 8, effector cells). Through this, it was confirmed that CAR-T cells targeting BDCA-2 were produced.
실시예 6. BDCA-2를 타겟하는 CAR-T 세포의 활성 측정Example 6. Measurement of activity of CAR-T cells targeting BDCA-2
상기 실시예 5를 통해 생산한 CAR-T 세포의 활성을 확인하였다. BDCA-2 항원이 발현된 293세포 (293/ BDCA-2, 2 × 104 cells/well)를 CAR-T 세포와 다양한 비율로 혼합하고 공동 배양 4시간, 24시간 후 배양 배지를 수거하였다. ELISA kit (Biolegend)을 이용하여 배양 배지내의 T세포가 활성화되었을 때 분비하는 IFN-γ(Interferon-gamma)의 농도를 측정하였다. The activity of CAR-T cells produced through Example 5 was confirmed. 293 cells (293/BDCA-2, 2 × 10 4 cells/well) expressing BDCA-2 antigen were mixed with CAR-T cells at various ratios, and the culture medium was collected after 4 and 24 hours of co-culture. The concentration of Interferon-gamma (IFN-γ) secreted by T cells in the culture medium when activated was measured using an ELISA kit (Biolegend).
그 결과 도 8 중 B와 같이, IFN-γ는 4시간부터 측정 가능하였으며, 24시간에는 현저히 증가하였다. 더불어 도 8 중 C와 같이, 타겟 세포 1개당 CAR-T세포의 수가 0.0625개의 비율로 첨가되었을 때도 24시간 공동 배양시 IFN-γ가 검출되었다. 반면, CAR를 발현하지 않는 UTD 세포를 첨가한 실험군은 어떠한 조건에서도 IFN-γ가 검출되지 않았다.As a result, as shown in B in FIG. 8, IFN-γ could be measured from 4 hours, and increased significantly at 24 hours. In addition, as shown in C in Figure 8, even when the number of CAR-T cells per target cell was added at a ratio of 0.0625, IFN-γ was detected during co-culture for 24 hours. On the other hand, in the experimental group added with UTD cells that do not express CAR, IFN-γ was not detected under any conditions.
실시예 7. BDCA-2를 타겟하는 CAR-T 세포의 pDC 제거능 확인Example 7. Confirmation of pDC removal ability of CAR-T cells targeting BDCA-2
본 발명에 따른 BDCA-2를 타겟하는 CAR-T 세포(201 HL CAR-T세포 및 201 LH CAR-T세포)가 pDC가 발현하는 BDCA-2를 인식하여 pDC 집단(population)를 제거할 수 있는지 확인하였다. CAR-T세포의 동종이형 효과(allogeneic effect)를 배제하기 위하여 CAR-T 세포를 생산한 지원자의 혈액으로부터 PBMC를 분리하고 이로부터 pDC 집단을 농축시켜 이를 타겟 세포로 사용하였다. 이때 형질세포양 수지상 세포 분리 키트 II (Miltenyi)를 사용하여 pDC 집단을 농축하였다. 농축된 pDC 집단을 anti-CD123-BV421 (6H6, Biolegend)와 anti- BDCA-2 항체 (AC144, Miltenyi)로 염색하고 FACS로 확인한 결과를 도 9 중 A에 나타내었다. 농축된 pDC 집단(도 9 중 A, 2 × 105 cells/100 μL, 타겟 세포)를 본 발명에 따른 CAR-T 세포(도 9 중 B, 2 × 105 cells/100 μL, 이펙터 세포)와 혼합한 후 4시간동안 반응시켰다. 그 후 남아있는 pDC와 CAR-T가 차지하는 %를 확인하여 도 10 중 A 및 B에 나타내었다. 더불어 pDC 집단을 CD123(6H6, Biolegend)와 BDCA-2항체(AC144, Miltenyi)로 염색하여 CAR-T세포에 의해 pDC 집단에 변화가 있는지를 확인하였다. 또한 ELISA를 이용하여 IFN-γ의 분비를 측정함으로써 pDC에 의해 유도되는 CAR-T 세포의 활성화를 확인하고 이를 도 11에 나타내었다. Can CAR-T cells targeting BDCA-2 according to the present invention (201 HL CAR-T cells and 201 LH CAR-T cells) recognize BDCA-2 expressed by pDCs and eliminate the pDC population? Confirmed. In order to rule out the allogeneic effect of CAR-T cells, PBMCs were isolated from the blood of volunteers who produced CAR-T cells, and pDC populations were concentrated therefrom and used as target cells. At this time, the pDC population was enriched using the plasmacytoid dendritic cell isolation kit II (Miltenyi). The enriched pDC population was stained with anti-CD123-BV421 (6H6, Biolegend) and anti-BDCA-2 antibody (AC144, Miltenyi), and the results confirmed by FACS are shown in A in Figure 9. The enriched pDC population (A in Figure 9, 2 × 10 5 cells/100 μL, target cells) was combined with CAR-T cells according to the present invention (B in Figure 9, 2 × 10 5 cells/100 μL, effector cells). After mixing, it was reacted for 4 hours. Afterwards, the percentage occupied by the remaining pDC and CAR-T was confirmed and shown in A and B of Figure 10. In addition, the pDC population was stained with CD123 (6H6, Biolegend) and BDCA-2 antibody (AC144, Miltenyi) to confirm whether there were changes in the pDC population due to CAR-T cells. In addition, the activation of CAR-T cells induced by pDC was confirmed by measuring the secretion of IFN-γ using ELISA, and this is shown in Figure 11.
그 결과, pDC 집단의 경우 아무런 자극(stimulation)없이 4시간동안 배양하였을 때 UTD에 의해서도 약 50% 정도가 감소하였음을 확인하였다(11%---4.10, 5.95, 6.73%). 반면 본 발명에 따른 201 HL CAR-T 세포를 이펙터 세포로 이용하였을 때 CD123+BDCA-2+ 세포 62%를 감소시킴을 확인하였다(9.73%---5.04, 2.85, 3.27%). 특히 본 발명에 따른 201 LH CAR-T세포를 이펙터 세포로 이용하였을 때 CD123+BDCA-2+ 세포의 약 90% 정도가 감소시키는 효과를 보여(8.41%---0.77, 0.94, 0.99%), 201 HL CAR-T세포보다 더 우수한 제거능을 보였다. As a result, it was confirmed that in the case of the pDC group, when cultured for 4 hours without any stimulation, the UTD decreased by approximately 50% (11%---4.10, 5.95, 6.73%). On the other hand, when 201 HL CAR-T cells according to the present invention were used as effector cells, it was confirmed that CD123+BDCA-2+ cells were reduced by 62% (9.73%---5.04, 2.85, 3.27%). In particular, when the 201 LH CAR-T cells according to the present invention were used as effector cells, it showed an effect of reducing about 90% of CD123+BDCA-2+ cells (8.41%---0.77, 0.94, 0.99%). It showed better removal ability than 201 HL CAR-T cells.
이러한 CAR-T 세포에 의한 CD123+BDCA-2+ pDC 세포의 감소는 배양배지에 분비(secretion)된 IFN-γ의 증가와 밀접한 관련이 있었다. 공동 배양(co-culture) 4시간 후 혼합된 집단에 존재하는 CAR-T세포를 anti-Flag-PE (L5, Biolegend)로 염색하여 확인하였을 때 두 배양에서 모두 15-17%로 유사하게 나타났기 때문에, 상기에서 확인한 201 LH CAR-T 와 201 HL CAR-T 세포의 CD123+BDCA-2+ 세포를 제거할 수 있는 능력의 차이는 혼합된 집단에 존재하는 CAR-T세포 수에 의한 것은 아닌 것으로 판단되었다.The decrease in CD123+BDCA-2+ pDC cells by these CAR-T cells was closely related to the increase in IFN-γ secreted in the culture medium. When CAR-T cells present in the mixed population were stained with anti-Flag-PE (L5, Biolegend) after 4 hours of co-culture, they were found to be similar at 15-17% in both cultures. , it was determined that the difference in the ability to eliminate CD123+BDCA-2+ cells between 201 LH CAR-T and 201 HL CAR-T cells identified above was not due to the number of CAR-T cells present in the mixed population. It has been done.
실시예 8. 201A 키메라 항체와 인간화 항체 제작 및 생산Example 8. Production and production of 201A chimeric antibody and humanized antibody
마우스 단일클론 항체의 경우 인간에서 면역원성을 가지는 것으로 알려져 있으므로, 201A 마우스 항체의 키메라 항체와 인간화 항체를 제작하였다. 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 201A 키메라 항체를 제작하였으며, 이하 201C로 명명하였다. 또한 마우스 항체의 인간화를 실시하여, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 201A 인간화 항체를 제작하였으며, 이하, 201H로 명명하였다.Since mouse monoclonal antibodies are known to be immunogenic in humans, chimeric antibodies and humanized antibodies of the 201A mouse antibody were produced. A 201A chimeric antibody containing a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 was produced, hereinafter referred to as 201C. In addition, the mouse antibody was humanized to produce a 201A humanized antibody comprising a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, hereinafter referred to as 201H. .
상기 키메라 항체, 201C의 경쇄와 중쇄 또는 인간화 항체, 201H의 경쇄와 중쇄는 각각 pCDNA3.3 및 Optivec에 클로닝하였다. 각각의 경쇄와 중쇄의 발현 벡터를 Expi293세포에 동시에 형질주입하여 201C와 201H를 생산하였다. 세포 배양액은 수거한 후 단백질 G(protein G) 컬럼을 이용하여 항체를 정제하였다. 정제한 항체는 공지된 방법의 SDS-PAGE를 수행하여 그 크기(size)를 확인하였다(도 12 참고). The light and heavy chains of the chimeric antibody, 201C, or the light and heavy chains of the humanized antibody, 201H, were cloned into pCDNA3.3 and Optivec, respectively. Expression vectors for each light chain and heavy chain were simultaneously transfected into Expi293 cells to produce 201C and 201H. The cell culture fluid was collected and the antibodies were purified using a protein G column. The size of the purified antibody was confirmed by performing SDS-PAGE using a known method (see Figure 12).
실시예 9. 201A 키메라 항체와 인간화 항체의 BDCA-2 발현세포에 대한 결합력 확인Example 9. Confirmation of binding ability of 201A chimeric antibody and humanized antibody to BDCA-2 expressing cells
9-1. Cyno BDCA-2를 발현하는 세포주 확립9-1. Establishment of a cell line expressing Cyno BDCA-2
더불어 원숭이(Cynomolgus monkey) BDCA-2 (CLEC4C) 유전자(cyno BDCA-2, 서열번호 22)를 합성한 후 바이러스 발현벡터 (pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-puro)에 클로닝하여 바이러스를 생산하였다. HEK 293세포를 cyno BDCA-2 발현 바이러스로 형질도입한 후 퓨로마이신 1μg/mL을 첨가한 배지에서 계대 배양하였다. 이를 통해 cyno BDCA-2를 발현하는 세포를 선별하였다. 발현 벡터에 대리지표(surrogate marker)로써 포함된 GFP의 형광을 현미경으로 확인함으로써, 세포주에 형질도입된 효율(efficiency)을 확인하였다(도 13 참고). 또한 FACS로 GFP 발현을 확인하였고, 원숭이 BDCA-2에도 결합한다고 알려진 항체, anti-BDCA-2-APC (Miltenyi, AC144)를 이용하여 세포를 염색한 후 FACS로 확인한 결과, 확립한 세포주에서 원숭이 BDCA-2가 충분한 양으로 발현함을 확인하였다(도 14 참고).In addition, the Cynomolgus monkey BDCA-2 (CLEC4C) gene (cyno BDCA-2, SEQ ID NO: 22) was synthesized and cloned into a virus expression vector (pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-puro) to produce the virus. . HEK 293 cells were transduced with a cyno BDCA-2 expression virus and subcultured in medium supplemented with 1 μg/mL of puromycin. Through this, cells expressing cyno BDCA-2 were selected. The efficiency of transduction into the cell line was confirmed by checking the fluorescence of GFP included as a surrogate marker in the expression vector under a microscope (see Figure 13). In addition, GFP expression was confirmed by FACS, and cells were stained using anti-BDCA-2-APC (Miltenyi, AC144), an antibody known to bind to monkey BDCA-2, and confirmed by FACS. As a result, monkey BDCA was detected in the established cell line. It was confirmed that -2 was expressed in sufficient amounts (see Figure 14).
9-2. 키메라 항체와 인간화 항체의 BDCA-2 발현세포에 대한 결합력 확인9-2. Confirmation of binding ability of chimeric and humanized antibodies to BDCA-2 expressing cells
상기 실시예 8을 통해 생산한 키메라 항체, 201C와 인간화 항체, 201H의 인간 BDCA-2에 결합력 유지 여부와 cyno BDCA-2에도 결합할 수 있는지를 확인하였다. 인간 BDCA-2 발현 293세포와 cyno BDCA-2 발현 293세포를 다양한 농도의 201C와 201H로 처리한 후, 이들 항체를 인식할 수 있는 이차 항체 (anti-human IgG-APC, Fc specific)를 이용해 염색하였다. It was confirmed whether the chimeric antibody, 201C, and the humanized antibody, 201H, produced through Example 8 maintained their binding affinity to human BDCA-2 and whether they could also bind to cyno BDCA-2. Human BDCA-2 expressing 293 cells and cyno BDCA-2 expressing 293 cells were treated with various concentrations of 201C and 201H, then stained using a secondary antibody (anti-human IgG-APC, Fc specific) that can recognize these antibodies. did.
그 결과 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 키메라 항체 및 인간화 항체 모두 용량 의존적(dose dependent)으로 인간 BDCA-2 발현 293세포와 cyno BDCA-2 발현 293세포에 결합할 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in Figures 15 and 16, both the chimeric antibody and the humanized antibody according to the present invention were able to bind to human BDCA-2 expressing 293 cells and cyno BDCA-2 expressing 293 cells in a dose dependent manner. Confirmed.
종합적으로, 본 발명은 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 발굴하고, 이를 기반으로 제작한 CAR, CAR-T세포, 키메라 항체 및 인간화항체의 활성을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 신규한 항체는 공지된 항체와 유사하게 BDCA-2를 인식할 수 있음을 확인하였고, 인간 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid Dendritic cell, pDC)의 표면으로부터의 BDCA-2의 내재화를 매개하여 I형 인터페론의 발현을 억제하는 효과를 보이며, 상기 효과가 공지된 항체보다 뛰어남을 확인하였다. 더불어 상기 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 기반으로 제작한 CAR, 상기 CAR를 발현하는 T세포는 우수한 pDC 제거능을 보였으며, 상기 BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체를 기반으로 제작한 키메라 항체와 인간화 항체는 인간 BDCA-2를 발현하는 세포와 원숭이 BDCA-2를 발현하는 세포 모두 결합할 수 있음을 확인하였다.Overall, the present invention discovers an antibody that specifically binds to BDCA-2 and confirms the activity of CAR, CAR-T cells, chimeric antibodies, and humanized antibodies produced based on it, and BDCA-2 according to the present invention It was confirmed that the novel antibody that specifically binds to BDCA-2 can recognize BDCA-2 similarly to known antibodies, and internalization of BDCA-2 from the surface of human plasmacytoid dendritic cells (pDC) It showed an effect of suppressing the expression of type I interferon by mediating, and it was confirmed that the effect was superior to that of known antibodies. In addition, CAR produced based on an antibody that specifically binds to BDCA-2 and T cells expressing the CAR showed excellent pDC removal ability, and CAR produced based on an antibody that specifically binds to BDCA-2 It was confirmed that the chimeric antibody and the humanized antibody can bind to both cells expressing human BDCA-2 and cells expressing monkey BDCA-2.
Claims (34)
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, BDCA-2(Blood dendritic cell antigen 2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
A light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and
An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 (Blood dendritic cell antigen 2), comprising a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
상기 항체는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄로 이루어진 것을 특징으로 하는, BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
According to clause 1,
The antibody is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2, characterized in that it consists of a light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. .
상기 항원 결합단편은 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, BDCA-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
According to clause 1,
BDCA, characterized in that the antigen-binding fragment is one or more selected from the group consisting of Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv, and domain antibodies. An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to -2.
A nucleic acid encoding an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2 according to any one of claims 1 to 3.
A recombinant expression vector containing the nucleic acid of claim 4.
Host cells transfected with the recombinant expression vector of claim 5.
Culturing the host cell of claim 6 to produce an antibody; And a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BDCA-2, comprising the steps of isolating and purifying the produced antibody.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일쇄 가변 단편(scFv)를 포함하는, BDCA-2 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR).
A light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; and
A BDCA-2 specific chimeric antigen receptor (CAR) comprising a single chain variable fragment (scFv) containing a heavy chain variable region containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
상기 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 (GGGGS)m 링커로 연결되며, 상기 m은 1 내지 10인 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 8,
A BDCA-2 specific CAR, wherein the light chain variable region and the heavy chain variable region are connected by a (GGGGS)m linker, and m is 1 to 10.
상기 링커는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 9,
BDCA-2 specific CAR, characterized in that the linker includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
상기 scFv는 경쇄 가변영역, 링커 및 중쇄 가변영역이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 8,
The scFv is a BDCA-2 specific CAR, characterized in that the light chain variable region, linker, and heavy chain variable region are sequentially connected.
상기 scFv는 중쇄 가변영역, 링커 및 경쇄 가변영역이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 8,
The scFv is a BDCA-2 specific CAR, characterized in that the heavy chain variable region, linker, and light chain variable region are sequentially connected.
상기 scFv는 서열번호 6 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 8,
The scFv is a BDCA-2 specific CAR, characterized in that it contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
상기 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv는 서열번호 8로 표시되는 염기서열에 암호화되고, 상기 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv는 서열번호 9로 표시되는 염기서열에 암호화되는 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 13,
The scFv containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is encoded in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the scFv containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is encoded in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9. BDCA-2 specific CAR, characterized in that
상기 BDCA-2 특이적 CAR는 신호 펩티드, 줄기 도메인, 막 관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 8,
The BDCA-2 specific CAR is characterized in that it further comprises one or more selected from the group consisting of a signal peptide, a stem domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.
상기 줄기 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28 및 CD8 힌지로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 15,
BDCA-2 specific CAR, wherein the stem domain is selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28, and CD8 hinge.
상기 막 관통 도메인은 FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, CD40, DAP10, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1, TNFSF14, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD154, T 세포 수용체의 알파 쇄, T 세포 수용체의 베타 쇄 및 T 세포 수용체의 제타 쇄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 15,
The transmembrane domain includes FcγR, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, CD40, DAP10, MHC class I molecule, TNF receptor protein, Immunoglobulin-like protein, Cytokine receptor, integrin, SLAM protein, activated NK cell receptor, BTLA, Toll ligand receptor, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7 , NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile) , CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 specific ligand, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD8, Ig alpha (CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα , PD-1, TNFSF14, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD154, consisting of the alpha chain of the T cell receptor, the beta chain of the T cell receptor, and the zeta chain of the T cell receptor. BDCA-2 specific CAR, characterized in that it is one or more types selected from the group.
상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88, DAP10, DAP12, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1 및 TNFSF14로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, BDCA-2 특이적 CAR.
According to clause 15,
The intracellular signaling domains include CD3ζ, FcγR, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88, DAP10, DAP12, MHC class. I molecule, TNF receptor protein, Immunoglobulin-like protein, cytokine receptor, integrin, SLAM protein, activated NK cell receptor, BTLA, Toll ligand receptor, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108) , SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 specific ligand, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ , BDCA-2 specific CAR, characterized in that one or more types selected from the group consisting of CD8, Ig alpha (CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1 and TNFSF14.
A nucleic acid encoding a BDCA-2 specific CAR according to any one of claims 8 to 18.
A recombinant expression vector containing the nucleic acid of claim 19.
Host cells transfected with the recombinant expression vector of claim 20.
Transformed T cells expressing the BDCA-2 specific CAR according to claim 8.
상기 T세포는 알파 베타 T세포, 감마 델타 T세포 또는 NKT세포인, 형질전환된 T세포.
According to clause 22,
The T cells are transformed T cells, which are alpha beta T cells, gamma delta T cells, or NKT cells.
상기 T세포는 동종 T세포, 자가 T세포, 조작된 자가 T세포 (eACT), 또는 종양-침윤 림프구 (TIL)인, 형질전환된 T세포.
According to clause 22,
A transformed T cell, wherein the T cell is an allogeneic T cell, an autologous T cell, an engineered autologous T cell (eACT), or a tumor-infiltrating lymphocyte (TIL).
서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 BDCA-2에 대한 키메라 항체.
A light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10; and
A chimeric antibody against BDCA-2 comprising a heavy chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
상기 서열번호 10로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 서열번호 12로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 서열번호 13으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, BDCA-2에 대한 키메라 항체.
According to clause 25,
The light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, and the heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 13. A chimeric antibody against BDCA-2, characterized in that it is encoded by
서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 BDCA-2에 대한 인간화 항체.
A light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; and
A humanized antibody against BDCA-2 comprising a heavy chain comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
상기 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 서열번호 17로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, BDCA-2에 대한 인간화 항체.
According to clause 27,
The light chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, and the heavy chain containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 17. A humanized antibody against BDCA-2, characterized in that encoded by .
The chimeric antibody against BDCA-2 of claim 25; or a nucleic acid encoding a humanized antibody against BDCA-2 of claim 27.
The chimeric antibody against BDCA-2 of claim 25; Or a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding the humanized antibody against BDCA-2 of claim 27.
The chimeric antibody against BDCA-2 of claim 25; Or a host cell transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding the humanized antibody against BDCA-2 of claim 27.
The chimeric antibody against BDCA-2 of claim 25; or producing an antibody by culturing a host cell transfected with a recombinant expression vector containing a nucleic acid encoding the humanized antibody against BDCA-2 of claim 27; And a method for producing a chimeric antibody against BDCA-2 or a humanized antibody against BDCA-2, comprising the steps of separating and purifying the produced antibody.
An antibody that specifically binds to BDCA-2 of claim 1; BDCA-2 specific CAR of claim 8; Transformed T cells of Article 22; The chimeric antibody against BDCA-2 of claim 25; Or a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases, comprising at least one selected from the group consisting of humanized antibodies against BDCA-2 of claim 27.
상기 자가면역질환은 전신성 홍반성 낭창(Lupus), 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 셀리악 병(Celiac disease-sprue), IgA 결핍(IgA deficiency), 크론병(Crohn's disease), 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 피부 경화증, 다발성 근염, 만성 활동성간염, 혼합 결체 조직 질환, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 에디슨 병, 백반, 글루텐 감수성 장병증, 그레이브병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구 감소증, 특발성 혈소판 감소 자반증, 간경변증, 심상성천포창, 자가면역 불임증, 구드패스츄어 증후군, 수포성 유천포창, 궤양성 대장염, 건선, 하시모토병 및 고밀도 침착병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.According to clause 33,
The autoimmune diseases include systemic lupus erythematosus (Lupus), type 1 diabetes, rheumatoid arthritis, celiac disease-sprue, IgA deficiency, Crohn's disease, multiple sclerosis, and Sjögren's syndrome. , scleroderma, polymyositis, chronic active hepatitis, mixed connective tissue disease, primary biliary cirrhosis, pernicious anemia, autoimmune thyroiditis, idiopathic Addison's disease, vitiligo, gluten-sensitive enteropathy, Grave's disease, myasthenia gravis, autoimmune neutropenia, Characterized by one or more types selected from the group consisting of idiopathic thrombocytopenic purpura, cirrhosis, pemphigus vulgaris, autoimmune infertility, Goodpasture syndrome, bullous pemphigoid, ulcerative colitis, psoriasis, Hashimoto's disease, and dense deposit disease, Pharmaceutical composition.
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| KR1020220083900A KR20240007815A (en) | 2022-07-07 | 2022-07-07 | Anti-BDCA-2 Antibody and Use Thereof |
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ID=89713437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020220083900A KR20240007815A (en) | 2022-07-07 | 2022-07-07 | Anti-BDCA-2 Antibody and Use Thereof |
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2022
- 2022-07-07 KR KR1020220083900A patent/KR20240007815A/en unknown
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