JPWO2020059554A1

JPWO2020059554A1 - プレート

Info

Publication number: JPWO2020059554A1
Application number: JP2020548347A
Authority: JP
Inventors: 大輔野元; 誠山中
Original assignee: Ushio Denki KK
Current assignee: Ushio Denki KK
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2019-09-09
Publication date: 2021-09-16
Also published as: WO2020059554A1

Abstract

マイクロ流路を流れる試料に対して、顕微鏡によって所要の観察または撮影を確実に実行することかできるプレートを提供する。内部にマイクロ流路を有するプレートであって、前記マイクロ流路を流れる試料を観察するときの補助となる観察補助マークが、当該マイクロ流路に沿って形成されていることを特徴とする。前記観察補助マークは、複数の線分が前記マイクロ流路に沿って等間隔で並ぶよう配置されたスケールよりなることが好ましい。また、前記観察補助マークは、複数の微小図形が前記マイクロ流路に沿って等間隔で並ぶよう配置された撮影用アライメントマークよりなることが好ましい。また、前記観察補助マークは、方眼罫よりなり、平面視したときに前記マイクロ流路と重なる部位に形成されていることが好ましい。

Description

本発明は、内部にマイクロ流路を有するプレートに関し、更に詳しくは、マイクロ流路内において細胞や生体組織を培養しながら観察することができる培養容器として好適なプレートに関する。

細胞は、生体内の細胞外微小環境下においてその機能制御が行われている。ここで、細胞外微小環境は、成長因子、ビタミン、ガス分子等の可溶性因子、細胞外マトリックス等の不溶性因子、および細胞間相互作用などから構成されている。
従来、細胞や生体組織の培養においては、寒天等の培地を形成した培養ディッシュや培養プレートなどの培養容器が使用されている。このような培養容器を使用した細胞培養は、二次元（平面）の環境で行われるため、細胞外微小環境を再現することが困難である。このような事情から、三次元（立体）の環境で細胞培養が可能なマイクロ流路を有するプレート（バイオチップ、マイクロチップ）が提案されている（特許文献１参照）。

図９は、従来のプレートの一例における構成を示す説明図である。このプレート８０は、液体試料が注入される注入口８２および液体試料が排出される排出口８３が形成された透明な第１の基板８１と、この第１の基板８１に積層された第２の基板８５とが一体に接合されて構成されている。プレート８０の内部には、注入口８２から排出口８３に向かって伸びるマイクロ流路８６が形成されている。
このプレート８０においては、注入口８２から注入された液体試料が、マイクロ流路８６を流通した後、排出口８３から排出される。そして、液体試料がマイクロ流路８６を流通する際に、当該液体試料中の細胞等の状態を、顕微鏡によって拡大して観察することができる。

しかしながら、このようなプレートにおいては、以下のような問題がある。
マイクロ流路を流通する液体試料中の細胞等を、顕微鏡によって拡大して観察する最中に、マイクロ流路内におけるどの個所を観察しているかが判らなくなることがある。
また、顕微鏡による視野を、マイクロ流路における或る領域から他の領域に移動させたときには、元の領域に正確に戻すことが困難である。
また、マイクロ流路を全長にわたって撮影する場合には、マイクロ流路を長手方向に分割して撮影した後、得られる画像を繋ぎ合わせることが行われるが、画像同士を正確に位置合わせして繋ぎ合わせることが困難である。

特開２０１８−４７６１４号公報

本発明の目的は、マイクロ流路を流れる試料に対して、顕微鏡によって所要の観察または撮影を確実に実行することかできるプレートを提供することにある。

本発明のプレートは、内部にマイクロ流路を有するプレートであって、
前記マイクロ流路を流れる試料を観察するときの補助となる観察補助マークが、当該マイクロ流路に沿って形成されていることを特徴とする。

本発明のプレートにおいては、前記観察補助マークは、複数の線分が前記マイクロ流路に沿って等間隔で並ぶよう配置されたスケールよりなることが好ましい。

また、本発明のプレートにおいては、前記観察補助マークは、複数の微小図形が前記マイクロ流路に沿って等間隔で並ぶよう配置された撮影用アライメントマークよりなることが好ましい。

また、本発明のプレートにおいては、前記観察補助マークは、方眼罫よりなり、平面視したときに前記マイクロ流路と重なる部位に形成されていることが好ましい。

また、本発明のプレートにおいては、前記マイクロ流路を形成するための流路形成用溝が形成された第１の基板と、この第１の基板に積層された第２の基板とが接合されてなり、前記第１の基板は、透明な合成樹脂よりなることが好ましい。
また、前記合成樹脂がシクロオレフィン樹脂であることが好ましい。
また、前記観察補助マークは、前記第１の基板における前記第２の基板と接合される面および／または前記第２の基板における前記第１の基板と接合される面に形成されていることが好ましい。

本発明のプレートによれば、マイクロ流路を流れる試料を観察するときの補助となる観察補助マークが形成されているため、マイクロ流路を流れる試料に対して、顕微鏡によって所要の観察または撮影を確実に実行することかできる。
例えば観察補助マークとして、複数の線分がマイクロ流路に沿って等間隔で並ぶよう配置されたスケールを形成することにより、マイクロ流路を流通する液体試料中の細胞等を、顕微鏡によって拡大して観察する最中に、マイクロ流路内におけるどの個所を観察しているかを容易に特定することができる。また、顕微鏡によって観察している最中に、当該顕微鏡の視野を、マイクロ流路における或る領域から他の領域に移動させたときにも、スケールにおける線分を基準として、元の領域に正確に戻すことができる。また、スケールによって、マイクロ流路を流通する液体試料中の細胞等の成長度合いを確認することができる。

また、観察補助マークとして、複数の微小図形がマイクロ流路に沿って等間隔で並ぶよう配置された撮影用アライメントマークを形成することにより、顕微鏡によって観察している最中に、当該顕微鏡による視野を、マイクロ流路における或る領域から他の領域に移動させたときにも、元の領域に正確に戻すことができる。また、マイクロ流路を全長にわたって撮影する場合には、マイクロ流路を長手方向に分割して撮影した複数の画像同士を、正確に位置合わせして繋ぎ合わせることができる。

また、観察補助マークとして、平面視したときにマイクロ流路と重なる部位に方眼罫を形成することにより、顕微鏡によって観察している最中に、当該顕微鏡の視野を、マイクロ流路における或る領域から他の領域に移動させたときにも、方眼罫を基準として、元の領域に正確に戻すことができる。また、方眼罫によって、マイクロ流路を流通する液体試料中の細胞等の成長度合いを確認することができる。

本発明の第１の実施形態に係るプレートの構成を示す平面図である。図１に示すプレートにおけるＡ−Ａ断面図である。図１に示すプレートにおけるＢ−Ｂ断面図である。本発明の第２の実施形態に係るプレートの構成を示す平面図である。本発明の第３の実施形態に係るプレートの構成を示す平面図である。図５に示すプレートにおける観察補助マークを拡大して示す説明図である。本発明のプレートの他の例における構成の一部を拡大して示す説明用断面図である。本発明のプレートの更に他の例における構成の一部を拡大して示す説明用断面図である。従来のプレートの一例における構成を示す説明図である。

以下、本発明のプレートの実施の形態について説明する。
〈第１の実施形態〉
図１は、本発明の第１の実施形態に係るプレートの構成を示す平面図である。図２は、図１に示すプレートにおけるＡ−Ａ断面図である。図３は、図１に示すプレートにおけるＢ−Ｂ断面図である。
このプレート１０は、透明な第１の基板１１と第２の基板１５とが積層されて一体的に接合された板状体によって構成されている。この例のプレート１０は、その内部に複数（図示の例では３つ）の直線状のマイクロ流路１６を有する。これらのマイクロ流路１６は、互いに連通することなく独立して形成され、かつ、平行に並ぶよう配列されている。

第１の基板１１には、第２の基板１５に接する側の面（図２において下面）に、流路形成用溝１２が形成されている。一方、第２の基板１５における第１の基板１１に接する側の表面（図２において上面）は、平坦面とされている。そして、第１の基板１１に形成された流路形成用溝１２によって、第１の基板１１と第２の基板１５との間にマイクロ流路１６が形成されている。

また、第１の基板１１には、各マイクロ流路１６に対応して、液体試料が注入される注入口１３および液体試料が排出される排出口１４が、当該第１の基板１１を厚み方向に貫通するよう形成されている。マイクロ流路１６の各々の一端は、対応する注入口１３に連通して接続され、マイクロ流路１６の各々の一端は、対応する排出口１４に連通して接続されている。

本発明のプレート１０には、マイクロ流路１６を流れる試料を観察するときの補助となる観察補助マーク２０が、マイクロ流路１６に沿って形成されている。図示の例のプレート１０においては、観察補助マーク２０は、第１の基板１１の外表面に形成され、平面視したときに、それぞれマイクロ流路１６の長手方向に垂直な方向に伸びる複数の線分（目盛り）２１が、マイクロ流路１６の側方において当該マイクロ流路１６に沿って等間隔で並ぶよう配置されたスケールによって構成されている。
観察補助マーク２０を構成するスケールにおいて、隣接する線分２１の間隔は例えば１μｍである。

第１の基板１１を構成する材料としては、透明な合成樹脂を用いることができる。かかる合成樹脂の具体例としては、ポリジメチルシロキサンなどのシリコーン樹脂、シクロオレフィン樹脂（シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）など）、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、スチレン樹脂（ポリスチレン（ＰＳ））などが挙げられる。これらの中では、射出成形性、透明性、強度、接合性などの観点から、シクロオレフィン樹脂を用いることが好ましい。
第２の基板１１を構成する材料としては、合成樹脂を用いることができ、その具体例としては、第１の基板１１を構成する合成樹脂と同様のものが挙げられる。
第１の基板１１および第２の基板１５の各々の厚みは、特に限定されるものではないが、例えば０．５〜７ｍｍである。マイクロ流路１６の幅は、例えば０．１〜３ｍｍである。マイクロ流路１６の高さ（流路形成用溝１２の深さ）は、例えば０．０５〜１ｍｍである。

上記のプレート１０は、例えば以下のようにして製造することができる。
先ず、図３に示すように、それぞれ樹脂よりなる第１の基板１１および第２の基板１５を製造する。第１の基板１１には、その表面に流路形成用溝１２が形成されていると共に、流路形成用溝１２の両端位置に、当該第１の基板１１を厚み方向に貫通する注入口１３および排出口１４（図２参照）が形成されている。一方、第２の基板１５の表面は、平坦面とされている。
第１の基板１１および第２の基板１５を製造する方法としては、射出成形法、注型法などの樹脂成形法を、用いられる樹脂に応じて適宜選択することができる。
次いで、第１の基板１１および第２の基板１５の各々における接合面となる面に対して、表面活性化処理を行う。この表面活性化処理としては、波長２００ｎｍ以下の真空紫外線を照射する紫外線照射処理、大気圧プラズマ装置からの大気圧プラズマを接触させるプラズマ処理を利用することができる。

表面活性化処理として紫外線照射処理を利用する場合において、真空紫外線を放射する光源としては、波長１７２ｎｍに輝線を有するキセノンエキシマランプ等のエキシマランプ、中心波長１８５ｎｍの低圧水銀ランプ、波長１２０〜２００ｎｍの範囲に強い発光スペクトルを有する重水素ランプを好適に用いることができる。
第１の基板１１および第２の基板１５の各々の表面に照射される真空紫外線の照度は、例えば１０〜５００ｍＷ／ｃｍ²である。
また、第１の基板１１および第２の基板１５の各々の表面に対する真空紫外線の照射時間は、第１の基板１１および第２の基板１５を構成する樹脂に応じて適宜設定されるが、例えば５〜６秒間である。

表面活性化処理としてプラズマ処理を利用する場合において、プラズマ生成用ガスとしては、窒素ガス、アルゴンガスなどを主成分とし、酸素ガスが０．０１〜５体積％含有してなるものを用いることが好ましい。または、窒素ガスとクリーンドライエア（ＣＤＡ）との混合ガスを用いることも可能である。
プラズマ処理に用いられる大気圧プラズマ装置の動作条件としては、例えば周波数が２０〜７０ｋＨｚ、電圧が５〜１５ｋＶｐ−ｐ、電力値が０．５〜２ｋＷである。
また、大気圧プラズマによる処理時間は、例えば５〜１００秒間である。

このようにして表面活性化処理された第１の基板１１および第２の基板１５を、それぞれの表面が互いに接触するよう積層する。そして、第１の基板１１および第２の基板１５を、自重により若しくは外部から圧力を加えることにより厚み方向に加圧した状態で、必要に応じて加熱することによって接合する。
以上において、加圧および加熱の具体的な条件は、第１の基板１１および第２の基板１５を構成する材料に応じて適宜設定される。
具体的な条件を挙げると、加圧力が例えば０．１〜１０ＭＰａで、加熱温度が例えば４０〜１３０℃である。

以上において、第１の基板１１における観察補助マーク２０は、レーザー光によるマーキング、機械加工、ナノインプリント、露光によって形成することができる。

第１の実施形態に係るプレート１０によれば、観察補助マーク２０として、複数の線分２１がマイクロ流路１６に沿って等間隔で並ぶよう配置されたスケールが形成されているため、マイクロ流路１６を流通する液体試料中の細胞等を、顕微鏡によって拡大して観察する最中に、マイクロ流路１６内におけるどの個所を観察しているかを容易に特定することができる。
また、顕微鏡によって観察している最中に、当該顕微鏡の視野を、マイクロ流路１６における或る領域から他の領域に移動させたときにも、スケールにおける線分２１を基準として、元の領域に正確に戻すことができる。
また、観察補助マーク２０を構成するスケールによって、マイクロ流路１６を流通する液体試料中の細胞等の成長度合いを確認することができる。

〈第２の実施形態〉
図４は、本発明の第２の実施形態に係るプレートの構成を示す平面図である。このプレート１０は、第１の実施形態に係るプレート１０と同様に、流路形成用溝１２、注入口１３および排出口１４が形成された、透明な第１の基板１１と、第２の基板１５（図２参照）とが積層されて一体的に接合された板状体によって構成されている。プレート１０の内部には、複数（図示の例では３つ）の直線状のマイクロ流路１６が、互いに連通することなく独立して形成され、かつ、平行に並ぶよう配列されている。

このプレート１０には、マイクロ流路１６を流れる試料を観察するときの補助となる観察補助マーク２０が、マイクロ流路１６に沿って形成されている。図示の例のプレート１０においては、観察補助マーク２０は、第１の基板１１の外表面に形成され、平面視したときに、それぞれ円形の複数の微細図形２２が、マイクロ流路１６の側方において当該マイクロ流路１６に沿って等間隔で並ぶよう配置された撮影用アライメントマークによって構成されている。観察補助マーク２０において、微細図形２２の配置ピッチは例えば１μｍである。この観察補助マーク２０は、第１の実施形態に係るプレート１０における観察補助マーク２０と同様にして形成することができる。
第２の実施形態に係るプレート１０におけるその他の構成は、第１の実施形態に係るプレート１０と同様である。

第２の実施形態に係るプレート１０によれば、観察補助マーク２０として、複数の微小図形２２がマイクロ流路１６に沿って等間隔で並ぶよう配置された撮影用アライメントマークが形成されているため、顕微鏡によって観察している最中に、当該顕微鏡の視野を、マイクロ流路１６における或る領域から他の領域に移動させたときにも、元の領域に正確に戻すことができる。
また、マイクロ流路１６を全長にわたって撮影する場合には、マイクロ流路１６を長手方向に分割して撮影した複数の画像同士を、正確に位置合わせして繋ぎ合わせることができる。

〈第３の実施形態〉
図５は、本発明の第３の実施形態に係るプレートの構成を示す平面図である。このプレート１０は、第１の実施形態に係るプレート１０と同様に、流路形成用溝１２、注入口１３および排出口１４が形成された、透明な第１の基板１１と、第２の基板１５（図２参照）とが積層されて一体的に接合された板状体によって構成されている。プレート１０の内部には、複数（図示の例では３つ）の直線状のマイクロ流路１６が、互いに連通することなく独立して形成され、かつ、平行に並ぶよう配列されている。

このプレート１０には、マイクロ流路１６を流れる試料を観察するときの補助となる観察補助マーク２０が、マイクロ流路１６に沿って形成されている。図示の例のプレート１０においては、観察補助マーク２０は、図６に拡大して示すように、マイクロ流路１６の長手方向に伸びる罫線２３とマイクロ流路１６の長手方向に垂直な方向に伸びる罫線２４とからなる方眼罫によって構成され、平面視したときに、第１の基板１１におけるマイクロ流路１６と重なる部位の外表面に形成されている。観察補助マーク２０を構成する方眼罫において、隣接する罫線２３，２４の間隔は例えば１００μｍである。この観察補助マーク２０は、第１の実施形態に係るプレート１０における観察補助マーク２０と同様にして形成することができる。
第３の実施形態に係るプレート１０におけるその他の構成は、第１の実施形態に係るプレート１０と同様である。

第３の実施形態に係るプレート１０によれば、観察補助マーク２０として、平面視したときにマイクロ流路１６と重なる部位に方眼罫が形成されているため、顕微鏡によって観察している最中に、当該顕微鏡の視野を、マイクロ流路１６における或る領域から他の領域に移動させたときにも、方眼罫を基準として、元の領域に正確に戻すことができる。
また、方眼罫によって、マイクロ流路１６を流通する液体試料中の細胞等の成長度合いを確認することができる。

本発明のプレートは、上記の実施の形態に限定されず、以下のように、種々の変更を加えることが可能である。
（１）本発明のプレートにおいて、観察補助マークは、視覚的に認識することが可能で、マイクロ流路を流れる試料を観察するときの補助となるものであれば、第１の実施形態乃至第３の実施形態のものに限定されない。
（２）第１の実施形態に係るプレート１０において、複数の線分２１のうち、長さまたは太さが異なる線分２１を例えば１０本置きに配置してもよい。
（３）第２の実施形態に係るプレート１０において、観察補助マーク２０を構成する微細図形２２は、円形のものに限定されず、例えば十字形のものや、その他の形状のものであってもよい。
（４）本発明のプレート１０において、第２の基板１５が透明なものであることは必須ではなく、半透明または不透明なものであってもよい。

（５）第１の実施形態〜第３の実施形態において、観察補助マーク２０は、第１の基板１１の外表面に形成されているが、図７に示すように、第１の基板１１における第２の基板１５と接合される面に観察補助マーク２０が形成されていてもよい。また、図８に示すように、第２の基板１５における第１の基板１１と接合される面に観察補助マーク２０が形成されていてもよい。さらに、第１の基板１１における第２の基板１５と接合される面および第２の基板１５における第１の基板１１と接合される面の両方に、観察補助マーク２０が形成されていてもよい。
プレート１０においては、培養すべき細胞が、マイクロ流路１６内における底面すなわち第２の基板１５の上面に付着される。このため、細胞の観察作業は、第２の基板１５の上面位置に顕微鏡の焦点を合わせて行われる。而して、観察補助マーク２０が、第１の基板１１における第２の基板１５と接合される面および／または第２の基板１５における第１の基板１１と接合される面に形成されていることにより、観察対象である細胞に合わせた焦点を変更することなしに、観察補助マーク２０を確認することができる。
また、マイクロ流路１６内における底面から一定の高さの位置を定点観察する場合には、観察補助マーク２０を基準として顕微鏡の焦点を調整することが可能である。すなわち、顕微鏡の焦点を観察補助マーク２０に合わせた後、所要の高さに調整することにより、観察作業を行うことができる。
また、顕微鏡で拡大して観察するときでも、マイクロ流路１６内における観察対象である細胞の絶対位置を特定することができるため、細胞の位置や動きの定量評価が可能となる。

１０プレート
１１第１の基板
１２流路形成用溝
１３注入口
１４排出口
１５第２の基板
１６マイクロ流路
２０観察補助マーク
２１線分
２２微細図形
２３，２４罫線
８０プレート
８１第１の基板
８２注入口
８３排出口
８５第２の基板
８６マイクロ流路

Claims

内部にマイクロ流路を有するプレートであって、
前記マイクロ流路を流れる試料を観察するときの補助となる観察補助マークが、当該マイクロ流路に沿って形成されていることを特徴とするプレート。
前記観察補助マークは、複数の線分が前記マイクロ流路に沿って等間隔で並ぶよう配置されたスケールよりなることを特徴とする請求項１に記載のプレート。
前記観察補助マークは、複数の微小図形が前記マイクロ流路に沿って等間隔で並ぶよう配置された撮影用アライメントマークよりなることを特徴とする請求項１に記載のプレート。
前記観察補助マークは、方眼罫よりなり、平面視したときに前記マイクロ流路と重なる部位に形成されていることを特徴とする請求項１に記載のプレート。
前記マイクロ流路を形成するための流路形成用溝が形成された第１の基板と、この第１の基板に積層された第２の基板とが接合されてなり、前記第１の基板は、透明な合成樹脂よりなることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載のプレート。
前記合成樹脂がシクロオレフィン樹脂であることを特徴とする請求項５に記載のプレート。
前記観察補助マークは、前記第１の基板における前記第２の基板と接合される面および／または前記第２の基板における前記第１の基板と接合される面に形成されていることを特徴とする請求項５または請求項６に記載のプレート。