JPWO2020016605A5

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Publication number: JPWO2020016605A5
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Publication date: 2022-06-30
Anticipated expiration: 2039-07-19

Description

本明細書に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、繰り返しの合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、
（Ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖が、リガーゼ酵素の作用によって、前記所定の配列の第１のヌクレオチドの付加により伸長され、
（Ｂ）前記第１の鎖にハイブリダイズされる二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素によって前記所定の配列の第２のヌクレオチドを加えることによって伸長され、
（Ｃ）次いで、前記二本鎖ポリヌクレオチドが、切断部位で切断され、
各サイクルの前記所定の配列の前記第１および第２のヌクレオチドが、切断後に、前記二本鎖ポリヌクレオチドにおいて保持され、前記第１のヌクレオチドおよび前記第２のヌクレオチドが、前記合成二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対においてパートナーヌクレオチドになる、方法。
２．前記切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によって定義される、上記１に記載の方法。
３．各サイクルにおいて、前記第２の鎖の伸長の前に、前記二本鎖ポリヌクレオチド中に切断部位が作成される、上記１または２に記載の方法。
４．前記リガーゼ酵素の作用による工程（Ａ）の間に、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に組み込まれて、前記切断部位を定義する、上記３に記載の方法。
５．所与の合成サイクルにおいて、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第２の鎖に付加される、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記可逆的ターミネーター基が、次のサイクルの前記第２のヌクレオチドの前記次の合成サイクルにおける前記付加の前に、そのサイクルの前記組み込まれた第２のヌクレオチドから除去される、上記１～４のいずれかに記載の方法。
６．連結反応が、粘着末端連結反応を含む、上記１～５のいずれかに記載の方法。
７．前記第１のヌクレオチドおよび前記ユニバーサルヌクレオチドが、ポリヌクレオチド連結分子の構成成分であり、前記ポリヌクレオチド連結分子が、前記リガーゼ酵素の作用による工程（Ａ）の間に、前記二本鎖ポリヌクレオチドに連結され、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記二本鎖ポリヌクレオチドへの連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が伸長され、前記切断部位が作成される、上記４に記載の方法。
８．前記方法が、
（１）合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、前記支持鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖であり、前記合成鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖である、提供することと、
（２）粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を前記足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
（ｉ）前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記所定の配列の第１のヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が前記第１のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第１の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
（３）前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（４）連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、組み込まれた第１および第２のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
（５）前記第２のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第１の合成サイクルを行うことを含み、
前記方法が、
（６）粘着末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
（ｉ）前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第１の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
（７）前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（８）前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記第１およびさらなる合成サイクル（複数可）の組み込まれた第１および第２のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
（９）前記第２のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
（１０）工程６～９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する前記二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む、上記２～７のいずれかに記載の方法。
９．任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、前記切断部位で前記連結された足場ポリヌクレオチドを切断する工程の前に、前記可逆的ターミネーター基が、前記第２のヌクレオチドから代替的に除去される、上記８に記載の方法。
１０．工程（１）において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第１のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、工程（７）で組み込まれる前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
第１およびさらなる合成サイクルにおいて、前記足場ポリヌクレオチド中の前記ヌクレオチド突出および前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端中の前記ヌクレオチド突出が、同じ数のヌクレオチドを含み、前記数が１以上である、上記８または上記９に記載の方法。
１１．（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１およびｎ＋２は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第１／次のおよび第２のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される、上記１０に記載の方法。
１２．（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１、ｎ＋２、およびｎ＋３は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における次の、第２の、および第３のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される、上記１０に記載の方法。
１３．（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、ｘは、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎ＋３に対するヌクレオチド位置の数であり、前記数は、１～１０以上の整数であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置は、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義される、上記１０に記載の方法。
１４．工程（１）において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第１のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（３）において組み込まれた前記第１のサイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置ｎ＋１を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、工程（７）において組み込まれた前記次の／第２の合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、前記第３の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対のパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第１のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（７）において組み込まれた前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置ｎ＋１を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、前記次の合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端において、前記ヘルパー鎖の前記末端は、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記１＋ｙヌクレオチドは、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対のパートナーヌクレオチドであり、
ｉ．位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対になるヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．連結後、位置ｎ＋１およびｎ＋２は、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第１および第２のヌクレオチド位置であり、
ｉｉｉ．ｙは、１以上である整数であり、
ｉｖ．ｘは、０以上である整数であり、
ｖ．前記足場ポリヌクレオチドにおけるｙの数は、好ましくは、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端におけるｙの数と同じ数であり、ｙが異なる数である場合、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端におけるｙの数は、好ましくは、前記足場ポリヌクレオチドにおけるｙの数よりも少なく、
ｖｉ．任意の所与の一連の第１のサイクルおよびさらなるサイクルにおいて、ｘに対して選択される数は、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ｙに対して選択される数－１である、上記８または上記９に記載の方法。
１５．第１およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される、上記１０に記載の方法。
１６．第１およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋４＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される、上記１０に記載の方法。
１７．前記方法が、
（ｉ）工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記第１のサイクルの前記所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、前記第１のサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
（ｉｉ）工程（３）において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第１のサイクルの前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第１のサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記第１のサイクルの前記第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、
（ｉｉｉ）切断後の工程（４）において、前記第１のサイクルの前記所定の配列の前記第１、第２、およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチド中に保持されるように、
（ｉｖ）工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
（ｖ）工程（６）において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記さらなるサイクルの前記第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、前記次のヌクレオチドの前記組み込み前にヌクレオチドから除去されるように、
（ｖｉ）切断後の工程（８）において、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の前記第１、第２、およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチド中に保持されるように、修正される、上記８～１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程（４）および（８）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第１およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、上記１７に記載の方法。
１９．前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程（４）および（８）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第１およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次＋１のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、上記１７に記載の方法。
２０．任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、前記所定の配列の第１のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第１のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、上記１～１９のいずれかに記載の方法。
２１．任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（４）および／または（８）の前に、合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、前記足場ポリヌクレオチドが提供され、前記合成鎖が、ヘルパー鎖なしで提供される、上記８～２０のいずれかに記載の方法。
２２．任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（４）および／または（８）の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、上記８～２１のいずれかに記載の方法。
２３．前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、（ｉ）前記足場ポリヌクレオチドを約８０℃～約９５℃の温度に加熱し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）前記足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）前記足場ポリヌクレオチドを１００％ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）前記足場ポリヌクレオチドを、前記ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させて、それにより前記ヘルパー鎖部分と前記足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することによって、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、上記２２に記載の方法。
２４．各切断工程が、２工程切断プロセスを含み、各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、したがって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含む、上記１～１０、１１、１４、１５、１７、および１８のいずれかに記載の方法。
２５．前記第１の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、上記２４に記載の方法。
２６．前記ヌクレオチド除去酵素が、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素である、上記２５に記載の方法。
２７．前記ヌクレオチド除去酵素が、
ｉ．ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）、または
ｉｉ．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である、上記２６に記載の方法。
２８．前記第２の工程が、塩基である化学物質を用いて行われる、上記２４～２７のいずれかに記載の方法。
２９．前記塩基がＮａＯＨである、上記２８に記載の方法。
３０．前記第２の工程が、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われる、上記２４～２７のいずれかに記載の方法。
３１．前記有機化学物質が、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンである、上記３０に記載の方法。
３２．前記第２の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ、任意選択的に、脱塩基部位リアーゼ活性を有する前記酵素が、
（ｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ１、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎ番目）、または
（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、上記２４～２７のいずれかに記載の方法。
３３．各切断ステップが、切断酵素を用いて前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含む１工程切断プロセスを含み、前記酵素が、
（ｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、
（ｉｉｉ）ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、または
（ｉｖ）８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）である、上記１～１０、１１、１４、１５、１７および１８のいずれかに記載の方法。
３４．前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、上記１～９、１２、１４、１６、１７、および１９のいずれかに記載の方法。
３５．前記酵素が、ヌクレオチド位置ｎ＋１とｎとの間の前記支持鎖を切断する、上記３４に記載の方法。
３６．前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、上記３４または上記３５に記載の方法。
３７．前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖が、ＤＮＡ鎖である、上記１～３６のいずれかに記載の方法。
３８．組み込まれたヌクレオチドが、ｄＮＴＰである、上記３７に記載の方法。
３９．組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰである、上記３８に記載の方法。
４０．可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’－Ｏ－アリル－ｄＮＴＰである、上記３９に記載の方法。
４１．可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰである、上記３９に記載の方法。
４２．前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、ＤＮＡ鎖であり、前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの他方の鎖が、ＲＮＡ鎖である、上記１～３６のいずれかに記載の方法。
４３．前記合成鎖が、ＲＮＡ鎖であり、前記支持鎖が、ＤＮＡ鎖である、上記４２に記載の方法。
４４．組み込まれたヌクレオチドが、ＮＴＰである、上記４３に記載の方法。
４５．組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰである、上記４４に記載の方法。
４６．可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰである、上記４５に記載の方法。
４７．可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰである、上記４５に記載の方法。
４８．前記ポリメラーゼ酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＤＮＡポリメラーゼである、上記１～４１のいずれかに記載の方法。
４９．前記ポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ－７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼのバリアントである、上記４８に記載の方法。
５０．前記ポリメラーゼ酵素が、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ、任意選択的に、未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＲＮＡポリメラーゼである、上記１～３６および４２～４７のいずれかに記載の方法。
５１．前記トランスフェラーゼ酵素が、末端トランスフェラーゼ活性を有し、任意選択的に、前記酵素が、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ｐｏｌラムダ、ｐｏｌマイクロ、またはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである、上記１～５０のいずれかに記載の方法。
５２．前記第２のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する前記工程が、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて行われる、上記５～５１のいずれかに記載の方法。
５３．前記リガーゼ酵素が、Ｔ３ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ＤＮＡリガーゼである、上記１～５２のいずれかに記載の方法。
５４．任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（１）／（６）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されている、上記８～５３のいずれかに記載の方法。
５５．任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（２）／（６）において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記ポリヌクレオチド連結分子において、前記相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている、上記８～５３のいずれかに記載の方法。
５６．任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、
（ａ）工程（１）／（６）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の部分とが、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されており、
（ｂ）工程（２）／（６）において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の部分とが、前記ポリヌクレオチド連結分子において、前記相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている、上記８～５３のいずれかに記載の方法。
５７．工程（１）および（６）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖および／またはそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分が、共通の表面に繋留されている、上記８～５３のいずれかに記載の方法。
５８．前記プライマー鎖部分および／またはそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分が、切断可能なリンカーを含み、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、上記５７に記載の方法。
５９．工程（１）および（６）において、前記足場ポリヌクレオチド中の前記ヘアピンループが表面に繋留されている、上記５５および５６に記載の方法。
６０．前記ヘアピンループが、切断可能なリンカーを介して表面に繋留され、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、上記５９に記載の方法。
６１．前記切断可能なリンカーが、ＵＶ切断可能なリンカーである、上記５８または上記６０に記載の方法。
６２．前記表面が、微粒子である、上記５７～６１のいずれかに記載の方法。
６３．前記表面が、平坦な表面である、上記５７～６１のいずれかに記載の方法。
６４．前記表面が、ゲルを含む、上記５９～６３のいずれかに記載の方法。
６５．前記表面が、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくは、前記ポリアクリルアミド表面が、ガラスなどの固体支持体に結合されている、上記６４に記載の方法。
６６．前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、１つ以上の共有結合を介して前記共通の表面に繋留されている、上記５７～６５のいずれかに記載の方法。
６７．前記１つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、上記６６に記載の方法。
６８．前記共通の表面上の前記官能基が、ブロモアセチル基であり、任意に、前記ブロモアセチル基が、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、上記６７に記載の方法。
６９．合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われる、上記１～６８のいずれかに記載の方法。
７０．前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、上記６９に記載の方法。
７１．前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、上記７０に記載の方法。
７２．合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを提供する、上記１～７１のいずれかに記載の方法。
７３．合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはＰＣＲによって増幅される、上記１～７２のいずれかに記載の方法。
７４．所定の配列を有するポリヌクレオチドをアセンブリする方法であって、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために、上記１～７３のいずれかに記載の方法を行うことと、前記第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
７５．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、二本鎖である、上記７４に記載の方法。
７６．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、一本鎖である、上記７４に記載の方法。
７７．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、好ましくは連結によって一緒に接合される、上記７４～７６のいずれかに記載の方法。
７８．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、上記７７に記載の方法。
７９．前記合成および／またはアセンブリ工程が、微小流体システム内の液滴中で実行される、上記７０～７８のいずれかに記載の方法。
８０．前記アセンブリ工程が、所定の配列を有する第１の合成ポリヌクレオチドを含む第１の液滴と、所定の配列を有する追加の１つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第２の液滴と、を提供することを含み、前記液滴が、互いに接触し、前記合成ポリヌクレオチドが、一緒に接合され、それにより前記第１および追加の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをアセンブリする、上記７９に記載の方法。
８１．前記合成工程が、各液滴が前記合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、複数の液滴を提供することと、前記合成サイクルの前記工程に従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を順次送達することと、によって行われる、上記８０に記載の方法。
８２．液滴の送達後かつ次の液滴の送達の前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施される、上記８１に記載の方法。
８３．前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、上記８１および８２に記載の方法。
８４．前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、上記８３に記載の方法。
８５．合成工程およびアセンブリ工程が、同じシステム内で行われる、上記８１～８４のいずれかに記載の方法。
８６．上記１～８５のいずれかに記載の方法を実施するためのポリヌクレオチド合成システムであって、（ａ）各反応領域が少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、（ｂ）前記反応試薬を前記反応領域に送達するための手段と、任意に（ｃ）前記足場ポリヌクレオチドからの前記合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む、ポリヌクレオチド合成システム。
８７．前記反応試薬を液滴で提供するための手段と、前記合成サイクルに従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を送達するための手段と、をさらに含む、上記８６に記載のシステム。
８８．上記８６または８７に記載のシステムと共に使用するため、かつ上記１～８５のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、前記合成サイクルの前記工程に対応する反応試薬の容量を含む、キット。
８９．ポリヌクレオチドマイクロアレイを作成する方法であって、前記マイクロアレイが、複数の反応領域を含み、各領域が、所定の配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記方法が、
（ａ）複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が１つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
（ｂ）各反応領域で上記１～７１のいずれかに記載の方法に従って合成サイクルを行い、それにより各領域で所定の配列を有する１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、を含む、方法。
９０．合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、マイクロアレイを提供し、各領域が、所定の配列を有する１つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含む、上記８９に記載の方法。

Claims

所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、繰り返しの合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、
（Ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖が、リガーゼ酵素の作用によって、前記所定の配列の第１のヌクレオチドの付加により伸長され、
（Ｂ）前記第１の鎖にハイブリダイズされる二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素によって前記所定の配列の第２のヌクレオチドを加えることによって伸長され、
（Ｃ）次いで、前記二本鎖ポリヌクレオチドが、切断部位で切断され、
各サイクルの前記所定の配列の前記第１および第２のヌクレオチドが、切断後に、前記二本鎖ポリヌクレオチドにおいて保持され、前記第１のヌクレオチドおよび前記第２のヌクレオチドが、前記合成二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対においてパートナーヌクレオチドになる、方法。
（a）前記切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によって定義される、および／または
（b）各サイクルにおいて、前記第２の鎖の伸長の前に、前記二本鎖ポリヌクレオチド中に切断部位が作成され、任意に前記リガーゼ酵素の作用による工程（Ａ）の間に、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に組み込まれて、前記切断部位を定義し、さらに任意に前記第１のヌクレオチドおよび前記ユニバーサルヌクレオチドが、ポリヌクレオチド連結分子の構成成分であり、前記ポリヌクレオチド連結分子が、前記リガーゼ酵素の作用による工程（Ａ）の間に、前記二本鎖ポリヌクレオチドに連結され、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記二本鎖ポリヌクレオチドへの連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が伸長され、前記切断部位が作成される、および／または
（c）所与の合成サイクルにおいて、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第２の鎖に付加される、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記可逆的ターミネーター基が、次のサイクルの前記第２のヌクレオチドの前記次の合成サイクルにおける前記付加の前に、そのサイクルの前記組み込まれた第２のヌクレオチドから除去される、および／または
（d）連結反応が、粘着末端連結反応を含む、請求項１に記載の方法。
前記方法が、
（１）合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、前記支持鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖であり、前記合成鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖である、提供することと、
（２）粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を前記足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
（ｉ）前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記所定の配列の第１のヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が前記第１のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第１の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
（３）前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（４）連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、組み込まれた第１および第２のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
（５）前記第２のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第１の合成サイクルを行うことを含み、
前記方法が、
（６）粘着末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
（ｉ）前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第１の鎖が、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第１の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
（７）前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第２のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（８）前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記第１およびさらなる合成サイクル（複数可）の組み込まれた第１および第２のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
（９）前記第２のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
（１０）工程６～９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する前記二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む、請求項２に記載の方法。
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、前記切断部位で前記連結された足場ポリヌクレオチドを切断する工程の前に、前記可逆的ターミネーター基が、前記第２のヌクレオチドから代替的に除去される、請求項３に記載の方法。
（a）工程（１）において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第１のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、工程（７）で組み込まれる前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
第１およびさらなる合成サイクルにおいて、前記足場ポリヌクレオチド中の前記ヌクレオチド突出および前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端中の前記ヌクレオチド突出が、同じ数のヌクレオチドを含み、前記数が１以上であるか、または
（ｂ）工程（１）において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第１のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（３）において組み込まれた前記第１のサイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置ｎ＋１を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、工程（７）において組み込まれた前記次の／第２の合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端で、前記ヘルパー鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、前記第３の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対のパートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記１＋ｙヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第１のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置ｎを占め、工程（７）において組み込まれた前記さらなる合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置ｎ＋１を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、前記次の合成サイクルの前記第２のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端において、前記ヘルパー鎖の前記末端は、１＋ｙヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記１＋ｙヌクレオチドは、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記１＋ｙ突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記さらなる合成サイクルの前記第１のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置ｎ＋２＋ｘを占め、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対のパートナーヌクレオチドであり、
ｉ．位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対になるヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．連結後、位置ｎ＋１およびｎ＋２は、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第１および第２のヌクレオチド位置であり、
ｉｉｉ．ｙは、１以上である整数であり、
ｉｖ．ｘは、０以上である整数であり、
ｖ．前記足場ポリヌクレオチドにおけるｙの数は、好ましくは、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端におけるｙの数と同じ数であり、ｙが異なる数である場合、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端におけるｙの数は、好ましくは、前記足場ポリヌクレオチドにおけるｙの数よりも少なく、
ｖｉ．任意の所与の一連の第１のサイクルおよびさらなるサイクルにおいて、ｘに対して選択される数は、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ｙに対して選択される数－１である、
請求項３または請求項４に記載の方法。
（I）（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１およびｎ＋２は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第１／次のおよび第２のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義されるか、または
（II）（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１、ｎ＋２、およびｎ＋３は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における次の、第２の、および第３のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義されるか、または
（III）（ａ）前記第１のサイクルの連結工程（工程２）において、および全てのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
ｉ．そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合するように、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
ｉｉｉ．前記突出が、そのサイクルの前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含む１つのヌクレオチド突出を含むように、かつ
ｉｖ．前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置ｎは、その組み込み時にそのサイクルの前記所定の配列の前記第２のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、ｘは、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置ｎ＋３に対するヌクレオチド位置の数であり、前記数は、１～１０以上の整数であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
（ｂ）前記第１のサイクルの伸長工程（工程３）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第２のヌクレオチドが、前記第２の鎖に組み込まれ、前記第１の鎖中のパートナーヌクレオチドと対合され、
（ｃ）前記第１のサイクルの切断工程（工程４）において、および全てのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ＋２と位置ｎ＋１との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第１の鎖に付着したそのサイクルの前記第１のヌクレオチドとそのパートナーヌクレオチドと対合したそのサイクルの前記第２のヌクレオチドとを保持し、その際、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第１のヌクレオチドによって占められる位置は、次の合成サイクルにおけるヌクレオチド位置ｎとして定義されるか、または
（IV）第１およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断されるか、または
（V）第１およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置ｎ＋４＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置ｎ＋３＋ｘとｎ＋２＋ｘとの間で切断される、
請求項５（a）に記載の方法。
前記方法が、
（ｉ）工程（２）において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記第１のサイクルの前記所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、前記第１のサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
（ｉｉ）工程（３）において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第１のサイクルの前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第１のサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記第１のサイクルの前記第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、
（ｉｉｉ）切断後の工程（４）において、前記第１のサイクルの前記所定の配列の前記第１、第２、およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチド中に保持されるように、
（ｉｖ）工程（６）において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第１のヌクレオチドを含み、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
（ｖ）工程（６）において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第２のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の１つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記さらなるサイクルの前記第２およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、前記次のヌクレオチドの前記組み込み前にヌクレオチドから除去されるように、
（ｖｉ）切断後の工程（８）において、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の前記第１、第２、およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチド中に保持されるように、修正される、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
（a）前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程（４）および（８）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第１およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化されるか、または
（b）前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程（４）および（８）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第１およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次＋１のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、
請求項７に記載の方法。
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、前記所定の配列の第１のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第１のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
（a）任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（４）および／または（８）の前に、合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、前記足場ポリヌクレオチドが提供され、前記合成鎖が、ヘルパー鎖なしで提供される、および／または
（b）任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、工程（４）および／または（８）の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、
請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
（a）各切断工程が、２工程切断プロセスを含み、各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、したがって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含み、任意に前記第１の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、および／または
前記第２の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ、任意選択的に、脱塩基部位リアーゼ活性を有する前記酵素が、
（ｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ１、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎ番目）、または
（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩであるか、または
（b）各切断ステップが、切断酵素を用いて前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含む１工程切断プロセスを含み、前記酵素が、
（ｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、
（ｉｉｉ）ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、または
（ｉｖ）８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）である、
請求項１～５、６（i）、６（iv）、７および８（a）のいずれか一項に記載の方法。
前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含み、任意に（a）前記酵素が、ヌクレオチド位置ｎ＋１とｎとの間の前記支持鎖を切断する、および／または（b）前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、
請求項１～４、５（b）、６（ii）、６（v）、７および８（b）のいずれか一項に記載の方法。
任意の１つ以上または全ての合成サイクルにおいて、
（ａ）工程（１）／（６）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の部分とが、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されており、
（ｂ）工程（２）／（６）において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の部分とが、前記ポリヌクレオチド連結分子において、前記相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている、請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、任意に１つ以上の共有結合を介して、共通の表面に繋留されており、さらに任意に前記１つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり、より好ましくは前記共通の表面上の前記官能基が、ブロモアセチル基であり、任意に、前記ブロモアセチル基が、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、
請求項３～１３のいずれか一項に記載の方法。
（a）合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われ、任意に前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムであり、より好ましくは前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、および／または
（b）合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを提供する、および／または
（c）合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはＰＣＲによって増幅される、
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
所定の配列を有するポリヌクレオチドをアセンブリする方法であって、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含み、任意に前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、好ましくは連結によって一緒に接合され、さらに任意に、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、
方法。