JPWO2019082935A1 - Nucleotide construct for expression of spider silk protein in photosynthetic bacteria - Google Patents
Nucleotide construct for expression of spider silk protein in photosynthetic bacteria Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2019082935A1 JPWO2019082935A1 JP2019551207A JP2019551207A JPWO2019082935A1 JP WO2019082935 A1 JPWO2019082935 A1 JP WO2019082935A1 JP 2019551207 A JP2019551207 A JP 2019551207A JP 2019551207 A JP2019551207 A JP 2019551207A JP WO2019082935 A1 JPWO2019082935 A1 JP WO2019082935A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- spider silk
- masp1
- photosynthetic
- silk protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 193
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 172
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 80
- 229920001872 Spider silk Polymers 0.000 title claims abstract description 71
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 66
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 48
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 101150108167 TAC1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 159
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 19
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 14
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 10
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 5
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000006325 marine broth Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108010000241 Arthropod Proteins Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 4
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 4
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 4
- 241000238902 Nephila clavipes Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 239000000386 donor Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000006327 marine agar Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 3
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 241001221062 Nephila clavata Species 0.000 description 2
- 241001478305 Rhodovulum Species 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001503681 Afifella Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241001157788 Araneus Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000191368 Chlorobi Species 0.000 description 1
- 241001142109 Chloroflexi Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241001025319 Etheostoma collis Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000207155 Heliobacterium Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 229920000271 Kevlar® Polymers 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101100425947 Mus musculus Tnfrsf13b gene Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000131970 Rhodospirillaceae Species 0.000 description 1
- 241001495161 Rhodovulum euryhalinum Species 0.000 description 1
- 241001459586 Rhodovulum imhoffii Species 0.000 description 1
- 241001495152 Rhodovulum sulfidophilum Species 0.000 description 1
- 241000092389 Rhodovulum tesquicola Species 0.000 description 1
- 241001447547 Rhodovulum visakhapatnamense Species 0.000 description 1
- 241000848330 Roseospira goensis Species 0.000 description 1
- 241001231768 Roseospira marina Species 0.000 description 1
- 241000831647 Roseospira visakhapatnamensis Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000852 hydrogen donor Substances 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
Abstract
光合成細菌においてタンパク質発現を誘導し得るプロモーターに機能的に連結された、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを含む、ヌクレオチド構築物を、光合成細菌に導入し、当該タンパク質を発現させることに成功した。光合成細菌は、給餌を必要とすることなく維持することができるため、クモ糸タンパク質の合成コストを低く抑えられることが可能になった。We have succeeded in introducing a nucleotide construct containing a nucleotide encoding a spider silk protein, which is functionally linked to a promoter capable of inducing protein expression in a photosynthetic bacterium, into the photosynthetic bacterium and expressing the protein. Since photosynthetic bacteria can be maintained without the need for feeding, it has become possible to keep the cost of synthesizing spider silk proteins low.
Description
本発明は、クモ糸タンパク質を光合成細菌にて発現させるためのヌクレオチド構築物に関する。また本発明は、該構築物を含む光合成細菌、及び該光合成細菌を用いたクモ糸タンパク質の製造方法に関する。 The present invention relates to nucleotide constructs for expressing spider silk proteins in photosynthetic bacteria. The present invention also relates to a photosynthetic bacterium containing the construct and a method for producing a spider silk protein using the photosynthetic bacterium.
クモは、異なる７種類の糸繊維を目的に応じて産生する。７種の糸繊維は、異なる７つの腺（大瓶状腺（主管足瓶嚢腺）、小瓶状腺、鞭状腺、ブドウ状腺、梨状腺、集合腺、管状腺）から各々抽出される。 Spiders produce seven different types of yarn fibers according to their purpose. Seven types of thread fibers are extracted from seven different glands (large bottle-shaped gland (main tube foot sac gland), vial-shaped gland, whip-shaped gland, grape-shaped gland, pear-shaped gland, collective gland, and tubular gland). ..
クモ糸繊維の主成分はタンパク質であり、その主な構造として、高度に保存された３つのドメインを有する。アラニンリッチ領域（結晶領域、ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）及びグリシンリッチ領域（非結晶領域、ｌｅｓｓ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）が、交互に配置されているコアドメインと、その両側にある非反復型のアミノ末端ドメインとカルボキシル末端ドメインである。そして、このような構造を採ることにより、ランダムコイル構造、βシート構造及びヘリックス構造を有し、これら構造の混在により、クモ糸繊維は優れた特性を発揮する。 The main component of spider silk fibers is protein, which has three highly conserved domains as its main structure. The alanine-rich region (crystalline region, crystalline) and glycine-rich region (non-crystalline region, less-crystalline) are alternately arranged in the core domain and the non-repetitive amino-terminal domains and carboxyl-terminal domains on both sides of the core domain. is there. By adopting such a structure, it has a random coil structure, a β-sheet structure and a helix structure, and the mixture of these structures causes the spider silk fiber to exhibit excellent characteristics.
例えば、クモ糸繊維は、抗張力及び伸張性といった材料特性において傑出している。さらに、鉄及びケブラー（登録商標）よりも靭性において優れ、クモ糸繊維は、天然ポリマー及び人工ポリマーにおいて、最も強靭な材料であることも知られている。その上、生分解性、生物的適合性及び抗菌性も有しているため、ドラッグデリバリー及びティッシュエンジニアリングといった生物医学的応用においても有用である。このように、クモ糸繊維は、多種多様な分野おいて、今後有望なスーパーマテリアルとして注目されている。 For example, spider silk fibers are outstanding in material properties such as tensile strength and extensibility. In addition, it is superior in toughness to iron and Kevlar®, and spider silk fibers are also known to be the toughest materials in natural and artificial polymers. In addition, it is biodegradable, biocompatible and antibacterial, making it useful in biomedical applications such as drug delivery and tissue engineering. As described above, spider silk fiber is attracting attention as a promising super material in a wide variety of fields.
しかしながら、クモは共食いや縄張り争いを行なうため、クモ糸タンパク質の大規模生産は、異種宿主においてしか達成することができず、例えば、組み換えクモ糸タンパク質の発現は、細菌、酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫（カイコ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、植物（タバコ及びジャガイモ）及び動物（マウス及びヤギ）において成功したことが報告されている（非特許文献１及び２）。 However, because spiders engage in co-eating and struggling for rope, large-scale production of spider silk proteins can only be achieved in heterologous hosts, for example, expression of recombinant spider silk proteins is carried out by bacteria, yeast (Pichia pastoris), etc. It has been reported to be successful in insects (Spider Bombyx mori), plants (spiders and potatoes) and animals (mouses and goats) (Non-Patent Documents 1 and 2).
本発明は、合成コストを抑えてクモ糸タンパク質を製造することを、可能とすることを目的とする。 An object of the present invention is to make it possible to produce a spider silk protein at a low synthesis cost.
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、クモ糸タンパク質を製造する宿主として、上記酵母、昆虫、植物及び動物といった従属栄養生物の代わりに、光合成独立栄養生物を用いることを構想した。当該生物は、環境中から得られる二酸化炭素等及び光を用いることによって、給餌を必要とすることなく、維持することができるため、この生物をクモ糸タンパク質の製造に利用することができれば、合成コストを低くすることが可能となる。 As a result of diligent research to achieve the above object, the present inventors use photosynthetic autotrophs instead of the heterotrophs such as yeast, insects, plants and animals as hosts for producing spider silk proteins. I envisioned that. The organism can be maintained without the need for feeding by using carbon dioxide or the like obtained from the environment and light. Therefore, if this organism can be used for the production of spider silk protein, it will be synthesized. It is possible to reduce the cost.
そこで、本発明者らは、ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来大瓶状腺縦糸タンパク質１（ＭａＳｐ１）における反復配列（以下「単量体」とも称する）を、海洋性紅色非硫黄光合成細菌（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）において発現させることを試みた。より具体的には、先ず、前記単量体を１個含むＭａＳｐ１単量体タンパク質、又は前記単量体を複数含むＭａＳｐ１多量体タンパク質をコードするプラスミドベクターを大腸菌にてクローニングし、そして、前記光合成細菌に接合伝達により導入した。 Therefore, the present inventors have arranged repetitive sequences (hereinafter, also referred to as “monomers”) in the large bottle-shaped gland warp protein 1 (MaSp1) derived from Nephila clavipe in marine red non-sulfur photosynthetic bacteria (Rhodovulum sulfidofilum). Attempted to express. More specifically, first, a plasmid vector encoding a MaSp1 monomer protein containing one of the monomers or a MaSp1 multimeric protein containing a plurality of the monomers was cloned in Escherichia coli, and then the photosynthesis. It was introduced into bacteria by conjugation transmission.
その結果、前記光合成細菌におけるＭａＳｐ１単量体タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより検出することができた。また同様に、ＭａＳｐ１多量体タンパク質もウエスタンブロッティングにより検出することができ、本発明を完成するに至った。 As a result, the expression of MaSp1 monomeric protein in the photosynthetic bacteria could be detected by SDS-PAGE and Western blotting. Similarly, the MaSp1 multimeric protein could also be detected by Western blotting, which completed the present invention.
すなわち、本発明は、クモ糸タンパク質を発現させるためのヌクレオチド構築物、該構築物を含む光合成細菌、及び該光合成細菌を用いたクモ糸タンパク質の製造方法に関し、より具体的には以下を提供する。
＜１＞ 光合成細菌においてタンパク質発現を誘導し得るプロモーターに機能的に連結された、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを含む、ヌクレオチド構築物。
＜２＞ 前記光合成細菌が紅色光合成細菌である、＜１＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜３＞ 前記プロモーターがＴａｃ１プロモーターである、＜１＞又は＜２＞に記載のヌクレオチド構築物。
＜４＞ 前記クモ糸タンパク質がＭａＳｐ１タンパク質である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のヌクレオチド構築物。
＜５＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載のヌクレオチド構築物が導入された、光合成細菌。
＜６＞ クモ糸タンパク質を製造する方法であって、
＜５＞に記載の光合成細菌を、光照射下において培養する工程と、
前記培養にて得られた光合成細菌の培養物から、クモ糸タンパク質を回収する工程とを、含む方法。That is, the present invention provides the following with respect to a nucleotide construct for expressing a spider silk protein, a photosynthetic bacterium containing the construct, and a method for producing a spider silk protein using the photosynthetic bacterium.
<1> A nucleotide construct containing a nucleotide encoding a spider silk protein, which is functionally linked to a promoter capable of inducing protein expression in a photosynthetic bacterium.
<2> The nucleotide construct according to <1>, wherein the photosynthetic bacterium is a purple photosynthetic bacterium.
<3> The nucleotide construct according to <1> or <2>, wherein the promoter is a Tac1 promoter.
<4> The nucleotide construct according to any one of <1> to <3>, wherein the spider silk protein is a MaSp1 protein.
<5> A photosynthetic bacterium into which the nucleotide construct according to any one of <1> to <4> has been introduced.
<6> A method for producing spider silk protein.
The step of culturing the photosynthetic bacterium according to <5> under light irradiation, and
A method including a step of recovering a spider silk protein from a culture of photosynthetic bacteria obtained in the above culture.
本発明によれば、宿主に給餌することなく、クモ糸タンパク質を製造することができるため、合成コストを抑えることが可能となる。 According to the present invention, since the spider silk protein can be produced without feeding the host, it is possible to suppress the synthesis cost.
（ヌクレオチド構築物）
本発明のヌクレオチド構築物は、光合成細菌においてタンパク質発現を誘導し得るプロモーターに機能的に連結された、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを含むことを特徴とする。(Nucleotide construct)
The nucleotide constructs of the present invention are characterized by containing nucleotides encoding spider silk proteins that are functionally linked to promoters capable of inducing protein expression in photosynthetic bacteria.
本発明における「クモ」とは、クモ目に分類される動物、好ましくは造網性のクモ目に分類される動物であり、さらに好ましくはジョロウグモ、オニグモであり、より好ましくはジョロウグモである。 The "spider" in the present invention is an animal classified into the order Spider, preferably an animal classified into the order Netrinic spider, more preferably Nephila clavata, Araneus spider, and more preferably Nephila clavata.
「クモの糸」又は「クモ糸」は、クモ絹糸とも言われ、クモの体内の絹糸腺で産生され、腹部後部にある出糸突起（糸疣）の出糸管より吐糸される。クモの体内の絹糸腺はその形から梨状腺、ブドウ状腺、瓶状腺、管状腺、集合腺及び鞭状腺に分けられる。「クモ絹糸」は、一般に、その機能及び成分から、牽引糸（別名：しおり糸、ひき糸）、わく糸、縦糸、横糸及びけい留糸等に分けられる。 "Spider thread" or "spider thread" is also called spider silk thread, is produced by the silk thread gland in the body of the spider, and is spit out from the thread tube of the spider protrusion (wart) at the back of the abdomen. The silk glands in the spider's body are divided into pear glands, grape glands, bottle glands, tubular glands, collective glands and whip glands according to their shape. "Spider silk thread" is generally classified into towing thread (also known as bookmark thread, ground thread), frame thread, warp thread, weft thread, clasp thread and the like according to its function and component.
本発明のヌクレオチド構築物がコードする「クモ糸タンパク質」は、クモ糸を構成するタンパク質のみならず、クモ糸を構成するタンパク質の特徴を有するタンパク質（類似タンパク質）のことである。天然のクモ糸タンパク質と全く同じ配列である必要はなく、人工的に改変されたタンパク質であっても良いが、本発明にかかる「クモ糸タンパク質」は、βシート構造を形成するアラニンリッチ領域（結晶領域）とランダムコイル構造の形成に関与するグリシンリッチ領域（非結晶領域）とが交互に配置された構造を含むタンパク質であることが好ましい。 The "spider silk protein" encoded by the nucleotide construct of the present invention is not only a protein that constitutes spider silk, but also a protein (similar protein) that has the characteristics of a protein that constitutes spider silk. The sequence does not have to be exactly the same as that of the natural spider protein, and it may be an artificially modified protein, but the "spider protein" according to the present invention is an alanine-rich region forming a β-sheet structure ( It is preferable that the protein contains a structure in which the crystalline region) and the glycine-rich region (non-crystalline region) involved in the formation of the random coil structure are alternately arranged.
クモ糸タンパク質の例として、代表的には、スピドロインタンパク質が挙げられる。スピドロインタンパク質は、フィブロインとも言われ、天然のクモの大瓶状腺等で紡糸され、主にスピドロインＩ（ＭａＳｐ１）とスピドロインII（ＭａＳｐ２）とが挙げられる。スピドロイン関連タンパク質等のアミノ酸配列として、典型的には、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）に収録されている、下記表１〜４において示されるアクセッション番号に記載のポリペプチドが挙げられる。 A typical example of a spider silk protein is a spiderin protein. The spiderin protein, also called fibroin, is spun in a large bottle-shaped gland of a natural spider, and mainly includes spiderin I (MaSp1) and spiderin II (MaSp2). Amino acid sequences of spidroin-related proteins and the like typically include the polypeptides listed in the accession numbers shown in Tables 1-4 below, which are recorded at the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
なお、タンパク質をコードする遺伝子の配列は、自然界において変異し、それに伴い、当該タンパク質のアミノ酸配列も変化し得る。したがって、本発明にかかる「クモ糸タンパク質」には、表１〜４に示す典型的な配列に特定されたタンパク質（野生型クモ糸タンパク質）のみならず、天然に変異した配列からなるタンパク質（野生型クモ糸タンパク質の相同体、野生型クモ糸タンパク質の天然変異体）も含まれるものであることは理解されたい。 The sequence of the gene encoding the protein is mutated in nature, and the amino acid sequence of the protein can be changed accordingly. Therefore, the "spider silk protein" according to the present invention includes not only the proteins specified in the typical sequences shown in Tables 1 to 4 (wild-type spider silk proteins) but also proteins consisting of naturally mutated sequences (wild). It should be understood that homologues of type spider protein, natural variants of wild type spider protein) are also included.
また、本発明にかかる「クモ糸タンパク質」は、このような天然に存在するタンパク質（野生型クモ糸タンパク質、野生型クモ糸タンパク質の相同体、及びそれらの天然変異体）のみならず、上述のとおり、アミノ酸配列が人工的に改変されたもの（クモ糸タンパク質改変体）であってもよい。 Further, the "spider silk protein" according to the present invention includes not only such naturally occurring proteins (wild-type spider silk protein, homologues of wild-type spider silk protein, and natural variants thereof), as well as the above-mentioned. As shown, the amino acid sequence may be artificially modified (spider silk protein variant).
また「クモ糸タンパク質」は、全長のみならず、その部分的な断片であってもよい。「部分的な断片」としては特に制限はなく、例えば、アラニンリッチ領域及びグリシンリッチ領域が交互に配置された構造を含む反復単位（単量体）、その反復単位が繰り返してなるコアドメイン、そのコアドメインの両端に位置する非反復型ドメイン（非反復型アミノ末端ドメイン、非反復型カルボキシル末端ドメイン）が挙げられるが、好ましくは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる、ＭａＳｐ１単量体タンパク質が挙げられる（なお、当該単量体タンパク質は、アクセッション番号：Ｐ１９８３７にて特定されるＭａＳｐ１タンパク質に由来する）。また、後述の実施例において示すとおり、クモ糸タンパク質として、前記単量体タンパク質を１個含むタンパク質（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）も好適に用いられる。さらに、前記単量体タンパク質を複数含む、ＭａＳｐ１多量体タンパク質も好適に用いられる。かかる多量体タンパク質として、前記単量体タンパク質を２個含む場合は、例えば、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、前記単量体タンパク質を３個含む場合は、例えば、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられ、前記単量体タンパク質を６個含む場合は、例えば、配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。 Further, the "spider silk protein" may be a partial fragment thereof as well as the full length. The "partial fragment" is not particularly limited, and for example, a repeating unit (monomer) containing a structure in which alanine-rich regions and glycine-rich regions are alternately arranged, a core domain in which the repeating units are repeated, and the like. Non-repetitive domains (non-repetitive amino-terminal domains, non-repetitive carboxyl-terminal domains) located at both ends of the core domain can be mentioned, but a MaSp1 monomer consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is preferable. Examples thereof include proteins (note that the monomeric protein is derived from the MaSp1 protein specified by accession number: P19837). Further, as shown in Examples described later, a protein containing one of the monomeric proteins (for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) is also preferably used as the spider silk protein. Further, a MaSp1 multimeric protein containing a plurality of the monomeric proteins is also preferably used. As such a multimeric protein, when two of the monomeric proteins are contained, for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 can be mentioned, and when three of the monomeric proteins are contained, for example, for example. A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be mentioned, and when 6 of the monomeric proteins are contained, for example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 can be mentioned.
本発明にかかる「クモ糸タンパク質」は、前記典型的なアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２〜６０個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜４０個、さらに好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜１０個（例えば、２〜８個、２〜４個、２個）である。 The "spider silk protein" according to the present invention also includes a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the typical amino acid sequence. Here, the term "plurality" is not particularly limited, but is usually 2 to 60, preferably 2 to 50, more preferably 2 to 40, still more preferably 2 to 30, and even more preferably 2 to 20. , More preferably 2 to 10 (for example, 2 to 8, 2 to 4, 2).
また、本発明にかかる「クモ糸タンパク質」は、前記典型的なアミノ酸配列との相同性が、５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上）であることが好ましく、８０％以上（例えば、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）であることがより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることがより好ましい。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。かかるプログラムを用いた解析方法の具体的な手法は公知であり、デフォルトのパラメーターを用いて解析することができる。また、本発明にかかる「相同性」には、「同一性」及び「類似性」が含まれる。 Further, the "spider silk protein" according to the present invention preferably has 50% or more (for example, 60% or more, 70% or more) homology with the typical amino acid sequence, and 80% or more (for example, 70% or more). , 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more), and 90% or more (for example, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more) is more preferable. Sequence homology can be determined using a BLASTP (amino acid level) program (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). Specific methods of analysis methods using such programs are known, and analysis can be performed using default parameters. Further, the "homology" according to the present invention includes "identity" and "similarity".
また、本発明にかかるヌクレオチド構築物がコードする「クモ糸タンパク質」には、「他のタンパク質」が直接又は間接的に付加されていてもよい。「他のタンパク質」としては特に制限はなく、本発明にかかるクモ糸タンパク質の精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、Ｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、また本発明にかかるクモ糸タンパク質の検出を容易とする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。また、これら他のタンパク質とクモ糸タンパク質とを分離するために、トロンビン認識配列、エンテロキナーゼ認識配列等の切断酵素によって認識される配列が、クモ糸タンパク質と他のタンパク質との間に配置されていてもよい。 In addition, "another protein" may be directly or indirectly added to the "spider silk protein" encoded by the nucleotide construct according to the present invention. The "other protein" is not particularly limited, and for the purpose of facilitating the purification of the spider silk protein according to the present invention, polyhistidine (His) tag (tag) protein, FLAG-tag protein (registered trademark, Sigma-Aldrich), S-tag, glutathione-S-transferase (GST) and other purification tag proteins are preferably used, and GFP is used for the purpose of facilitating the detection of the spider silk protein according to the present invention. Fluorescent proteins such as, and tag proteins for detection such as chemically luminescent proteins such as luciferase are preferably used. In addition, in order to separate these other proteins from the spider silk protein, a sequence recognized by a cleaving enzyme such as a thrombin recognition sequence or an enterokinase recognition sequence is arranged between the spider silk protein and the other protein. You may.
かかる他のタンパク質が付加されたクモ糸タンパク質としては、特に制限はないが、後述の光合成細菌における発現効率がより良いという観点から、配列番号；７又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が好ましい。なお、配列番号；７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質においては、Ｎ末から順に、Ｈｉｓタグ、トロンビン認識配列、Ｓタグ及びエンテロキナーゼ認識配列からなるタグタンパク質（配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、並びに配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＭａＳｐ１単量体タンパク質が配置されているタンパク質である、また、配列番号；８に記載のアミノ酸配列は、配列番号；７に記載のアミノ酸配列から、トロンビン認識配列及びＳタグ直後のプロリン残基が除外されたものとなっている（詳細については、下記表５を参照）。 The spider silk protein to which the other protein is added is not particularly limited, but a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 8 is preferable from the viewpoint of better expression efficiency in photosynthetic bacteria described later. .. In the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, the tag protein consisting of His tag, thrombin recognition sequence, S tag and enterokinase recognition sequence (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6) is in this order from the N-terminal. A protein consisting of) and a MaSp1 monomeric protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are arranged, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is set forth in SEQ ID NO: 7. From the amino acid sequence of, the thrombin recognition sequence and the proline residue immediately after the S tag are excluded (see Table 5 below for details).
また、後述の実施例において示すとおり、他のタンパク質が付加されたクモ糸タンパク質として、Ｎ末から、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と、配列番号：３、４又は５に記載のアミノ酸配列からなるＭａＳｐ１多量体タンパク質が配置されているタンパク質も、本発明において好適に用いられる。 Further, as shown in Examples described later, as spider silk proteins to which other proteins have been added, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 from the N-terminal and a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 3, 4 or 5 are described. A protein in which a MaSp1 multimeric protein consisting of the amino acid sequence of is arranged is also preferably used in the present invention.
本発明のヌクレオチド構築物は、上述のクモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドに機能的に連結されることにより、光合成細菌において当該タンパク質の発現を誘導し得る「プロモーター」を少なくとも含む必要がある。かかる「プロモーター」としては、特に制限はなく、例えば、Ｔａｃ１プロモーター（典型的には、配列番号：１４に記載のヌクレオチド配列からなるプロモーター）、ｌａｃプロモーター（典型的には、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列からなるプロモーター）、ｐｕｆプロモーター（典型的には、配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列からなるプロモーター）が挙げられるが、光合成細菌における発現効率がより良いという観点から、Ｔａｃ１プロモーターが好ましい。また、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよく、例えば、温度、ｐＨ、ホルモン、代謝物（例えば、ラクトース、マンニトール及びアミノ酸）、光、浸透ポテンシャル（例えば、塩誘導）、重金属又は抗生物質によって誘導されるものが挙げられる。 The nucleotide construct of the present invention must include at least a "promoter" capable of inducing expression of the protein in photosynthetic bacteria by being functionally linked to the nucleotide encoding the spider silk protein described above. The "promoter" is not particularly limited, and is, for example, the Tac1 promoter (typically, the promoter consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14), the lac promoter (typically, set forth in SEQ ID NO: 15). (Promoter consisting of the nucleotide sequence of) and puf promoter (typically, the promoter consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16), but the Tac1 promoter is preferable from the viewpoint of better expression efficiency in photosynthetic bacteria. .. The promoter may also be an inducible promoter, for example by temperature, pH, hormones, biotransformers (eg lactose, mannitol and amino acids), light, osmotic potential (eg salt induction), heavy metals or antibiotics. Some are induced.
なお、本発明にかかる「プロモーター」は、前記典型的なヌクレオチド配列において１又は複数のヌクレオチドが置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたヌクレオチド配列からなるタンパク質も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２〜２０個、好ましくは２〜１５個、より好ましくは２〜１０個（例えば、２〜９個、２〜８個、２〜７個、２〜６個）、さらに好ましくは２〜５個（例えば、２〜４個、２〜３個、２個）である。 The "promoter" according to the present invention also includes a protein consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are substituted, deleted, added, and / or inserted in the typical nucleotide sequence. Here, the term "plurality" is not particularly limited, but is usually 2 to 20, preferably 2 to 15, more preferably 2 to 10 (for example, 2 to 9, 2 to 8, 2 to 7). 2 to 6), more preferably 2 to 5 (eg, 2 to 4, 2 to 3 and 2).
また、本発明にかかる「プロモーター」は、前記典型的なヌクレオチド配列との相同性が、５０％以上（例えば、６０％以上、７０％以上）であることが好ましく、８０％以上（例えば、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上）であることがより好ましく、９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることがより好ましい。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮのプログラムを利用して決定することができる。かかるプログラムを用いた解析方法の具体的な手法は公知であり、デフォルトのパラメーターを用いて解析することができる。 Further, the "promoter" according to the present invention preferably has a homology with the typical nucleotide sequence of 50% or more (for example, 60% or more, 70% or more), and 80% or more (for example, 85%). % Or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more), and 90% or more (for example, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95%). Above, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more) is more preferable. Sequence homology can be determined using the BLASTN program. Specific methods of analysis methods using such programs are known, and analysis can be performed using default parameters.
さらに、本発明のヌクレオチド構築物は、前記プロモーターの他、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを光合成細菌にて発現（転写及び翻訳）するのに寄与する他の制御配列、例えば、複製開始点、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、ポリリンカー、エンハンサー、サイレンサー、リボゾーム結合部位等を適宜含むことができる。一般に、前記プロモーターの下流に、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドが位置し、さらに該遺伝子の下流にターミネーターが位置する。 In addition, the nucleotide constructs of the invention include the promoter and other regulatory sequences that contribute to the expression (transcription and translation) of nucleotides encoding spider silk proteins in photosynthetic bacteria, such as replication initiation sites, terminators, etc. A poly A addition signal, a polylinker, an enhancer, a silencer, a ribosome binding site and the like can be appropriately included. In general, the nucleotide encoding the spider silk protein is located downstream of the promoter, and the terminator is located further downstream of the gene.
さらに、前記発現を制御する配列以外に発現を誘導する配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導する配列としては、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。 Further, a sequence that induces expression may be included in addition to the sequence that controls expression. Examples of the sequence that induces such expression include a lactose operon that can induce the expression of a gene located downstream by adding isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG).
また、光合成細菌に接合伝達法によって導入される場合、本発明のヌクレオチド構築物は、ｍｏｂ、ｔｒａ、ｏｒｉＴ及びｏｒｉＶ遺伝子群から選択される少なくとも１の遺伝子を含むものであることが望ましい。なお、これら遺伝子は細菌間の接合伝達に必要な遺伝子であるが、全て同じヌクレオチド構築物上になくても良く、別のヌクレオチド構築物（ヘルパープラスミドＤＮＡ等）に分配し、それを併用することによって接合伝達を行うことができる。 Further, when introduced into a photosynthetic bacterium by a conjugation transfer method, it is desirable that the nucleotide construct of the present invention contains at least one gene selected from the mob, tra, oriT and oriV gene groups. These genes are genes required for conjugation transmission between bacteria, but they do not have to be all on the same nucleotide construct, and they are conjugated by distributing them to another nucleotide construct (helper plasmid DNA, etc.) and using them in combination. Can communicate.
さらに、本発明のヌクレオチド構築物は、その発現を指標として形質転換された光合成細菌を選択できるという観点から、マーカー遺伝子を含むものであってもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等の酵素遺伝子（レポーター遺伝子）が挙げられる。 Furthermore, the nucleotide construct of the present invention may contain a marker gene from the viewpoint that transformed photosynthetic bacteria can be selected using its expression as an index. Examples of the marker gene include drug resistance genes such as canamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, hyglomycin resistance gene, nutritional requirement gene, luciferase gene, β-galactosidase gene, and chloramphenicolacetyl. Examples thereof include an enzyme gene (reporter gene) such as a transferase (CAT) gene.
また、このようなヌクレオチド構築物の形態としては、例えば、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等のクローニングベクターが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではないが、プラスミドＤＮＡが好ましく、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２、ｐＫＴ２３０、ｐＢＨＲ１等の広域宿主プラスミドＤＮＡがより好ましい。 In addition, examples of the form of such a nucleotide construct include cloning vectors such as plasmid DNA, cosmid DNA, and phage DNA, but the plasmid DNA is preferable, and pBBR1MCS2 and pKT230 are not particularly limited thereto. , PBHR1 and the like, more preferred broad host plasmid DNA.
本発明のヌクレオチド構築物調製の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。例えば、本発明のヌクレオチド構築物を調製するには、後述の実施例において示すように、クモ糸タンパク質、また必要に応じて前記他のタンパク質もコードするヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法等が採用される。 As the procedure and method for preparing a nucleotide construct of the present invention, those commonly used in the field of genetic engineering can be used. For example, in order to prepare the nucleotide construct of the present invention, as shown in Examples described later, a spider silk protein and, if necessary, a nucleotide encoding the other protein are cleaved with an appropriate restriction enzyme and suitable. A method of inserting and ligating into a restriction enzyme site or a multicloning site of a vector is adopted.
また、このようにして挿入されるクモ糸タンパク質等をコードするヌクレオチドは、宿主細胞での発現量を上げるためにコドンの使用頻度を宿主細胞に合わせて最適化することが好ましい。かかるコドンの最適化は公知の方法で行うことができる。また、当該最適化には、使用頻度の高いコドンへの同義置換のみならず、使用頻度の低いいコドン（レアコドン）の削除も含まれる。さらに、本発明において、コドンの使用頻度を合わせる対象となる宿主細胞は、通常、光合成細菌となるが、後述の接合伝達法を用いる場合には、レシピエントとなる光合成細菌のみならず、ドナーとなる細菌（後述の実施例における、大腸菌）に合わせてコドンの使用頻度を最適化しても良い。 Further, for the nucleotide encoding the spider silk protein or the like inserted in this way, it is preferable to optimize the frequency of codon use according to the host cell in order to increase the expression level in the host cell. Such codon optimization can be performed by known methods. In addition, the optimization includes not only synonymous substitution with frequently used codons but also deletion of less frequently used codons (rare codons). Further, in the present invention, the host cell for which the frequency of codon use is adjusted is usually a photosynthetic bacterium, but when the conjugation transmission method described later is used, not only the photosynthetic bacterium as the recipient but also the donor The frequency of codon use may be optimized according to the bacterium (Escherichia coli in the examples described later).
（光合成細菌の形質転換体）
本発明は、上述のヌクレオチド構築物が導入された光合成細菌を提供する。(Transformant of photosynthetic bacteria)
The present invention provides a photosynthetic bacterium into which the above-mentioned nucleotide construct has been introduced.
本発明において、「光合成細菌」とは、光合成を行える細菌であればよく、酸素非発生型光合成細菌であってもよく、また酸素発生型光合成細菌（藍色細菌）であってもよい。酸素非発生型光合成細菌としては、紅色細菌（紅色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌）、緑色細菌（緑色非硫黄細菌、緑色硫黄細菌）、ヘリオバクテリアが挙げられるが、好気性条件下でも生存可能であるため、扱い易く、メンテナンスが容易であるという観点から、好ましくは紅色細菌であり、さらに、好気的で暗所又は嫌気的で明所な条件下でも増殖でき、より扱い易く、メンテナンスが容易であるという観点から、また海水等の高塩度の条件下における培養となるため、培養中のクロスコンタミネーションも最小限に抑えることがし易いという観点からも、より好まししくは紅色非硫黄細菌である。より具体的に、本発明にかかる「光合成細菌」の好適な例として、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ （Ａｆｉｆｅｌｌａ） ｍａｒｉｎａ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｅｕｒｙｈａｌｉｎｕｍ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｉｍｈｏｆｆｉｉ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｔｅｓｑｕｉｃｏｌａ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｖｉｓａｋｈａｐａｔｎａｍｅｎｓｅ、Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ ｍａｒｉｎａ、Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ ｇｏｅｎｓｉｓ、Ｒｏｓｅｏｓｐｉｒａ ｖｉｓａｋｈａｐａｔｎａｍｅｎｓｉｓが、挙げられる。 In the present invention, the "photosynthetic bacterium" may be any bacterium capable of photosynthesis, may be an oxygen-evolving photosynthetic bacterium, or may be an oxygen-evolving photosynthetic bacterium (blue bacterium). Examples of non-oxygen-generating photosynthetic bacteria include purple bacteria (purple non-sulfur bacteria, red sulfur bacteria), green bacteria (green non-sulfur bacteria, green sulfur bacteria), and heliobacterium, which can survive under aerobic conditions. Therefore, from the viewpoint of being easy to handle and easy to maintain, it is preferably a purple bacterium, and can grow even under aerobic and dark or anaerobic and bright conditions, and is easier to handle and maintain. From the viewpoint of being cultivated under high salt conditions such as seawater, and from the viewpoint that it is easy to minimize cross-contamination during culturing, more preferably, purple non-sulfur. It is a bacterium. More specifically, suitable examples of the present invention "photosynthetic bacteria", Rhodovulum sulfidophilum, Rhodopseudomonas (Afifella) marina, Rhodovulum euryhalinum, Rhodovulum imhoffii, Rhodovulum tesquicola, Rhodovulum visakhapatnamense, Roseospira marina, Roseospira goensis, is Roseospira visakhapatnamensis, Can be mentioned.
かかる光合成細菌へのヌクレオチド構築物導入方法（形質転換法）としては、特に制限はなく、例えば、接合伝達法、ペプチドを用いた導入法、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、スフェロプラスト法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポソーム（カチオン性、膜融合性、ｐＨ感受性等）を用いた方法が挙げられる。 The method for introducing a nucleotide construct (transformation method) into such a photosynthetic bacterium is not particularly limited, and is, for example, a conjugation transfer method, a peptide-based introduction method, an electroporation method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, or a spheroplast. Examples thereof include a method, a lipofection method, a DEAE dextran method, and a method using liposomes (cationic, membrane-fused, pH-sensitive, etc.).
また、かかる方法により光合成細菌が形質転換されたかどうかは、クモ糸タンパク質をコードするヌクレオチドを、ＰＣＲやシークエンシング等により検出することにより、また当該タンパク質を免疫学的手法（ウエスタンブロッティング等）により検出することにより確認することができる。さらに、本発明のヌクレオチド構築物が、上記マーカー遺伝子を含むものである場合には、そのマーカーに応じた選択条件下にて培養することにより、確認することもできる。 Whether or not the photosynthetic bacterium was transformed by such a method is detected by detecting the nucleotide encoding the spider silk protein by PCR, sequencing, or the like, and by an immunological method (Western blotting, etc.). It can be confirmed by doing. Further, when the nucleotide construct of the present invention contains the above marker gene, it can be confirmed by culturing under the selection conditions according to the marker.
（クモ糸タンパク質の製造方法）
本発明のクモ糸タンパク質製造方法は、
本発明の光合成細菌を、光照射下において培養する工程と、
前記培養にて得られた光合成細菌の培養物から、クモ糸タンパク質を回収する工程とを、含むことを特徴とする。(Manufacturing method of spider silk protein)
The method for producing spider silk protein of the present invention
A step of culturing the photosynthetic bacterium of the present invention under light irradiation,
It is characterized by including a step of recovering a spider silk protein from a culture of photosynthetic bacteria obtained in the above culture.
本発明にかかる培養工程において、光合成細菌に照射する光としては、当該細菌が吸収し得る波長の光であれば良く、例えば、紅色光合成細菌であれば、波長６２０ｎｍ以上の赤色光（波長：〜７００ｎｍ、例えば６５０〜７００ｎｍ、具体的には６８０ｎｍ）、遠赤色光（波長：７００〜８００ｎｍ、例えば７００〜７５０ｎｍ、具体的には７３０ｎｍ）が好適に用いられる。また、他の波長の光が混合した光（例えば、白色光）であってもよい。さらに、放射照度としても特に制限はなく、通常、１０〜５０Ｗｍ−２である。また、かかる光照射は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー光源、蛍光ランプ等の人工光源、又は自然光源（太陽光）を利用することによって行なうことができる。In the culturing step according to the present invention, the light irradiating the photosynthetic bacterium may be light having a wavelength that can be absorbed by the bacterium. 700 nm, for example 650 to 700 nm, specifically 680 nm) and far-red light (wavelength: 700 to 800 nm, for example 700 to 750 nm, specifically 730 nm) are preferably used. Further, the light may be a mixture of light of other wavelengths (for example, white light). Further, the irradiance is not particularly limited, and is usually 10 to 50 Wm- 2 . Further, such light irradiation can be performed by using a light emitting diode (LED), a laser light source, an artificial light source such as a fluorescent lamp, or a natural light source (sunlight).
光合成細菌の培養に用いる培地としては特に制限はなく、各光合成に必要な条件（有機物、硫化水素及び水等の水素供与体、炭素源）が揃っていればよく、光合成細菌が海洋性のものである場合には、海水成分の培地（例えば、マリンアガー、マリンブロス、海水（滅菌海洋水等）そのもの）が好適に用いられる。 The medium used for culturing photosynthetic bacteria is not particularly limited, as long as the conditions necessary for each photosynthesis (organic substances, hydrogen donors such as hydrogen sulfide and water, carbon sources) are met, and the photosynthetic bacteria are marine. In this case, a medium containing seawater components (for example, marine agar, marine broth, seawater (sterile marine water, etc.) itself) is preferably used.
なお、本発明の方法は、大腸菌の発現系等と比べ、無機塩等の極めて安価な原料にて培養することが可能である。例えば、大腸菌の培養で通常用いられるグルコース、フルクトース、グルコン酸等の炭素源の代わりに、本発明においては、二酸化炭素や炭酸塩等の無機炭素原料を用いて培養することが可能である。さらに、酵母エキスやペプトンなどの有機窒素原料の代わりに、本発明においては、窒素、アンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩等の無機窒素原料で培養することも可能である。 In addition, the method of the present invention can be cultured with an extremely inexpensive raw material such as an inorganic salt as compared with an expression system of Escherichia coli. For example, instead of carbon sources such as glucose, fructose, and gluconic acid that are usually used in culturing Escherichia coli, in the present invention, inorganic carbon raw materials such as carbon dioxide and carbonate can be used for culturing. Further, in the present invention, instead of the organic nitrogen raw material such as yeast extract and peptone, it is possible to culture with an inorganic nitrogen raw material such as nitrogen, ammonia, ammonium salt, nitrate and nitrite.
また、他の条件として、半好気性（半嫌気性）条件下、嫌気性条件下で培養することが好ましく、培養温度は、通常１５〜３７℃であり、好ましくは２５〜３５℃である。培養時間としては、特に制限はなく、用いるヌクレオチド構築物、光合成細菌及び導入法の種類、並びにクモ糸タンパク質の製造の程度により、適宜調整され得るが、通常１日〜３０日であり、好ましくは２日〜１０日、より好ましくは３日〜７日である。 As another condition, it is preferable to culture under semi-aerobic (semi-anaerobic) conditions and anaerobic conditions, and the culture temperature is usually 15 to 37 ° C, preferably 25 to 35 ° C. The culturing time is not particularly limited and may be appropriately adjusted depending on the nucleotide construct used, the type of photosynthetic bacteria and the method of introduction, and the degree of production of the spider silk protein, but is usually 1 to 30 days, preferably 2 days. 10 to 10 days, more preferably 3 to 7 days.
また、このように培養して得られる光合成細菌の「培養物」とは、本発明において、増殖した光合成細菌のみならず、培養することによって得られる、前記細菌の分泌産物及び該光合成細菌の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。 In addition, the "culture" of the photosynthetic bacterium obtained by culturing in this way is not only the grown photosynthetic bacterium but also the secretory product of the bacterium and the metabolism of the photosynthetic bacterium obtained by culturing. It is a medium containing products and the like, and contains dilutions and concentrates thereof.
このような光合成細菌の培養物からのクモ糸タンパク質の回収についても、特に制限はなく、公知の回収、精製方法を用いて行うことができ、例えば、光合成細菌を溶解又は機械的に破壊することによって回収することができる。クモ糸タンパク質が分泌されている場合に、培地を回収することによって得ることができる。得られたタンパク質は、標準的な手順を用いて精製することができる。所望の場合、前記回収物を遠心分離にかけて、適切な画分（沈殿物又は上清）を収集することができる。また、クモ糸タンパク質をさらに精製するために、ゲルろ過クロマトグラフィー、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、透析法、相分離又は濾過に供することができる。さらにまた、クモ糸タンパク質に精製用タグタンパク質を付加させて光合成細菌に付加させている場合には、そのタグに応じたアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製することができる。 The recovery of spider silk protein from such a culture of photosynthetic bacteria is also not particularly limited and can be carried out by using a known recovery and purification method. For example, lysing or mechanically destroying photosynthetic bacteria. Can be recovered by. It can be obtained by collecting the medium when the spider silk protein is secreted. The resulting protein can be purified using standard procedures. If desired, the harvest can be centrifuged to collect the appropriate fraction (precipitate or supernatant). The spider silk protein can also be subjected to gel filtration chromatography, such as anion exchange chromatography, dialysis, phase separation or filtration to further purify the spider silk protein. Furthermore, when a tag protein for purification is added to the spider silk protein and added to the photosynthetic bacteria, purification can be performed using affinity chromatography according to the tag.
なお、本発明の方法において、上述のとおり、夾雑タンパク質のない無機塩原料のみで培養することが可能である。したがって、大腸菌等の他の宿主細胞よりも、本発明の方法は、タンパク質精製における煩雑な工程を簡素化できる。 In the method of the present invention, as described above, it is possible to culture only with an inorganic salt raw material without contaminating proteins. Therefore, the method of the present invention can simplify complicated steps in protein purification compared to other host cells such as Escherichia coli.
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例において、以下の材料及び方法を用い、光合成細菌におけるクモ糸タンパク質の発現を試みた。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on Examples, but the present invention is not limited to the following Examples. In this example, the expression of spider silk protein in photosynthetic bacteria was attempted using the following materials and methods.
なお、本実施例において発現を試みたクモ糸タンパク質は、クモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅ）のＭａＳｐ１における反復配列（単量体）、その二量体、三量体及び六量体を各々含むタンパク質である（以下、これらタンパク質を「ＭａＳｐ１タンパク質」とも総称する）。また、これらＭａＳｐ１タンパク質のＮ末には、Ｈｉｓタグ、トロンビン認識配列、Ｓタグ及びエンテロキナーゼ認識配列からなるタグタンパク質（配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）を融合させ、光合成細菌における発現を試みた（以下、前記タグタンパク質を融合させたタンパク質を、「融合ＭａＳｐ１タンパク質」とも総称する）。下記表６に、各ＭａＳｐ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号）、並びに各融合ＭａＳｐ１タンパク質のアミノ酸数及び分子量を示す。 The spider silk protein that was attempted to be expressed in this example is a protein containing a repeating sequence (monomer) in MaSp1 of a spider (Nephila clavipe), its dimer, trimer, and hexamer, respectively ( Hereinafter, these proteins are also collectively referred to as "MaSp1 protein"). In addition, a tag protein consisting of a His tag, a thrombin recognition sequence, an S tag and an enterokinase recognition sequence (a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6) is fused to the N-terminal of these MaSp1 proteins in photosynthetic bacteria. Expression was attempted (hereinafter, proteins fused with the tag protein are also collectively referred to as "fused MaSp1 protein"). Table 6 below shows the amino acid sequence (SEQ ID NO:) of each MaSp1 protein, and the number and molecular weight of amino acids of each fusion MaSp1 protein.
（細菌株及び培養条件）
海洋性紅色非硫黄光合成細菌 Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ１３７４／ＡＴＣＣ３５８８６は、理化学研究所 微生物材料開発室（ＪＣＭ）より入手した。Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍは、マリンアガー又はリンブロス（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ社製，ＵＳＡ）にて、３０℃、半好気条件、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ−２）にて培養（維持）した。(Bacterial strain and culture conditions)
The marine red non-sulfur photosynthetic bacterium Rhodovulum sulfidofilum DSM1374 / ATCC35886 was obtained from the Japan Collection of Microorganisms (JCM), RIKEN. Rdb. Sulfidofilm was cultured (maintained) in marine agar or limbros (manufactured by BD Difco, USA) at 30 ° C. under semi-aerobic conditions and under continuous irradiation with far-red light (730 nm, 30 Wm- 2 ).
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＴａＫａＲａ社製，Ｊａｐａｎ）を、Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）アガー又はＬＢブロス（ＢＤ ＤｉｆｃｏＬＢ社製，ＵＳＡ）にて、３７℃、好気条件、１８０ｒｐｍにて振とう培養しながら維持し、ジェネラルクローニングに供した。 Escherichia coli DH5α (TaKaRa, Japan) was maintained in Lysogeny broth (LB) agar or LB broth (BD DifcoLB, USA) with shaking culture at 37 ° C., aerobic conditions, 180 rpm. It was used for general cloning.
Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍへのプラスミド接合伝達を行なうため、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８３年、１（９）：７８４−７９１．）を、ドナー株として用い、ＬＢアガー又はＬＢブロス（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ社製，ＵＳＡ）にて、３７℃、好気条件、１８０ｒｐｍにて振とう培養しながら維持した。 Rdb. To carry out plasmid conjugation transfer to the plasmid, E. coli. Colli S17-1 (Simon, R. et al., Nature Biotechnology, 1983, 1 (9): 784-791.) Was used as a donor strain in LB agar or LB broth (manufactured by BD Difco, USA). The cells were maintained under shaking culture at 37 ° C., aerobic conditions, and 180 rpm.
（プラスミド構築及びＲｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍへの接合伝達）
全てのＰＣＲ増幅は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製，Ｊａｐａｎ）を用いて行なった。また、前述のＭａＳｐ１タンパク質を各々コードし、Ｅ．ｃｏｌｉのコドンに最適化したＤＮＡを、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、トロンビン認識配列及びエンテロキナーゼ認識配列（配列番号：６に記載のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと共に、ｐＥＴ３０−ａ−ＭａＳｐ１（Ｎｕｍａｔａ，Ｋ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１０年、６２（１５）：１４９７−１５０８ 参照）から、下記表７に示すプライマー（配列番号：１１〜１３）を用いて増幅した。また、当該表において、Ｔａｃ１プロモーターを、該プロモーターを有するプラスミドを鋳型として増幅するために用いたプライマー（配列番号：９及び１０）も併せて示す。(Plasid construction and conjugation transfer to Rdb. Sulfidofilm)
All PCR amplification was performed using KOD-plus DNA polymerase (manufactured by TOYOBO, Japan). In addition, each of the above-mentioned MaSp1 proteins was encoded, and E.I. DNA optimized for the codon of colli, together with DNA encoding His tag, S tag, thrombin recognition sequence and enterokinase recognition sequence (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6), pET30-a-MaSp1 (Numata, K) Et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2010, 62 (15): 1497-1508), amplified using the primers shown in Table 7 below (SEQ ID NOs: 11-13). In addition, the primers (SEQ ID NOs: 9 and 10) used to amplify the Tac1 promoter using the plasmid having the promoter as a template are also shown in the table.
なお、表７において、下線を引いた箇所は、制限酵素認識配列を示す。また太字にて記載した箇所は、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）を示す。 In Table 7, the underlined parts indicate the restriction enzyme recognition sequences. The parts shown in bold indicate the ribosome binding sequence (RBS).
ＴａｃＩプロモーター及びＭａＳｐ１遺伝子配列は、対応する制限酵素にて処理して精製した後、宿主ベクター ｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２（Ｋｏｖａｃｈ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ、１９９５年、１６６（１）： １７５−１７６ 参照）に挿入した（図１及び２ 参照）。 The TacI promoter and MaSp1 gene sequence are treated with the corresponding restriction enzymes and purified, and then the host vector pBBR1MCS-2 (see Kovach, ME et al., Gene, 1995, 166 (1): 175-176). (See Figures 1 and 2).
組み換えプラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１（ドナー）とＲｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（レシピエント）との細菌間接合伝達は、以下に記載の方法に沿って行なった。 E. carrying the recombinant plasmid. colli S17-1 (donor) and Rdv. Bacterial conjugation transmission with sulfidophilum (recipient) was performed according to the method described below.
先ず、組み換えプラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１を、５０μｇｍＬ−１カナマイシン含有５ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍにて、１６時間の振とう培養を行なった。一方、Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを、１５ｍＬ マリンブロスに接種し、３０℃、半好気性条件下、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ−２）にて、３０時間培養した。First, E. cerevisiae carrying the recombinant plasmid. E. coli S17-1 was inoculated into 5 mL LB medium containing 50 μg mL -1 kanamycin, and shake-cultured at 37 ° C. and 180 rpm for 16 hours. On the other hand, Rdv. Sulfidofilum was inoculated into 15 mL marine broth and cultured for 30 hours under continuous irradiation of far-red light (730 nm, 30 Wm- 2 ) under semi-aerobic conditions at 30 ° C.
両細菌培養物を、１２，０００ｒｐｍ、３分間の遠心処理に供した後、新しい培養液に再懸濁した（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１はＬＢブロスに、Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍはマリンブロスに再懸濁した）。 Both bacterial cultures were subjected to centrifugation at 12,000 rpm for 3 minutes and then resuspended in fresh cultures (E. coli S17-1 in LB broth and Rdb. Sulfidofilum in marine broth). did).
そして、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１及びＲｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの細胞懸濁液を１：１にて混合した。得られた細菌混合液 約２００μＬを、マリンアガープレートに染み込ませ、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ−２）にて、１日培養した。その後、細胞をアガーから削り取り、新しいマリンブロス５ｍＬに再懸濁した。And E. colli S17-1 and Rdv. Cell suspensions of sulfidofilum were mixed 1: 1. Approximately 200 μL of the obtained bacterial mixture was impregnated into a marine agar plate and cultured for 1 day under continuous irradiation with far-red light (730 nm, 30 Wm- 2 ). The cells were then scraped from the agar and resuspended in 5 mL of fresh marine broth.
得られた細胞懸濁液 約１００μＬを、１００μｇｍＬ−１カナマイシン及び１００μｇｍＬ−１亜テルル酸カリウム含有シモンズクエン酸アガーに播いた。そのアガープレートを、３０℃にて、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ−２）にて、７日間培養した。Approximately 100 μL of the resulting cell suspension was seeded in 100 μg mL -1 kanamycin and 100 μg mL -1 potassium subterlate - containing Simmons citrate agar. The agar plate was cultured at 30 ° C. under continuous irradiation of far-red light (730 nm, 30 Wm- 2 ) for 7 days.
なお、接合完了体が得られたことは、コロニーＰＣＲ、制限酵素処理及びＤＮＡシークエンシングにて確認した。 It was confirmed by colony PCR, restriction enzyme treatment and DNA sequencing that a perfective conjugation was obtained.
（融合ＭａＳｐ１タンパク質の発現）
Ｅ．ｃｏｌｉのコドンに最適化したＮｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来のＭａＳｐ１遺伝子を含むｐＥＴ３０プラスミドが導入された、組み換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＴａＫａＲａ社製，Ｊａｐａｎ）を、３７℃、５０μｇｍＬ−１カナマイシン含有ＬＢブロスにて、振とう（１８０ｒｐｍ）させながら、ＯＤ６００（培養液の濁度）が約１．０に達する迄培養した。その後、１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、培養温度を３０℃に変更して４時間又は２４時間培養することにより、ＭａＳｐ１タンパク質の発現を誘導した。(Expression of fused MaSp1 protein)
E. Recombinant E. coli was introduced with a pET30 plasmid containing the MaSp1 gene from Nephila clavipes optimized for the codon of E. coli. While shaking (180 rpm) colli BL21 (DE3) (Japan, manufactured by TaKaRa) at 37 ° C. in LB broth containing 50 μg mL -1 kanamycin, the OD 600 (turbidity of the culture solution) became about 1.0. Incubated until reached. Then, 1 mM isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) was added, and the culture temperature was changed to 30 ° C. and the cells were cultured for 4 hours or 24 hours to induce the expression of MaSp1 protein.
Ｅ．ｃｏｌｉのコドンに最適化したＮｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来のＭａＳｐ１遺伝子を導入した組み換えＲｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを、３０℃、１００μｇｍＬ−１カナマイシン含有マリンブロスにて、半好気性条件、遠赤色光の連続照射下（７３０ｎｍ，３０Ｗｍ−２）にて、ＯＤ６００が約１．５に達する迄、培養した。その後、融合ＭａＳｐ１タンパク質の発現誘導を、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１日、２日、３日及び４日培養することにより行った。また、前記ＯＤ６００が約１．５に達した後、ＩＰＴＧ非存在下でも更に４日間培養した。E. A recombinant Rdv. Introduced with the MaSp1 gene from Nephila clavipes optimized for the codon of colli. Sulfidofilum is cultured in a marine broth containing 100 μgmL- 1 kanamycin at 30 ° C. under semi-aerobic conditions and continuous irradiation with far-red light (730 nm, 30 Wm- 2 ) until OD 600 reaches about 1.5. did. Then, the expression induction of the fused MaSp1 protein was carried out by adding 1 mM IPTG and culturing for 1, 2, 3, and 4 days. In addition, after the OD 600 reached about 1.5, the cells were cultured for another 4 days even in the absence of IPTG.
（タンパク質溶解液の調製）
前記ＩＰＴＧ誘導後又はＩＰＴＧ非誘導下での培養後、４℃にて、９，０００ｇ、１０分間の遠心処理に供し、細菌を回収した。湿重量１ｇの細菌ペレットを、５ｍＬの変性バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，８Ｍ 尿素及び１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７）に添加して再懸濁した。さらに、細胞懸濁液を、４℃にて一晩攪拌し、９，０００ｇ、３０分間、４℃の遠心処理に供した。そして、上清（タンパク質溶解液）を回収した。(Preparation of protein lysate)
After the IPTG induction or non-IPTG induction, the cells were subjected to centrifugation at 4 ° C. at 9,000 g for 10 minutes to recover the bacteria. Bacterial pellets weighing 1 g were added to 5 mL of denaturing buffer (10 mM Tris, 8M urea and 100 mM NaH 2 PO 4 , pH 7) and resuspended. Further, the cell suspension was stirred at 4 ° C. overnight and subjected to centrifugation at 9 ° C. for 30 minutes at 9,000 g. Then, the supernatant (protein lysate) was collected.
（ＨｉｓＴｒａｐ精製及び濃縮）
タンパク質溶解液（ＩＰＴＧ誘導下又は非誘導下にて１〜４日間培養）をまとめた上で（約５５０ｍＬ培養液に相当）、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製，ＵＳＡ）を用い、そのメーカープロトコールに沿って精製した。(HisTrap purification and concentration)
After collecting the protein lysates (cultured under IPTG induction or non-induction for 1 to 4 days) (corresponding to about 550 mL culture solution), use a HisTrap HP 1 mL column (GE Healthcare Life Sciences, USA). , Purified according to its manufacturer protocol.
精製に際して、結合バッファー（８Ｍ 尿素，０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ リン酸バッファー，５ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．４）及び抽出バッファー（８Ｍ 尿素，０．５Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ リン酸バッファー，５００ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．４）を、０．２２μｍセルロースアセテートフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，ＵＳＡ）にてろ過した。 Upon purification, binding buffer (8M urea, 0.5M NaCl, 20 mM phosphate buffer, 5 mM imidazole, pH 7.4) and extraction buffer (8M urea, 0.5M NaCl, 20 mM phosphate buffer, 500 mM imidazole, pH 7.4). Was filtered through a 0.22 μm cellulose acetate filter (manufactured by Corning, USA).
ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ ｍＬカラム、結合バッファー及び抽出バッファーを用いて、得られた精製物は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ６ ＭＷＣＯ ３０００タンパク質濃縮スピンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製，ＵＳＡ）を用いて濃縮した。 Using a HisTrap HP 1 mL column, binding buffer and extraction buffer, the resulting purified product was concentrated using a Vivaspin 6 MWCO 3000 protein enriched spin column (GE Healthcare Life Sciences, USA).
なお、６×ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）がＮ末に融合されている、融合ＭａＳｐ１タンパク質は、ＨｉｓＴｒａｐカラムへの結合能を有するため、前記処理により精製、濃縮されることとなる。 The fused MaSp1 protein in which the 6 × histidine residue (His tag) is fused to the N-terminal has the ability to bind to the HisTrap column, and thus is purified and concentrated by the above treatment.
（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））
前記にて調製したサンプル（タンパク質溶液、ＨｉｓＴｒａｐによる濃縮後のタンパク質溶液等）を、１６．５％プレキャストＴｒｉｓ−トリシンゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに、２時間供した。そして、ゲルに、固定バッファー（２５％エタノール及び１５％ホルムアルデヒド）を３０分間染み込ませた後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）−Ｒ２５０による染色に１時間供した。得られた結果を図３に示す。(SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE))
The sample prepared above (protein solution, protein solution concentrated with HisTrap, etc.) was subjected to SDS-PAGE using 16.5% precast Tris-Trisingel (Bio-Rad, USA) for 2 hours. .. Then, the gel was impregnated with a fixed buffer (25% ethanol and 15% formaldehyde) for 30 minutes, and then subjected to staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) -R250 for 1 hour. The obtained results are shown in FIG.
（ウエスタンブロッティング）
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したゲルからフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（０．２μｍ孔サイズ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）に、セミドライブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製，ＵＳＡ）を用い、タンパク質を電気泳動転写した。(Western blotting)
From the gel used for SDS-PAGE, a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (0.2 μm pore size) (Bio-Rad, USA) was subjected to a semi-drilotter (Bio-Rad, USA), and a protein was used. Was electrophoretically transferred.
ＰＶＤＦメンブレンにおける、Ｈｉｓタグを含む融合ＭａＳｐ１単量体タンパク質の検出は、Ｈｉｓタグ（登録商標）ウエスタン試薬プロトコール（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，ＵＳＡ）に沿って、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体及びＡＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを用い、ＨｉｓタグＡＰウエスタン試薬による比色検出法により行った。得られた結果を図４に示す。また、融合ＭａＳｐ１タンパク質の検出は、前記プロトコールに沿って、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，ＵＳＡ）、並びにＮｏｖｅｘ（登録商標）ＥＣＬ化学発光基質試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，ＵＳＡ）を用い、化学発光検出法によっても行った。得られた結果を図５に示す。 Detection of fusion MaSp1 monomeric proteins containing His-tags on PVDF membranes was performed according to the His-tag® Western Reagent Protocol (Novagen, USA) with anti-His tag monoclonal antibodies and AP-labeled goat anti-mouse IgG. Was used, and the colorimetric detection method using His-tag AP Western reagent was used. The obtained results are shown in FIG. Further, the detection of the fused MaSp1 protein was carried out according to the protocol, using an anti-His tag monoclonal antibody and an HRP-labeled goat anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific, USA), and a Novex® ECL chemiluminescent substrate reagent kit (registered trademark). It was also performed by chemiluminescence detection method using Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., USA). The obtained results are shown in FIG.
（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析）
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したゲルから、目的とするバンドを切り出し、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって分析し、アミノ酸配列を同定した。なお、ＬＣ−ＭＳデータについては、ＭＡＳＣＯＴプログラムにより、処理及び探索を行なった。(LC-MS / MS analysis)
The target band was excised from the gel subjected to SDS-PAGE and analyzed by liquid chromatography / mass spectrometry (LC-MS) to identify the amino acid sequence. The LC-MS data was processed and searched by the MASCOT program.
図３に示した結果から明らかなように、細菌間接合伝達法を用い、融合ＭａＳｐ１単量体タンパク質をコードするベクターの海洋性紅色非硫黄光合成細菌 Ｒｄｖ．ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍへの導入を試みた結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、前記タンパク質の分子量相当の位置に、強いバンドが検出された（図３のレーンＨＰ 参照）。さらに、図４に示した結果から明らかなように、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングにおいて、同位置にＭａＳｐ１単量体タンパク質に融合させたＨｉｓタグが検出された（図４のレーンＨＰ 参照）。また、図５に示した結果から明らかなように、ＭａＳｐ１単量体タンパク質のみならず、二量体タンパク質、三量体タンパク質及び六量体タンパク質のいずれについても検出することができた。なお、融合ＭａＳｐ１単量体タンパク質については、検出されたタンパク質が当該単量体タンパク質であることを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した。 As is clear from the results shown in FIG. 3, the marine red non-sulfur photosynthetic bacterium Rdv. Of the vector encoding the fused MaSp1 monomeric protein was used by the interbacterial junction transfer method. As a result of attempting to introduce it into sulfidophilum, a strong band was detected at a position corresponding to the molecular weight of the protein in SDS-PAGE (see Lane HP in FIG. 3). Furthermore, as is clear from the results shown in FIG. 4, in Western blotting using an anti-His tag antibody, a His tag fused to a MaSp1 monomeric protein was detected at the same position (see Lane HP in FIG. 4). ). Further, as is clear from the results shown in FIG. 5, not only the MaSp1 monomeric protein but also any of the dimer protein, the trimer protein and the hexamer protein could be detected. Regarding the fused MaSp1 monomeric protein, it was confirmed by LC-MS / MS analysis that the detected protein was the monomeric protein.
したがって、光合成細菌においてＭａＳｐ１タンパク質（クモ糸タンパク質）を発現させることができるということが、明らかになった。 Therefore, it has been clarified that MaSp1 protein (spider silk protein) can be expressed in photosynthetic bacteria.
以上説明したように、本発明によれば、クモ糸タンパク質の製造の場となる光合成細菌は、給餌を必要とすることなく維持、増殖させることができるため、その合成コストを低く抑えられることが可能となる。 As described above, according to the present invention, the photosynthetic bacteria used for producing the spider silk protein can be maintained and proliferated without the need for feeding, so that the synthesis cost can be kept low. It will be possible.
クモ糸タンパク質は、上述のとおり、抗張力、伸張性、靭性といった材料特性において傑出している。そのため、例えば、防弾衣、パラシュート、自動車の車体等の高い耐衝撃性が必要な材料の製造、開発において利用できる。さらに、生分解性、生物的適合性及び抗菌性も有しているため、クモ糸タンパク質は、創傷閉止材、縫合糸、絆創膏、再生医療用の足場材料等の医療材料の製造、開発においても利用できる。 As mentioned above, spider silk proteins are outstanding in material properties such as tensile strength, extensibility and toughness. Therefore, for example, it can be used in the manufacture and development of materials that require high impact resistance, such as bulletproof vests, parachutes, and automobile bodies. In addition, because of its biodegradability, biocompatibility and antibacterial properties, spider silk proteins are also used in the manufacture and development of medical materials such as wound closures, sutures, adhesive plasters and scaffolding materials for regenerative medicine. Available.
したがって、かかるクモ糸タンパク質をその合成コストを抑えて提供することができる本発明は、工業分野、医療分野等の様々な分野において極めて有用である。 Therefore, the present invention capable of providing such a spider silk protein at a low synthesis cost is extremely useful in various fields such as an industrial field and a medical field.
配列番号：２〜８
＜２２３＞ 人工的に合成されたポリペプチドの配列
配列番号：９〜１３
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号：１４〜１６
＜２２３＞ 人工的に合成されたプロモーターの配列SEQ ID NO: 2-8
<223> Sequence number of artificially synthesized polypeptide: 9 to 13
<223> Sequence number of artificially synthesized primer: 14 to 16
<223> Artificially synthesized promoter sequence
Claims (6)
請求項５に記載の光合成細菌を、光照射下において培養する工程と、
前記培養にて得られた光合成細菌の培養物から、クモ糸タンパク質を回収する工程とを、含む方法。A method of producing spider silk protein
A step of culturing the photosynthetic bacterium according to claim 5 under light irradiation,
A method including a step of recovering a spider silk protein from a culture of photosynthetic bacteria obtained in the above culture.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023097595A JP2023116685A (en) | 2017-10-26 | 2023-06-14 | Nucleotide construct for expressing spider silk protein in photosynthetic bacterium |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762577373P | 2017-10-26 | 2017-10-26 | |
| US62/577,373 | 2017-10-26 | ||
| JP2017219141 | 2017-11-14 | ||
| JP2017219141 | 2017-11-14 | ||
| PCT/JP2018/039521 WO2019082935A1 (en) | 2017-10-26 | 2018-10-24 | Nucleotide construct for expressing spider silk protein in photosynthetic bacterium |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023097595A Division JP2023116685A (en) | 2017-10-26 | 2023-06-14 | Nucleotide construct for expressing spider silk protein in photosynthetic bacterium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2019082935A1 true JPWO2019082935A1 (en) | 2021-01-14 |
Family
ID=66247541
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019551207A Pending JPWO2019082935A1 (en) | 2017-10-26 | 2018-10-24 | Nucleotide construct for expression of spider silk protein in photosynthetic bacteria |
| JP2023097595A Pending JP2023116685A (en) | 2017-10-26 | 2023-06-14 | Nucleotide construct for expressing spider silk protein in photosynthetic bacterium |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023097595A Pending JP2023116685A (en) | 2017-10-26 | 2023-06-14 | Nucleotide construct for expressing spider silk protein in photosynthetic bacterium |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPWO2019082935A1 (en) |
| WO (1) | WO2019082935A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112575016B (en) * | 2019-09-29 | 2022-09-06 | 上海交通大学 | Construction and application of membrane-free organelle in prokaryotes |
| CN111363022B (en) * | 2020-04-03 | 2023-04-25 | 上海交通大学 | Preparation method of high-concentration recombinant spider silk protein spinning solution and spinning thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010538616A (en) * | 2007-09-11 | 2010-12-16 | サファイア エナジー，インコーポレイティド | Molecular production by photosynthetic organisms |
| WO2015146195A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | 株式会社カネカ | Microorganism having multiple genes encoding pha synthase and method for producing pha using same |
| WO2017033652A1 (en) * | 2015-08-24 | 2017-03-02 | 株式会社カネカ | Polyhydroxyalkanoate resin composition having free hydroxy groups, and method for producing same |
-
2018
- 2018-10-24 JP JP2019551207A patent/JPWO2019082935A1/en active Pending
- 2018-10-24 WO PCT/JP2018/039521 patent/WO2019082935A1/en active Application Filing
-
2023
- 2023-06-14 JP JP2023097595A patent/JP2023116685A/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010538616A (en) * | 2007-09-11 | 2010-12-16 | サファイア エナジー，インコーポレイティド | Molecular production by photosynthetic organisms |
| WO2015146195A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | 株式会社カネカ | Microorganism having multiple genes encoding pha synthase and method for producing pha using same |
| WO2017033652A1 (en) * | 2015-08-24 | 2017-03-02 | 株式会社カネカ | Polyhydroxyalkanoate resin composition having free hydroxy groups, and method for producing same |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| KATSIOU, E. ET AL.: "Heterologous expression of genes encoding bacterial light-harvesting complex II in Rhodobacter capsu", MICROBIOL. RES., vol. 153, JPN6019001258, 1998, pages 189 - 204, XP008104204, ISSN: 0004865813 * |
| TOKAREVA, O. ET AL.: "Recombinant DNA production of spider silk proteins", MICROBIAL BIOTECHNOLOGY, vol. 6 (6), JPN6019001259, 2013, pages 651 - 663, ISSN: 0004865814 * |
| 松永是: "海洋性光合成原核生物のバイオテクノロジー", 化学と生物, vol. 27 (8), JPN6019001260, 1989, pages 513 - 520, ISSN: 0005011771 * |
| 立山晃: "研究最前線−クモの糸に学び、構造タンパク質をつくる", ＲＩＫＥＮ ＮＥＷＳ, vol. 423, JPN6019001256, 2016, pages 04 - 07, ISSN: 0004865812 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023116685A (en) | 2023-08-22 |
| WO2019082935A1 (en) | 2019-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2023116685A (en) | Nucleotide construct for expressing spider silk protein in photosynthetic bacterium | |
| Li et al. | Simple defined autoinduction medium for high-level recombinant protein production using T7-based Escherichia coli expression systems | |
| JP2021185155A (en) | Method and compositions for synthesizing improved silk fibers | |
| ES2569075T3 (en) | Expression system | |
| CN106061511A (en) | Construct and sequence for enhanced gene expression | |
| CN102586286B (en) | Expression system of bacillus thur ingiens (Bt) insecticidal protein Cry1Ac-a | |
| Widmaier et al. | Quantification of the physiochemical constraints on the export of spider silk proteins by Salmonella type III secretion | |
| CN108368512B (en) | Preparation method of recombinant human granulocyte colony stimulating factor | |
| US9321816B2 (en) | Expression systems and methods of producing spider silk proteins | |
| CN104119445A (en) | Fusion protein containing leucine-rich repetitive sequence, and preparation method and application thereof | |
| CN107805283A (en) | One kind intends spider's thread protein and its biological synthesis method | |
| US20160102125A1 (en) | Expression systems and associated methods | |
| CN116555320A (en) | Recombinant human-derived III-type triple helix collagen engineering bacterium, and construction method and application thereof | |
| CN116554309A (en) | Recombinant human III type collagen and preparation method and application thereof | |
| US11639377B2 (en) | Preparation of type I collagen-like fiber and method for regulating and controlling the D-periodic of fiber thereof | |
| CN106591349B (en) | A kind of chlamydomonas heterologous gene expression system and its application based on Induced by Blue Light | |
| CN109988802A (en) | A kind of expression cassette of efficient secretory expression source of people FGF21 albumen and its application | |
| CN105671069B (en) | A kind of bee peptide expression vector and its construction method and application | |
| KR102211740B1 (en) | Novel promoter HASP1 of Phaeodactylum tricornutum and signal peptide thereof and uses thereof | |
| CN109021086A (en) | A kind of antibacterial peptide cecropin A mutant and its encoding gene, preparation method and application | |
| KR20130141001A (en) | A novel vector system for isolation and purification of target proteins | |
| CN104163865A (en) | Optimized DNA sequences of recombinant human bone morphogenetic protein-2 and coded protein thereof | |
| CN102286530A (en) | Tetrahymena expression vectors capable of introducing exogenous genes by one-step method, and construction method application thereof | |
| CN104119447A (en) | Fusion protein containing leucine-rich repetitive sequence, and preparation method and application thereof | |
| WO2022269557A1 (en) | Recombinant algae and production of spider silk protein from the recombinant algae |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200204 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211004 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220905 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221031 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221206 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230314 |