JPWO2018190118A1 - Screening method of fragrance material showing ambergris note - Google Patents
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Abstract
本発明はアンバーグリスノートを呈する香料素材のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、アンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する工程とを含む。The present invention provides a method for screening a fragrance material exhibiting ambergris notes. The screening method of the present invention is a method of screening candidate compounds presenting ambergris note from test compounds using an olfactory receptor exhibiting responsiveness to a flavor presenting ambergris note, wherein (i) OR7A17, OR7C1, and a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and being responsive to a fragrance exhibiting ambergris note, selected from the group consisting of: Contacting the olfactory receptor with the test compound and measuring the response of the olfactory receptor to the test compound; and (ii) measuring the response of the olfactory receptor used in step (i) in the absence of the test compound Comparing the results of the steps (i) and (ii) with the measurement results in the step (iii), and And a step of selecting a candidate compound that exhibits ambergris notes.
Description
本発明は、アンバーグリスノートを呈する香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to a method for screening candidate compounds of a fragrance material exhibiting ambergris notes.
アンバーグリス（龍涎香）は、香水におけるアニマリック香調の中でも、ムスクとならんで重要な香りである。アンバーグリスは、マッコウクジラの結石が海岸に漂着して得られた天然の香料であるが、商業捕鯨の禁止等により非常に貴重であるため、現在では、合成香料による代替品の使用がほとんどである。各香料会社によってパフォーマンスのより優れたアンバーグリスノートを呈する香料の開発が行われている。
一方、近年、新しい香料素材の候補物質を探索するために嗅覚受容体（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）を発現する培養細胞を利用する方法が提案されている（例えば、特許第５５２０１７３号公報（特許文献１）、特許第５９２１２２６号公報（特許文献２）など）。
嗅覚受容体は、脊椎動物では主に鼻腔内の嗅上皮の嗅毛に発現し、様々な香気化合物に応答するセンサータンパク質である。香気化合物が嗅覚受容体へ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換する。ｃＡＭＰはＣＮＧチャネルを開口し、それによってナトリウムイオン（Ｎａ＋）やカルシウムイオン（Ｃａ２＋）が細胞内へと流入して受容器電位を発生させ、脳へと情報を送る。嗅覚受容体を発現する培養細胞に香気化合物を接触させたときの細胞内のｃＡＭＰ増加量やカチオン増加量を測定することにより、匂いを判別することが可能であると考えられる。
ヒトの嗅覚受容体は４００種弱あることが知られており、一種の香気化合物は一種または複数種の嗅覚受容体に応答し、一種の嗅覚受容体は複数種の香気化合物に応答することが知られている。Ambergris is an important scent of animalic fragrances in perfume, similar to musk. Ambergris is a natural fragrance obtained by drifting sperm whale stones on the shore, but it is very valuable due to the ban on commercial whaling and other reasons. is there. Perfume companies are developing perfumes that exhibit better performing ambergris notes.
On the other hand, in recent years, there has been proposed a method of using cultured cells expressing olfactory receptors to search for a candidate substance for a new fragrance material (for example, Japanese Patent No. 5520173 (Patent Document 1)). Japanese Patent No. 592226 (Patent Document 2).
Olfactory receptors are sensor proteins that are expressed in vertebrates mainly on the olfactory hair of the olfactory epithelium in the nasal cavity and respond to various odor compounds. When the odor compound binds to the olfactory receptor, it activates an intracellular G protein, which activates adenylate cyclase to convert ATP to cyclic AMP (cAMP). cAMP opens CNG channels, causing sodium ions (Na + ) and calcium ions (Ca 2+ ) to flow into cells and generate receptor potentials, sending information to the brain. It is considered that the odor can be discriminated by measuring the amount of increase in cAMP and the amount of cation in the cell when the odorant receptor is brought into contact with the cultured cell expressing the olfactory receptor.
Human olfactory receptors are known to be less than 400 species, and one odorant compound responds to one or more odorant receptors, and one odorant receptor responds to multiple odorant compounds. Are known.
アンバーグリスノートを呈する既知の香気化合物に応答する嗅覚受容体を探索し、その嗅覚受容体を用いることでアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングできる可能性がある。しかし、アンバーグリスノートを呈する香料素材に応答する嗅覚受容体はこれまでに知られていなかった。
このような状況の下、アンバーグリスノートを呈する香料素材に応答する嗅覚受容体を探索し、アンバーグリスノートを呈する新しい香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法を提供することが望まれている。It is possible to search for olfactory receptors responding to known odor compounds exhibiting ambergris notes, and to screen candidate compounds exhibiting ambergris notes by using the olfactory receptors. However, olfactory receptors that respond to perfume materials exhibiting ambergris notes have not been known so far.
Under such circumstances, it is desired to provide a method for searching for an olfactory receptor that responds to a fragrance material exhibiting an ambergris note and screening candidate compounds of a new fragrance material exhibiting an ambergris note.
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行ったところ、アンバーグリスノートを代表するＡＭＢＲＯＸＡＮ（登録商標）またはＡｍｂｅｒ Ｘｔｒｅｍｅ（商標）に特異的に応答する嗅覚受容体を特定することに成功した。本発明者はさらに検討を進め、これらの嗅覚受容体を用いることにより、アンバーグリスノートを呈する香料素材の候補化合物を適切にスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and have succeeded in specifying an olfactory receptor specifically responding to AMBROXAN (registered trademark) or Amber Xtreme (trademark) representing Ambergris Note. did. The present inventors have further studied and found that by using these olfactory receptors, it is possible to appropriately screen candidate compounds for fragrance materials exhibiting ambergris note, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下に示すアンバーグリスノートを呈する香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法を提供するものである。
［１］アンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含む、方法。
［２］アンバーグリスノートを呈する香料が、次式：
で示される化合物からなる群より選択される、［１］に記載の方法。
［３］嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上または嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］嗅覚受容体の応答をレポーターアッセイにより測定する、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が２以上であるときに、工程（ｉｉｉ）においてアンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。That is, the present invention provides a method for screening a candidate compound of a fragrance material exhibiting the following ambergris note.
[1] A method for screening candidate compounds exhibiting ambergris note from among test compounds using an olfactory receptor exhibiting responsiveness to a fragrance exhibiting ambergris note,
(I) a group consisting of OR7A17, OR7C1, and a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and exhibiting responsiveness to a fragrance exhibiting ambergris note Contacting the test compound with an olfactory receptor selected from the step, and measuring the response of the olfactory receptor to the test compound,
(Ii) measuring the response of the olfactory receptor used in step (i) in the absence of the test compound;
(Iii) comparing the measurement results in steps (i) and (ii), and selecting a test compound having altered responsiveness as a candidate compound exhibiting ambergris note.
[2] The fragrance exhibiting an ambergris note is represented by the following formula:
The method according to [1], wherein the method is selected from the group consisting of:
[3] measuring the response of the olfactory receptor on cells isolated from a living body expressing the olfactory receptor or on cells artificially expressing the olfactory receptor by genetic manipulation [1] or [ 2].
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the response of the olfactory receptor is measured by a reporter assay.
[5] When the result of the measurement in the step (i) is divided by the result of the measurement in the step (ii) to obtain a Fold Increse value of 2 or more, the compound is selected as a candidate compound exhibiting an ambergris note in the step (iii). The method according to any one of [1] to [4].
本発明の方法を用いることにより、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法は、アンバーグリスノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献できるものと期待される。また、新しい香料素材を開発するために多数の候補化合物の匂いを人間の嗅覚のみで評価することは、嗅覚疲労や個人差の問題があり、適切に候補化合物を選択することに困難を伴う場合があるが、本発明の方法によれば、このような問題を解消または軽減することができる。 By using the method of the present invention, a candidate compound exhibiting ambergris note can be screened from test compounds. The screening method of the present invention is expected to contribute to the development of a new fragrance material exhibiting ambergris notes. Evaluating the odors of a large number of candidate compounds using only human olfaction in order to develop new fragrance materials is problematic when there are problems with olfactory fatigue and individual differences, and it is difficult to properly select candidate compounds. However, according to the method of the present invention, such a problem can be solved or reduced.
以下、本発明のスクリーニング方法について具体的に説明する。 Hereinafter, the screening method of the present invention will be specifically described.
本発明は、アンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含むことを特徴としている。The present invention is a method for screening candidate compounds presenting ambergris note from among test compounds, using an olfactory receptor showing responsiveness to a flavor presenting ambergris note,
(I) a group consisting of OR7A17, OR7C1, and a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and exhibiting responsiveness to a fragrance exhibiting ambergris note Contacting the test compound with an olfactory receptor selected from the step, and measuring the response of the olfactory receptor to the test compound,
(Ii) measuring the response of the olfactory receptor used in step (i) in the absence of the test compound;
(Iii) comparing the measurement results in steps (i) and (ii), and selecting a test compound having a changed responsiveness as a candidate compound exhibiting ambergris note.
本発明のスクリーニング方法は、ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体に対する被験化合物の応答性を指標として、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物を選択するものである。
一種の嗅覚受容体は類似構造を有する複数種の香気化合物に応答することが知られていることから、アンバーグリスノートを呈する既知の香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を特定し、その嗅覚受容体に対する被験化合物の応答性を評価することによって、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物を選択することができる。なお、本明細書において「アンバーグリスノートを呈する香料素材」とは、アンバーグリスノートを呈する香料の素材となる化合物、組成物または混合物をいうものとする。以下、本発明のスクリーニング方法の各工程について説明する。The screening method of the present invention comprises OR7A17, OR7C1, and an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and exhibits responsiveness to a fragrance exhibiting ambergris note. A candidate compound exhibiting an ambergris note is selected from the test compounds, using the response of the test compound to an olfactory receptor selected from the group consisting of proteins as an index.
Since a type of olfactory receptor is known to respond to multiple types of odorous compounds with similar structures, we identified olfactory receptors that show responsiveness to known fragrances that exhibit ambergris notes, By evaluating the responsiveness of the test compound to the olfactory receptor, a candidate compound exhibiting ambergris note can be selected from the test compounds. In addition, in this specification, the "perfume material exhibiting ambergris notes" refers to a compound, a composition, or a mixture serving as a material of perfumes exhibiting ambergris notes. Hereinafter, each step of the screening method of the present invention will be described.
＜工程（ｉ）＞
工程（ｉ）では、ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する。<Step (i)>
In the step (i), a protein comprising OR7A17, OR7C1, and an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and exhibiting responsiveness to a fragrance exhibiting ambergris note A test compound is brought into contact with an olfactory receptor selected from the group consisting of and the response of the olfactory receptor to the test compound is measured.
嗅覚受容体としては、ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体が用いられる。
ＯＲ７Ａ１７は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿０３０９０１として登録されており、配列番号１で示される塩基配列の第１番目から第９３０番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質である。
ＯＲ７Ｃ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿１９８９４４として登録されており、配列番号３で示される塩基配列の第１番目から第９６３番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）からなるタンパク質である。
ＯＲ７Ａ１７は、化合物（ａ）および化合物（ｃ）に強く応答し、ＯＲ７Ｃ１は化合物（ｂ）、化合物（ｄ）、化合物（ｅ）、化合物（ｆ）および化合物（ｇ）などに選択的に強く応答することから、ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１を用いたスクリーニング方法は、アンバーグリスノートを呈する香料素材の開発に貢献できるものと期待される。As the olfactory receptor, OR7A17, OR7C1, and a protein containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 and exhibiting responsiveness to a fragrance exhibiting ambergris note An olfactory receptor selected from the group consisting of:
OR7A17 is registered in GenBank as NM_030901, and is a protein consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by the 1st to 930th DNAs of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
OR7C1 is registered in GenBank as NM — 198944, and is a protein consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) encoded by the 1st to 963rd DNAs of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
OR7A17 responds strongly to compound (a) and compound (c), and OR7C1 selectively responds strongly to compound (b), compound (d), compound (e), compound (f), compound (g), etc. Therefore, the screening method using OR7A17 and OR7C1 is expected to contribute to the development of a fragrance material exhibiting an ambergris note.
嗅覚受容体としてこれらの嗅覚受容体が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体を用いてもよい。なお、本明細書においてアミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズム（ＮＣＢＩより公に入手できる）によって算出される。 An amino acid having an identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more with the amino acid sequence of these olfactory receptors as an olfactory receptor An olfactory receptor selected from the group consisting of proteins having a sequence and being responsive to a fragrance exhibiting an ambergris note may be used. In this specification, the sequence identity of an amino acid sequence is calculated by a BLAST search algorithm (available publicly from NCBI).
本発明において、アンバーグリスノートを呈する香料としては、次式で示される化合物からなる群より選択される一種以上が好ましく挙げられる。 In the present invention, as the fragrance exhibiting ambergris note, one or more selected from the group consisting of the compounds represented by the following formulas is preferably exemplified.
化合物（ａ）（３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）−３ａ，６，６，９ａ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２，４，５，５ａ，７，８，９，９ｂ−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏ［ｅ］［１］ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎは、ＡＭＢＲＯＸＡＮ（登録商標）という名称で知られており、花王株式会社より入手可能である。
化合物（ｂ）（２，２，６，６，７，８，８−ｈｅｐｔａｍｅｔｈｙｌ−３，３ａ，４，５，５ａ，７，８ａ，８ｂ−ｏｃｔａｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｇ］［１］ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）は、Ａｍｂｅｒ Ｘｔｒｅｍｅ（商標）という名称で知られる香料の主成分であり、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社より入手可能である。
化合物（ｃ）（１−（１，２，３，４，５，６，７，８−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−２，３，８，８，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｅｔｈａｎ−１−ｏｎｅ）は、ＯＲＢＩＴＯＮＥ（登録商標）という名称で知られており、高砂香料工業株式会社より入手可能である。
化合物（ｄ）（１Ｒ，６Ｓ）−（１−（２，２，６−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）ｈｅｘａｎ−３−ｏｌ）は、Ａｍｂｅｓｔｏｌ（登録商標）またはＮＯＲＬＩＭＢＡＮＯＬ（登録商標） ＤＥＸＴＲＯという名称で知られており、高砂香料工業株式会社またはＦｉｒｍｅｎｉｃｈ社より入手可能である。
化合物（ｅ）（ ２−（２，２，７，７−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｃｙｃｌｏ［６．２．１．０］（１，６）ｕｎｄｅｃ−５−ｅｎ−５−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎ−１−ｏｌおよび２−（２，２，７，７−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｃｙｃｌｏ［６．２．１．０］（１，６）ｕｎｄｅｃ− ４−ｅｎ−５−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎ−１−ｏｌの異性体混合物）は、ＡＭＢＥＲＭＡＸ（登録商標）という名称で知られており、Ｇｉｖａｕｄａｎ社より入手可能である。
化合物（ｆ）（（４ａＲ，５Ｒ，７ａＳ，９Ｒ）−Ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−２，２，５，８，８，９ａ−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌ−４Ｈ−４ａ，９−ｍｅｔｈａｎｏｚｕｌｅｎｏ［５，６−ｄ］−１，３−ｄｉｏｘｏｌｅ）は、ＡＭＢＲＯＣＥＮＩＤＥ（商標）という名称で知られており、Ｓｙｍｒｉｓｅ社より入手可能である。
化合物（ｇ）（３，８，８， １１ａ−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａｈｙｄｒｏ−５Ｈ−３，５ａ−ｅｐｏｘｙ−ｎａｐｈｔ（２， １−ｃ） ｏｘｅｐｉｎ ａｎｄ ｉｓｏｍｅｒｓ）は、ＡＭＢＥＲＫＥＴＡＬという名称で知られており、Ｇｉｖａｕｄａｎ社より入手可能である。Compound (a) (3aR, 5aS, 9aS, 9bR) -3a, 6,6,9a-tetramethyl-2,4,5,5a, 7,8,9,9b-octahydro-1H-benzo [e] [1] Benzofuran is known under the name AMBROXAN® and is available from Kao Corporation.
Compound (b) (2,2,6,6,7,8,8-heptamethyl-3,3a, 4,5,5a, 7,8a, 8b-octahydroxycyclopentana [g] [1] benzofuran) was obtained from Amber Xtreme It is the main component of perfume known under the name (trademark) and is available from International Flavors and Fragrances.
Compound (c) (1- (1,2,3,4,5,6,7,8-octahydro-2,3,8,8, -tetramethyl-2-naphthyl) ethan-1-one) was obtained by ORBITONE (Registered trademark) and is available from Takasago International Corporation.
Compound (d) (1R, 6S)-(1- (2,2,6-Trimethylcyclohexyl) hexan-3-ol) is known under the name Abestol® or NORLIMBANOL® DEXTRO, Available from Takasago International Corporation or Firmenich.
Compound (e) (2- (2,2,7,7-tetramethylcyclo [6.2.1.0] (1,6) undec-5-en-5-yl) propan-1-ol and 2- ( 2,2,7,7-Tetramethyltricyclo [6.2.1.0] (1,6) undec-4-en-5-yl) propan-1-ol isomer mixture) is AMBERMAX® And is available from Givaudan.
Compound (f) ((4aR, 5R, 7aS, 9R) -Octahydro-2,2,5,8,8,9a-hexamethyl-4H-4a, 9-methanozuleno [5,6-d] -1,3- dioxole) is known under the name AMBROCENIDE ™ and is available from Symrise.
Compound (g) (3,8,8,11a-tetramethyldodecahydro-5H-3,5a-epoxy-naphth (2,1-c) oxepin and isomers) is known by the name AMBERKETAL and is available from Givaudan. It is possible.
これらの中でも、アンバーグリスノートを呈する香料としては、化合物（ａ）、化合物（ｂ）、化合物（ｃ）および化合物（ｅ）がより好ましく、化合物（ａ）および化合物（ｅ）が特に好ましい。なお、本明細書において「応答性を示す」とは、嗅覚受容体発現細胞において、香料非存在下と比較して何らかの変化が見られることを意味する。 Among these, as the fragrance exhibiting an ambergris note, compound (a), compound (b), compound (c) and compound (e) are more preferable, and compound (a) and compound (e) are particularly preferable. In addition, in this specification, "showing responsiveness" means that some change is seen in the olfactory receptor-expressing cells as compared with the absence of a fragrance.
嗅覚受容体は、一種で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。 Olfactory receptors may be used alone or in combination of two or more.
本発明において嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する方法は特に制限されない。例えば、嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上で被験化合物と接触させ、嗅覚受容体の応答を測定してもよいし、嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で被験化合物と接触させ、嗅覚受容体の応答を測定してもよい。嗅覚受容体と被験化合物を接触させる時間は、被験化合物の濃度にも依存するため一概には言えないが、通常、２〜４時間である。 In the present invention, the method of contacting an olfactory receptor with a test compound and measuring the response of the olfactory receptor to the test compound is not particularly limited. For example, contacting a test compound on cells isolated from a living body expressing an olfactory receptor, the response of the olfactory receptor may be measured, or the olfactory receptor may be artificially expressed by genetic manipulation. May be contacted with the test compound on the cells, and the response of the olfactory receptor may be measured. The time for bringing the test compound into contact with the olfactory receptor depends on the concentration of the test compound and cannot be unconditionally determined, but is usually 2 to 4 hours.
嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞は、嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。 Cells in which an olfactory receptor has been artificially expressed by genetic manipulation can be produced by transforming the cell with a vector incorporating a gene encoding the olfactory receptor.
本発明の好ましい態様では、嗅覚受容体と共に、ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込んでもよい。ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込むことにより、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進することができる。
ウシロドプシンは、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１０１４８９０として登録されている。ウシロドプシンは、配列番号５で示される塩基配列の第１番目から第１０４７番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）からなるタンパク質である。
また、ウシロドプシンに代えて、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ嗅覚受容体の細胞膜発現を促進することができるタンパク質を用いてもよい。
なお、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進できるものであれば、ウシロドプシンに限らず、他のタンパク質のアミノ酸残基を用いてもよい。In a preferred embodiment of the present invention, the N-terminal 20 amino acid residues of bovine rhodopsin may be incorporated together with the olfactory receptor. By incorporating the N-terminal 20 amino acid residues of bovine rhodopsin, cell membrane expression of the olfactory receptor can be promoted.
Bovine rhodopsin is registered in GenBank as NM_001014890. Bovine rhodopsin is a protein consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) encoded by the 1st to 1047th DNA of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5.
Further, in place of bovine rhodopsin, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. May be used, the protein comprising an amino acid sequence having the formula (1) and capable of promoting cell membrane expression of an olfactory receptor.
Not only bovine rhodopsin but also amino acid residues of other proteins may be used as long as they can promote cell membrane expression of the olfactory receptor.
嗅覚受容体の応答を測定する方法は特に制限されなく、当分野で用いられている任意の方法を用いることができる。例えば、香気化合物が嗅覚受容体へ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換し、細胞内のｃＡＭＰ量を増加させることが知られている。したがって、ｃＡＭＰ量を測定することで嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が用いられる。中でも、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体の応答を測定することが好ましい。 The method for measuring the response of the olfactory receptor is not particularly limited, and any method used in the art can be used. For example, when an odorant compound binds to an olfactory receptor, the G protein in the cell is activated, and the G protein activates adenylate cyclase to convert ATP into cyclic AMP (cAMP), thereby reducing the amount of cAMP in the cell. It is known to increase. Therefore, the response of the olfactory receptor can be measured by measuring the amount of cAMP. As a method for measuring the amount of cAMP, an ELISA method, a reporter gene assay, or the like is used. Among them, it is preferable to measure the response of the olfactory receptor by a reporter gene assay using a luminescent substance such as luciferase.
＜工程（ｉｉ）＞
工程（ｉｉ）では、被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する。
嗅覚受容体の応答を測定する方法は、嗅覚受容体と被験化合物を接触させないことを除いて、工程（ｉ）で示した方法と同様の方法を用いることができる。例えば、嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上で嗅覚受容体の応答を測定してもよいし、嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定してもよい。工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定結果を適切に比較するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定条件は、被験化合物の接触の有無を除いて、同じであることが好ましい。<Step (ii)>
In step (ii), the response of the olfactory receptor used in step (i) is measured in the absence of the test compound.
The method for measuring the response of the olfactory receptor can be the same as the method shown in the step (i) except that the test compound is not brought into contact with the olfactory receptor. For example, the response of the olfactory receptor may be measured on cells isolated from a living body expressing the olfactory receptor, or the olfactory receptor may be measured on cells that artificially express the olfactory receptor by genetic manipulation. The body's response may be measured. In order to properly compare the measurement results in steps (i) and (ii), the measurement conditions in steps (i) and (ii) are preferably the same except for the presence or absence of contact with the test compound.
＜工程（ｉｉｉ）＞
工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する。
本発明では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して応答性に変化が見られた場合、工程（ｉ）で用いた被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として評価することができる。
本発明の一実施態様によれば、応答性の変化は、工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値を指標として評価してもよい。例えば、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体の応答を測定する場合、Ｆｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは１０以上の被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として評価することができる。<Step (iii)>
In the step (iii), the measurement results in the steps (i) and (ii) are compared, and a test compound having changed responsiveness is selected as a candidate compound exhibiting ambergris note.
In the present invention, when a change is observed in the responsiveness by comparing the measurement results in the steps (i) and (ii), the test compound used in the step (i) is evaluated as a candidate compound exhibiting ambergris note. be able to.
According to one embodiment of the present invention, the change in responsiveness may be evaluated using a Fold Increase value obtained by dividing the measurement result in step (i) by the measurement result in step (ii) as an index. For example, when the response of an olfactory receptor is measured by a reporter gene assay method using a luminescent substance such as luciferase, the test compound having a Fold Increse value of preferably 2 or more, more preferably 4 or more, and still more preferably 10 or more It can be evaluated as a candidate compound exhibiting grease note.
上記のようにして、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングすることができる。本発明によれば、人間の嗅覚によって行う官能評価による嗅覚疲労や個人差などによる問題を生じることなく、多数の被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物を選択することができる。
選択された化合物は、アンバーグリスノートを呈する香料素材の候補化合物として用いることができる。選択された化合物を基に必要に応じて改変等を行い、最適な匂いのする化合物を開発することもできる。さらには、選択された化合物を他の香料素材とブレンドして最適な匂いのする香料素材を開発することも可能である。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、アンバーグリスノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献することができる。As described above, a candidate compound exhibiting ambergris note can be screened from the test compounds. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the candidate compound which presents an ambergris note can be selected from many test compounds, without causing problems due to olfactory fatigue due to sensory evaluation performed by human smell or individual differences.
The selected compound can be used as a candidate compound for a fragrance material exhibiting an ambergris note. Modification or the like can be performed as needed based on the selected compound to develop a compound having an optimum odor. Furthermore, it is also possible to blend the selected compound with other fragrance materials to develop a fragrance material having an optimum odor. By using the screening method of the present invention, it is possible to contribute to the development of a new fragrance material exhibiting ambergris notes.
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to these examples.
［実施例１］
アンバーグリスノートを呈する香料化合物（ａ）および化合物（ｂ）に応答する嗅覚受容体の探索
（１）嗅覚受容体遺伝子クローニング
ヒト嗅覚受容体ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ： Ｆｅｍａｌｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）よりＰＣＲ法にてクローニングすることで得た。ｐＭＥ１８ＳベクターにウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込み、さらにその下流に、得られたヒト嗅覚受容体遺伝子を組み込むことで、ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクターを得た。[Example 1]
Search for olfactory receptors responding to fragrance compounds (a) and (b) exhibiting ambergris notes (1) Cloning of olfactory receptor genes The human olfactory receptors OR7A17 and OR7C1 genes are based on sequence information registered in GenBank. Was obtained by cloning from Human Genomic DNA: Female (Promega) by the PCR method. A human olfactory receptor gene expression vector was obtained by incorporating the N-terminal 20 amino acid residues of bovine rhodopsin into the pME18S vector and further incorporating the resulting human olfactory receptor gene downstream thereof.
（２）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での嗅覚受容体遺伝子の発現
ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクター０．０５μｇ、ＲＴＰ１Ｓベクター０．０１μｇ、ｃＡＭＰ応答配列プロモーターを含むホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．２９（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．０１μｇ、およびチミジンキナーゼプロモーターを含むウミシイタケルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．７４（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．００５μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）１０μＬに溶解して遺伝子溶液（１穴分）とした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４時間後にコンフルエントに達する細胞数で９６穴プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の使用法に従ってリポフェクション法によって遺伝子溶液を各穴に添加して、細胞に遺伝子導入を行い、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で２４時間培養した。(2) Expression of olfactory receptor gene in HEK293T cells 0.05 μg of human olfactory receptor gene expression vector, 0.01 μg of RTP1S vector, 0.01 μg of firefly luciferase vector pGL4.29 (Promega) containing a cAMP response element promoter, 0.005 μg of Renilla luciferase vector pGL4.74 (Promega) containing a thymidine kinase promoter and Thymidine kinase promoter was dissolved in 10 μL of Opti-MEM I (Thermo Fisher Scientific) to obtain a gene solution (for one well). HEK293T cells were seeded at 100 μL per 96-well plate (Biocoat, Corning) at the number of cells that reached confluence after 24 hours, and a gene solution was added to each well by lipofection according to the method of Lipofectamine 3000, and the gene was added to the cells. After the introduction, the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere for 24 hours.
（３）ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ
培養液を除去した後に、検体となる香料化合物を測定する濃度になる様にＣＤ２９３（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地（２０μＭ Ｌ−グルタミン添加）で調製したものを５０μＬずつ添加し、３時間の刺激を行った後に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の使用方法に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。嗅覚受容体の応答強度は、香料化合物の刺激によって生じたルシフェラーゼ活性を、香料化合物を含まない試験系で生じたルシフェラーゼ活性で割ることで求められるＦｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値で表現した。(3) Luciferase reporter gene assay After removing the culture solution, 50 μL of a medium prepared with a CD293 (Thermo Fisher Scientific) medium (adding 20 μM L-glutamine) so as to have a concentration at which a fragrance compound serving as a sample is measured is added. After adding and stimulating for 3 hours, luciferase activity was measured according to the method of using Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). The response intensity of the olfactory receptor was expressed as a Fold Increase value obtained by dividing the luciferase activity generated by the stimulation of the fragrance compound by the luciferase activity generated in a test system containing no fragrance compound.
（４）化合物（ａ）および化合物（ｂ）に対する嗅覚受容体応答の測定
ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１を発現させた細胞で、化合物（ａ）（花王株式会社）１００μＭおよび化合物
（ｂ）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｌａｖｏｒｓ ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社）３００μＭに対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図１ＡおよびＢにそれぞれ示す。化合物（ａ）に対してはＯＲ７Ａ１７のみが、化合物（ｂ）に対してはＯＲ７Ｃ１のみが、Ｆｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値１０以上の応答を示した。
一方で、嗅覚受容体を発現させなかった細胞を用いたＭｏｃｋ試験、および米国特許出願公開第２０１５／０２６０７０７号明細書にアンバーグリス香料化合物への応答が記載されているＯＲ２Ｌ８およびＯＲ４Ｋ５は、Ｆｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ値１０以上の応答を示さなかった。
なお、ＯＲ２Ｌ８は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１００１９６３として登録されており、配列番号７で示される塩基配列の第１番目から第９３９番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）からなるタンパク質である。またＯＲ４Ｋ５は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１００５４８３として登録されており、配列番号９で示される塩基配列の第１番目から第９７２番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）からなるタンパク質である。(4) Measurement of Olfactory Receptor Response to Compound (a) and Compound (b) In cells expressing OR7A17 and OR7C1, compound (a) (Kao Corporation) 100 μM and compound (b) (International Flavors and Fragrances) 2.) The receptor response to 300 μM was measured by luciferase reporter gene assay. The results are shown in FIGS. 1A and 1B, respectively. Only OR7A17 responded to compound (a) and only OR7C1 responded to compound (b) with a Fold Increment value of 10 or more.
On the other hand, OR2L8 and OR4K5 described in Mock test using cells in which olfactory receptor was not expressed, and the response to ambergris fragrance compound in US Patent Application Publication No. 2015/0260707, are Fold Increase. No response above a value of 10 was shown.
OR2L8 is registered in GenBank as NM_001001963 and is a protein consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) encoded by the 1st to 939th DNAs of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7. OR4K5 is registered in GenBank as NM — 001005483, and is a protein consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) encoded by the first to 972nd DNAs of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9.
また、ＯＲ７Ａ１７の、様々な濃度の化合物（ａ）に対する受容体応答、およびＯＲ７Ｃ１の、様々な濃度の化合物（ｂ）に対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図２ＡおよびＢにそれぞれ示す。ＯＲ７Ａ１７は化合物（ａ）に、ＯＲ７Ｃ１は化合物（ｂ）に対して濃度依存的な応答を示した。一方で、Ｍｏｃｋ試験では応答が見られなかった。すなわち、ＯＲ７Ａ１７は化合物（ａ）に対して、ＯＲ７Ｃ１は化合物（ｂ）に対して、特異的に応答することが示された。 Also, the receptor response of OR7A17 to various concentrations of compound (a) and the response of OR7C1 to various concentrations of compound (b) were measured by luciferase reporter gene assay. The results are shown in FIGS. 2A and 2B, respectively. OR7A17 showed a concentration-dependent response to compound (a), and OR7C1 showed a concentration-dependent response to compound (b). On the other hand, no response was seen in the Mock test. That is, it was shown that OR7A17 specifically responds to compound (a) and OR7C1 specifically responds to compound (b).
［実施例２］
アンバーグリス香料化合物に対するＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１の応答強度の評価
化合物（ａ）または化合物（ｂ）に対して強い応答を示したＯＲ７Ａ１７またはＯＲ７Ｃ１を用いて、アンバーグリスノートを呈する香料化合物である化合物（ｃ）（高砂香料株式会社）、化合物（ｄ）（高砂香料工業株式会社）、化合物（ｅ）（Ｇｉｖａｕｄａｎ社より５０％Ｄｏｗａｎｏｌ ＴＰＭ希釈品として入手）、化合物（ｆ）（Ｓｙｍｒｉｓｅ社より１０％ＴＥＣ希釈品として入手）および化合物（ｇ）（Ｇｉｖａｕｄａｎ社より８．５％ＩＰＭ希釈品として入手）に対する応答強度を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図３Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥにそれぞれ示す。ＯＲ７Ａ１７は化合物（ｃ）に対して、ＯＲ７Ｃ１は化合物（ｄ）、化合物（ｅ）、化合物（ｆ）および化合物（ｇ）に対して濃度依存的な応答を示した。一方で、Ｍｏｃｋ試験では応答が見られなかった。すなわち、ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１は各種アンバーグリス香料化合物に特異的に応答することが示された。[Example 2]
Evaluation of response intensity of OR7A17 and OR7C1 to ambergris fragrance compound Compound (c) which is a fragrance compound exhibiting ambergris note using OR7A17 or OR7C1 showing a strong response to compound (a) or compound (b) (Takasago Perfumery Co., Ltd.), Compound (d) (Takasago Perfumery Co., Ltd.), Compound (e) (obtained as a 50% Dowanol TPM diluted product from Givaudan), Compound (f) (10% TEC diluted from Symrise) ) And compound (g) (obtained as a 8.5% IPM dilution from Givaudan) were measured by luciferase reporter gene assay. The results are shown in FIGS. 3A, B, C, D and E, respectively. OR7A17 showed a concentration-dependent response to compound (c), and OR7C1 showed a concentration-dependent response to compound (d), compound (e), compound (f) and compound (g). On the other hand, no response was seen in the Mock test. That is, it was shown that OR7A17 and OR7C1 specifically respond to various ambergris flavor compounds.
［実施例３］
様々な香調の香料化合物に対するＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１の応答強度の評価
前出のアンバーグリスノート香料化合物（ａ）、化合物（ｃ）、化合物（ｄ）、化合物（ｂ）、化合物（ｅ）、化合物（ｆ）および化合物（ｇ）に加えて、比較として様々な香調の表１に記載の非アンバーグリスノート香料化合物に対する、ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１の応答強度を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。各化合物の濃度は、細胞毒性やＭｏｃｋ試験系での受容体非特異的な応答を示さない条件とした。[Example 3]
Evaluation of Response Intensity of OR7A17 and OR7C1 to Perfume Compounds with Various Scents Ambergris Note Perfume Compound (a), Compound (c), Compound (d), Compound (b), Compound (e), Compound (e) In addition to f) and compound (g), the response intensities of OR7A17 and OR7C1 to the non-ambergris note fragrance compounds listed in Table 1 for various odors for comparison were measured by luciferase reporter gene assay. The concentration of each compound was such that it did not show cytotoxicity or non-receptor response in the Mock test system.
なお、表１に記載の非アンバーグリスノート香料化合物は、以下のものを使用した。
Ｄ−Ｌｉｍｏｎｅｎｅ（ナカライテスク株式会社）
Ｃｉｓ−３−Ｈｅｘｅｎｏｌ（日本ゼオン株式会社）
Ｍｅｌｏｎａｌ（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）
Ｌ−Ｍｅｎｔｈｏｌ（高砂香料工業株式会社）
Ｌｉｎａｌｙｌ ａｃｅｔａｔｅ（東京化成工業株式会社）
Ｖａｎｉｌｌｉｎ（東京化成工業株式会社）
Ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ（Ｒｅｎｅｓｓｅｎｚ社）
ＴＨＥＳＡＲＯＮ（登録商標）、（１Ｒ，６Ｓ）−Ｅｔｈｙｌ ２，２，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（高砂香料工業株式会社）
ＣＡＬＯＮＥ（登録商標）、７−Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｅｐｉｎ−３−ｏｎｅ（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ社）
ＨＩＮＤＩＮＯＬ（登録商標）、（Ｒ，Ｅ）−２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−（２，２，３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｅｎｔ−３−ｅｎｙｌ）ｂｕｔ−２−ｅｎ−１−ｏｌ）（高砂香料工業株式会社）
ＪＡＶＡＮＯＬ（登録商標）、［（１Ｒ，２Ｓ）−１−ｍｅｔｈｙｌ−２−［［（１Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−１，２，２−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−３−ｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．０］ｈｅｘａｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ］ｍｅｔｈａｎｏｌ（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）
Ｌ−Ｍｕｓｃｏｎｅ、（Ｒ）−３−ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｄｅｃａｎ−１−ｏｎｅ（高砂香料工業株式会社）The following nonambergris note fragrance compounds shown in Table 1 were used.
D-Limonene (Nacalai Tesque, Inc.)
Cis-3-Hexenol (Zeon Corporation)
Melonal (Givaudan)
L-Menthol (Takasago International Corporation)
Linyl acetate (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
Vanillin (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
Citronellol (Renessenz)
THESARON (registered trademark), (1R, 6S) -Ethyl 2,2,6-trimethylcyclohexanecarboxylate (Takasago International Corporation)
CALONE (registered trademark), 7-methylbenzo [b] [1,4] dioxepin-3-one (from Firmenich)
HINDINOL (registered trademark), (R, E) -2-Methyl-4- (2,2,3-trimethylcyclopent-3-enyl) but-2-en-1-ol) (Takasago International Corporation)
JAVANOL (registered trademark), [(1R, 2S) -1-methyl-2-[[(1R, 3S, 5S) -1,2,2-trimethyl-3-bicyclo [3.1.0] hexanyl] methyl Cyclopropyl] methanol (Givaudan)
L-Muscone, (R) -3-methylcyclopentadecane-1-one (Takasago International Corporation)
結果を図４に示す。ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１はアンバーグリスノートを呈する７種の化合物のいずれかに応答し、その他の香調の化合物に対しては応答しなかった。すなわち、ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１はアンバーグリスノート香料化合物に特異的に応答することが示された。 FIG. 4 shows the results. OR7A17 and OR7C1 responded to any of the seven compounds exhibiting ambergris note and did not respond to other odorous compounds. That is, OR7A17 and OR7C1 were shown to specifically respond to the Ambergris Note fragrance compound.
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、多数の被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物を選択することができる。本発明のスクリーニング方法は、アンバーグリスノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献できるものと期待される。 By using the screening method of the present invention, a candidate compound exhibiting ambergris note can be selected from a large number of test compounds. The screening method of the present invention is expected to contribute to the development of a new fragrance material exhibiting ambergris notes.
Claims (5)
（ｉ）ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含む、方法。A method for screening candidate compounds presenting ambergris note from among test compounds, using an olfactory receptor showing responsiveness to a flavor presenting ambergris note,
(I) a group consisting of OR7A17, OR7C1, and a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4, and exhibiting responsiveness to a fragrance exhibiting ambergris note Contacting the test compound with an olfactory receptor selected from the step, and measuring the response of the olfactory receptor to the test compound,
(Ii) measuring the response of the olfactory receptor used in step (i) in the absence of the test compound;
(Iii) comparing the measurement results in steps (i) and (ii), and selecting a test compound having altered responsiveness as a candidate compound exhibiting ambergris note.
で示される化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。The fragrance presenting an ambergris note has the following formula:
The method according to claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of compounds represented by the following formula:
Selecting a candidate compound exhibiting an ambergris note in step (iii) when the Fold Increase value obtained by dividing the measurement result in step (i) by the measurement result in step (ii) is 2 or more. Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4.
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