JPWO2017159795A1 - テントキシン合成関連遺伝子、これを用いたジヒドロテントキシン又はテントキシンの製造方法及びこれを有する形質転換体 - Google Patents
テントキシン合成関連遺伝子、これを用いたジヒドロテントキシン又はテントキシンの製造方法及びこれを有する形質転換体 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2017159795A1 JPWO2017159795A1 JP2018506008A JP2018506008A JPWO2017159795A1 JP WO2017159795 A1 JPWO2017159795 A1 JP WO2017159795A1 JP 2018506008 A JP2018506008 A JP 2018506008A JP 2018506008 A JP2018506008 A JP 2018506008A JP WO2017159795 A1 JPWO2017159795 A1 JP WO2017159795A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- seq
- sequence shown
- identity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
配列番号4に示すアミノ酸配列又は配列番号4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のアデニレーションドメインと、配列番号5に示すアミノ酸配列又は配列番号5に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のN-メチルトランスフェラーゼドメインと、配列番号6に示すアミノ酸配列又は配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号7に示すアミノ酸配列又は配列番号7に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第2モジュールと、
配列番号8に示すアミノ酸配列又は配列番号8に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3のアデニレーションドメインと、配列番号9に示すアミノ酸配列又は配列番号9に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号10に示すアミノ酸配列又は配列番号10に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第3モジュールと、
配列番号11に示すアミノ酸配列又は配列番号11に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4のアデニレーションドメインと、配列番号12に示すアミノ酸配列又は配列番号12に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のN-メチルトランスフェラーゼドメインと、配列番号13に示すアミノ酸配列又は配列番号13に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号14に示すアミノ酸配列又は配列番号14に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4の縮合ドメインとをN末端側からこの順で有する第4モジュールと、
をN末端側からこの順で有し、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするテントキシン合成関連遺伝子。
(b)配列番号16に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質
(c)配列番号15に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質
(3)Alternaria属の糸状菌由来であることを特徴とする(1)記載のテントキシン合成関連遺伝子。
(b)配列番号16に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質
(c)配列番号15に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質
(6)上記タンパク質は、
配列番号1に示すアミノ酸配列又は配列番号1に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のアデニレーションドメインと、配列番号2に示すアミノ酸配列又は配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号3に示すアミノ酸配列又は配列番号3に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第1モジュールと、
配列番号4に示すアミノ酸配列又は配列番号4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のアデニレーションドメインと、配列番号5に示すアミノ酸配列又は配列番号5に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のN-メチルトランスフェラーゼドメインと、配列番号6に示すアミノ酸配列又は配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号7に示すアミノ酸配列又は配列番号7に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第2モジュールと、
配列番号8に示すアミノ酸配列又は配列番号8に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3のアデニレーションドメインと、配列番号9に示すアミノ酸配列又は配列番号9に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号10に示すアミノ酸配列又は配列番号10に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第3モジュールと、
配列番号11に示すアミノ酸配列又は配列番号11に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4のアデニレーションドメインと、配列番号12に示すアミノ酸配列又は配列番号12に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のN-メチルトランスフェラーゼドメインと、配列番号13に示すアミノ酸配列又は配列番号13に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号14に示すアミノ酸配列又は配列番号14に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4の縮合ドメインとをN末端側からこの順で有する第4モジュールと、
をN末端側からこの順で有することを特徴とする(5)記載のテントキシン合成関連遺伝子。
(b)配列番号18に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する活性を有するタンパク質
(c)配列番号17に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する活性を有するタンパク質
(10)Alternaria属の糸状菌由来であることを特徴とする(9)記載のテントキシン合成関連遺伝子。
培養上清からジヒドロテントキシンを回収する工程とを含む、
ジヒドロテントキシンの製造方法。
培養上清からテントキシンを回収する工程とを含む、
テントキシンの製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-052806号の開示内容を包含する。
本発明に係るテントキシン合成関連遺伝子は、テントキシンの前駆体であるジヒドロテントキシンを合成する非リボソーム型ペプチド合成酵素をコードする遺伝子と、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する酵素をコードする遺伝子とを含む意味である。以下の説明において、テントキシンの前駆体であるジヒドロテントキシンを合成する非リボソーム型ペプチド合成酵素を単にNRPSと称し、当該NRPSをコードする遺伝子をNRPS遺伝子と称する。また、以下の説明において、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する酵素をシトクロムP450やP450、酸化還元酵素等と称し、当該シトクロムP450をコードする遺伝子をP450遺伝子と称する。ここで、ジヒドロテントキシンは、体系名がシクロ(L-Leu-N-メチル-D-Phe-Gly-N-メチル-L-Ala-)であり、L−アラニン、L−ロイシン、フェニルアラニン及びグリシンを構成単位として含んでいる。テントキシンの体系名は、(2Z)-3-フェニル-N-メチルシクロ(Dha-Gly-N-メチル-L-Ala-L-Leu-)である。
ジヒドロテントキシンを合成するNRPSは、L−アラニンのカルボシキル基とL−ロイシンのアミノ基との間にペプチド結合を形成し、L−ロイシンのカルボキシル基とフェニルアラニンのアミノ基との間にペプチド結合を形成し、フェニルアラニンのカルボキシル基とグリシンのアミノ基との間にペプチド結合を形成し、当該グリシンのカルボキシル基と上記L−アラニンのアミノ基との間にペプチド結合を形成する活性を有している。また、ジヒドロテントキシンを合成するNRPSは、L−ロイシンとフェニルアラニンとの間のペプチド結合をメチル化し、グリシンとL−アラニンとの間のペプチド結合をメチル化する活性を有している。
〔P450遺伝子〕
本発明に係るP450遺伝子は、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。本発明に係るP450遺伝子は、一例としてAlternaria alternata由来であって、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する活性を有するP450のアミノ酸配列を配列番号18に示し、当該アミノ酸配列に対応するコーディング領域の塩基配列を配列番号17に示す。本発明に係るP450遺伝子は、これら配列番号17及び18により規定することができる。
〔形質転換体〕
上述した本発明に係るテントキシン合成関連遺伝子のうち、NRPS遺伝子を発現可能に宿主に導入することによってジヒドロテントキシン合成能を有する形質転換体を作製することができ、また、NRPS遺伝子及びP450遺伝子をともに発現可能に宿主に導入することによってテントキシン合成能を有する形質転換体を作製することができる。なお、上述したP450遺伝子を、ジヒドロテントキシン合成能を有する宿主に導入することによってテントキシン合成能を有する形質転換体を作製することができる。
〔ジヒドロテントキシン又はテントキシンの製造〕
上述した形質転換体を利用することで、目的とするテントキシンやジヒドロテントキシンを製造することができる。すなわち、上述した本発明に係るテントキシン合成関連遺伝子のうち、NRPS遺伝子を発現可能に導入した形質転換体を利用することで、ジヒドロテントキシンを製造することができる。また、NRPS遺伝子及びP450遺伝子をともに発現可能に導入した形質転換体を利用することによって、テントキシンを製造することができる。さらに、上述したP450遺伝子を、ジヒドロテントキシン合成能を有する宿主に発現可能に導入した形質転換体を利用することによってテントキシンを製造することができる。
ブロモフェノキシム(bromofenoxim)、ブロモブチド(bromobutide)、プリミスルフロン・メチル(primisulfuron-methyl)、プレチラクロール(pretilachlor)、プロカルバゾン・ナトリウム塩(procarbazone-sodium)、プロジアミン(prodiamine)、プロスルフロン(prosulfuron)、プロスルホカルブ(prosulfocarb)、プロパキザホップ(propaquizafop)、プロパクロール(propachlor)、プロパジン(propazine)、プロパニル(propanil)、プロピザミド(propyzamide)、プロピソクロール(propisochlor)、プロピリスルフロン(propyrisulfuron)、プロファム(propham)、プロフルアゾール(profluazol)、プロホキシジム(profoxydim)、プロポキシカルバゾン・ナトリウム塩(propoxycarbazone-sodium)、プロメトリン(prometryn)、プロメトン(prometon)、ヘキサジノン(hexazinone)、ヘプタマロキシログルカン(heptamaloxyloglucan)、ベナゾリン(benazolin)、ベフルブタミド(beflubutamid)、ベンカルバゾン(bencarbazone)、ベンスリド(bensulide)、ベンスルフロン・メチル(bensulfuron- methyl)、ベンズフェンジゾン(benzfendizone)、ベンゾビシクロン(benzobicyclon)、ベンゾフェナップ(benzofenap)、ベンタゾン(bentazone)、ベンフルラリン(benfluralin)、ベンフレセート(benfuresate)、ペトキサミド(pethoxamid)、ペノキススラム(penoxsulam)、ペブレート(pebulate)、ペラルゴン酸(pelargonic acid)、ペンジメタリン(pendimethalin)、ペンタノクロール(pentanochlor)、ペントキサゾン(pentoxazone)、ホサミン(fosamine)、ホメサフェン(fomesafen)、ホラムスルフロン(foramsulfuron)、マレイン酸ヒドラジド(maleic hydrazide)、メコプロップ-P・カリウム塩(mecoprop-P-potassium)、メコプロップ(mecoprop)(ナトリウム、カリウム、イソプロピルアミン、トリエタノールアミン、ジメチルアミン等の塩を含む)、メソスルフロン・メチル(mesosulfuron-methyl)、メソトリオン(mesotrione)、メタザクロール(metazachlor)、メタゾスルフロン(metazosulfuron)、メタベンズチアズロン(methabenzthiazuron)、メタミトロン(metamitron)、メタミホップ(metamifop)、メチオゾリン(methiozolin)、メチルダイムロン(methyldymuron)、メトキスロン(metoxuron)、メトスラム(metosulam)、メトスルフロンメチル(metsulfuron-methyl)、メトブロムロン(metobromuron)、メトベンズロン(metobenzuron)、メトラクロール(metolachlor)、メトリブジン(metribuzin)、メフェナセット(mefenacet)、モノスルフロン・メチル(monosulfuron-methyl)、モノスルフロン(monosulfuron)、モノリニュロン(monolinuron)、モリネート(molinate)、ヨードスルフロン(iodosulfuron)、ヨードスルフロンメチルナトリウム塩(iodosulfulon-methyl-sodium)、ヨーフェンスルフロン・ナトリウム塩(iofensulfuron-sodium)、ヨーフェンスルフロン(iofensulfuron)、ラクトフェン(lactofen)、リニュロン(linuron)、リムスルフロン(rimsulfuron)、レナシル(lenacil)、1-ナフチルアセトアミド(1-naphthylacetamide)、1-メチルシクロプロペン(1-methylcyclopropene)、2,6-ジイソプロピルナフタレン(2,6-diisopropylnaphthalene)、4-オキソ-4-(2-フェニルエチル)アミノ酪酸(化学名、CAS登録番号:1083-55-2)、4-クロロフェノキシ酢酸(4-CPA)、PESA(4-oxo-[(2-phenylethyl)amino]butanoic acid)、n-デシルアルコール(n-decanol)、アビグリシン(aviglycine)、アンシミドール(ancymidol)、イナベンフィド(inabenfide)、インドール酢酸(indole acetic acid)、インドール酪酸(indole butyric acid)、ウニコナゾール-P(uniconazole-P)、ウニコナゾール(uniconazole)、エコリスト(ecolyst)、エチクロゼート(ethychlozate)、エテホン(ethephon)、エポコレオン(epocholeone)、カルボネ(carvone)、クロキシホナック・カリウム塩(cloxyfonac-potassium)、クロキシホナック(cloxyfonac)、クロプロップ(cloprop)、クロルメコート(chlormequat)、サイトカイニン(cytokinins)、シクラニリド(cyclanilide)、シントフェン(sintofen)、ジケグラック(dikegulac)、ジベレリン酸(gibberellin acid)、ジメチピン(dimethipin)、ダミノジット(daminozide)、チジアズロン(thidiazuron)、トリアコンタノール(triacontanol)、トリネキサパック・エチル(trinexapac-ethyl)、パクロブトラゾール(paclobutrazol)、フルメトラリン(flumetralin)、フルルプリミドール(flurprimidol)、フルレノール(flurenol)、プロヒドロジャスモン(prohydrojasmon)、プロヘキサジオン・カルシウム塩(prohexadione-calcium)、ヘプタマロキシログルカン(heptamaloxyloglucan)、ベンジルアミノプリン(benzylaminopurine)、ホルクロルフェニュロン(forchlorfenuron)、マレイン酸ヒドラジド(maleic hydrazide)、メピコート・クロリド(mepiquat chloride)、メフルイジド(mefluidide)、過酸化カルシウムを挙げることができる。
〔実施例1〕
<Alternaria alternataのゲノム解析>
A. alternata の分生子を200 ml CM液体培地(500ml 三角フラスコ)に植菌し、26℃、130rpmで48時間培養した。培養菌体をミラクロスで集菌した後、スパーテルで菌体をプレスして脱水し、予め-20℃に冷却しておいた乳鉢に菌体を入れ、液体窒素を注いで凍結させた。粉状になるまで乳棒で素早く破砕した後、DNeasy Plant Maxi Kitを用いてゲノムDNAを抽出した。
<A. alternataが有するNRPS遺伝子の探索>
次世代シークエンサーを用いたゲノム解析の結果から推定タンパク質のアミノ酸配列をデータベース化した。そして、当該データベースを用いてジヒドロテントキシン合成能を有するNRPSを検索した。
<ジヒドロテントキシン生合成に関与するNRPSの推定>
上述のように、A. alternataが8個の推定NRPS遺伝子を有していると考えられたことから、この中からジヒドロテントキシンの基本ペプチド骨格を生合成している遺伝子の探索を行った。なお、テントキシンはジヒドロテントキシンを前駆体として生合成されることが明らかになっている(Liebermann, B. and W. Ihn, Dihydrotentoxin: a precursor of tentoxin or its degradation product? Journal of basic microbiology, 1988. 28(1-2): p. 63-70.)。
<ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する酵素の推定>
テントキシンは、ジヒドロテントキシンを構成するフェニルアラニン残基の側鎖部分が酸化された構造を有する。したがって、テントキシンの生合成には、推定したNRPS遺伝子(tenA)と、酸化酵素とが関与していると考えられた。一般的に、二次代謝産物の生合成に関わる遺伝子は、ゲノム上に群(クラスター)を形成して配置されていることから、この酸化酵素遺伝子はtenA遺伝子の近傍に存在している可能性が高いと推測された。そこで、A. alternataゲノム上のtenA周辺に存在する遺伝子の機能を調べたところ、tenA遺伝子の上流に隣接して存在し、ent-kaurene oxidaseとアノテーションされた遺伝子を見出した。この遺伝子は、酸化酵素であるシトクロムP450(CYP512Aに相同性)をコードしていることが解った。よって、これがジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する反応を触媒している可能性が考えられた。この遺伝子をP450遺伝子と命名した。
<tenA及びP450遺伝子によるテントキシン生産>
以上のように、ジヒドロテントキシン合成能を有するNRPSをコードする遺伝子として推定したtenA遺伝子と、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する酵素をコードする遺伝子として推定したP450遺伝子とを用いて、テントキシンの生合成を試みた。
<テントキシン及びジヒドロテントキシンの生産確認>
空ベクター導入株、tenA単独導入株、P450単独導入株、tenA/P450共導入株の分生子を5% glucoseまたは5% maltoseを炭素源とするCM培地30ml(100mlバッフル付三角フラスコ)に植菌し、30℃、130rpmで10日間培養を行った。菌体内及び培養上清中の代謝物はまとめてアセトン及び酢酸エチルにより抽出した後、LC/MS分析に供した。
<LC条件>
装置:ACQUITY UPLC I-Classシステム(Waters社製)
カラム:Acquity UPLC BEH C18 2.1x150mm(Waters社製)
移動相:A/B=80/20(0.5min hold)→3min→2/98(0.5min hold)→0.5min→80/20
A:蒸留水
B:アセトニトリル
流速:0.4ml/min
検出波長:220nm、282nm
<MS条件>
装置:Xevo G2 QTof(Waters社製)
イオン化条件:ESI、positive
分析の結果を図3及び4に示す。図3及び4に示すように、炭素源maltoseの発現誘導条件において、tenA単独導入株ではジヒドロテントキシンのみが検出され、tenA/P450共導入株では、ジヒドロテントキシンに加えてテントキシンが検出された。なお、テントキシンは標品のHPLCの保持時間の比較とMSスペクトルの結果から同定した。一方、ジヒドロテントキシンはMSスペクトルの分子量の一致により同定した(図5)。
本実施例では、実施例1で同定したNRPS遺伝子を異種発現させたときのジヒドロテントキシシンの生産量を、Cochliobolus miyabeanus由来のNRPS遺伝子(CmNps3)を異種発現させたときの同生産量と比較した。
C. clavataにおけるCcNRPS遺伝子の上流側約1,010bpのプロモーター領域をL-arm、CcNRPS遺伝子の5’末端から4860番目の塩基を起点に995bpの領域をR-armとし両遺伝子断片をC. clavataのゲノムDNAを鋳型にしたPCRにより得た。また、目的の遺伝子(tenA遺伝子又はCmNps3遺伝子)を制御するためのC. clavata由来の355bpのターミネーター領域及び形質転換体の選抜マーカーとなるpyrG遺伝子を同ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより得た。続いてIn-Fusion Cloning Kit (Clontech社製)を用いて、上記PCRで増幅したL-arm、ターミネーター配列、pyrG遺伝子、R-armをこの順に連結させた遺伝子断片をpUC19に挿入し、各遺伝子破壊コンストラクトを作製した。なお、L-armとターミネーター配列の間には、遺伝子の挿入のための制限酵素Swa I及びNot I認識配列を設計した(図6)。
・L-arm増幅用
Cc_TRAF140154_pre_Larm_FW:
5’-cggtacccggggatcCCCACGTGCAGCTTCAAC-3’(配列番号25)
Cc_TRAF140154_pre_Larm_RV:
5’-ATTTAAATAGTTACAATATTCGTGGAGTATCCC-3’(配列番号26)
・R-arm増幅用
Cc_TRAF140154_pre_Rarm_FW:
5’-accgtcatggatatcCTACGGACCGAGTGAGAACTC-3’(配列番号27)
Cc_TRAF140154_pre_Rarm_RV:
5’-cgactctagaggatcCAGAGTATTTAGTTGGAGGGATTG-3’(配列番号28)
・pyrG選抜マーカー増幅用
PyrG-mark_FW:5’-GATATCGCCGCTCTGCTTCATTGC-3’(配列番号29)
PyrG-mark_RV:5’-GATATCCATGACGGTTGCTAGGGTC-3’(配列番号30)
・ターミネーター配列増幅用
Cc_nmt1_pre_Ter_FW:
5’-tgtaactatttaaatGCGGCCGCGCAGTTGCCGTTGGACCA-3’(配列番号31)
Cc_nmt1_pre_Ter_RV:
5’-cagagcggcgatatcCGCGACACTGTAATATTAAAGC-3’(配列番号32)
・PCR条件
PCRには、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific社製)を使用した。温度条件は、初期変性:98℃で30secとし、変性:98℃で10sec、アニーリング:60℃で30sec及び伸長:72℃で1minを1サイクルとして30サイクル行い、最終伸長:72℃で5minの条件とした。
<tenA遺伝子高発現コンストラクトの構築>
実施例1で作製した麹菌へのtenA導入用に構築したコンストラクトを制限酵素Not Iで処理してtenA遺伝子を切り出し、上記で作製した遺伝子導入用ベクターのNot Iサイトにライゲーションにより挿入した。これにより、図7Aに示したtenA高発現コンストラクトを構築した。
<CmNps3高発現コンストラクトの構築>
独立行政法人 製品評価技術基盤機構(Nite)より購入したC. miyabeanus(NBRC No. 100216)の分生子懸濁液をPD培地に植菌し、26℃、140rpmで4日間培養した。培養菌体をミラクロスで集菌した後、スパーテルで菌体をプレスして脱水し、予め-20℃に冷却しておいた乳鉢に菌体を入れ、液体窒素を注いで凍結させた。粉状になるまで乳棒で素早く破砕した後、DNeasy Plant Maxi Kitを用いてゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型に5’末端に制限酵素Not I認識配列を付加したプライマーを用いてCmNps3遺伝子をPCR増幅し、In-Fusion Cloning Kitを用いてpUC19に挿入した。挿入配列のシークエンスを解析したところ、論文にて開示されたCmNps3遺伝子の塩基配列と異なる塩基が複数箇所見出された。そこで、In-Fusion反応を活用してこれらの塩基に変異を導入し、論文にて開示された塩基配列と一致するように改変した。改変したCmNps3遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号33に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号34に示した。すなわち、配列番号33及び34の配列は、上記文献(De Bruyne, L., et al.)に記載されたCmNps3に関する配列である。
・CmNps3増幅用
CmNps3(NotI)_FW:
5’-cggtacccggggatcGCGGCCGCATGGGTGACATAGGAAAACC-3’(配列番号35)
CmNps3(NotI)_RV:
5’-cgactctagaggatcGCGGCCGCTCATGCCTCCTGCAGTGA-3’(配列番号36)
・PCR条件
PCRには、KOD FX Neo (東洋紡社製)を使用した。温度条件は、初期変性:94℃で2minとし、変性:98℃で10sec、伸長:74℃で8minを1サイクルとして5サイクル行った後、変性:98℃で10sec、伸長:72℃で8minを1サイクルとして5サイクル行った後、変性:98℃で10sec、伸長:70℃で8minを1サイクルとして5サイクル行った後、変性:98℃で10sec、伸長:68℃で8minを1サイクルとして5サイクル行い、最終伸長:68℃で5minの条件とした。
<C. clavataの形質転換>
100mlのCM+5mM uridine+5mM uracil培地(300ml三角フラスコ)にC. clavata pyrG遺伝子破壊株の胞子懸濁液を植菌し、30℃で40時間振盪培養した後、ガラスろ過器(11G1)を用いたろ過により菌糸を集め、滅菌水で洗浄後、スパーテル等で押さえて十分に水分を除いた。菌体を10mlのprotoplast化溶液[3mg/ml Yatalase、0.3mg/ml Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum、0.8M NaCl、10mM sodium phosphate buffer(pH6.0)]に加え、懸濁し、30℃で3時間ゆるやかに振盪しprotoplast化を行った。ミラクロスでろ過し、ろ液を1,500xgで5分間遠心し、protoplastを集め、0.8M NaClで2回洗浄した。protoplastを2×108/mlとなるようにSolution 1[0.8M NaCl、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl(pH8.0)]に懸濁し、0.2容量のSolution 2[40%(w/v)PEG4000、50mM CaCl2、50mM Tris-HCl(pH8.0)]を加えて緩やかに懸濁し、0.2mlのprotoplast懸濁液に制限酵素Sbf I消化により直鎖化したtenA高発現コンストラクト(図7A)又はCmNps3高発現コンストラクト(図7B)を5μg相当量を加え、氷中で10分間静置した。1mlのSolution 2を加え、緩やかに懸濁し、室温で15分間静置した。10mlのSolution 1を加えて緩やかに懸濁し、遠心でprotoplastを集め、上清をできるだけ除き、protoplastを1mlのSolution 1に懸濁した。CM+1.2M sucrose選択プレート5枚にprotoplast懸濁液を0.2mlずつのせ、6〜7ml(90mm φ シャーレ当たり)のCM+1.2M sucrose軟寒天(1%)選択培地を加え、protoplastが均一になるようにすばやく重層し、26℃で6日間培養した。
<代謝物の分析>
上記で作製したtenA高発現株及びCmNps3高発現株の分生子懸濁液を30mlのCM培地に植菌し、26℃、140rpmで7日間振盪培養した。菌体内及び培養上清中の代謝物はまとめてアセトンおよび酢酸エチルにより抽出した後、LC/MS分析に供した。
<HPLC条件>
装置:Prominence UFLC (SHIMADZU社製)
カラム:CAPCELL PAK SG120 5μm、4.6mm×250mm(SHISEIDO社製)
移動相:A/B=80/20(5min hold)→15min→2/98(5min hold)→5min→80/20
A:蒸留水/TFA (100/0.1、v/v)
B:アセトニトリル/TFA(100/0.1、v/v)
流速:1.0ml/min
検出波長:220nm、282nm
<MS条件>
装置:3200 Q TRAP(Applied Biosystems社製)
イオン化条件:ESI、positive
分析の結果を図8A〜8Eに示した。HPLC分析の結果、図8Bに示すように、tenA高発現株では、保持時間13.8分に野生株(図8A)で認められない明瞭なピークが確認された。本ピークはMSスペクトルの解析の結果、図8Dに示すように、ジヒドロテントキシンの分子量と一致した。なお、ジヒドロテントキシンの分子量は416.51である。
Claims (19)
- 配列番号1に示すアミノ酸配列又は配列番号1に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のアデニレーションドメインと、配列番号2に示すアミノ酸配列又は配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号3に示すアミノ酸配列又は配列番号3に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第1モジュールと、
配列番号4に示すアミノ酸配列又は配列番号4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のアデニレーションドメインと、配列番号5に示すアミノ酸配列又は配列番号5に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のN-メチルトランスフェラーゼドメインと、配列番号6に示すアミノ酸配列又は配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号7に示すアミノ酸配列又は配列番号7に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第2モジュールと、
配列番号8に示すアミノ酸配列又は配列番号8に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3のアデニレーションドメインと、配列番号9に示すアミノ酸配列又は配列番号9に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号10に示すアミノ酸配列又は配列番号10に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第3モジュールと、
配列番号11に示すアミノ酸配列又は配列番号11に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4のアデニレーションドメインと、配列番号12に示すアミノ酸配列又は配列番号12に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のN-メチルトランスフェラーゼドメインと、配列番号13に示すアミノ酸配列又は配列番号13に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号14に示すアミノ酸配列又は配列番号14に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4の縮合ドメインとをN末端側からこの順で有する第4モジュールと、
をN末端側からこの順で有し、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質をコードするテントキシン合成関連遺伝子。 - 上記タンパク質は、以下(a)〜(c)のいずれかのタンパク質であることを特徴とする請求項1記載のテントキシン合成関連遺伝子。
(a)配列番号16に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号16に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質
(c)配列番号15に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質 - Alternaria属の糸状菌由来であることを特徴とする請求項1記載のテントキシン合成関連遺伝子。
- 上記糸状菌は、Alternaria alternataであることを特徴とする請求項3記載のテントキシン合成関連遺伝子。
- 以下(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードするテントキシン合成関連遺伝子。
(a)配列番号16に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号16に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質
(c)配列番号15に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ジヒドロテントキシンの非リボソーム型ペプチド合成活性を有するタンパク質 - 上記タンパク質は、
配列番号1に示すアミノ酸配列又は配列番号1に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のアデニレーションドメインと、配列番号2に示すアミノ酸配列又は配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号3に示すアミノ酸配列又は配列番号3に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第1モジュールと、
配列番号4に示すアミノ酸配列又は配列番号4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のアデニレーションドメインと、配列番号5に示すアミノ酸配列又は配列番号5に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第1のN-メチルトランスフェラーゼドメインと、配列番号6に示すアミノ酸配列又は配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号7に示すアミノ酸配列又は配列番号7に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第2モジュールと、
配列番号8に示すアミノ酸配列又は配列番号8に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3のアデニレーションドメインと、配列番号9に示すアミノ酸配列又は配列番号9に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号10に示すアミノ酸配列又は配列番号10に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第3の縮合ドメインをN末端側からこの順で有する第3モジュールと、
配列番号11に示すアミノ酸配列又は配列番号11に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4のアデニレーションドメインと、配列番号12に示すアミノ酸配列又は配列番号12に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第2のN-メチルトランスフェラーゼドメインと、配列番号13に示すアミノ酸配列又は配列番号13に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4のペプチジルキャリアタンパク質ドメインと、配列番号14に示すアミノ酸配列又は配列番号14に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる第4の縮合ドメインとをN末端側からこの順で有する第4モジュールと、
をN末端側からこの順で有することを特徴とする請求項5記載のテントキシン合成関連遺伝子。 - Alternaria属の糸状菌由来であることを特徴とする請求項5記載のテントキシン合成関連遺伝子。
- 上記糸状菌は、Alternaria alternataであることを特徴とする請求項7記載のテントキシン合成関連遺伝子。
- 以下(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードするテントキシン合成関連遺伝子。
(a)配列番号18に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号18に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する活性を有するタンパク質
(c)配列番号17に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、ジヒドロテントキシンをテントキシンに変換する活性を有するタンパク質 - Alternaria属の糸状菌由来であることを特徴とする請求項9記載のテントキシン合成関連遺伝子。
- 上記糸状菌は、Alternaria alternataであることを特徴とする請求項10記載のテントキシン合成関連遺伝子。
- 請求項1乃至8いずれか一項記載のテントキシン合成関連遺伝子を導入した形質転換体を培養する工程と、
培養上清からジヒドロテントキシンを回収する工程とを含む、
ジヒドロテントキシンの製造方法。 - 上記形質転換体は、上記テントキシン合成関連遺伝子を発現可能に導入した糸状菌であることを特徴とする請求項12記載のジヒドロテントキシンの製造方法。
- 請求項1乃至8いずれか一項記載のテントキシン合成関連遺伝子と、請求項9乃至11いずれか一項記載のテントキシン合成関連遺伝子とを導入した形質転換体を培養する工程と、
培養上清からテントキシンを回収する工程とを含む、
テントキシンの製造方法。 - 上記形質転換体は、上記2種類のテントキシン合成関連遺伝子を発現可能に導入した糸状菌であることを特徴とする請求項14記載のテントキシンの製造方法。
- 請求項1乃至8いずれか一項記載のテントキシン合成関連遺伝子を導入した形質転換体。
- 請求項9乃至11いずれか一項記載のテントキシン合成関連遺伝子を導入した形質転換体。
- 請求項1乃至8いずれか一項記載のテントキシン合成関連遺伝子と、請求項9乃至11いずれか一項記載のテントキシン合成関連遺伝子とを導入した形質転換体。
- 上記遺伝子を麹菌(Aspergillus oryzae)に導入したものであることを特徴とする請求項16乃至18いずれか一項記載の形質転換体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016052806 | 2016-03-16 | ||
JP2016052806 | 2016-03-16 | ||
PCT/JP2017/010697 WO2017159795A1 (ja) | 2016-03-16 | 2017-03-16 | テントキシン合成関連遺伝子、これを用いたジヒドロテントキシン又はテントキシンの製造方法及びこれを有する形質転換体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017159795A1 true JPWO2017159795A1 (ja) | 2019-01-24 |
JP6906770B2 JP6906770B2 (ja) | 2021-07-21 |
Family
ID=59851570
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018506008A Active JP6906770B2 (ja) | 2016-03-16 | 2017-03-16 | テントキシン合成関連遺伝子、これを用いたジヒドロテントキシン又はテントキシンの製造方法及びこれを有する形質転換体 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11174297B2 (ja) |
EP (1) | EP3431599B1 (ja) |
JP (1) | JP6906770B2 (ja) |
CN (1) | CN108779457B (ja) |
AR (1) | AR107900A1 (ja) |
TW (1) | TWI778955B (ja) |
WO (1) | WO2017159795A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR107900A1 (es) * | 2016-03-16 | 2018-06-28 | Aist | Un gen de síntesis de tentoxina, un método para producir tentoxina o dihidrotentoxina usando el gen, y un transformante que lo comprende |
CN115074337B (zh) * | 2021-03-12 | 2023-11-28 | 上海交通大学 | α-酮戊二酸依赖型双加氧酶在催化合成环内过氧桥键中的应用 |
CN114672500B (zh) * | 2022-04-01 | 2023-08-29 | 湖南农业大学 | 一种莲子草假隔链格孢致病基因Unigene0007998及其应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0578616A3 (en) * | 1992-07-09 | 1994-06-01 | Sandoz Ltd | Cylosporin synthetase |
MXPA01012932A (es) * | 1999-07-01 | 2002-07-30 | Basf Ag | Genes de corynebacterium glutamicum que codifican proteinas de sistema de fosfoenolpiruvato: azucar fosfotransferasa. |
EP1616963B1 (en) * | 2004-06-25 | 2009-11-18 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing dipeptides or dipeptide derivatives |
CA2803222A1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-01-05 | Dsm Ip Assets B.V. | A method for the production of a compound of interest |
AR107900A1 (es) * | 2016-03-16 | 2018-06-28 | Aist | Un gen de síntesis de tentoxina, un método para producir tentoxina o dihidrotentoxina usando el gen, y un transformante que lo comprende |
-
2017
- 2017-03-16 AR ARP170100656A patent/AR107900A1/es unknown
- 2017-03-16 JP JP2018506008A patent/JP6906770B2/ja active Active
- 2017-03-16 WO PCT/JP2017/010697 patent/WO2017159795A1/ja active Application Filing
- 2017-03-16 TW TW106108763A patent/TWI778955B/zh active
- 2017-03-16 EP EP17766791.2A patent/EP3431599B1/en active Active
- 2017-03-16 CN CN201780018035.XA patent/CN108779457B/zh active Active
- 2017-03-16 US US16/085,502 patent/US11174297B2/en active Active
-
2021
- 2021-10-12 US US17/499,599 patent/US11919928B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3431599A4 (en) | 2019-08-28 |
JP6906770B2 (ja) | 2021-07-21 |
TWI778955B (zh) | 2022-10-01 |
US11174297B2 (en) | 2021-11-16 |
WO2017159795A1 (ja) | 2017-09-21 |
US20190100565A1 (en) | 2019-04-04 |
EP3431599B1 (en) | 2022-06-15 |
TW201734211A (zh) | 2017-10-01 |
CN108779457B (zh) | 2022-09-13 |
US20220024996A1 (en) | 2022-01-27 |
CN108779457A (zh) | 2018-11-09 |
US11919928B2 (en) | 2024-03-05 |
AR107900A1 (es) | 2018-06-28 |
EP3431599A1 (en) | 2019-01-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11919928B2 (en) | Method for producing dihydrotentoxin | |
UA127242C2 (uk) | Суміші й композиції, які містять штами paenibacillus або фузарицидини і хімічні пестициди | |
AU2019297402B2 (en) | Substituted thiophenecarboxamides and analogues as antibacterials agents | |
CN103025166A (zh) | 用于耐受性或抗性谷物作物的除草剂 | |
AU2021278625A1 (en) | Bacterial strain belonging to Bacillus genus, and microbiological control agent using said bacterial strain | |
US20230133087A1 (en) | Active compound combinations and fungicide compositions comprising those | |
CN115551355A (zh) | 活性化合物结合物和包含它们的杀真菌剂组合物 | |
TW202313960A (zh) | 促進植物成長之屬於離胺酸芽孢桿菌屬之菌株及其利用 | |
CA3228942A1 (en) | Active compound combinations and fungicide compositions comprising those | |
CN115551354A (zh) | 活性化合物结合物和包含它们的杀真菌剂组合物 | |
WO2020200959A1 (en) | Method for controlling ganoderma disease in oil palm | |
US11851411B2 (en) | Herbicidal compounds | |
EP3915371A1 (en) | Active compound combinations and fungicide compositions comprising those | |
CA3139524A1 (en) | Active compound combinations | |
US20210163451A1 (en) | Methods and compositions for substituted 2,5-diketopiperazine analogs | |
EP3679791A1 (en) | Active compound combinations | |
WO2023204285A1 (ja) | バシルス属菌株の生菌または培養物を有効成分として含有する植物成長調整剤及びその利用法 | |
RU2797513C2 (ru) | Замещенные тиофенкарбоксамиды и аналоги в качестве антибактериальных средств | |
EP3679793A1 (en) | Active compound combinations | |
EP3679789A1 (en) | Active compound combinations |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200128 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210209 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210412 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210608 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210621 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6906770 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |