JPWO2017130349A1 - 塩基配列決定装置、キャピラリアレイ電気泳動装置及び方法 - Google Patents

塩基配列決定装置、キャピラリアレイ電気泳動装置及び方法 Download PDF

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Abstract

塩基配列決定装置は、(1)各塩基に対応する波長スペクトルの時系列信号を移動度補正した移動度補正信号を出力する移動度補正部と、(2)点拡がり関数の複数のパラメータ候補について、前記移動度補正信号の逆畳み込み後信号をそれぞれ算出する処理と、算出された逆畳み込み後信号についてピーク間隔の分散を計算する処理と、計算された分散を用いて前記点拡がり関数のパラメータを特定する処理と、特定されたパラメータを有する前記点拡がり関数に対応する前記逆畳み込み信号を更新逆畳み込み信号として出力する処理と、を実行する逆畳み込み部と、(3)前記更新逆畳み込み後信号からピーク波形を抽出し、更新ピーク抽出後信号を出力するピーク抽出部と、(4)前記更新ピーク抽出後信号を入力し、塩基配列を決定する配列特定部とを有する。

Description

本発明は、塩基配列を自動的に決定する技術に関する。
核酸を構成する塩基配列を決定する装置は、一般に、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）シーケンサと呼ばれる。ＤＮＡシーケンサには様々な検出技術が存在するが、以下では、キャピラリ電気泳動型シーケンサについて説明する。キャピラリ電気泳動型シーケンサは、核酸試料を電気泳動させることにより塩基配列を決定する。キャピラリ電気泳動型シーケンサは、４種の塩基（Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン））に対応する色素から発せられる波長スペクトルを時系列の入力信号として観察し、塩基配列を決定する。このように時系列の入力信号から塩基配列を決定する処理を「ベースコール」と呼ぶ。
ベースコールでは、入力信号に色変換や移動度補正を施した信号の中から、各塩基に対応するピークを検出し、それらのピークの位置の順序に応じて配列を決定する。ただし、必ずしも急峻なピークが観測されるとは限らず、ピーク同士が重なりを持つほどピークの幅が広がることがあり、重なった複数のピークが入力信号上は一つのピークとして観測されることがある。この場合、入力信号上の一つのピークを元の複数のピークに分解し、各ピークの正しい位置を決定しなければ解析が不正確となる。
このようなピークの重なりがあっても精度良く配列を決定する方法として、特許文献１に記載の方法がある。特許文献１の要約には、「（Ａ）試料核酸を電気泳動分離して得られた４種類の塩基種別のピークを含む電気泳動データから基盤ピークを抽出する基盤ピーク抽出工程、（Ｂ）抽出された基盤ピークにより構成される時系列データにおいて、探索を開始する探索始点基盤ピーク及びピーク間隔基準値を設定する条件設定工程、（Ｃ）前記時系列データにおいて、探索始点基盤ピークを始点として、隣接する基盤ピーク間を時系列の前方向及び後方向に順次走査し、基盤ピーク間の間隔を前記ピーク間隔基準値とを比較してピーク欠落区間に補間ピークを追加することにより塩基配列を決定する。」と記載されている。
国際公開第２００８／０５０４２６号
前述の通り、特許文献１には、「基盤ピーク間の間隔を前記ピーク間隔基準値とを比較してピーク欠落区間に補間ピークを追加する」技術が記載されている。しかし、欠落区間にピークを追加する方法では、仮にピークを追加すべき区間を決定することができたとしても、どの塩基種別のピークを追加すべきかを決定することはできない。例えば図１のように、塩基種別Ａと塩基種別Ｇの間で波形が時間的に重なっている場合を考える。塩基種別Ａには微小なピークＰ１が存在するが、ノイズなど何らかの原因によりピークＰ１が検出できなかった場合、その時刻に、塩基種別Ａと塩基種別ＧのいずれにピークＰ１を追加するかは明らかではない。
そこで、本発明は、ピークの分離度が低い場合でも高精度に塩基配列を決定できる技術を提供する。
上記課題を解決するために、本発明は、例えば特許請求の範囲に記載の構成を採用する。本明細書は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例には、「(1)各塩基に対応する波長スペクトルの時系列信号を移動度補正した移動度補正信号を出力する移動度補正部と、(2)点拡がり関数の複数のパラメータ候補について、前記移動度補正信号の逆畳み込み後信号をそれぞれ算出する処理と、算出された逆畳み込み後信号についてピーク間隔の分散を計算する処理と、計算された分散を用いて前記点拡がり関数のパラメータを特定する処理と、特定されたパラメータを有する前記点拡がり関数に対応する前記逆畳み込み信号を更新逆畳み込み信号として出力する処理と、を実行する逆畳み込み部と、(3)前記更新逆畳み込み後信号からピーク波形を抽出し、更新ピーク抽出後信号を出力するピーク抽出部と、(4)前記更新ピーク抽出後信号を入力し、塩基配列を決定する配列特定部と、を有する塩基配列決定装置」がある。
本発明によれば、ピークの分離度が低い場合でも高精度に塩基配列を決定することができる。前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
ピークの分離度が低い場合を説明する図。 実施例１に係るキャピラリ電気泳動装置の全体構成を示す図。 実施例１に係る蛍光検出装置の構成を説明する図。 信号処理部の機能構成を説明する図。 複数のブロックについて計算された標準偏差を用いた再計算機能（ブロック間再計算機能）を説明する図。 ユーザインタフェース画面の例を示す図。 ピーク間隔制約付逆畳み込み部の処理動作を説明するフローチャート。 キャピラリ電気泳動装置の他の構成例を示す図。
以下、図面に基づいて、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明の実施の態様は、後述する形態例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲において、種々の変形が可能である。
（１）実施例１
（１−１）全体構成
図２に、キャピラリアレイ電気泳動装置１０の構成例を示す。キャピラリアレイ電気泳動装置１０は、測定対象物であるＤＮＡに蛍光標識を付加したサンプル（以下「サンプル」という。）が入った複数のサンプル容器１１（各サンプル容器１１には、異なるサンプルが入っている）収容するサンプルトレイ１２と、サンプルトレイ１２を搬送する搬送器２０と、サンプル容器１１内のサンプルの電気泳動路となるキャピラリアレイ３０と、キャピラリアレイ３０内に電気泳動媒体４１を注入するポンプユニット４２と、キャピラリアレイ３０の両端に高電圧を印加する高圧電源２１と、キャピラリアレイ３０内を一定の温度に保つ恒温槽３１と、サンプルが電気泳動する経路上に設けられる検出位置３２と、蛍光検出装置５０と、制御基板５１とを有する。
キャピラリアレイ３０は、複数のキャピラリ３３の集合体である。個々のキャピラリ３３は中空である。本実施例の場合、キャピラリ３３の長さは３０ｃｍ以下とする。もっとも、キャピラリ３３の長さは３０ｃｍ以上（例えば３６ｃｍ以上）であってもよい。また、個々のキャピラリ３３の一端は、サンプル容器１１内のサンプルに挿入されている。サンプルは、サンプル容器１１からキャピラリ３３内へと移動し、その後、キャピラリ内を電気泳動する。ポンプユニット４２は、個々のキャピラリ３３内に電気泳動媒体４１（例えばポリマー）を注入する。これにより、個々のキャピラリ３３内は、電気泳動媒体４１が充填される。
高圧電源２１は、電気泳動媒体４１が充填された個々のキャピラリ３３の両端に高電圧（例えば最大電圧が２０ｋＶ）を印加する。高電圧の印加により、各サンプルは、各キャピラリ３３内を通って、サンプル容器１１から検出位置３２へ電気泳動する。検出位置３２を通過した各サンプルは、排出位置３４に向けて電気泳動する。サンプルは、その塩基長に応じて泳動速度が異なるため、塩基長の短いＤＮＡから順番に検出位置３２に到達する。
蛍光検出装置５０は、検出位置３２に到達したサンプルから順番に励起光を照射し、蛍光標識が発する蛍光信号強度と波長を検出する。本実施例における蛍光検出装置５０は、検出した蛍光信号の波長に基づき、ＤＮＡの塩基配列を決定し、制御基板５１に出力する。また、蛍光検出装置５０は、決定された塩基配列その他の情報を表示装置５２の画面上に表示する。制御基板５１は、蛍光検出装置５０が解析した蛍光信号の塩基配列を外部端末（不図示）に転送する。ここでの外部端末は、解析結果の確認のため、表示装置を有することが望ましい。
図３に、蛍光検出装置５０の内部構成例を示す。蛍光検出装置５０は、励起光源６１と、シャッタ６２と、励起光レンズ６３と、光学フィルタ６６と、蛍光レンズ６７と、回析格子６８と、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）６９と、ＣＣＤ制御部７０と、ＡＤＣ（Analog to digital converter）７１と、信号処理部７２と、メモリ７３とを有する。
励起光源６１は、継続して励起光６４を照射する光源である。検出位置３２に対応する全てのキャピラリ３３は、励起光６４によって照射される。シャッタ６２は、所定間隔ごとに開閉を繰り返す。シャッタ６２は、励起光源６１から照射される励起光６４を開放時に透過し、閉鎖時に遮断する。励起光レンズ６３は、シャッタ６２を透過する励起光６４を集光する。励起光レンズ６３によって集光された励起光６４は検出位置３２に向けて照射される。電気泳動により、個々のキャピラリ３３の検出位置３２を通過するＤＮＡに付加されている蛍光標識は、励起光６４が照射されることで励起され、蛍光信号６５を発する。
光学フィルタ６６（例えばカラーフィルタ）は、蛍光標識から発せられる蛍光信号６５以外の光をカットする。蛍光レンズ６７は、光学フィルタ６６を通過する蛍光信号６５を集光する。蛍光レンズ６７により集光された蛍光信号６５は、回析格子６８にて波長ごとに分光され、受光素子（受光部）であるＣＣＤ６９の受光面へ照射される。波長ごとに分光された蛍光信号６５が照射されると、ＣＣＤ６９の受光面には、信号電荷が発生する。ＣＣＤ６９の変換回路は、信号電荷を電圧（アナログ）に変換してＡＤＣ７１に出力する。ＣＣＤ６９は、フレームトランスファー型、フルフレームトランスファー型、インターライントランスファー型、フレームインタートランスファー型のいずれでもよい。
ＡＤＣ７１は、ＣＣＤ６９から出力されたアナログ信号をデジタル信号に変換する。ＡＤＣ７１は、変換後のデジタル信号を信号処理部７２に出力する。信号処理部７２は、出力されたデジタル信号から蛍光信号強度（疑似的に１画素として結合された受光面の蛍光信号強度が該当する）を取得する。本実施例の信号処理部７２は、デジタル信号から得られる蛍光信号の波長に基づいてＤＮＡの塩基配列を決定する信号処理を実行する。なお、信号処理部７２は、出力されたデジタル信号から得られる蛍光信号強度と波長をメモリ７３に記憶する。
（１−２）信号処理部７２の機能構成
図４に、信号処理部７２の機能構成を示す。本実施例の場合、信号処理部７２の機能は、コンピュータによるプログラムの実行を通じて実現される。信号入力部１０１は、ＡＤＣ７１からデジタル信号である入力信号を受け取る。前述したように、入力信号は、各塩基種別Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）の４種の各塩基に対応する色素から発せられる波長スペクトルの時系列である。各時刻の波長スペクトルは、各波長を離散化した実数値の配列であり、その配列長Ｎはたとえば10や20など 4以上の整数である。そのため、入力信号はＮチャンネル実数値信号である。
ベースライン除去部１０２は、ベースライン除去処理を実行し、入力信号（Ｎチャンネル実数値信号）からベースライン除去後信号を得る。ベースライン除去処理は、各時刻の近傍区間の最小値を差し引くなどの公知の方法を用いればよい。色変換部１０３は、色変換処理を実行し、ベースライン除去後信号（Ｎチャンネル実数値信号）から、各チャンネルが４種の各塩基に対応する４チャンネル信号である色変換後信号を計算する。色変換処理には、予めキャリブレーションされた色変換行列の擬似逆行列の乗算など、公知の方法を用いればよい。
ブロック切り出し部１０４は、強度が十分小さい時刻を境界として、色変換後信号の各チャンネルの信号を小区間（以下「ブロック」ともいう。）に分割するブロック切り出し処理を実行し、各ブロックに対応する信号を切り出し後信号として出力する。図５に、ブロックの切り出し例を示す。図５に示すように、一つの切り出し信号は、一塊の波形から構成される。ブロックに分割することで、後段の逆畳み込み処理やピーク間隔制約付き逆畳み込み処理などの計算量を削減することができる。これにより、処理時間の短縮及び消費メモリの削減を実現できる。
逆畳み込み部１０５は、切り出し後信号に対し、逆畳み込み（デコンボリューション）処理を実行し、初期逆畳み込み後信号を計算する。一般に、逆畳み込み処理は、点拡がり関数（PSF）が既知の場合と未知の場合とで困難さが異なる。PSFが既知の場合、逆畳み込み処理は、入力信号（切り出し後信号）とPSFを用いて逆畳み込み後信号を計算する処理である。この場合、ウィーナーフィルタを用いた方法などにより、比較的高精度に逆畳み込みが可能である。
ところで、キャピラリ電気泳動装置１０では、PSFが変動することがある。従って、逆畳み込み部１０５は、PSFが未知の条件下で逆畳み込みを行う必要がある。この処理は、入力信号を用いて、PSFと逆畳み込み後信号の両方を計算する処理であり、「ブラインドデコンボリューション」と呼ばれる。例えば、Nonnegative Matrix Factorization（NMF）に基づいて、このような同時最適化を伴う逆畳み込みが実行可能である。しかし、一般に、PSFと逆畳み込み後信号の組の候補は無数に存在し、その局所解も無数に存在する。このため、高精度な解を得ることは一般的には困難である。NMFでは、L1正則化やL1/L2正則化などのスパース正則化のように局所解を避けて大局解を得る方策も存在するが、キャピラリ電気泳動装置１０で使用しても十分な精度を得ることは困難である。
そこで、本実施例の逆畳み込み部１０５では、以下に説明する手法により解の候補を削減し、局所解を避ける。まず、逆畳み込み部１０５は、PSFをガウス関数に限定し、その未知パラメータを標準偏差σのみに限定する。このようにPSFの未知パラメータを限定することで、局所解を避けることができる。逆畳み込み部１０５は、離散化した有限個の標準偏差σごとに、対応するガウス関数をPSFとして逆畳み込み処理を実行し、標準偏差σごとの逆畳み込み後信号を得る。
次に、逆畳み込み部１０５は、解の候補を、以下に示す(1)、(2)及び(3)の条件を満たすような標準偏差σと逆畳み込み後信号の組のみに絞る。
(1) 以下で計算されるe(σ)がある閾値以下であること
まず、逆畳み込み部１０５は、標準偏差σに対応するガウス関数とそれを用いた逆畳み込み信号とを用いて畳み込み処理を実行し、畳込み後信号を計算する。次に、逆畳み込み部１０５は、標準偏差σごとに畳込み後信号と入力信号との誤差e(σ)を、平均二乗誤差やカルバック・ライブラーダイバージェンスに基づいて計算する。次に、誤差e(σ)が、ある閾値以下である標準偏差σのみを選択する。この条件により、畳み込み生成モデルに従う解のみをパラメータ候補に絞ることができる。
(2) 逆畳み込み後信号から抽出される各ピークの間隔について、ブロック内でのピーク間隔の最小値が、ある閾値以上であること
この条件に従って、ピーク間隔が短すぎる解の候補を除外すると、局所解を避けることができる。
(3) σが、e(σ)の変曲点σ_rの近傍であること
逆畳み込み部１０５は、例えば誤差e(σ)のσに関する２次微分値e”(σ)の正のピークを変曲点として検出し、そのピークの位置を変曲点σ_rに代入する。この条件により、ピークの個数が本来よりも多すぎるような解を除外することができる。これは以下の理由による。ピークの個数が本来よりも多すぎるような解に対応するe(σ)は、本来の解に対応するe(σ)と同程度に小さい値となる。また、ピークの個数が本来よりも小さい解に対応するe(σ)は、本来の解に対応するe(σ)より大きい値となる。そこで、e(σ)が急峻に変化するσ、すなわち変曲点σ_rに対応する解が本来の解に近いといえる。
以上の処理の実行により、逆畳み込み部１０５は、ブロック毎に標準偏差σと逆畳み込み後信号を算出する。ここでは、図５に示すように、i番目のブロックの標準偏差をσ_iとする。標準偏差σは、短時間では大きく変動しないと仮定することができる。逆畳み込み部１０５には、この仮定の下、逆畳み込みの精度を更に高める機能（ブロック間再計算機能）も搭載されている。
この機能の実行時、逆畳み込み部１０５は、あるブロックの標準偏差σと、その前後に出現するブロックにおける標準偏差の平均値との差分が閾値Tを超えているか否かを判定する。
Figure 2017130349
式１が成立する場合、逆畳み込み部１０５は、式２で与えられる値を標準偏差とするPSFで再度逆畳み込みを実行し、新たな逆畳み込み後信号を算出する。ただし、Kは、ある自然数（１、２、３…）の定数である。
Figure 2017130349
例えば図５の場合、ｉ番目のブロックの標準偏差σiは“1.2”であり、その前後のブロックの標準偏差の平均値“3.15”とは大きく異なっているため、逆畳み込み部１０５は、ｉ番目のブロックについて逆畳み込み後信号を再計算する。なお、この複数ブロックを考慮した再計算機能は逆畳み込み部１０５が自動的に実行する仕組みとしてもよいし、後述するように作業者がユーザインタフェース画面上で機能の実行又は非実行を指定入力できるようにしてもよい。なお、図５に示す画面はインターフェース画面として作業者に提示されるようにしてもよい。
図４の説明に戻る。ピーク抽出部１０６は、ピーク抽出処理を実行し、初期逆畳み込み後信号からピーク抽出後信号を得る。ピーク抽出処理には、一次微分の零交差を計算する計算法などの公知の方法を用いればよい。
移動度補正部１０７は、移動度補正処理を実行し、ピーク抽出後信号と色変換後信号から移動度補正後信号を計算する。移動度補正処理は、以下の手順で実行される。
(1) 移動度補正部１０７は、ピーク抽出後信号を「移動度補正途中ピーク信号」に代入し、色変換後信号を「移動度補正途中信号」に代入する。
(2) 移動度補正部１０７は、移動度補正途中ピーク信号に対し、Ｇ（グアニン）のピークＰＧのうち、その時間軸上の後方で隣接するピークがＧ（グアニン）以外の塩基に対応するピークＰＧについて、ピークＰＧとその時間軸上の後方で隣接する他の塩基のピークとの平均間隔d(G)を計算する。同様に、移動度補正部１０７は、Ａ（アデニン）のピークＰＡのうち、時間軸上の後方で隣接するピークがＡ（アデニン）以外の塩基に対応するピークＰＡについて、ピークＰＡとその時間軸上の後方で隣接する他の塩基のピークとの平均間隔d(A)を計算する。同様に、移動度補正部１０７は、Ｔ（チミン）のピークＰＴのうち、その時間軸上の後方で隣接するピークがＴ（チミン）以外の塩基に対応するピークＰＴについて、ピークＰＴとその時間軸上の後方で隣接する他の塩基のピークとの平均間隔d(T)を計算する。同様に、移動度補正部１０７は、Ｃ（シトシン）のピークＰＣのうち、その時間軸上の後方で隣接するピークがＣ（シトシン）以外の塩基に対応するピークＰＣについて、ピークＰＣとその時間軸上の後方で隣接する他の塩基のピークとの平均間隔d(C)を計算する。
(3) 移動度補正部１０７は、d(G)、d(A)、d(T)、d(C)の平均値d_meanを計算する。
(4) 移動度補正部１０７は、以下の式で与えられるd’(G)、d’(A)、d’(T)、d’(C)を計算する。
d’(G) ＝ d(G) − d_mean
d’(A) ＝ d(A) − d_mean
d’(T) ＝ d(T) − d_mean
d’(C) ＝ d(C) − d_mean
(5) 移動度補正部１０７は、移動度補正途中ピーク信号のＧ（グアニン）に対応するチャンネルをd’(G)だけ時間軸上後方にシフトし、Ａ（アデニン）のチャンネルをd’(A)だけ時間軸上後方にシフトし、Ｔ（チミン）のチャンネルをd’(T)だけ時間軸上後方にシフトし、Ｃ（シトシン）のチャンネルをd’(C)だけ時間軸上後方にシフトし、シフト後の信号で移動度補正途中ピーク信号を上書きする。
(6) 移動度補正部１０７は、移動度補正途中信号のＧ（グアニン）に対応するチャンネルをd’(G)だけ時間軸上後方にシフトし、Ａ（アデニン）に対応するチャンネルをd’(A)だけ時間軸上後方にシフトし、Ｔ（チミン）に対応するチャンネルをd’(T)だけ時間軸上後方にシフトし、Ｃ（シトシン）に対応するチャンネルをd’(C)だけ時間軸上後方にシフトし、シフト後の信号で移動度補正途中信号を上書きする。
(7) 移動度補正部１０７は、d’(G)、d’(A)、d’(T)、d’(C)のいずれもが十分に小さい場合（各閾値より小さい場合）、上書きした移動度補正途中信号を移動度補正後信号に代入して終了し、そうでなければ(2)の処理に戻る。
ピーク間隔許容度入力部１０９は、表示装置５２の画面に表示されたインターフェース画面を通じ、作業者によるピーク間隔の分散の許容度αの入力を受け付ける処理を実行する。αは、ピーク間隔の分散をどれくらい許容するかの許容値を意味する。作業者は、ピーク間隔許容度入力部１０９を通じてαを設定できることにより、ノイズの大きさに依存した最適なαを用いて高精度にベースコールを行うことができる。
図６に、ピーク間隔許容度入力部１０９が表示するインターフェース画面２００の例を示す。図６に示すインターフェース画面２００には、塩基Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）に対応する色素から発せられる各波長スペクトルの時系列を処理して得られる移動度補正後信号と更新逆畳み込み後信号の波形が表示されている。
インターフェース画面２００には、ピーク間隔の分散の許容度αの入力欄２０１が設けられている。インターフェース画面２００には、入力された許容度αを用いて計算されたした更新逆畳み後信号が表示される。従って、許容度αの値が変更されると、表示される更新逆畳み後信号の波形も変化する。作業者は、許容度αを用いて計算した更新逆畳み後信号を確認することにより、入力した許容度αが適切な値か否かを容易に判断することができる。
また、ピーク間隔許容度入力部１０９は、入力された許容度αを用いて計算した更新逆畳み後信号を元に抽出したピーク位置２０２も表示する。図６では、ピーク位置２０２は一点鎖線で示されている。作業者は、ピーク位置２０２の間隔が一定か否かを確認することにより、入力した許容値αが適切な値か否かを容易に判断することができる。ピーク位置２０２の間隔が一定に近いほど許容値αが適正値に近い。また、作業者は、インターフェース画面２００に表示された移動度補正後信号と更新逆畳み後信号を比較することにより、逆畳み込み処理が適切に実行されているか否かを容易に判断することができる。つまり、入力した許容値αが適切な値であるか否かを容易に判断することができる。なお、インターフェース画面２００には、逆畳み込み部１０５のブロック間再計算機能の実行の有無を選択するためのチェック欄２０３、ノイズが大きい場合の計算処理の実行を指示するためのチェック欄２０４、ノイズが小さい場合の計算処理の実行を指示するためのチェック欄２０５も設けられている。チェック欄２０３にチェックが入っている場合の処理内容は図５を用いて既に説明済である。チェック欄２０４又は２０５にチェックが入っている場合の処理内容については後述する。なお、図６はインターフェース画面２００の一例であり、入力欄２０１とチャック欄２０３〜２０５は表示されていなくてもよいし、一部だけが表示されていてもよい。
図４の説明に戻る。ピーク間隔制約付逆畳み込み部１０８は、４チャンネルの移動度補正後信号に対し、逆畳み込み（デコンボリューション）処理を行い、４チャンネルの更新逆畳み込み後信号を計算する。前述したように、PSFが未知の場合、逆畳み込み処理で十分な精度を得ることは困難である。そこで、本実施例のピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８では、以下のように解の候補を削減することにより、局所解を避ける。
図７に、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８の処理動作を示す。まず、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、PSFをガウス関数に限定し、その未知パラメータを標準偏差σのみに限定する。このようにPSFの未知パラメータを限定することで、局所解を避けることができる。次に、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、離散化した有限個の標準偏差σをパラメータ候補として列挙し（ステップＳ３０１）、個々のパラメータ候補について以下の処理を実行する（ステップＳ３０２）。まず、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、処理対象の標準偏差に対応するガウス関数をPSFとして用いて逆畳み込み処理を実行し、４チャンネルの逆畳み込み後信号を得る（ステップＳ３０３）。
次に、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、処理対象のパラメータ候補（すなわち、標準偏差σ）について、以下に示す(1)及び(2)の手順でe(σ)とv(σ)を計算する。
(1) 前述の処理と同様、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、標準偏差σに対応するガウス関数とそれを用いた逆畳み込み信号とを用いて畳み込み処理を実行し、４チャンネルの畳込み後信号を計算する。次に、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、算出された畳込み後信号と入力信号との誤差e(σ)を、平均二乗誤差やカルバック・ライブラーダイバージェンスに基づいて計算する。
(2) ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、算出された４チャンネルの畳込み後信号から抽出される各ピークについて、チャンネルの違いを無視して特定される隣接ピークとの間隔を計算する。詳細については図６を用いて既に説明した。次に、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、それら間隔に対応する全てのピークについて分散値v(σ)を計算する。ただし、v(σ)は文字通りの分散値ではなく、標準偏差や平均値からの偏差の最大値やMedian Absolute Deviation (MAD)であってもよい。本明細書では、これらを総称する意味で「分散」の用語を用いる。
次に、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、例えば次式により評価値ｃを計算する（ステップＳ３０４）。
ｃ＝e(σ) ＋ α×v(σ) …式３
αは、前述したように、ピーク間隔の分散の許容度である。例えばノイズが大きい場合、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、許容度αを大きく設定することでピーク間隔の分散v（σ）を重視する。これにより、畳み込みの誤差ｅ（σ）が大きくても許容した解が得られる。一方、ノイズが小さい場合、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、許容度αを小さく設定することで畳み込みの誤差ｅ（σ）を重視し、ピーク間隔の分散v（σ）が大きくても許容した解が得られる。
因みに、ノイズが大きいか否かの判定は、ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８が自動的に実行しても良い。また、図６に示したように、作業者がインターフェース画面２００のチェック欄２０４又は２０５のいずれかをチェックしていることをピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８が検知し、チェック内容に応じて許容度αの大きさを変更する仕組みを採用してもよい。
ピーク間隔制約付逆畳み込み処理部１０８は、評価値ｃが最小となる標準偏差を探索し（ステップＳ３０５）、特定された標準偏差に対応する４チャンネルの畳み込み後信号を、４チャンネルの更新逆畳み込み後信号として出力する（ステップＳ３０６）。このようにして得られた更新逆畳み込み後信号は、ピーク間隔がほぼ一定であるという制約を満たしている。このような解は本来の解である可能性が高いため、十分な精度での逆畳み込み結果となる。なお、評価値ｃの計算に用いる計算式によっては、最大値を採る標準偏差を探索してもよい。
以上の処理は、ブロック毎（図５参照）に実行される。なお、ピーク間隔制約付逆畳み込み部１０８の処理は、前述の逆畳み込み部１０５と同様、複数のブロックについて計算された結果を用いて、より精度を高めることができる。ここでも、i番目のブロックの標準偏差σをσ_iとする。ここでも、標準偏差σは、短時間では大きく変動しないと仮定する。ピーク間隔制約付逆畳み込み部１０８は、あるブロックの標準偏差σと、その前後に出現するブロックにおける標準偏差の平均値との差分が閾値Tを超えているか否かを判定する。
Figure 2017130349
式４が成立する場合、ピーク間隔制約付逆畳み込み部１０８は、式５で与えられる値を標準偏差とするPSFで再度逆畳み込みを実行し、新たな逆畳み込み後信号を算出する。ただし、Kは、ある自然数（１、２、３…）の定数である。
Figure 2017130349
図４の説明に戻る。ピーク抽出部１１０は、ピーク波形を抽出する処理を実行し、４チャンネルの更新逆畳み込み後信号から４チャンネルの更新ピーク抽出後信号を計算する。ピーク抽出処理には、更新逆畳み込み後信号の一次微分の零交差を計算し、零交差が存在する時刻の更新ピーク抽出後信号の信号値を更新逆畳み込み後信号の信号値で置き換えるなどの方法を用いればよい。更新逆畳み込み後信号の一次微分の計算には、更新逆畳み込み後信号に対してスプライン補間を行い、スプライン補間後の信号の一次微分値を計算する。これにより、雑音に対して頑健なピーク抽出が可能である。
ピーク抽出部１１０には、さらに精度を高める目的で、全てのピークに対して以下の判定ルールに基づく判定処理を実行し、判定の結果「削除」と判定されたピークを削除してもよい。
判定ルール：d ＜ 0ならば削除する。
ただし、dは、以下のx_1とx_2に依存する識別関数である。
・x_1 ＝ 注目ピークの強度 − 近傍ピークの強度の平均値
・x_2 ＝ 移動度補正後信号における注目ピークの時刻の注目ピークのチャンネルの強度 / 移動度補正後信号における注目ピークの時刻のチャンネルに亘っての平均強度
例えばdには、線形識別関数d ＝ w_1 * x_1 ＋ w_2 * x_2 ＋ w_3を用いてもよく、SVM（Support Vector Machine）を用いてもよく、決定木を用いても良い。
配列特定部１１１は、配列特定処理を実行し、４チャンネルの更新ピーク抽出後信号から結果配列を出力する。配列特定処理では、更新ピーク抽出後信号中の各ピークに対応する塩基種別のラベルＧ、Ａ、Ｔ、Ｃを時間順に並べることでラベル列を生成する。このラベル列を結果配列とする。配列出力部１１２は、結果配列をハードディスクやＳＳＤ（Solid State Drive）などの記憶装置に出力するか、又は、表示装置５２を用いて提示する。
（１−３）まとめ
以上説明したように、本実施例のキャピラリアレイ電気泳動装置１０には、ピーク間隔に制約を付けた上で逆畳み込み処理を実行する機能を搭載する。これにより、ピークの分離度が低い場合（特に、異なる塩基種別の波形が時間的に重なっている場合）でも、高精度に塩基配列を決定することができる。特に可搬型（小型）のシーケンサや測定時間が短いシーケンサではピークの分離度が低くなり易いと考えられるため、本実施例の手法はこれらのシーケンサに効果的である。
（２）実施例２
本実施例では、キャピラリアレイ電気泳動装置１０に、各種のパラメータを機械学習する機能を採用する場合について説明する。なお、本実施例におけるキャピラリアレイ電気泳動装置１０の基本的な装置は実施例１と同じである。以下では、同じ測定条件で既知の塩基配列の試料を測定した複数の入力信号が信号入力部１０１に入力されるものとする。
まず、学習工程１として、ピーク間隔の分散の許容度αを自動的にチューニングする方法について説明する。信号処理部７２は、ある範囲[α_min, α_max]内で、許容度αを、ある刻みΔαで変化させ、それぞれのαを用いて実施例１で説明した一連の処理を実行し、塩基配列を決定する。その後、信号処理部７２は、個々の許容度αを用いて決定された塩基配列と正しい配列との一致率p(α)を計算し、一致率p(α)が最大となるように許容度αを設定する。この学習工程の実行により、ユーザインタフェース画面２００を用いた許容度αの入力を省略することができる。
次に、学習工程２として、許容度α以外のパラメータをチューニングする方法について説明する。信号処理部７２は、例えば実施例１で説明したピーク抽出部１１０の削除判定ルールのパラメータw_1、w_2、w_3をチューニングする。ここでは、塩基配列が既知の試料を測定しているため、本来存在するピークが正しく抽出されたか、又は、本来存在しないピークが誤って抽出されたか、又は、本来存在するピークが誤って除外抽出されなかったか、本来存在しないピークが正しく除外されたか、といった１ピーク毎の正否が分かる。この正否を教師信号とし、信号処理部７２は、出力信号dと合わせて教師あり学習を行う。
出力信号dが線形識別関数の場合、信号処理部７２は、誤り訂正学習などのアルゴリズムを用いればよい。出力信号dがSVM（Support Vector Machine）の場合、信号処理部７２は、教師あり学習にSMO（Sequential Minimal Optimization）アルゴリズムを用いることができる。出力信号dが決定木の場合、信号処理部７２は、ID3またはC4.5などのアルゴリズムで教師あり学習が可能である。
学習工程１の結果と学習工程２の結果は互いに依存関係を有する。そこで、信号処理部７２は、学習工程１と学習工程２を交互に行うことで、全体として最適なパラメタチューニングを実行する。
（３）実施例３
図８に、キャピラリアレイ電気泳動装置１０Ａの他の構成例を示す。図８には、図２との対応部分に同一符号を付して示す。実施例１の場合、塩基配列の決定処理を蛍光検出装置５０の信号処理部７２で実行しているが、本実施例の蛍光検出装置５０Ａでは信号処理部７２に塩基配列の解析機能を搭載せず、キャピラリアレイ電気泳動装置１０Ａに対して外付けされるコンピュータ等の外部装置５３で実行する。このため、図８に示すキャピラリアレイ電気泳動装置１０Ａでは、制御基板５１に対して外部装置５３が接続されている。外部装置５３は、信号処理部７２で実行される信号処理を実行するのに十分な計算資源を有するものとする。また、外部装置５３には、処理結果等の確認用に表示装置が設けられている。なお、制御基板５１と外部装置５３との通信は、有線方式でも無線方式でもよい。例えば外部装置５３は、デスクトップＰＣ、ノートＰＣ、スマートフォン、携帯情報端末である。
（４）他の実施例
本発明には、上述した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上述した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部については、他の構成の追加、削除又は置換が可能である。
また、上述した各構成、機能、処理部、処理手段等は、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。また、上記の各構成、機能等は、プロセッサがそれぞれの機能を実現するプログラムを解釈し、実行することによりソフトウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、テーブル、ファイル等の情報は、メモリや、ハードディスク、ＳＳＤ等の記録装置、または、ＩＣ（integrated circuit）カード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くことができる。
また、制御線や情報線は説明上必要と考えられるものを示しており、製品上必ずしも全ての制御線や情報線を示しているとは限らない。実際には殆ど全ての構成が相互に接続されていると考えてもよい。
１０…キャピラリアレイ電気泳動装置、
１１…サンプル容器、
１２…サンプルトレイ、
２０…搬送器、
２１…高圧電源、
３０…キャピラリアレイ、
３１…恒温槽、
３２…検出位置、
３３…キャピラリ、
３４…排出位置、
４１…電気泳動媒体、
４２…ポンプユニット、
５０…蛍光検出装置、
５１…制御基板、
５２…表示装置、
７２…信号処理部、
１０１…信号入力部、
１０２…ベースライン除去部、
１０３…色変換部、
１０４…ブロック切り出し部、
１０５…逆畳み込み部、
１０６…ピーク抽出部、
１０７…移動度補正部、
１０８…ピーク間隔制約付逆畳み込み部、
１０９…ピーク間隔許容度入力部、
１１０…ピーク抽出部、
１１１…配列特定部、
１１２…配列出力部、
２００…インターフェース画面、
２０１…許容度αの入力欄、
２０２…ピーク位置、
２０３…チェック欄、
２０４…チェック欄、
２０５…チェック欄。

Claims (15)

  1. 各塩基に対応する波長スペクトルの時系列信号を移動度補正した移動度補正信号を出力する移動度補正部と、
    点拡がり関数の複数のパラメータ候補について、前記移動度補正信号の逆畳み込み後信号をそれぞれ算出する処理と、算出された逆畳み込み後信号についてピーク間隔の分散を計算する処理と、計算された分散を用いて前記点拡がり関数のパラメータを特定する処理と、特定されたパラメータを有する前記点拡がり関数に対応する前記逆畳み込み信号を更新逆畳み込み信号として出力する処理と、を実行する逆畳み込み部と、
    前記更新逆畳み込み後信号からピーク波形を抽出し、更新ピーク抽出後信号を出力するピーク抽出部と、
    前記更新ピーク抽出後信号を入力し、塩基配列を決定する配列特定部と
    を有する塩基配列決定装置。
  2. 請求項１に記載の塩基配列決定装置において、
    前記逆畳み込み部は、前記複数のパラメータ候補について算出された前記逆畳み込み後信号のそれぞれについて畳み込み誤差とピーク間隔の分散を計算し、前記畳み込み誤差と前記分散の大きさとによって計算される評価値に基づいて前記更新逆畳み込み信号の算出に使用する前記点拡がり関数のパラメータを特定する
    ことを特徴とする塩基配列決定装置。
  3. 請求項２に記載の塩基配列決定装置において、
    前記評価値の計算時に使用する、前記分散に乗算する重み係数を与える許容度を、インターフェース画面に対する入力を通じて受け付ける入力部を更に有する
    ことを特徴とする塩基配列決定装置。
  4. 請求項３に記載の塩基配列決定装置において、
    前記許容度の入力値の変更に応じて、前記インターフェース画面に表示される前記更新逆畳み込み後信号の波形が変化する
    ことを特徴とする塩基配列決定装置。
  5. 請求項１に記載の塩基配列決定装置において、
    前記逆畳み込み部による前記逆畳み込み後信号のピーク間隔の前記分散の計算時に、複数の時間区間について計算される前記分散の計算結果を用いるか否かを、インターフェース画面に表示されるチェック欄へのチェックの有無を通じて受け付ける入力部を更に有する
    ことを特徴とする塩基配列決定装置。
  6. 請求項１に記載の塩基配列決定装置において、
    前記逆畳み込み部は、前記逆畳み込み後信号のピーク間隔の前記分散の計算結果を、当該計算結果に対応する時間区間以外の複数の時間区間について計算される前記分散の計算結果を用いて修正し、修正後の前記分散を用いて前記点拡がり関数のパラメータを特定する
    ことを特徴とする塩基配列決定装置。
  7. 請求項１に記載の塩基配列決定装置において、
    前記逆畳み込み部は、前記更新逆畳み込み後信号の算出に使用する前記点拡がり関数のパラメータを特定する処理の実行前に、以下の(1)〜(3)を満たす逆畳み込み後信号が得られるパラメータ候補のみを抽出する
    ことを特徴とする塩基配列決定装置。
    (1)前記逆畳み込み後信号と前記移動度補正信号との間の畳み込み誤差が所定の閾値以下である。
    (2)前記逆畳み込み後信号から抽出されるピークの間隔の最小値が閾値以上である。
    (3)前記点拡がり関数のパラメータ候補が、前記畳み込み誤差の変曲点の近傍に存在する。
  8. サンプルが電気泳動されるキャピラリアレイと、
    前記キャピラリアレイに泳動電圧を印加する高圧電源と、
    前記キャピラリアレイからの蛍光を検出する受光部と、
    前記受光部からの信号を処理して前記サンプルの塩基配列を決定する請求項１に記載の塩基配列決定装置と
    を有するキャピラリアレイ電気泳動装置。
  9. 信号処理部とメモリを有する塩基配列決定装置で実行される塩基配列決定方法において、
    前記信号処理部が、各塩基に対応する波長スペクトルの時系列信号を移動度補正した移動度補正信号を出力する処理と、
    前記信号処理部が、点拡がり関数の複数のパラメータ候補について、前記移動度補正信号の逆畳み込み後信号をそれぞれ算出する処理と、
    前記信号処理部が、算出された逆畳み込み後信号のそれぞれについてピーク間隔の分散を計算する処理と、
    前記信号処理部が、計算された分散を用いて前記点拡がり関数のパラメータを特定する処理と、特定されたパラメータを有する前記点拡がり関数に対応する前記逆畳み込み信号を更新逆畳み込み信号として出力する処理と、
    前記信号処理部が、前記更新逆畳み込み後信号からピーク波形を抽出し、更新ピーク抽出後信号を出力する処理と、
    前記信号処理部が、前記更新ピーク抽出後信号を入力し、塩基配列を決定する処理と
    を有する塩基配列決定方法。
  10. 請求項９に記載の塩基配列決定方法において、
    前記信号処理部が、前記複数のパラメータ候補について算出された前記逆畳み込み後信号のそれぞれについて畳み込み誤差とピーク間隔の分散を計算し、前記畳み込み誤差と前記分散の大きさとによって計算される評価値に基づいて前記更新逆畳み込み信号の算出に使用する前記点拡がり関数のパラメータを特定する
    ことを特徴とする塩基配列決定方法。
  11. 請求項１０に記載の塩基配列決定方法において、
    前記信号処理部が、前記評価値の計算時に使用する、前記分散に乗算する重み係数を与える許容度の入力欄をインターフェース画面に表示する
    ことを特徴とする塩基配列決定方法。
  12. 請求項１１に記載の塩基配列決定方法において、
    前記信号処理部は、前記許容度の入力値の変更に応じて、前記インターフェース画面に表示する前記更新逆畳み込み後信号の波形を変化させる
    ことを特徴とする塩基配列決定方法。
  13. 請求項９に記載の塩基配列決定方法において、
    前記信号処理部が、前記逆畳み込み部による前記逆畳み込み後信号のピーク間隔の前記分散の計算時に、複数の時間区間について計算される前記分散の計算結果を用いるか否かを指示するためのチェック欄をインターフェース画面に表示する
    ことを特徴とする塩基配列決定方法。
  14. 請求項９に記載の塩基配列決定方法において、
    前記信号処理部が、前記逆畳み込み後信号のピーク間隔の前記分散の計算結果を、当該計算結果に対応する時間区間以外の複数の時間区間について計算される前記分散の計算結果を用いて修正し、修正後の前記分散を用いて前記点拡がり関数のパラメータを特定する
    ことを特徴とする塩基配列決定方法。
  15. 請求項９に記載の塩基配列決定方法において、
    前記信号処理部が、前記更新逆畳み込み後信号の算出に使用する前記点拡がり関数のパラメータを特定する処理の実行前に、以下の(1)〜(3)を満たす逆畳み込み後信号が得られるパラメータ候補のみを抽出する
    ことを特徴とする塩基配列決定方法。
    (1)前記逆畳み込み後信号と前記移動度補正信号との間の畳み込み誤差が所定の閾値以下である。
    (2)前記逆畳み込み後信号から抽出されるピークの間隔の最小値が閾値以上である。
    (3)前記点拡がり関数のパラメータ候補が、前記畳み込み誤差の変曲点の近傍に存在する。
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